JPS6127901A - 生体を保存する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はたん白質系保護剤を添加した水性液を用いて生
体細胞、その集合体または臓器などの生体を０℃以下で
安定に保存する方法に関する。

［従来の技術］ 生体細胞、その集合体または臓器などの生体を保存する
方法としては、常温で保存する方法や簡単な方法である
低温で保存する方法がある。

しかしながら前者の方法では、培地の変換、微生物によ
る汚染防止、細胞の移植などという非常に繁雑な操作が
必要である。

また後者の方法でも、氷晶の形成による細胞などの破壊
が著しく、保存性が充分良好であるとはいえない。

このような細胞の破壊を緩和するため、ジメチルスルホ
キシド（ＤＨ３Ｏ）やグリセリンを保存液に添加する方
法が考えられ、現在一般に使用されている。しかし、こ
のような方法をとっても生体の保存性は不充分であり、
長期間、細胞破壊などをおこさず保存することができな
い。その上、これらの添加剤は１０％またはそれ以上の
高濃度で保存液中に存在させなければならないため、保
存後回使用する際の保護剤の除去に手間がかかり、煩雑
であり、取扱いの面においても欠点を有している。さら
にＤＨ３Ｏのばあいには、細胞毒性の現われることがあ
るなどの欠点をも有している。

臓器を保存するばあいにおいても、凍結保護法では細胞
の損傷が著しく、また潅流法であっても従来の数℃以上
での潅流法では４〜５日程度以上の保存は困難とされ、
たとえば犬の腎臓を凍結潅流法で保存する。ばあいには
１００〜１２０時間程度の保存に関する報告があるにす
ぎない。

［発明が解決しようとする問題点」 本発明は、常温で生体を保存するばあいに必要とされる
繁雑な操作や、低温で保存、するばあいに生じる細胞な
どが破壊し、保存性が不充分であるというような問題を
解決し、簡単な操作で長期間、生体細胞、その集合体、
組織、臓器などの生体を保存しようとするものである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、たん白質系保護剤を添加した水性液を用いて
０℃以下で安定に生体を保存する方法に関する。

［実施例］ 本発明に用いるたん白質系保護剤とは、単独または適正
なＩ媒とともに水に可溶であり、氷晶核や氷の生成、成
長を抑制しうるちのであればとくに限定はない。このよ
うなたん白質系保護剤の代表例としては、糖たん白質、
高級アルコール、脂肪酸またはアミノ酸エステルで修飾
したたん白質などがあげられる。これらの物質は、水性
液に添加することにより、凝固点を降下あるいは氷の成
長を抑制すると同時に、保存性を上昇させる作用を有す
る。

前記部たん白質の具体例としては、たとえば卵白アルブ
ミン、ムコたん白質などがあげられるが、これらに限定
されるものではない。

このような糖たん白質は、通常、動植物から採取される
。

前記高級アルコール、脂肪酸またはアミノ酸エステルで
修飾したたん白質（以下、ＭＰという）は、たとえばカ
ゼイン、ゼラチン、アルブミン、ラクトアルブミン、大
豆たん白質、魚肉たん白質などのたん白質を酵素を用い
てまたは通常の化学的方法により高級アルコール、脂肪
酸またはアミノ酸エステルで修飾され製造される。前記
たん白質がカゼインなどのように水に溶けにくいたん白
質であるばあいには、水溶性を増す目的でアシル化、サ
クシニル化などして用いてもよい。

前記高級アルコールとしては、炭素数６〜３゜の脂肪族
アルコールがあげられ、その具体例とし−（はオクチル
アルコール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール
、ステアリルアルコールなどがあげられる。

前記脂肪酸としては、炭素数４〜３ｏの脂肪酸があげら
れ、その具体例としてはオクチル酸、ラウリン酸、パル
ミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸などがあげられる
。

前記アミノ酸エステルを構成するアミノ酸としては、た
とえばロイシン、ノルロイシン、アラニンなどの疎水性
を有するアミノ酸が好適に用いられるが、これらに限定
されるものではない。

前記アミノ酸エステルを構成するアルコールとしては、
脂肪族アルコールが好ましいが、これらに限定されるも
のではない。脂肪族アルコールのうちでは炭素数４〜１
６のものがさらに好ましく、炭素数が小さくなると製造
されるＨＰの起泡力が大きくなり、炭素数が大きくなる
と乳化力が大きくなる傾向が生ずる。

本発明に用いるＨＰの具体例としては、たとえばサクシ
ニルカゼインロイシンドデシルエステル、ゼラチンロイ
シンデシルエステル、ゼラチンロイシンドデシルエステ
ルなどがあげられ、たとえば分子量が２０００〜４００
００ダルトンのものが修飾しやすい。

たん白質をアミノ酸エステルで修飾するのに酵素を用い
るばあいには、たとえばパパイン、ブロメライン、フィ
シンなどで代表されるチオ−ルブロテアーゼが好適に使
用される。

酵素を用いてたん白質をアミノ酸エステルで修飾するば
あいの具体例としては、たとえば渡辺ら、Ｊ、Ｆｏｏｄ
　Ｓｃｉ、、赳１４６１〜１４６９（１９８１）に記載
されているごとく、たん白質とアミノ酸エステルとを水
性溶媒中で酵素反応させることによりえられる。その際
の水性溶媒としては、たとえば水−アセトン系、水−エ
タノール系などを使用し、２−メルカプトエタノール、
システィンなどのチオール保護剤を使用して行なうのが
、反応系を均一にし、酵素反応を効率的に進めるなどの
面から好ましい。このような方法は容易に行なうことが
できるので、工業的規模で多最に生産することが可能で
ある。

反応条件はたん白質の種類、酵素の種類、アミノ酸エス
テルの種類などによって適宜選択すればよいが、通常、
反応系をｐＨ７〜１０１．：ｌｌ整し、５〜５０℃で０
．２５〜２４時間反応させればよい。

ＭＰを科学的方法により製造するばあいの具体例として
は、たん白質と高級アルコール、脂肪酸またはアミノ酸
エステルとの混合物を超音波処理したり、脂肪酸をエス
テルの形にしてエステル交換反応によりたん白質に共有
結合させる方法が例示できるが、このような方法に限定
されるものではない。

本発明の方法を適用しうる臓器、生体細胞またはその集
合体などである生体としては、たとえＩシ血球などの生
体細胞、ランゲルハンス島など生体細胞の集合体、筋組
織などの組織、臓器などの器官などがあげられるが、こ
れらに限定されるものではない。

つぎに本発明の方法を用いた保存方法について説明する
。

たとえば蒸溜水のような水１００部（重量部、以下同様
）を含む液体に対して、好ましくは０．０１〜３０部、
さらに好ましくは０，０３〜５部の糖たん白質またはＨ
Ｐを添加した水性液、好ましくは水溶液に生体を浸漬し
、０℃以下、好ましくは生体を不凍状態で保存するばあ
いには−２〜−１０℃、冷凍して保存するばあいには通
常−４０℃以下にする。

糖たん白質またはＭＰを含まない水性液を用いて生体を
０℃程度未満の温度で保存しようとすると、急速な氷の
成長のため生体が著しく損傷されるというような問題が
生ずるが、糖たん白質またはＭＰを添加すると、その機
序は明確には解明されていないが、氷点をかなり低温、
少なくとも最大氷晶生成帯を下まわる温度である一５℃
まで下げることができ、また生体を冷凍するばあいでも
氷の成長速度を抑止できるので細胞組織などの傷みが少
ない。

それゆえ糖たん白質または肝を用いると、水性液を０℃
以下の低温で保存しても、問題が生じにくくなり、簡単
な操作で長期間、変性などをほとんどおこすことなく生
体を保存することができるようになる。なお糖たん白質
またはＨＰの添加量が、水１００部に対して０．０１部
未満になると、水性液の氷点を降下させたり、氷の成長
を抑止する降下が小さく、また３０部をこえて使用して
も、効果は変らなくなる。

臓器を保存するばあいに、前記水性液などを潅流させる
と系内の温度を均一に保つことができ、したがって臓器
内の温度分布も少なくなり、長期間の保存がしやすくな
る。

本発明に用いる糖たん白質またはＭＰなどのたん白質系
保護剤は、これ単独で用いてもよいが、たとえば食塩な
どの塩類、ショ糖、ブドウ糖、果糖などの糖類、ソルビ
トール、マルチトールなどの糖アルコール類、ＤＨ８Ｏ
、グリセリンなどの既存の保護剤と併用すると、単独で
使用するばあいよりもさらに保存効果を増大させうる。

つぎに本発明の方法を実施例にもとづき説明する。

製造例１ １０ｉＨのシスティンと２０％（重量％、以下同様）の
エタノールを含む１Ｍ炭Ｉｌ緩衝液（ｐＨ９）に、濃度
が３３％になるように市販のゼラチンを加え、し−ロイ
シンドデシルエステルをゼラチン１００ｇに対し、ｏ、
　ｉＨ加え、さらにパパインをゼラチン１００ｇに対し
て１ｇ加えた。そののち３７℃で１５分間反応させたの
ち、１Ｎ塩酸を加えてｐｔｌを１に下げて酵素反応を停
止させ、流水透析で非透析性画分をとった。非透析性画
分の凍結乾燥物をジクロロメタンとアセトンで洗浄して
平均分子量７３００ダルトンの精製酵素修飾ゼラチン（
以下、ＥＲＧ−１２という）をえた。

実施例１〜３および比較例１〜３ ラット膵臓よりコラ−ゲナーゼ法により膵島を１００〜
１０００個採集し、２１のＲＰＨＩ−１６４０培地（１
０％仔牛血清、ペニシリン５００μｏ／＋＋　１、スト
レプトマイシン５００μａｕｒａ　Ｉを含む）に分散さ
せた試料を２個調製した。

一方の試料には製造例１で合成したＥＨＧ−１２を５％
になるように添加し、他方には口Ｈ３Ｏを１０％になる
ように含有させた。そののち、それぞれの試料を２０℃
で２０分間放置したのち、プログラムフリーザーにより
０．５℃／ｉｉｎの割合で降温させ、−４０℃にした。

そののち−１８６℃まで１℃／　ｓｉｎで降温させて保
存した。

３０日後、膵島を３７℃の温浴中で溶解し、ショ糖溶液
により階段希釈したのち、培地で洗浄し、ペトリ皿上で
３７℃のＣＯ２−インキュベーターで７日間培養した。

培養後３種の刺激剤を含むクレブスヘンゼラ、イト炭酸
緩衝液（にｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ　ｂｉｃａｒ
ｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ＫＨＢＢ））に移し、培地
中に放出されたホルモン活性を、また融解直後の膵島を
トルイジンブルーで染色することにより、膵島の生存を
観測した。それらの結果を第１表および第２表に示す。

［以下余白コ 第　　　２　　　表 実施例４および比較例４ 製造例１でえられたＥＨＧ−１２を０．５ｚ添加して、
実施例１と同様な方法により１０９／ｉｆの赤面法を凍
結保存し、融解後の血球数およびトルイジンブルー染色
自球数をｌ−−マの血球計算盤により測定した。

比較例としてグリセリンを１０％添加した水溶液を用い
たばあいについて、上記と同様にして融解後の血球数お
よびトルイジンブルー染色血球数を測定した。

それらの結果を第３表に示す。

実施例５ １５〜２５Ｋｇの雑犬をベンドパルビタール麻酔下に気
管挿管してレスビレ−ターによる自動調節呼吸を行ない
、腎を摘出した。摘出した腎はヘパリン１．０００１１
　／２００ｍ１および２％キシロカインを加えた４℃の
ザックス（Ｓａｃｋｓ）　ＩＦ液で洗った。該腎の重量
測定後、９００１のへルツァ−（Ｂｅｌｚｅｒ）液（ｐ
Ｈ７，７５±０．０５．４℃および一２℃）をＨＯＸ−
１００型拍動性潅流装置により潅流させた。なお−２℃
の潅流液中にはＥＲＧ−１２が０．５％含まれていた。

また腎動脈圧は約６０ｉｉＨｇで潅流した。静脈側流出
液を一定時間毎にサンプリングし、下記方法により組織
検査を行なった。

それらの結果を第４〜６表に示す。

（光学顕微鏡観察） ■所定温度で潅流した尿細管を光学顕微鏡（４００倍）
で観察し、組織の変化の有無をみる。

■所定温度で潅流した糸球体係蹄の毛細血管内ＰＡＳ陽
性物質の有無をみる。

（電子顕微鏡観察） 所定温度で潅流した糸球体内皮細胞および上皮”細胞の
空胞変性、係蹄血管顆粒状または膿胞状物質、糸球体基
底膜量大を電子顕微Ｈ（ｉｏｏ。

倍）で観察。

［以下余白］ 前記結果から、４℃潅流では２〜４日後には既に腎臓に
浮腫が見られ、かつ組織学的にも明瞭な変化が生じ、組
織の破壊が進みつつあるのに対し、ＥＲＧ−１２を添加
したものを一２℃でＮ流したばあいでは８日問潅流後で
もまだ良好な状態を保っていることがわかる。

［発明の効果］ 以上説明したように本発明の方法によると、形態的にも
機能的にも生体を損傷することなく長期間保存すること
ができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　たん白質系保護剤を添加した水性液を用いて０℃以
   下で安定に生体を保存する方法。 ２　前記生体が臓器、生体細胞またはその集合体である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３０℃以下の水性液体を潅流し、安定に生体を保存する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４　前記たん白質系保護剤が高級アルコール、脂肪酸も
   しくはアミノ酸エステルで修飾したたん白質または糖た
   ん白質である特許請求の範囲第１項記載の方法。