JPS61260896A - 胆汁酸の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遊離型、アミノ酸抱台型など各種の胆汁酸を含
有する試料溶液中の各胆汁酸を分析する方法に関する。

（従来の技術） 胆汁に含有される胆汁酸は遊離型、グリシン抱合型など
種々の胆汁酸の混合物である。肝胆道系疾患においては
胆汁酸の分画パターンが変化したり、血清中の胆汁酸量
が変化することが多い、そのため、各胆汁酸を検出もし
くは定量することにより疾病の検出もしくはその病態を
知ることが行われている。試料溶液に含をされる胆汁酸
混合物を各胆汁酸成分に分離して、その各々の成分につ
いて分析する方法は１例えば特公昭５６−３８２００号
公輯に開示されている。それによれば、まず、胆汁酸混
合物を含む試料溶液を逆相系のポリマーゲルやシリカゲ
ルを充填した分離カラムを用いて液体クロマトグラフィ
ー法により各胆汁酸成分に分離する０次に１分離された
胆汁酸を含有する溶出液にニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤ’　）を加えて、３α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−Ｈ２Ｏ）を固定化
したカラムに通じる。３α−）１ｓＤの触媒作用で胆汁
酸はケト型に酸化され、　　ＮＡ口゛は還元されて還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）
に変化する。

Ｎ　Ａ　Ｄ　４１の光吸収もしくは螢光を測定すること
により各胆汁酸の検出もしくは定量がなされる。

このような方法においては、胆汁酸混合物を含有する体
液などの試料はあらかじめ熱エタノール抽出、修飾シリ
カゲルやポリマーゲルを用いたゲル吸着法などにより除
蛋白される。しかし、熱エタノール抽出やゲル吸着法を
行っても、胆汁酸よりも疎水性が高い化合物を除去する
ことは難しい。

このような化合物がカラム内のゲルに吸着してゲルが汚
染されるために胆汁酸の分離能力が低下したり、カラム
内の圧力上昇が起こる０分離カラムの寿命も短い０分離
カラムにかける試料の量を少量にすれば、上記カラムの
汚染による問題を軽減することができる。しかし、試料
の量が少ないと生成するＮＡＤＨＯ量も少量であるため
、その光吸収もしくは螢光を測定しても精度の高い分析
値を得ることができない、特に、３β−ステロイド類な
どの微量胆汁酸を分析することが難しい。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、少量の試料で微量胆汁酸をも
高感度に分析することの可能な胆汁酸の分析方法を提供
することにある。本発明の他の目的は２分離カラムを長
時間にわたり失活させずに使用することの可能な、液体
クロマトグラフィー法を用いた胆汁酸の分析方法を提供
することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の胆汁酸の分析方法は、（ａ）　　胆汁酸混合物
を含有する試料溶液を液体クロマトグラフィーにより各
胆汁酸成分に分離する工程−申）咳分離された各胆汁酸
成分を含有する溶出液にニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドとレザズリンおよび／またはレザズリンアルカ
リ塩とを含有する反応用溶液を混合させる工程；（ｃｌ
　　（ｂ）項で得られた混合液を固定化胆汁酸脱水素酵
素および固定化ジアホラーゼを同一または個別に充填し
たカラムに導く工程；およびｆｄｌ　　（Ｃ１項のカラ
ム内でレザズリンがジアホラーゼの存在下で還元されて
生成し。

該カラムからの溶出液中に含まれるレゾルフィンの光吸
収または螢光を測定する工程、を包含し。

そのことにより上記目的が達成される。

本発明方法は１例えば、第１図に示される定量装置によ
り具体化される。この装置は、溶離液１を収容する溶離
液槽１１と、グラジェント用電磁弁１２および定！ｆ、
量ポンプ１３を介してこの１Ｗｌｌに連結される試料注
入器２と、試料注入器２に連結される分離カラム３とを
有する。溶離液１は１分析する胆汁酸の種類や数により
複数種が用いられる。

例えば、第１図に示すように、３種類の溶離液１ａ、ｌ
ｂおよびＩＣをそれぞれ収容する溶離液槽１１ａ、ｌｌ
ｂおよびｌｌｃが設置される。この装置は。

さらに１分離カラム３に連結する固定化胆汁酸脱水素酵
素カラム５と、この固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５に
定流量ポンプ４２を介して連結される反応用溶液収容槽
４１を有する。固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５はさら
に固定化ジアホラーゼカラム６に連結され５固定化ジア
ホラーゼカラム６は。

検出器である螢光検出器７に連結されている。螢光検出
器７により定量された定量値は記録計７１により表示さ
れる。この装置によれば、まず、溶剤液１がグラジェン
ト用電磁弁１２を介して定流量ポンプ１３によって試料
注入器２に供給される。試料注入器２にあらかじめ供給
されている胆汁酸混合物を含有する試料がこの溶離液中
に熔解して試料）８液が調製される。：Ｉ容諦液として
は、ｐ）１６〜１０の緩衝液が用いられる。この緩衝液
には、必要に応じて、アセトニトリル、メタノール、エ
タノールなどの有機溶媒が１０〜５０ｆｆｉｆｆｉ％の
範囲で含有される、有機溶媒の含有量が過剰であると胆
汁酸の分離が悪くなる。

胆汁酸混合物を含有する試料は、あらかじめ熱エタノー
ル抽出、修飾シリカゲルやポリマーゲルによる吸着処理
などを行い２分離カラムのゲルを汚染する蛋白質などを
除去しておく、試料注入器２で調製された試料溶液は１
分離カラム３に注入される。他方、溶離液ｌは定流量ポ
ンプ１３により常時分離カラム３に供給されている０分
離カラム３には多孔性化学結合型シリカゲルなど液体ク
ロマトグラフィーの分離カラムに通常用いられる微粒子
が充填されている。この分離カラムにより胆汁酸は各成
分に分離され溶出される。溶出液は固定化胆汁酸脱水素
酵素カラム５へ導かれる。このカラム５へは、さらに、
　　ＮＡＤ”とレザズリンおよび／またはレザズリンア
ルカリ塩（以下、レザズリン（アルカリ塩）とする）と
を含む反応用溶液４が定流量ポンプ４２により反応用溶
液収容槽４１から導入される。固定化胆汁酸脱水素酵素
カラム５には胆汁酸脱水素酵素が固定されている。胆汁
酸脱水素酵素としては、シュードモナス　テストステロ
ｍ；（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｅｓＬｓｔｅｒｏｎ
ｉ）やシュードモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ｐｕｔｉｄａ）由来の３α−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼ（３α−１（ＳＤ　　、以下、ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼをＩＳＤとする）およ
び３β−１４ＳＤ　　；ニジエルシア　コリ　（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）由来の７α−ＩＳＤ　
；ストレプトマイセス　ヒドロゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
＋ｇｙｃｅｓ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓ　）由来の３α−
）ＩＳＯおよび２０β−ＩＳＤ　　；エラバクテリウム
　レンタム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ　１ｅｎｔｕ＋
ｗ）由来の１２α−）１ｓＤなどが用いられる。特に３
α−）ＩＳＤや３β−ＩＳＤについては、有機溶媒に対
する安定性の高いシュードモナス　テストステロｍ；（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｓｔｅｒｏｎｉ）由
来のものが好適である。固定化胆汁酸脱水素酵素カラム
および後述の固定化ジアホラーゼカラムに用いられる担
体としてはセルロース、多孔性ガラスピーズなどが好適
に用いられうる。

分離用カラム３で各成分に分離された胆汁酸は５このカ
ラム５内で胆汁酸脱水素酵素の存在下でＮ＾０と反応し
て胆汁酸の水酸基がカルボニル基に変化し、ケト型の胆
汁酸を生じる。胆汁酸としてコール酸を用いると次のよ
うにケトコールを生じる。

補酵素であるＮＡＤ”は還元されてＮＡＤＨを生じる。

生成ＮＡＤＨのモル数は胆汁酸のモル数に相当する。

固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５からの溶出液は次に、
酸化還元酵素であるジアホラーゼが固定化された固定化
ジアホラーゼカラム６に導入される。

ジアホラーゼとしては１例えば、バシルス　ステアロテ
モフイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｖｏｐｈｉｌｉｓ）やクロストリジウム　クルレイベリ
　（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ曽ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来の
ものが用いられる。有機溶媒に対する安定性、温度変化
による安定性、経時安定性の点で特に、バシルス　ステ
アロテモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｓ＋ｏｐｈｉｌｉｓ）由来のジアホラーゼが好ま
しい、このカラム６内ではレザズリン（アルカリ塩）と
固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５で生じたＮＡＤ）Ｉと
がジアホラーゼの存在下で反応し１次のようにレゾルフ
ィンを生じる。　　ＮＡＤＨは再び酸化されてＮＡＤ”
　となる。

レザズリン（アルカリ塩）はＮＡＤＨに対して大過剰に
用いられるため生成するレゾルフィンのモル数はＮＡＤ
）ｌのモル数、言いかえれば胆汁酸のモル数に相当する
。

第１図のように固定化胆汁酸脱水素酵素カラム５および
ジアホラーゼ固定化カラム６を連結する代わりに、それ
ぞれの酵素を１つのカラム内に固定化してもよい、この
ような胆汁酸脱水素酵素とジアホラーゼとが固定化され
た固定化酵素カラムは、それぞれの酵素を固定化したゲ
ルを混合してカラムに充填する方法；それぞれの酵素を
適量ずつ混合し、これをゲルに固定化してカラムに充填
する方法、などにより調製されうる。このような固定化
酵素カラムを用いると２個のカラムを使用する場合に比
べてシャープな検出ピークが得られる。しかし、胆汁酸
脱水素酵素およびジアホラーゼの一方が極端に有機溶媒
に不安定な場合には。

失活しやすい方の酵素にあわせてカラムの寿命が短くな
る。このような場合は、第１図のように別々ツカラムを
用いて失活しやすい方のカラムを適宜交換するほうが分
析が安価になされうる。

ジアホラーゼ固定化カラム６から溶出する溶離液は螢光
検出器７へ導入される。この溶離液に含有されるレゾル
フィンは５８０ｎｍ付近に螢光スペクトルの極大を示す
ため、螢光検出器７により検出され記録計７１に記録さ
れる。この値にもとづいて各胆汁酸成分が定量される。

レゾルフィンはまた。

５４０ｒｖ付近に吸収スペクトルの極大を示すため。

螢光検出器に代えて分光光度針で測定することも可能で
ある。螢光検出器７を出たレゾルフィンを含む溶液は廃
液槽８へ入る。

（作用） 本発明方法では、固定化胆汁酸脱水素酵素カラムを通過
した）容量液に含有されるＩＩＡＤ）ｌを測定する代わ
りに、レゾルフィンを生成させてこれを測定するため、
　ＮＡＤ）Ｉを直接測定する場合に比べると１０〜５０
倍以上の高怒度で胆汁酸が測定される。そのため試料中
の胆汁酸が少量であっても正確に測定がなされうる０例
えば肝胆道系疾患においては尿や血液中の胆汁酸の含有
量が変化する場合がある。疾病初期において２例えば、
血液中の胆汁酸の変化量が極めて微量であってもこれを
検出もしくは定量することが可能である。さらに１通常
。

人体に存在しないβ−ヒドロキシステロイド類などが体
液中に存在する場合は、その含量がｍｌであるため、こ
れを正確に検出して疾病と関連づけて研究することが難
しかったが１本発明方法によればこれらを正確に検出す
ることが可能である。

使用する試料が少量でもよいため、熱エタノール抽出や
ゲル吸着法では完全に除去できずかつ疎水性が胆汁酸以
上に高い化合物によるカラムの汚染が低減される。その
ためカラムの寿命が長くなり分析を安価に行うことが可
能である。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

（Ａ）分離カラムの調製：粒子径が１０〜２０μｍのア
クリル系樹脂の微粒子が充填された内径６−１長さ２５
ｃｍのカラムト２６０　ＢＩＬＥ（積水化学工業株式会
社製）を用いた。

（Ｂ）固定化３α−Ｈ５Ｄカラムの調製：粒径約８０μ
醜のセルロース粒子を担体として用いた。このセルロー
ス粒子５１１にイオン交ｔＡ水５ｍｌおよび２Ｍ炭酸ナ
トリウム水溶液１０＠ｊｔを加えて攪拌した。これにあ
らかじめシアン化ブロマイド２ｇを溶解したアセトニト
リルｌ　ｍｌを加え、激しく攪拌して９０秒間反応させ
た。このようにして活性化させたセルロース粒子を０．
１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）　、　　イオン交換水、
　　０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０，１Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ９，５）で順次すみやかに洗浄した。これに、
シュードモナス・テストステロー二ＣＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ｔｅｓＬｓｔｅｒｏｎｉ）属細苗由来の３α−
Ｈ２Ｏ４４ｍｇを溶解させた０、５Ｍの塩化ナトリウム
を含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐ）１９．５）　５１１１
を加え、室温で２時間撹拌して反応させて３α−Ｈ２Ｏ
を担体上に固定した。セルロース粒子表面に存在する活
性点をブロックするために０．０５％の２−メルカプト
エタノールを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ）ｌ
　８．０）を加えて４℃で２時間反応させた。このよう
にして得られた固定化３α−）ＩＳＯを０．５Ｍの塩化
ナトリウムを含む０．１Ｍ！’１緩衝液（ｐＨ５，０）
　、イオン交換水、０．５Ｍの塩化　。

ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐ）１９．５）
で順次繰り返し洗浄した。内径４ｉｍ、長さ３０ｍｍ０
カラムを準備し、これに上記の固定化３α−Ｈ２Ｏを充
填した。

（Ｃ）固定化ジアホラーゼカラムの調製：３α−）Ｉｓ
Ｄの代わりにバジルス　ステアロテモフィルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）
由来のジアホラーゼを用いたこと以外は（Ｂ）項と同様
に操作を行い、固定化ジアホラーゼカラムを得た。

（Ｄ＞胆汁酸の定量：分離カラム３．固定化胆汁酸脱水
素酵素カラム５およびジアホラーゼ固定化カラム６を第
１図に示すように接続し、室温３０℃にて胆汁酸の分析
を行った。溶離液１ａは、０．５％リン酸アンモニウム
水溶液（ｐＨ９，１）とアセトニトリルとの混液（混合
容積比８７：１３）；溶離液１ｂは、　１．２　′３Ａ
リン酸アンモニウム水溶液（ｐ）Ｉ　９．７）とアセト
ニトリルとの混液（混合容積比８５：１５）；溶離液ｌ
Ｃは０．５％リン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ９，１）
とアセトニトリルとの混液（混合容積比７６　：　２４
）である１反応用溶液４としてはβ−ＮＡＤ’を５＋＋
＋Ｈの濃度で、レザズリンナトリウムをｌＸｌ０−’％
の濃度で、εＤＴＡ・２Ｎａを１１の濃度で、そして２
−メルカプトエタノールを０．０５％の濃度で含有する
０、５％リン酸アンモニウム溶液（ｐＨ９，５）を用い
た。試料として、コール酸、ウルソデオキシコール酸、
ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸およびリトコ
ール酸の５種類について、それぞれ遊離型、グリシン包
含型およびタウリン包含型の３種類、計１５種類の胆汁
酸を準備した。これらの胆汁酸をそれぞれ各１０μｍｏ
ｌ／ｊ！ずつ含有する試料溶液を調製した。

定ｔｌｉＬｉｔポンプ１３　（Ｔｌ１ｌｌ　ＲＣＩＴＡ
ｌ’ｌＩ［；　ＪＡＳＣＯ社製）により溶離液１ａを１
ｍｌ／分の流速で流しながら、上記試料溶液５μｌを試
料注入器２より注入した０分離カラム３からの溶出液に
反応用溶液４を定流量ポンプ４２　（ＬＣ−３Ａ、島津
製作所社製）で０．６ｍ１７分の流速で注入して混合し
、固定化３α−Ｈ５Ｄカラム５および固定化ジアホラー
ゼカラム６に順次導き、酵素反応を行わせた。試料溶液
注入４分後にグラジェント用電磁弁１２を切り換えて溶
離液として１ｂが供給されるようにした。さらに３１分
後にグラジェント用電磁弁１２を切り換えて溶離液ＩＣ
が供給されるようにした。これを、励起波長３４０ｎｓ
、螢光波長４６０ｎｍの螢光検出器？　（ＲＦ５３０；
商品名）を用いてレンジ１６で検出し記録計７１で記録
した。

得られたチャートを第２図に示す、第２図において、と
−クａはコール酸、ビークｂはグリココール酸、ビーク
Ｃはタウロコール酸、ビークｄはウルソデオキシコール
酸、ビークｅはグリコウルソデオキシコール酸、ビーク
ｆはタウロウルソデオキシコール酸、ビークｇはケノデ
オキシコール酸、ビークｈはデオキシコール酸、ビーク
ｉはグリコケノデオキシコール酸、ビークｊはグリコデ
オキシコール酸、ビークにはタウロケノデオキシコール
酸、ビークｌはタウロデオキシコール酸。

ビークｍはリトコール酸、ビークｎはグリコリトコール
酸、そしてビーク０はタウロリトコール酸に相当する。

土較五 （Ａ）分離カラムの調製：実施例１　（Ａ）項と同様で
ある。

（Ｂ）固定化３α−）１５０カラムの調製：実施例１　
（Ｂ）項と同１兼である。

（Ｃ）胆汁酸の分析：反応用溶液中にレザズリンナトリ
ウムを含有せず、かつ固定化ジアホラーゼカラムを連結
しなかったこと以外は実施例１　（Ｄ）項と同様に行っ
た。固定化３α−）１５０カラムから溶出する１−９Ｘ
ｌ液中に含有されるＮＡＤ）Ｉの螢光を測定した。螢光
光度計のレンジが１６ではビークはほとんど観察されな
かった。レンジを５１２とし。

可変２分析損作を繰り返したところ第２図と同様なチャ
ートが得られた。この結果から実施例の方法は本比較例
に比べて約ｌＯ倍以上感度の高いことが判明した。

（発明の効果） 本発明方法によれば、このように、液体クロマトグラフ
ィー法を利用し遊離型、アミノ酸抱合型など各種の胆汁
酸を含有する試料溶液から各胆汁酸を分離して、これを
効果的に分析することが可能である０分析窓度が高いた
め少量の試料で微量胆汁酸をも正確に分析することがで
きる。使用する試料が少量でよいため１分離用カラムの
汚染が軽減され、長時間連続して分析が可能である。そ
のため分析が安価になされうる。このような方法により
血清や尿中の胆汁酸の分析を行い、その分画パターンか
ら各種疾病の早期診断に役立てることも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法による胆汁酸の定量方法の一実施例
を示すフローダイヤグラム、そして第２図は実施例１に
おいて記録された記録計７１のチャ−トである。 ｌ・・・溶離液、２・・・試料注入器、３・・・分離カ
ラム。 ４・・・反応用溶液、５・・・固定化胆汁酸脱水素酵素
カラム、６・・・固定化ジアホラーゼカラム、７・・・
螢光検出器。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）胆汁酸混合物を含有する試料溶液を液体クロ
   マトグラフィーにより各胆汁酸成分に分離する工程、 （ｂ）該分離された各胆汁酸成分を含有する溶出液にニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドとレザズリンおよ
   び／またはレザズリンアルカリ塩とを含有する反応用溶
   液を混合させる工程、（ｃ）（ｂ）項で得られた混合液
   を固定化胆汁酸脱水素酵素および固定化ジアホラーゼを
   同一または個別に充填したカラムに導く工程、および（
   ｄ）（ｃ）項のカラム内でレザズリンがジアホラーゼの
   存在下で還元されて生成し、該カラムからの溶出液中に
   含まれるレゾルフィンの光吸収または螢光を測定する工
   程。 を包含する胆汁酸の分析方法。 ２、前記胆汁酸脱水素酵素が３α−ヒドロキシステロイ
   ドデヒドロゲナーゼ、３β−ヒドロキシステロイドデヒ
   ドロゲナーゼ、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
   ゲナーゼおよび７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
   ナーゼでなる群から選択される少なくとも一種である特
   許請求の範囲第１項に記載の分析方法。