JPH0851989A - マレイン酸の異性化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 マレイン酸イソメラーゼ含有菌体又はその処
理物を、マレイン酸を含有する温度５〜２０℃の水溶液
に作用させフマル酸を生成せしめることを特徴とするマ
レイン酸の異性化方法。 【効果】 本発明の方法によれば、酵素法により、効率
よく、かつ高収率でマレイン酸を異性化し、フマル酸を
製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マレイン酸の異性化法
に関し、さらに詳しくは、マレイン酸イソメラーゼ含有
微生物又はその処理物にマレイン酸を作用させる際に温
度５〜２０℃の低温で作用させることを特徴とするマレ
イン酸の異性化法に関する。マレイン酸の異性化物であ
るフマル酸は、アスパラギン酸、リンゴ酸等ファインケ
ミカルズの原料として有用な有機酸である。

【０００２】

【従来の技術】マレイン酸の異性化方法としては、主に
化学的方法が提案されている（米国特許第 2,816,923
号、同第 2,955,136号、同第 3,332,992号）が、反応平
衡によりフマル酸への変換率が制約を受けること、高温
反応であるためにマレイン酸あるいはフマル酸の劣化が
起こり、副生成物を生成し、収量が低くなるなどの問題
点を有している。

【０００３】一方、酵素法による異性化に関しては、マ
レイン酸イソメラーゼがマレイン酸を異性化してフマル
酸を生成することが知られている〔K.Otsuka Agric.Bio
l.Chem. 、25、(9) 、726 （1961）〕ものの、酵素学的
性質について検討されているに過ぎず、産業上の応用の
観点からの検討はまったくなされていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、あらたな観
点から効率よくマレイン酸を異性化する方法の提案を目
的としてなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、マレイン酸イソメ
ラーゼ含有微生物又はその処理物を、温度５〜２０℃の
低温でマレイン酸を含有する水溶液に作用させれば、効
率的にマレイン酸の異性化ができることを見いだし、本
発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、マレイン酸イソメラ
ーゼ含有微生物又はその処理物を、マレイン酸を含有す
る温度５〜２０℃の水性溶液に作用させフマル酸を生成
せしめることを特徴とするマレイン酸の異性化方法であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００７】本発明の方法に用いられる微生物は、マレ
イン酸を異性化してフマル酸を生成しうる能力を有する
微生物、すなわちマレイン酸イソメラーゼを含有する微
生物（以下これを「マレイン酸イソメラーゼ含有微生
物」と略称することがある）であれば特に制限がなく、
例えばマレイン酸イソメラーゼを含有するアルカリゲネ
ス属、シュードモナス属、キサントモナス属に属する微
生物があげられる。具体的には、アルカリゲネス・フェ
カリス（Alcaligenes faecalis）IFO 12669 、同IFO 13
111 、同IAM 1473、アルカリゲネス・ユウトロフス（Al
caligenes eutrophus ）IAM 12305、シュードモナス・
フルオレッセンス（Pseudomonas fluolescens ）ATCC 2
3728、キサントモナス・マルトモナス（Xanthomonas ma
rutomonas）ATCC 13270 等を例示することができる。こ
れらの微生物は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）、東京
大学分子細胞生物学研究所細胞・機能高分子総合センタ
ーＩＡＭカルチャーコレクション、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）等から入手可
能である。

【０００８】さらに、上記微生物由来のマレイン酸イソ
メラーゼ遺伝子を組換えし、マレイン酸イソメラーゼ活
性を増強させた遺伝子組換え微生物を用いるもこともで
きる。マレイン酸イソメラーゼ含有微生物の培養は、そ
れ自体既知の通常用いられる、肉エキス、酵母エキス、
ペプトン等の天然栄養源を添加した培地で行うことがで
きる。該培地には、必要に応じ、窒素源として、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝
酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニア；無機物として
は、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガ
ン、亜鉛、銅等を添加して培養することもできる。

【０００９】また、マレイン酸の異性化能を高めるため
には、培地中にマレイン酸、又はマロン酸を添加するこ
とが望ましい。マレイン酸及びマロン酸の添加濃度は１
０〜２００ｍＭ 、好ましくは５０〜１００ｍＭ の範囲
内が適当である。上記マレイン酸イソメラーゼ含有微生
物の培養は、通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、
培養温度は２５〜４０℃、好ましくは２８〜３５℃が適
当である。培養途中のｐＨは６〜９付近とすることがで
き、培養中のｐＨの調整は、酸又はアルカリを添加して
行うことができる。

【００１０】本発明の方法は、上記の如く微生物を培養
することにより得られる培養物から遠心分離等により回
収された菌体又は菌体を必要により固定化、破砕処理、
部分精製等した処理物を用いて行うことができる。ま
た、菌体は、培養物から回収されたまま、あるいは適当
な緩衝液、例えば０．０５Ｍ〜０．２Ｍ程度のリン酸緩
衝液（ｐＨ６〜９）で洗浄された洗浄菌体であってもよ
い。菌体等の固定化は、アクリルアミドモノマー、アル
ギン酸又はカラギーナン等の適当な担体に固定化させる
方法により行うことができる。

【００１１】かくして得られるマレイン酸イソメラーゼ
含有微生物又はその処理物を、マレイン酸を含有する温
度５〜２０℃の水溶液に作用させることにより、効率的
にマレイン酸を異性化しフマル酸を生成させることがで
きる。上記の如く調整された菌体又はその処理物の使用
量は特に制限されるものではなく、水性溶液の容量を基
準として１〜３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）が適当である。

【００１２】反応に用いる水性溶液は、マレイン酸を含
有する水溶液又は適当な緩衝液、例えば０．０５〜０．
２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とすることが
できる。水性溶液中には、菌体の透過性を向上させる目
的で、トルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を
０．０５〜２％（ｗｔ／ｖｏｌ）程度添加することがで
きる。

【００１３】水性溶液中の反応原料となるマレイン酸の
濃度は、通常０．１〜２ ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．
２〜１．５ｍｏｌ／Ｌの範囲内が適当である。本発明は
水性溶液の温度を比較的低温に維持しながら反応を行う
ことに一つの特徴を有しており、水性溶液の温度は５〜
２０℃、好ましくは１０〜１５℃の範囲内に維持するこ
とが重要である。反応中の水性溶液のｐＨは６〜１０、
好ましくは７〜９付近とすることができ、ｐＨの調整
は、酸又はアルカリを水性溶液に添加して行うことがで
きる。通常、マレイン酸は、酸の形態で用いられるの
で、ｐＨの調整はアルカリを添加して行うことができ、
その際に用いられるアルカリとしては、例えば、アンモ
ニア、苛性ソーダ、苛性カリ等を挙げることができる。
また、反応時間は、通常１０〜７２時間とすることがで
きる。

【００１４】原料として用いられるマレイン酸は、酸の
形態のみならず、その無水物または塩も原料として用い
ることができる。無水物である無水マレイン酸は水溶液
とすることにより容易にマレイン酸に変換する。マレイ
ン酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩
等を挙げることができる。かくして得られる高濃度のフ
マル酸を含有する水溶液は、そのままＬ−リンゴ酸やＬ
−アスパラギン酸の製造原料として用いることができ
る。また該水溶液を硫酸等でｐＨ２〜３の酸性に調整す
ることにより、フマル酸を結晶として回収することがで
きる。

【００１５】

【実施例】以下のに本発明を説明してきたが、下記の実
施例により本発明を更に具体的に説明する。しかしなが
ら、下記の実施例は本発明の具体的認識を得る一助とみ
なすべきものであり、本発明の範囲を何等制限するもの
ではない。

【００１６】

【実施例１】（１）マレイン酸イソメラーゼ含有微生物の培養 肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び
マレイン酸１０ｇを蒸留水に溶解し、１０００ｍｌとし
た培地（苛性ソーダでｐＨ７．０に調整）１００ｍｌを
５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０
分間滅菌処理したものに、アルカリゲネス・フェカリス
IFO 12669菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養
した。また、上記と同様の培地１０００ｍｌを３Ｌ容の
ジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅菌
処理したものに、上記振盪培養液３０ｍｌを接種し、こ
れを３０℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠
心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した
菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗
浄し、以下の反応に供した。

【００１７】（２）マレイン酸イソメラーゼによるマレ
イン酸の異性化 ついで、各反応液（マレイン酸０．３ｍｏｌｅに蒸留水
を加えて溶解し、苛性ソーダを加えてｐＨを７．０に調
整後、全量を蒸留水で１Ｌとしたもの）各５０ｍｌに、
上記菌体０．５ｇとトルエン０．５ｍｌを加え、第１表
に記載の各温度にて各々１時間反応させた。反応終了
後、反応液中のマレイン酸及びフマル酸を高速液体クロ
マトグラフィー（島津製、ＬＣ−５Ａ）で定量し、各反
応温度におけるマレイン酸異性化率（生成したフマル酸
量÷消費したマレイン酸量）を求めた。その結果を第１
表に、５℃における異性化率を１００とする相対値で示
す。

【００１８】

【表１】第１表 反応温度 マレイン酸異性化率 ５℃ １００ １０℃ ９５ １５℃ ９２ ２０℃ ８５ ２５℃ ６５ ３０℃ ５５ ３７℃ ５５

【００１９】

【発明の効果】本発明の方法によれば、酵素法により、
効率よく、かつ高収率でマレイン酸を異性化し、フマル
酸を製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マレイン酸イソメラーゼ含有微生物又は
   その処理物を、マレイン酸を含有する温度５〜２０℃の
   水性溶液に作用させフマル酸を生成せしめることを特徴
   とするマレイン酸の異性化方法。