JPS61282099A - １２−ケト−３α，７α−ジヒドロキシコラン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はコール＠（３α、７α、１２α−トリヒドロキ
シ−５β−フラン酸）から、胆石溶解剤としであるいは
利胆剤ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣ）　（７）合成
原料として有用なケノデオキシコール酸（ＣＤＣ）の製
造中間体である１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシ
−５β−フラン酸（以下１２−ケトコール酸と略称する
）を、微生物を用いて効率よく製造する方法に関する。

（従来の技術） 従来、微生物を用いてコール酸よシ１２−ケトコール酸
を製造する方法には、アルスロバクタ−属の微生物を用
いる方法（特開昭５７−８７９６号など）、ブレビバク
テリウム属の微生物を用いる方法（特開昭５６−２９９
９８号など）などが公知である。また、本発明者等も、
ミクロコツカス属及びコリネバクテリウム属に属する特
定の微生物が培地中に添加されたコール酸塩よシ１２−
ケトコール酸塩を生成することを見出し特許出願をした
。

（特願昭５７−２２７４８７号等） （発明が解決しようとする問題点） しかし、これらのいずれの方法においても短時間で高収
量、高純度の１２−ケトコール酸を得るのは困難であシ
、本発明者等の知見によれば、培地中にコール酸塩を添
加し、培養して１２−ケトコール酸塩を得る方法では１
２−ケトコール酸の生成速度、残存するコール酸の量、
得られる１２−ケトコール酸の着色度合等におのずと限
界があり、効率よい方法とは判断できない。本発明の目
的は、高濃度のコール酸から短時間で高収量、高純度の
１２−ケトコール酸を得ることにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、長年、コール酸から１２−ケトコール酸
を生成する微生物及びその微生物を用いた１２−ケトコ
ール酸の製造方法について研究を重ねてきた。その結果
、ミクロコツカス属に属する特定の微生物を培養し、そ
の菌体または菌体を含む培養液を、コール酸及び／又は
その塩を含む緩衝液と混合して反応させ、反応液中に１
２−ケトコール酸及び／又はその塩を生成せしめこれを
採取する方法によシ高収量、高純度の１２−ケトコール
酸が得られることを知見し、本発明を完成するに致った
。

、　本発明で使用される微生物には、ミクロコッカスＳ
Ｄ−１０１（微工研菌寄第６８４１号）及び、その突然
変異株並びに遺伝子組替え株等であるが、特にこれらの
微生物に限定するものでなく、ミクロコツカス属に属す
る微生物でコール酸及び／又はその塩よシ１２−ケトコ
ール酸及び／又はその塩を生成するものであれば特に限
定はない。

本発明で使用される培地は、前記微生物が培養によ）増
殖し得るものならば任意のものでよく、例えば炭素源と
してはグルコース、フラクトース、シュクロース、酢酸
１エチルアルコール、グリセリンなど、窒素源としては
一’！ｆトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイー
プリカー等の有機窒素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム等の無機窒素が用いられる。また、このほかにリ
ン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、硫酸マグネシウムなどの無機塩が添
加される。

本発明における培養は好気的条件下に例えば通気攪拌法
や往復振盪法によって培養することができる。温度は２
０〜３８℃のいずれでもよいが、好ましくは２２〜２７
℃である。この範囲よシ低温では微生物の生育速度が遅
く、またこの範囲よシ高温では、微生物がコール酸及び
／又はその塩から１２−ケトコール酸及び／又はその塩
を生成する変換活性が著しく悪化する。培養時の声は６
．０〜９．０のいずれでもよいが、好ましくは培養初期
にｐＨ７，０〜８．０とし、成る程度培養が進んだ段階
でｐＨ５，８〜６．２とすることが適当である。この範
囲よシ低−では微生物の生育遺産が遅（、寸たこの範囲
よシ高ＰＨでは微生物がコール酸及び／又はその塩から
１２−ケトコール酸及び／又はその塩を生成する変換活
性が悪化する。培養時間は８〜３０時間程度で実施する
。

菌体は培養液を遠心分離などの方法で処理し、集菌した
のち、あるいはさらに生理食塩水等で洗浄したのち、コ
ール酸及び／又は含む緩衝液に懸濁してもよく、集菌せ
ずに菌体の浮遊した培養液とコール酸及び／又はその塩
を含む緩衝液を直接混合してもよい。得られる生成物は
集菌ののち懸濁して反応させたもののほうが着色が少な
いが、工業的には集菌せずに混合する方法がよシ容易で
ある。

本発明の変換反応時のコール酸及び／又はその塩の濃度
は５〜５００１１／Ｉｔでよく、反応時間、操作法など
の条件を考慮し、１０ｇ〜１００１１７！程度が好まし
い。用いる緩衝液はリン酸２水素カリウムとリン酸１水
素カリウムなどのリン酸塩、トリヒドロキシメチルアミ
ノメタン塩酸塩、ホウ酸ナトリウムなどのホウ酸塩、四
ホウ酸ナトリウムなどの四ホウ酸塩等でよく、変換反応
時の濃度は１０ミリモル／！〜５００ミリモル／！でよ
いが、特にホウ酸塩、四ホウ酸塩を１０ミリモル／！〜
５００ミリモル／ｊの濃度で用いるのが好ましい。ホウ
酸塩、四ホウ酸またはそれらの塩の添加により、副生物
の生成は極めて低い割合におさ、見られるが、リン酸塩
、トリスヒドロキシメチルアミノメタンの塩では副生物
が少量生成する。

変換反応時のＰＨはｐＨ６，７〜９．０でよいが、声６
．７〜７．２が好ましい。緩衝液にホウ酸、四ホウ酸及
び／又はその塩を用いた場合でもこの範囲よシ高−では
副生物が少量生成する。この範囲より低声ではコール酸
が析出し、変換活性が失なわれる。−の調整は水酸化ナ
トリウム等のアルカリ金属水酸化物の水溶液と、塩酸、
硫酸等の酸で行なう。変換反応時の温度は２０〜４５℃
でよいが、３５〜４１℃が好ましい。この範囲よシ低温
では残存するコール酸及び／又はその塩が多く、この範
囲よシ高温では変換活性の失活が短時間で起こる。変換
反応の時間はコール酸濃度等の条件にょって異なるが２
〜７２時間程度で実施する。

反応液からの生成物すなわち１２−ケトコール　　　酸
の回収は公知の方法によって収率よく行なうことができ
る。例えば、反応液のＰＨを酸の添加によシ低下させ得
られた１２−ケトコール酸の沈澱をろ過後、乾燥しても
よく、−を低下させた後、酢酸エチルなどの有機溶媒に
よって１２−ケトコール酸を抽出した後、溶媒を留去し
てもよい。

（作　用） 本発明においては、微生物をコール酸塩を含む培地中で
培養させることなく、コール酸及び／又はその塩を含ま
ない培地中で培養し、その菌体をコール酸及び／又はそ
の塩を含む緩衝液に懸濁又は混合し反応させる方法によ
シ、微生物のコール酸及び／又はから１２−ケトコール
酸及び／又はへの変換活性を最も高らしめる条件での培
養を可　　　□能とし、また変換反応時の温度、声等の
条件を正確に制御することを可能としたため、短時間で
高収量、高純度の１２−ケトコール酸を得ることができ
るものである。

培養温度は２２〜２７℃の範囲でコール酸及び／又はそ
の塩から１２−ケトコール酸及び／又はその塩を生成す
る酵素の菌体内での合成が最も活発であるものと推定さ
れる。また培養時声も−５，８〜６．２で当該酵素の合
成が最も活発であると推定される。

また、変換反応温度については、高温はどコール酸又は
その塩と１２−ケトコール酸又はその塩との化学平衡が
、１２−ケトコール酸又はその塩側に存在すると推定さ
れ、コール酸及び／又はその塩から１２−ケトコール酸
及び／又はその塩を生成する酵素の至適温度が４０’Ｃ
付近であシ、コール酸及び／又はその塩から副生物を生
成する酵素及び１２−ケトコール酸及び／又はその塩か
ら副生物を生成する酵素の至適温度は３７℃よシ低温に
あると考えられる。

°変換反応時の−については、コール酸及び／又はその
塩から１２−ケトコール酸及び／又はその塩を生成する
酵素の至適−がｐＨ６，８付近に存在しコール酸及び／
又はその塩から副生物を＃虎ナス酵素及び１２−ケトコ
ール酸及び／又はその塩から副生物を生成する酵素の至
適…は７．２〜７．５にあるものと考えられる。

さらに、ホウ酸、四ホウ酸及び／又はその塩はｐＨ５，
８〜６．２の範囲でコール酸及び／又はその塩から副生
物を生成する酵素及び１２−ケトコール酸及び／又はそ
の塩から副生物を生成する酵素を強く阻害するものと推
定される。

（効　果） 本発明によればミクロコツカス属に属する特定の微生物
を培養しその菌体あるいは菌体を含む培養液をコール酸
及び／又はその塩を含む緩衝液に懸濁、あるいは混合し
、反応させることにょシ、高濃度のコール酸及び／又は
その塩よυ高収量、高純度の１２−ケトコール酸を得る
ことが可能である。さらに前記の特定温度範囲、特定声
範囲、特定緩衝液を用いればその効果は著しい。さらに
また、このような微生物菌体を一種の触媒として用いる
方法は、菌体の〈シ返しの使用による経費の節減、ある
いは他の微生物において公知の方法による菌体の固定化
などの可能性を強く示唆するものである。

以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定さ
れるものではない。

実施例１ 下記組成の培地を５にジャーファーメンタｉに入れ、１
２０℃４０分のオートクレーブ加熱滅菌を行なった。冷
却後、２規定水酸化ナトリウム溶液によシーを７．２に
調整し、無菌的にグルコース４０ｇを加えた。この培地
に、予め同一培地で５００ｄ三角フラスコによシ前培養
しておｈたミクロコッカスＳＤ−１０１の培養液５Ｑｍ
を加え、２５℃で２４時間培養した。菌の生育とともに
声は低下し、ｐＨ６，０になった時点から１４チアンモ
ニア水の添加を開始し、−を６．０〜６．２に保った。

次に、との培養液１！をとり、コール酸４０．９を含む
２００ミリモル／！のホウ酸緩衝液（声７．０）１！に
加え、声を７．０にした。この反応液を３７℃で２６時
間通気攪拌したのち、遠心分離した。

上清の−を１規定塩酸でｐＨ２−まで降下させ、生成物
を析出させた。吸引ろ過後、風乾して１２−ケトコール
酸を得た。変換反応の進行度合は、反応開始後冬時間の
反応液を下記の方法で分析することによシ確かめられた
。結果は表１に示す通りである。

培地組成 グルコース　　２チ（別に滅菌して添加）硫酸アンモニ
ウム　　　０．２％ リン酸水素１カリウム　０．２チ リン酸水素２カリウム　０．５チ 酵母エキス　　　　　　０．２チ 硫酸マグネシウム　　　０．０５チ 硫酸第−鉄　　　　　　４　ｐｐｍ 硫酸マンガン　　　　　４　ｐｐｍ 水道水 分析方法 液体クロマトグラフによる定量。試料をＣＤＣを内部標
準とした修正内部標準法及び単純面積百分率法で定量し
た。

カ　　　ラ　　　ム　：　　５ｈｏｄｅｘ　　ＯＰＳ　
　ｐａｋ　　Ｆ　４１１ポ　ン　プ；日本分光（株）製
ＢＩＰ−１型ディテクタ；　ｇｈｏｄｅｘ　−ＲＩ　Ｓ
Ｅ　−３１型移　動　相；７５：２５メタノール−水混
合液、リン酸０．０２モル／！ カラム温度；３０℃ 送　　　　液；　　ｌ　Ｍ／ｍｉＨ 試料量；２０μを 表　　１ 実施例２ 反応温度を２４時間目から４１℃にしたほかは全て実施
例１と同様に行なった。結果は表２に示すとうシであっ
た。

表　　２ 実施例３ 実施例１と同じ方法で培養した培養液１！をとシ、遠心
分離によシ集菌してコール酸４０．Ｆを含む１００ミリ
モル／！のホウ酸緩衝液ＩＪに菌体を懸濁し−を７．０
とした。その後実施例２と同じ方法で反応させた。結果
は表３に示すとうりであった。

表　　３ 実施例４ 培養温度を３５℃にしたほかは全て実施例１と同様に行
なった。結果は表４に示すとうシであった。

表　　４ 実施例５ 培養温度を２７℃にしたほかは全て実施例１と同様に行
なった。結果は表５に示すとうシであった。

表　　５ 実施例６ 培養時−を７，０に保ったほかは全て実施例１と同様に
行なった。結果は表６に示すとうりであった。

表　　６ 実施例７ 反応にコール酸４０Ｉを含む２００ミリモル／！の四ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）１７を用いたほかは、全て実
施例１と同様に行なった。結果は表７に示すとうシであ
った。

表　　７ 実施例８ 反応にコール酸４０ｇを含む１モル／！のホウ酸緩衝液
（ｐＨ７，０）１７を用いたほかは全て実施例１と同様
に行なった。結果は表８に示すとうシであった。

実施例９ 反応にコール酸４０．９を含む２００ミリモル／！のリ
ン酸緩衝液（ＰＩ−１７，０）ｌ＃を用いたほかは全て
実施例１と同様に行なった。結果は表９に示すとうシで
あった。

実施例１０ 反応にコール酸４０．９を含む２００ミリモル／！のト
リスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液（ｐＨ７，０
）　、Ｉ　Ａを用いたほかは全て実施例１と同様に行な
った。結果は表１０に示すとうシであった。

表１０ 実施例１１ 反応時声を７．３に保ったほかは全て実施例１と同様に
行なった。結果は表１１に示すとうシであった。

表１１ 実施例１２ 反応時−を６．５に保ったほかは全て実施例１と同様に
行なった。結果は表１２に示すとうシであった。

表１２ 実施例１３ 反応温度を３２℃にしたほかは全て実施例１と同様に行
なった。結果は表１３に示すとうシであった。

実施例１４ 反応温度を４５℃にしたほかは全て実施例１と同様に行
なっな。結果は表１４に示すとうシでちった。

表１４ 実施例１５ 反応にコール酸１００Ｉを含む２００ミリモル／！のホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用い、反応時間を４８時間
まで延長したほかは、全て実施例１と同様に行なった。

結果は表１５に示すとうシであった０ 表１５ 実施例１６ 反応にコール酸３００．９を含む２００ミリモル／！の
ホウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用い、反応時間を７２時
間まで延長したほかは全て実施例１と同様に行なった。

結果は表１６に示すとうりであった。

表１６ 比較例１ 実施例１に示す培地に、ｍ廖２０１ｒＫｉ／ｄ）−１ｘ
Ａようにコール酸を加えて、−を７．０としてから滅菌
し、実施例１に示す方法で前培養した同−菌を同−量加
え、３５℃で２４時間培養した。培養冬時間の培地中の
コール酸及び１２−ケトコール酸の濃度は表１７のよう
であった。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ミクロコッカス属に属し、コール酸及び／又はそ
   の塩から、１２−ケト−３α，７α−ジヒドロキシコラ
   ン酸及び／又はその塩を生成する能力を有する微生物を
   栄養培地で培養し、その菌体又は菌体を含む培養液をコ
   ール酸及び／又はその塩を含む緩衝液と混合して反応さ
   せ、反応液中に１２−ケト−３α，７α−ジヒドロキシ
   コラン酸及び／又はその塩を生成せしめ、これを採取す
   ることを特徴とする１２−ケト−３α，７α−ジヒドロ
   キシコラン酸及び／又はその塩の製造方法。
2. （２）用いる微生物がミクロコッカスＳＤ−１０１また
   はその変異株である特許請求の範囲第１項記載の製造方
   法。
3. （３）緩衝液がホウ酸、四ホウ酸及び／又はその塩であ
   る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
4. （４）培養温度が２２〜２７℃、培養時ｐＨがｐＨ５．
   ８〜６．２である特許請求の範囲第１項記載の製造方法
   。
5. （５）反応温度が３５〜４１℃、反応時ｐＨがｐＨ６．
   ７〜７．２である特許請求の範囲第１項記載の製造方法
   。