JPS61288158A - 診断用ポリヌクレオチド試薬複合体、溶液中での試薬複合体からの置換およびアフイニテイ分離を含むその使用法、ならびにその製法 - Google Patents
診断用ポリヌクレオチド試薬複合体、溶液中での試薬複合体からの置換およびアフイニテイ分離を含むその使用法、ならびにその製法Info
- Publication number
- JPS61288158A JPS61288158A JP10188986A JP10188986A JPS61288158A JP S61288158 A JPS61288158 A JP S61288158A JP 10188986 A JP10188986 A JP 10188986A JP 10188986 A JP10188986 A JP 10188986A JP S61288158 A JPS61288158 A JP S61288158A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- probe
- labeled
- nucleotide sequence
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 313
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 313
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 313
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 157
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 28
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 title description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 14
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 243
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 136
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 136
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 116
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 35
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 28
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 26
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 17
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 14
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 14
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 11
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 11
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- -1 aT) Chemical compound 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 3
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical class C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004226 guanylic acid Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 150000004712 monophosphates Chemical group 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- OWFJMIVZYSDULZ-PXOLEDIWSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,6,10,11,12a-hexahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O OWFJMIVZYSDULZ-PXOLEDIWSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 1-Butene Chemical compound CCC=C VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000662 Anethum graveolens Species 0.000 description 1
- 108010006591 Apoenzymes Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001669680 Dormitator maculatus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 229920001730 Moisture cure polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150015939 Parva gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N butene Natural products CC=CC IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011295 pitch Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical class [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は生物学的試料中における標的ヌクレオチド配列
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の存在を検出するための診断用
アッセイ法、およびそのだめのポリヌクレオチド試薬複
合体に関する。
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の存在を検出するための診断用
アッセイ法、およびそのだめのポリヌクレオチド試薬複
合体に関する。
生物学的試料中の特定のｙｇ＋）ヌクレオチドの存在を
検出するための一般的な方法は、第１段階としである表
面に試料の核酸を固定化することを一般に伴う。試料が
固定化されると、プローブ（ｐｒｏｂｅ） ＄リヌク
レオチド鎖（通常は検出可能な標識、たとえば放射性リ
ン原子で標識されたもの）を固定化試料と共にインキュ
（−トし、これにより、固定化試料が標的ヌクレオチド
配列を含む場合プリン／ピリミジン塩基配列特異性の相
補的塩基対により、固定化試料に結合させる。こうして
ハイプリノビ形成しなかった標識プローブを洗い流した
のち、支持体上の標識の存否を測定する。この測定技術
には写真フィルムの露光、液体シンチレーション計数、
および蛍光鏡検法が含まれる。米国特許第４，３５８，
５３５号明細書（ファルコウら、１９８２年）を参、照
されたい。
検出するための一般的な方法は、第１段階としである表
面に試料の核酸を固定化することを一般に伴う。試料が
固定化されると、プローブ（ｐｒｏｂｅ） ＄リヌク
レオチド鎖（通常は検出可能な標識、たとえば放射性リ
ン原子で標識されたもの）を固定化試料と共にインキュ
（−トし、これにより、固定化試料が標的ヌクレオチド
配列を含む場合プリン／ピリミジン塩基配列特異性の相
補的塩基対により、固定化試料に結合させる。こうして
ハイプリノビ形成しなかった標識プローブを洗い流した
のち、支持体上の標識の存否を測定する。この測定技術
には写真フィルムの露光、液体シンチレーション計数、
および蛍光鏡検法が含まれる。米国特許第４，３５８，
５３５号明細書（ファルコウら、１９８２年）を参、照
されたい。
ワードら（欧州特許出願第６３，８７９号明細書、１９
８２年）はこの方法の変法について記述している。この
方法においては、プローブを検出可能な標識で直接に標
識するのではなく、プローブを非同位体置換基、たとえ
ば特定のヌクレオチド上のビオチンで標識する。この場
合、ノ・イブリッド形戊していないプローブを洗い流し
たのち、支持体を酵素に結合したアビジンなどの試薬と
接触させる。アビジン−酵素複合体は高いアビジン−ビ
オチン結合親和性のため選択的にビオチンに結合し、こ
れによυ酵素は標的ヌクレオチド配列が支持体上に固定
化された部位に選択的に固着する。
８２年）はこの方法の変法について記述している。この
方法においては、プローブを検出可能な標識で直接に標
識するのではなく、プローブを非同位体置換基、たとえ
ば特定のヌクレオチド上のビオチンで標識する。この場
合、ノ・イブリッド形戊していないプローブを洗い流し
たのち、支持体を酵素に結合したアビジンなどの試薬と
接触させる。アビジン−酵素複合体は高いアビジン−ビ
オチン結合親和性のため選択的にビオチンに結合し、こ
れによυ酵素は標的ヌクレオチド配列が支持体上に固定
化された部位に選択的に固着する。
次いで酵素に対する基質を添加して酵素反応生成物を検
出することにより、支持体上の標的ヌクレオチド配列の
初期濃度に関数的に依存する増幅された信号が得られる
。欧州特許出願第９７．３７３号明細書（エンゾ・バイ
オヶム社、１９８４年１月４日）も参照されたい。
出することにより、支持体上の標的ヌクレオチド配列の
初期濃度に関数的に依存する増幅された信号が得られる
。欧州特許出願第９７．３７３号明細書（エンゾ・バイ
オヶム社、１９８４年１月４日）も参照されたい。
上記の非同位体系の変法も他の欧州特許出願明細書に記
載されている（スタンダード・オイル、イリノイ、欧州
特許出願第７０，６８７号明細書、１９８３年）。その
場合、一形態（その８〜１゜頁を参照されたい）におい
ては標的ヌクレオチド配列に対して特異的な２種のプロ
ーブが用いられる。標的ヌクレオチド配列の第１の部分
にハイブリッド形成しうる第１プローブは固体支持体に
固着している。各種の標識を保有し、標的ヌクレオチド
配列の別個の第２の部分に選択的にハイズリラド形成し
うる第２プローブを次いで使用して、支持体と接触させ
る。標的ヌクレオチド配列が生物学的試料中に存在する
場合、第２プローブが第１プローブおよび標的ヌクレオ
チド配列を介して支持体に結合した組合せ構造（または
サンドインチ）が形成されるであろう。支持体を各段階
における未結合の溶液成分から分離することによって、
３回目の分離後の支持体を含む相中の標識の存在は試料
中の標的ヌクレオチド配列の存在および濃度の関数とな
るであろう。国際特許出願公開８３１０１４５９号明細
書〔オリオンーイトマ・オイ（Ｏｒｉｏｎ−Ｙｈｔｍａ
Ｏｙ）、１９８３年４月２９日〕も参照されたい。
載されている（スタンダード・オイル、イリノイ、欧州
特許出願第７０，６８７号明細書、１９８３年）。その
場合、一形態（その８〜１゜頁を参照されたい）におい
ては標的ヌクレオチド配列に対して特異的な２種のプロ
ーブが用いられる。標的ヌクレオチド配列の第１の部分
にハイブリッド形成しうる第１プローブは固体支持体に
固着している。各種の標識を保有し、標的ヌクレオチド
配列の別個の第２の部分に選択的にハイズリラド形成し
うる第２プローブを次いで使用して、支持体と接触させ
る。標的ヌクレオチド配列が生物学的試料中に存在する
場合、第２プローブが第１プローブおよび標的ヌクレオ
チド配列を介して支持体に結合した組合せ構造（または
サンドインチ）が形成されるであろう。支持体を各段階
における未結合の溶液成分から分離することによって、
３回目の分離後の支持体を含む相中の標識の存在は試料
中の標的ヌクレオチド配列の存在および濃度の関数とな
るであろう。国際特許出願公開８３１０１４５９号明細
書〔オリオンーイトマ・オイ（Ｏｒｉｏｎ−Ｙｈｔｍａ
Ｏｙ）、１９８３年４月２９日〕も参照されたい。
溶液中の二本鎖試料核酸を制限酵素で消化したのち原紙
上の特定サイズの断片を検出することによる特異的標的
ヌクレオチド配列（鎌状赤血球貧血遺伝子）に対する他
の診断法が米国特許第４．３９５．４８６号明細書（ウ
ィルソンら）に示されている。
上の特定サイズの断片を検出することによる特異的標的
ヌクレオチド配列（鎌状赤血球貧血遺伝子）に対する他
の診断法が米国特許第４．３９５．４８６号明細書（ウ
ィルソンら）に示されている。
以上の方法は多くの場合生物学的試料中のヌクレオチド
配列の存在を検出するであろうが、これらはそれぞれ多
数の工程を含むか、あるいは必然的にインキュベーショ
ン期間が長く、このためこれらの方法は臨床研究所で容
易に採用するためには実用的でない。さらにこれらの方
法の多くは妨害ポリヌクレオチド配列に関して、あるい
は低水準の標的ヌクレオチド配列をバックグラウンド信
号に対比して信頼性をもって検出することに関して、選
択性または感度に限度がある。特に支持体マトリックス
への標識プローブの非特異的結合は各方法において実質
的なバックグラウンド信号となる。
配列の存在を検出するであろうが、これらはそれぞれ多
数の工程を含むか、あるいは必然的にインキュベーショ
ン期間が長く、このためこれらの方法は臨床研究所で容
易に採用するためには実用的でない。さらにこれらの方
法の多くは妨害ポリヌクレオチド配列に関して、あるい
は低水準の標的ヌクレオチド配列をバックグラウンド信
号に対比して信頼性をもって検出することに関して、選
択性または感度に限度がある。特に支持体マトリックス
への標識プローブの非特異的結合は各方法において実質
的なバックグラウンド信号となる。
標的ヌクレオチド配列に関して生物学的試料を分析する
ことは別として、ノ・イブリッド形成（相補的ホＩＪヌ
クレオチド配列間の二重らせんの形成）の物理化学につ
いて種々の観点から研究されている。これらの研究には
、インビボおよびインビトロ双方における核酸の連鎖移
動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）および置換（ｄｉｓｐｌａｃ
ｅｍｅｎｔ）の現象についての検討が含まれる。しかし
本発明者らはこれらの研究を参照しても連鎖移動および
置換の現象が診断および検出に何らから明らかな応用性
をもつとは認めない。シー・グリーンおよびシー・チベ
ツツの１ヌクレイツク・アシッド・リサーチ１．９巻、
／１６８．１９０５−１８貞（１９°８１年）には、６
、ＩＫｂ（塩基６１００個の鎖長）の一本領ＤＮＡポリ
ヌクレオチドがその中央付近で（１，７−３，３Ｋｂの
距離）鎖長１．６ Ｋ ｂの末端標識された相補的ＤＮ
Ａポリヌクレオチドにハイブリッド形成した複合体（・
・イブリッド）を形成することが記載されている。この
複合体に溶液中で６． Ｉ Ｋ ｂの相補的連鎖を添加
すると、標識ポリヌクレオチドが急速に置換された（同
参考文献の１９１０頁、第２図を参照されたい）。これ
は反応混合物のアリコートを採取し、ポリヌクレオチド
をダルクロマトグラフィーにより分離し、これらをオー
トラジオグラフィーにより分析することにより追跡され
た。置換された１、 ６ Ｋ ｂポリヌクレオチドから
の信号は８５分以上の期間で（核酸の濃度に応じて）１
０％以下から９０チ以上の放射性信号にまで規則的に増
大した。この場合１．６ ／ ６． ＩＫ ｂハイブリ
ッドが残留放射能の大部分にを与していた。
ことは別として、ノ・イブリッド形成（相補的ホＩＪヌ
クレオチド配列間の二重らせんの形成）の物理化学につ
いて種々の観点から研究されている。これらの研究には
、インビボおよびインビトロ双方における核酸の連鎖移
動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）および置換（ｄｉｓｐｌａｃ
ｅｍｅｎｔ）の現象についての検討が含まれる。しかし
本発明者らはこれらの研究を参照しても連鎖移動および
置換の現象が診断および検出に何らから明らかな応用性
をもつとは認めない。シー・グリーンおよびシー・チベ
ツツの１ヌクレイツク・アシッド・リサーチ１．９巻、
／１６８．１９０５−１８貞（１９°８１年）には、６
、ＩＫｂ（塩基６１００個の鎖長）の一本領ＤＮＡポリ
ヌクレオチドがその中央付近で（１，７−３，３Ｋｂの
距離）鎖長１．６ Ｋ ｂの末端標識された相補的ＤＮ
Ａポリヌクレオチドにハイブリッド形成した複合体（・
・イブリッド）を形成することが記載されている。この
複合体に溶液中で６． Ｉ Ｋ ｂの相補的連鎖を添加
すると、標識ポリヌクレオチドが急速に置換された（同
参考文献の１９１０頁、第２図を参照されたい）。これ
は反応混合物のアリコートを採取し、ポリヌクレオチド
をダルクロマトグラフィーにより分離し、これらをオー
トラジオグラフィーにより分析することにより追跡され
た。置換された１、 ６ Ｋ ｂポリヌクレオチドから
の信号は８５分以上の期間で（核酸の濃度に応じて）１
０％以下から９０チ以上の放射性信号にまで規則的に増
大した。この場合１．６ ／ ６． ＩＫ ｂハイブリ
ッドが残留放射能の大部分にを与していた。
１３．８ＫｂのＤＮＡに相当する総質量（長い連鎖およ
び一部置換された短い連鎖の双方）をもつと想された推
定上の一部置換中間体は明らかに検出されなかった。文
献著者らは、２本の６． Ｉ Ｋ ｂポリヌクレオチド
の初期ハイブリッド形成（分枝鎖を形成する）が速度制
限工程であり；標識ポリスクレオチドの１．６ Ｋ ｂ
対合領域に沿った置換はきわめて速やかであり、これは
分枝鎖（１３，ｓＫｂの質量に相当）の０．８分という
計算上の平均寿命と一致すると結論している。彼らは単
一分枝鎖状中間体または二重に核形成した（Ｄループを
形成した）中間体の双方につき可能性を示している（同
参考文献の１９１２頁に示されている）。彼らは分枝移
動現象をより良く研究するために、移動現象を遅延させ
ると思われる薬物の使用により、および／″！たけ１．
６ Ｋ ｂ以上の７・イブリッド塩基対を含む複合体の
使用により、置換過程を遅らせることを試みた（同参考
文献の１９１３−１９１４頁を参照されたい）。１．６
／ ６． Ｉ Ｋ ｂの連鎖については、グリーンら
は非特異的連鎖をいずれも除去して精製された６、 Ｉ
Ｋ ｂの補体を用いて試みたにすぎない点に注目すべ
きである。
び一部置換された短い連鎖の双方）をもつと想された推
定上の一部置換中間体は明らかに検出されなかった。文
献著者らは、２本の６． Ｉ Ｋ ｂポリヌクレオチド
の初期ハイブリッド形成（分枝鎖を形成する）が速度制
限工程であり；標識ポリスクレオチドの１．６ Ｋ ｂ
対合領域に沿った置換はきわめて速やかであり、これは
分枝鎖（１３，ｓＫｂの質量に相当）の０．８分という
計算上の平均寿命と一致すると結論している。彼らは単
一分枝鎖状中間体または二重に核形成した（Ｄループを
形成した）中間体の双方につき可能性を示している（同
参考文献の１９１２頁に示されている）。彼らは分枝移
動現象をより良く研究するために、移動現象を遅延させ
ると思われる薬物の使用により、および／″！たけ１．
６ Ｋ ｂ以上の７・イブリッド塩基対を含む複合体の
使用により、置換過程を遅らせることを試みた（同参考
文献の１９１３−１９１４頁を参照されたい）。１．６
／ ６． Ｉ Ｋ ｂの連鎖については、グリーンら
は非特異的連鎖をいずれも除去して精製された６、 Ｉ
Ｋ ｂの補体を用いて試みたにすぎない点に注目すべ
きである。
前記３種の特許出願（ダイヤモンドら、ウィリアムスら
、およびコリンズら）には各種様式のポリヌクレオチド
置換アッセイ法が示されている。
、およびコリンズら）には各種様式のポリヌクレオチド
置換アッセイ法が示されている。
これらの方法においてはプローブポリヌクレオチド（同
明細書に記載されている）および標識ポリヌク区オチド
（同明細書に記載されている）を含む試薬複合体を試料
と接触させる。試料が標的ヌクレオチド配列を含む場合
これは試薬複合体から標識ポリヌクレオチドを置換する
であろう。ある形態においては置換は固定化されたプロ
ーブ（同明細書に記載されている）からのものであり；
他の形態においては置換が溶液中で行われる。溶液中で
の置換を伴うある形態の場合、次いで無傷の試薬複合体
から、置換された標識ポリヌクレオチドの置換後分離を
行う（米国特許出願 第６０７．８８５号明細書、クレーム１７〜１９を参照
されたい）。この置換後分離の例はすべてサイズに基づ
くものであるが、同明細書はアフィニテイクロマトグラ
フィーにより行うことができると述べている。ビオチン
−アビジンのアフィニティ結合はプローブ固定化に関連
して詳述されておシ、同第６０７．８８５号明細書のク
レーム４４にも置換後アフィニティ分離のだめの手段と
して示されている。その記述はプローブ上の固定化可能
な基としてビオチンなどを、または・・ブテンとしてニ
トロフェノールを示している。同第６０７．８８５号明
細書の、他の箇所に示されるように、ビオチン−アビジ
ン対はきわめて高いＫａｓｓをもつので、結合が本質的
に不可逆的であることは推定されるであろう。
明細書に記載されている）および標識ポリヌク区オチド
（同明細書に記載されている）を含む試薬複合体を試料
と接触させる。試料が標的ヌクレオチド配列を含む場合
これは試薬複合体から標識ポリヌクレオチドを置換する
であろう。ある形態においては置換は固定化されたプロ
ーブ（同明細書に記載されている）からのものであり；
他の形態においては置換が溶液中で行われる。溶液中で
の置換を伴うある形態の場合、次いで無傷の試薬複合体
から、置換された標識ポリヌクレオチドの置換後分離を
行う（米国特許出願 第６０７．８８５号明細書、クレーム１７〜１９を参照
されたい）。この置換後分離の例はすべてサイズに基づ
くものであるが、同明細書はアフィニテイクロマトグラ
フィーにより行うことができると述べている。ビオチン
−アビジンのアフィニティ結合はプローブ固定化に関連
して詳述されておシ、同第６０７．８８５号明細書のク
レーム４４にも置換後アフィニティ分離のだめの手段と
して示されている。その記述はプローブ上の固定化可能
な基としてビオチンなどを、または・・ブテンとしてニ
トロフェノールを示している。同第６０７．８８５号明
細書の、他の箇所に示されるように、ビオチン−アビジ
ン対はきわめて高いＫａｓｓをもつので、結合が本質的
に不可逆的であることは推定されるであろう。
固定化されたホモポリヌクレオチドセグメントが特定の
ホＩＪヌクレオチドの可逆的結合に用いられている（た
とえばオリ（−（ａＴ） −セルロースに可逆的に結
合したポＩＪ （ｒＡ）末端ＲＮＡ）。たとえばエッチ
・アビブおよびピー・レーダーのプロン・ナシ・アカデ
・サイ・ユ・−・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）、６９巻、１４
０８−１４１２頁（１９７２年）、およびピー・ティー
・ギルハムおよびダブリュー・イー・ロビンソンのジエ
イ・アメ・ケミ・ンサ（Ｊ、 Ａｍ。
ホＩＪヌクレオチドの可逆的結合に用いられている（た
とえばオリ（−（ａＴ） −セルロースに可逆的に結
合したポＩＪ （ｒＡ）末端ＲＮＡ）。たとえばエッチ
・アビブおよびピー・レーダーのプロン・ナシ・アカデ
・サイ・ユ・−・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）、６９巻、１４
０８−１４１２頁（１９７２年）、およびピー・ティー
・ギルハムおよびダブリュー・イー・ロビンソンのジエ
イ・アメ・ケミ・ンサ（Ｊ、 Ａｍ。
Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、）、 ８６巻、４９８５−４９８
９頁（１９６４年）を参照されたい。
９頁（１９６４年）を参照されたい。
発明の要約
本発明は試薬複合体（標的結合領域の一部に結合した標
識ポリヌクレオチドを含むプローブポリヌクレオチド）
から標識ポリヌクレオチドを溶液中で試料の標的ヌクレ
オチド配列によって速やかに置換し、次いでプローブポ
リヌクレオチド独特の特色に基づいてアフィニティ分離
し、これによって置換された標識ポリヌクレオチドに認
められる標識を直接的または間接的に測定することが可
能となることに基づく。この標識は試料中の標的ヌクレ
オチド配列の存在および濃度に対し関数関係にある信頼
できる定量的測定値として用いられる。置換後アフィニ
ティ分離に有用なプローブポリヌクレオチドの要素は、
その特色によって容易にかつ好都合にプローブポリヌク
レオチドの結合を逆行させ、これによって製造中に特定
の標識ポリヌクレオチドから試薬複合体を分離すること
ができるので、試薬複合体の製造にも有用である。
識ポリヌクレオチドを含むプローブポリヌクレオチド）
から標識ポリヌクレオチドを溶液中で試料の標的ヌクレ
オチド配列によって速やかに置換し、次いでプローブポ
リヌクレオチド独特の特色に基づいてアフィニティ分離
し、これによって置換された標識ポリヌクレオチドに認
められる標識を直接的または間接的に測定することが可
能となることに基づく。この標識は試料中の標的ヌクレ
オチド配列の存在および濃度に対し関数関係にある信頼
できる定量的測定値として用いられる。置換後アフィニ
ティ分離に有用なプローブポリヌクレオチドの要素は、
その特色によって容易にかつ好都合にプローブポリヌク
レオチドの結合を逆行させ、これによって製造中に特定
の標識ポリヌクレオチドから試薬複合体を分離すること
ができるので、試薬複合体の製造にも有用である。
この方法で試薬複合体から好都合に分離される標識ポリ
ヌクレオチド°は、プローブポリヌクレオチドにハイブ
リッド形成していないもの、あるいは十分にかつ安定な
状態でハイブリッド形成してはいないものである。この
精製工程は、核酸鎖置換に関するアッセイにおいて解釈
を誤ると思われる非特異的解離または偽解離の発生を避
ける補助となる。この精製処理は、ポリヌクレオチド試
薬複合体の製造に際して導入された過剰の試薬、詳細に
は信号発生部分を保有するが標識ポリヌクレオチドに化
学的または物理的に会合してはいないものの除去に有用
である。
ヌクレオチド°は、プローブポリヌクレオチドにハイブ
リッド形成していないもの、あるいは十分にかつ安定な
状態でハイブリッド形成してはいないものである。この
精製工程は、核酸鎖置換に関するアッセイにおいて解釈
を誤ると思われる非特異的解離または偽解離の発生を避
ける補助となる。この精製処理は、ポリヌクレオチド試
薬複合体の製造に際して導入された過剰の試薬、詳細に
は信号発生部分を保有するが標識ポリヌクレオチドに化
学的または物理的に会合してはいないものの除去に有用
である。
従って、本発明は
（１） プリン／ピリミジン塩基対の水素結合を介し
て標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプローブポ
リヌクレオチド、および （ＩＩ） プリン／ビＩＪ ミジン塩基対の水素結合
を介して、プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチ
ド配列に塩基対結合しうる領域と少なくとも部分的に共
通の範囲をもつ（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）プローブポ
リヌクレオチドの領域においてプローブポリヌクレオチ
ドに塩基対結合することにより結合した標識ポリヌクレ
オチド からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定められ
た標的ヌクレオチド配列の存在を測定するための診断用
試薬複合体において、 標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオチドとの
間で起こりうる塩基対結合が試薬複合体から標識ポリヌ
クレオチドを置換しうるものであって； プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に塩
基対結合しうる領域から遠位において（すなわち間隔を
置いて）、プローブポリヌクレオチドが結合セグメント
を含み； プローブポリヌクレオチドのこの結合セグメントに、標
識ポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドに結合
した状態を保つ条件下で、アフィニティ試薬が可逆的に
結合しうる ことを特徴とする診断用試薬複合体を提供する。
て標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプローブポ
リヌクレオチド、および （ＩＩ） プリン／ビＩＪ ミジン塩基対の水素結合
を介して、プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチ
ド配列に塩基対結合しうる領域と少なくとも部分的に共
通の範囲をもつ（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）プローブポ
リヌクレオチドの領域においてプローブポリヌクレオチ
ドに塩基対結合することにより結合した標識ポリヌクレ
オチド からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定められ
た標的ヌクレオチド配列の存在を測定するための診断用
試薬複合体において、 標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオチドとの
間で起こりうる塩基対結合が試薬複合体から標識ポリヌ
クレオチドを置換しうるものであって； プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に塩
基対結合しうる領域から遠位において（すなわち間隔を
置いて）、プローブポリヌクレオチドが結合セグメント
を含み； プローブポリヌクレオチドのこの結合セグメントに、標
識ポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドに結合
した状態を保つ条件下で、アフィニティ試薬が可逆的に
結合しうる ことを特徴とする診断用試薬複合体を提供する。
本発明は、
（ａ） （１）プリン／ピリミジン塩基対の水素結合
を介して標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプロ
ーブポリヌクレオチド、および（ｉｉ）プリン／ピリミ
ジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌクレオ
チドが標的ヌクレオチド配列に結合しうる領域と少なく
とも部分的に共通の範囲をもつプローブ７ ＋）ヌクレ
オチドの領域においてプローブポリヌクレオチドに塩基
対結合することにより結合した標識ポリヌクレオチドの
試薬複合体を供給し； （ｂ） 試薬複合体を溶液中で、標的ヌクレオチド配
列が存在する場合プローブ１＋）ヌクレオチドに結合し
かつ複合体から標識ポリヌクレオチドを置換する条件下
において試料と接触させ；（ｃ１）接触工程（ｂ）のの
ち反応液の一部から残留する試薬複合体を分離し、そし
て （ｃ２）分離後の溶液相中の置換された標識ポリヌクレ
オチドの存在を測定する 工程からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定め
られた標的ヌクレオチド配列の存在を測定するための方
法であって； プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に塩
基対結合しうる領域から遠位において、プローブポリヌ
クレオチドが結合セグメントを含み； 分離工程（ｃ１）が、接触工程（ｂ）の溶液生成物を上
記結合セグメントに対する固定化されたアフィニティ試
薬と接触した状態で通過させ、固定化されたアフィニテ
ィ試薬から実質的に結合セグメント不含の溶液相を回収
し、この溶液相について測定工程（ｃ２）を実施し、そ
の際、固定化されたアフィニティ、試薬と試薬複合体の
結合が可逆的である ことを特徴とする方法をも含む。
を介して標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプロ
ーブポリヌクレオチド、および（ｉｉ）プリン／ピリミ
ジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌクレオ
チドが標的ヌクレオチド配列に結合しうる領域と少なく
とも部分的に共通の範囲をもつプローブ７ ＋）ヌクレ
オチドの領域においてプローブポリヌクレオチドに塩基
対結合することにより結合した標識ポリヌクレオチドの
試薬複合体を供給し； （ｂ） 試薬複合体を溶液中で、標的ヌクレオチド配
列が存在する場合プローブ１＋）ヌクレオチドに結合し
かつ複合体から標識ポリヌクレオチドを置換する条件下
において試料と接触させ；（ｃ１）接触工程（ｂ）のの
ち反応液の一部から残留する試薬複合体を分離し、そし
て （ｃ２）分離後の溶液相中の置換された標識ポリヌクレ
オチドの存在を測定する 工程からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定め
られた標的ヌクレオチド配列の存在を測定するための方
法であって； プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に塩
基対結合しうる領域から遠位において、プローブポリヌ
クレオチドが結合セグメントを含み； 分離工程（ｃ１）が、接触工程（ｂ）の溶液生成物を上
記結合セグメントに対する固定化されたアフィニティ試
薬と接触した状態で通過させ、固定化されたアフィニテ
ィ試薬から実質的に結合セグメント不含の溶液相を回収
し、この溶液相について測定工程（ｃ２）を実施し、そ
の際、固定化されたアフィニティ、試薬と試薬複合体の
結合が可逆的である ことを特徴とする方法をも含む。
本発明は
（ａｌ （１）プリン／ピリミジン塩基対の水素結合
を介して標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領域
をもつプローブホＩＪヌクレオチド、および（４）プリ
ン／ピリミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポ
リヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に塩基対結合し
うる領域と少なくとも部分的に共通の範囲をもつプロー
ブホＩＪヌクレオチドの領域においてプローブポリヌク
レオチドに塩基対結合しうる標識ポリヌクレオチド をハイブリッド形成させ； プローブポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチ
ドが標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領域から
遠位にある結合セグメントを含み；（ｂ） 該結合セ
グメントにおける選択的な可逆的吸着により、試薬複合
体をプローブポリヌクレオチドに結合していない標識ポ
リヌクレオチドから分離し； 結合セグメントにおける試薬複合体の吸着、および試薬
複合体の脱着の条件は、ハイブリッド形成工程ｆａ）に
おいてプローブポリヌクレオチドにハイブリッド形成し
た標識ヌクレオチドが分離工程（ｂ）に際してハイブリ
ッド形成状態を維持するのに十分なほど緩和である 工程からなる、生物学的試料の核酸中におけるあらかじ
め定められた標的ヌクレオチド配列の存在を測定するの
に有用な診断用試薬の製法をも含む。
を介して標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領域
をもつプローブホＩＪヌクレオチド、および（４）プリ
ン／ピリミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポ
リヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に塩基対結合し
うる領域と少なくとも部分的に共通の範囲をもつプロー
ブホＩＪヌクレオチドの領域においてプローブポリヌク
レオチドに塩基対結合しうる標識ポリヌクレオチド をハイブリッド形成させ； プローブポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチ
ドが標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領域から
遠位にある結合セグメントを含み；（ｂ） 該結合セ
グメントにおける選択的な可逆的吸着により、試薬複合
体をプローブポリヌクレオチドに結合していない標識ポ
リヌクレオチドから分離し； 結合セグメントにおける試薬複合体の吸着、および試薬
複合体の脱着の条件は、ハイブリッド形成工程ｆａ）に
おいてプローブポリヌクレオチドにハイブリッド形成し
た標識ヌクレオチドが分離工程（ｂ）に際してハイブリ
ッド形成状態を維持するのに十分なほど緩和である 工程からなる、生物学的試料の核酸中におけるあらかじ
め定められた標的ヌクレオチド配列の存在を測定するの
に有用な診断用試薬の製法をも含む。
この明細書において以下の用語は分子生物学の領域で一
般的に受容されているそれらの意味に基づいて用いられ
る。
般的に受容されているそれらの意味に基づいて用いられ
る。
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖は、互いに
３７ 、 Ｓ／−ホスホジエステル結合により結合し、
かつ糖の１位の炭素において炭素−窒素結合によりペン
ダント基であるプリン塩基またはピリミジン塩基、たと
えば（ただし、以下のものに限定されることはない）ウ
ラシル（天然においてはリポソームにのみ結合、ｒＵ）
、チミン（天然においてはデオキシリボースにのみ結合
、ａＴ）、 シトシン（ｄＣまたはｒＣ）、アデニン
（ｄＡまたはｒＡ）、およびグアニン（ｄＧまたばｒＧ
）に結合したＲントース糖（一般にリボースまたはデオ
キシリボース）の線状重合体構造を意味する。従ってポ
リヌクレオチドにはデオキシリボ核酸（ＤＭＡ）の連鎖
およびリボ核酸（ＲＮＡ）の連鎖、ならびに複合ＤＭＡ
−ＲＮＡ鎖が含まれる。
３７ 、 Ｓ／−ホスホジエステル結合により結合し、
かつ糖の１位の炭素において炭素−窒素結合によりペン
ダント基であるプリン塩基またはピリミジン塩基、たと
えば（ただし、以下のものに限定されることはない）ウ
ラシル（天然においてはリポソームにのみ結合、ｒＵ）
、チミン（天然においてはデオキシリボースにのみ結合
、ａＴ）、 シトシン（ｄＣまたはｒＣ）、アデニン
（ｄＡまたはｒＡ）、およびグアニン（ｄＧまたばｒＧ
）に結合したＲントース糖（一般にリボースまたはデオ
キシリボース）の線状重合体構造を意味する。従ってポ
リヌクレオチドにはデオキシリボ核酸（ＤＭＡ）の連鎖
およびリボ核酸（ＲＮＡ）の連鎖、ならびに複合ＤＭＡ
−ＲＮＡ鎖が含まれる。
これらのポリヌクレオチド鎖の末端は、ペントースの５
位の炭素原子が他のペントースに結合していない（ただ
し水酸基、モノホスフェート基、または他の天然もしく
は合成の部分を保有してもよい）５′末端、およびペン
トースの３位の炭素原子が他のペントースに結合してい
ない（ただし同様に水酸基、モノホスフェート基、また
は他の天然もしくは合成の部分を保有してもよい９３′
末端と呼ばれる。
位の炭素原子が他のペントースに結合していない（ただ
し水酸基、モノホスフェート基、または他の天然もしく
は合成の部分を保有してもよい）５′末端、およびペン
トースの３位の炭素原子が他のペントースに結合してい
ない（ただし同様に水酸基、モノホスフェート基、また
は他の天然もしくは合成の部分を保有してもよい９３′
末端と呼ばれる。
相補的塩基対またはプリン／ピリミジン塩基対とは、２
本の逆平行ポリヌクレオチド鎖の又ンダントを形成する
対向塩基間の水素結合を意味する。
本の逆平行ポリヌクレオチド鎖の又ンダントを形成する
対向塩基間の水素結合を意味する。
これは天然のＤＮＡについてはｄＧがｄＣに対向し、ｄ
ＡがａＴに対向した場合、エネルギー的に最も有利であ
る。天然に広く存在する５種の塩基以外の塩基も優先的
な対をもつ。たとえば５−メチルシトシンは優先的にグ
アニンに結合する。説明のために、この対を多くの図面
において、対向する連鎖が逆平行の方向に向かう（５′
対３′という意味において）平行な直線によって示す。
ＡがａＴに対向した場合、エネルギー的に最も有利であ
る。天然に広く存在する５種の塩基以外の塩基も優先的
な対をもつ。たとえば５−メチルシトシンは優先的にグ
アニンに結合する。説明のために、この対を多くの図面
において、対向する連鎖が逆平行の方向に向かう（５′
対３′という意味において）平行な直線によって示す。
しかし２本鎖セグメントの実際の幾何学的形状は米国特
許出願第６０７．８８５号明細書の第１Ｄ図に概略的に
示されるように、普通は種々のピッチのらせん状である
（周知の二重らせん）点を認識すべきである。
許出願第６０７．８８５号明細書の第１Ｄ図に概略的に
示されるように、普通は種々のピッチのらせん状である
（周知の二重らせん）点を認識すべきである。
ハイブリッド形成とは、ここでは二本鎖構造の形成に導
く条件下で２種のポリヌクレオチドを混和し、相補的塩
基対が相補的配列またはほぼ相補的配列の存在する二本
鎖構造を形成させるという意味で用いられる。
く条件下で２種のポリヌクレオチドを混和し、相補的塩
基対が相補的配列またはほぼ相補的配列の存在する二本
鎖構造を形成させるという意味で用いられる。
本発明の基本的成分はプローブポリヌクレオチド（ここ
では時にプローブと呼ぶ）、標識（ｌａｂｅｌｅｄ 、
ここでは時にｔａｇｇｅｄ）ｙｔ？リヌクレオチド、核
酸（その一部をここでは時に標的ポリヌクレオチドまた
は標的ヌクレオチド配列と呼ぶ〕を含む生物学的試料で
ある。試料は標的ヌクレオチド配列を含むかも知れず、
あるいは含まないかも知れない。プローブが診断法、製
造法または双方の分離工程の一部として固定化される支
持（固定化）アフィニティ試薬も供給される。診断法の
実施に際しては、読取りのために追加の試薬または装置
がしばしば必要となる。読取シという語は、試薬複合体
から置換され、次いで溶液中の置換された標識ポリヌク
レオチドをプローブポリヌクレオチドおよび試薬複合体
から分離することによって生成液相中に見出される標識
ポリヌクレオチドの直接的または間接的な検出を意味す
る。
では時にプローブと呼ぶ）、標識（ｌａｂｅｌｅｄ 、
ここでは時にｔａｇｇｅｄ）ｙｔ？リヌクレオチド、核
酸（その一部をここでは時に標的ポリヌクレオチドまた
は標的ヌクレオチド配列と呼ぶ〕を含む生物学的試料で
ある。試料は標的ヌクレオチド配列を含むかも知れず、
あるいは含まないかも知れない。プローブが診断法、製
造法または双方の分離工程の一部として固定化される支
持（固定化）アフィニティ試薬も供給される。診断法の
実施に際しては、読取りのために追加の試薬または装置
がしばしば必要となる。読取シという語は、試薬複合体
から置換され、次いで溶液中の置換された標識ポリヌク
レオチドをプローブポリヌクレオチドおよび試薬複合体
から分離することによって生成液相中に見出される標識
ポリヌクレオチドの直接的または間接的な検出を意味す
る。
本発明を実施するに際しては、プローブポリヌクレオチ
ドはプリン／ピリミジン塩基配列の少なくとも１領域に
おける相補的塩基対によって試料の特定の標的ヌクレオ
チド配列に特異的に結合しうる線状または環状ポリヌク
レオチドである。この結合はＤＮＡとＲＮＡ％ＤＮ’Ａ
とＤＮＡ、 またはＲＮＡとＲＮＡのいずれの間であ
ってもよい。従ってプローブはＤＮＡまたはＲＮＡのい
ずれであってもよい。のちにより詳細に論じるように、
標的ヌクレオチド配列に選択的に結合するのは一般にプ
ローブの特定の領域にすぎない。プローブの他の領域は
ハイブリッド形成に関与し々いが本発明においては重要
な役割を果たす（たとえばアフィニティリガンドの付着
部位として作用することにより）各種の天然または合成
の配列であってよい。
ドはプリン／ピリミジン塩基配列の少なくとも１領域に
おける相補的塩基対によって試料の特定の標的ヌクレオ
チド配列に特異的に結合しうる線状または環状ポリヌク
レオチドである。この結合はＤＮＡとＲＮＡ％ＤＮ’Ａ
とＤＮＡ、 またはＲＮＡとＲＮＡのいずれの間であ
ってもよい。従ってプローブはＤＮＡまたはＲＮＡのい
ずれであってもよい。のちにより詳細に論じるように、
標的ヌクレオチド配列に選択的に結合するのは一般にプ
ローブの特定の領域にすぎない。プローブの他の領域は
ハイブリッド形成に関与し々いが本発明においては重要
な役割を果たす（たとえばアフィニティリガンドの付着
部位として作用することにより）各種の天然または合成
の配列であってよい。
付着部位と、標的ヌクレオチド配列が結合する領域との
間にある程度の隔りがあることについてはのちに詳述す
る。
間にある程度の隔りがあることについてはのちに詳述す
る。
標的ヌクレオチドが特異的に結合するプローブの領域（
ここでは標的結合領域と呼ぶ；図面におけるＴＢＲ）に
ついては、この配列内の各ヌクレオチドが標的ヌクレオ
チド配列内にその適正な相補的結合相手（たとえばｄＴ
に対するａＡ）を見出すという点でこの結合は完全であ
るか、あるいは若干の不整合を含むであろう。プローブ
の標的結合領域の少なくとも一部は試薬複合体中におい
て一本鎖であること、すなわち標識ポリヌクレオチド配
列に対して相補的でないことが好ましい。この一本領領
域はここでは時に初期結合領域（図面におけるよりＲ）
と呼ばれる。標的ヌクレオチド配列はこの塩基領域に、
標識ポリヌクレオチドを置換することなく結合しうるか
らである。プローブのこの種の初期結合領域は少なくと
も塩基１５個の長さであり、好ましくは少なくとも塩基
５０個の長さである。総体的な標的結合領域には初期結
合領域、および大部分もしくは（好ましくは）すべての
標識ポリヌクレオチド結合領域（図面および以下の論述
におけるＬＢＨ）が含まれる。総体的な標的結合領域（
ＴＥＲ）の長さは他と無関係に決定されるものではなく
、むしろよりＲおよびＬＥＲ部分の好ましい長さ、また
はより好ましい長さの和の関数と考えることができる。
ここでは標的結合領域と呼ぶ；図面におけるＴＢＲ）に
ついては、この配列内の各ヌクレオチドが標的ヌクレオ
チド配列内にその適正な相補的結合相手（たとえばｄＴ
に対するａＡ）を見出すという点でこの結合は完全であ
るか、あるいは若干の不整合を含むであろう。プローブ
の標的結合領域の少なくとも一部は試薬複合体中におい
て一本鎖であること、すなわち標識ポリヌクレオチド配
列に対して相補的でないことが好ましい。この一本領領
域はここでは時に初期結合領域（図面におけるよりＲ）
と呼ばれる。標的ヌクレオチド配列はこの塩基領域に、
標識ポリヌクレオチドを置換することなく結合しうるか
らである。プローブのこの種の初期結合領域は少なくと
も塩基１５個の長さであり、好ましくは少なくとも塩基
５０個の長さである。総体的な標的結合領域には初期結
合領域、および大部分もしくは（好ましくは）すべての
標識ポリヌクレオチド結合領域（図面および以下の論述
におけるＬＢＨ）が含まれる。総体的な標的結合領域（
ＴＥＲ）の長さは他と無関係に決定されるものではなく
、むしろよりＲおよびＬＥＲ部分の好ましい長さ、また
はより好ましい長さの和の関数と考えることができる。
プローブの初期結合領域につき５００個を越える塩基の
長さは一般に必要ではなく、大部分の場合著しく不利で
ある。臨床研究所用としてのこの領域の塩基対の長さに
対する適切な下限は、プローブポリヌクレオチドの標的
結合領域の塩基配列および塩基組成、ならびにのちに示
す他の物理的因子に若干依存し、特に目的とするハイブ
リッド形成、置換後アフィニティ分離、ハイブリッド形
成の動力学、および採用する読取りシステムに依存する
。他の拘束は、後記の若干の実施態様につき記述するよ
うに、結合セグメントがホモポリマー型ヌクレオチド配
列（たとえばポＩＪ （ｄｃ） ） を含む場合、こ
れと同じ配列が標識ポリヌクレオチド中に存在しないこ
とが好ましいという点である。さらに後記のように、こ
れらの場合、それぞれが結合した形であるならば塩基対
合ＬＢＲ領域は普通は塩基対合結合セグメント（ＢＳ）
よシも実質的に長い（かつ融点が高い）であろう（
＠者が標識ポリヌクレオチドと、後者がホモポリヌクレ
オチドアフィニティ試薬（たとえば固定化されたポＩＪ
（ｄＧ））と複合体を形成したもの）。
長さは一般に必要ではなく、大部分の場合著しく不利で
ある。臨床研究所用としてのこの領域の塩基対の長さに
対する適切な下限は、プローブポリヌクレオチドの標的
結合領域の塩基配列および塩基組成、ならびにのちに示
す他の物理的因子に若干依存し、特に目的とするハイブ
リッド形成、置換後アフィニティ分離、ハイブリッド形
成の動力学、および採用する読取りシステムに依存する
。他の拘束は、後記の若干の実施態様につき記述するよ
うに、結合セグメントがホモポリマー型ヌクレオチド配
列（たとえばポＩＪ （ｄｃ） ） を含む場合、こ
れと同じ配列が標識ポリヌクレオチド中に存在しないこ
とが好ましいという点である。さらに後記のように、こ
れらの場合、それぞれが結合した形であるならば塩基対
合ＬＢＲ領域は普通は塩基対合結合セグメント（ＢＳ）
よシも実質的に長い（かつ融点が高い）であろう（
＠者が標識ポリヌクレオチドと、後者がホモポリヌクレ
オチドアフィニティ試薬（たとえば固定化されたポＩＪ
（ｄＧ））と複合体を形成したもの）。
特定の実施態様においてアフィニティ試薬が固定化され
る固相は一般に用いられる種類のものほぼすべてであり
、これには特に高分子材料、セラミック材料、試験管そ
の他の容器の壁面、紙、ニトロセルロースまたはガラス
が含まれる。本発明のある形態においては、固相は蛋白
質、ポリスチレン、ラテックスまたはガラスなどの材料
から製造された粒子またはビーズからなる。固相は液体
スラリー中に存在し、薄膜または比較的厚いディスクに
プレスされてもよく、あるいはカラム内の充填床として
（例および第１図および第２Ｃ図において説明する）、
または毛管内壁の内張シとして存在してもよい。
る固相は一般に用いられる種類のものほぼすべてであり
、これには特に高分子材料、セラミック材料、試験管そ
の他の容器の壁面、紙、ニトロセルロースまたはガラス
が含まれる。本発明のある形態においては、固相は蛋白
質、ポリスチレン、ラテックスまたはガラスなどの材料
から製造された粒子またはビーズからなる。固相は液体
スラリー中に存在し、薄膜または比較的厚いディスクに
プレスされてもよく、あるいはカラム内の充填床として
（例および第１図および第２Ｃ図において説明する）、
または毛管内壁の内張シとして存在してもよい。
アフィニティ試薬を固体支持体に付着させる手段は単純
な吸着であってもよいが、特異的共有結合、イオン結合
または水素結合のうちのある形であることが好ましい。
な吸着であってもよいが、特異的共有結合、イオン結合
または水素結合のうちのある形であることが好ましい。
本発明の場合、プローブポリヌクレオチドは複合体にお
いては支持体に固定化されておらず、むしろ試薬は生物
学的試料と混合され、これによりハイブリッド形成は（
起こるとすれば）溶液中で起こるので、試薬複合体全体
が溶液状である。後記のようにプローブは実際に、ノ・
イブリッド形成後にたとえば支持体上のアフィニティ試
薬を含む多孔床またはフィルターに導通することにより
固定化または分離しうる置換基を含む。このような固定
化により、後続の測定のために、置換された標識ホＩＪ
ヌクレオチドのみが液相中に残留するであろう。
いては支持体に固定化されておらず、むしろ試薬は生物
学的試料と混合され、これによりハイブリッド形成は（
起こるとすれば）溶液中で起こるので、試薬複合体全体
が溶液状である。後記のようにプローブは実際に、ノ・
イブリッド形成後にたとえば支持体上のアフィニティ試
薬を含む多孔床またはフィルターに導通することにより
固定化または分離しうる置換基を含む。このような固定
化により、後続の測定のために、置換された標識ホＩＪ
ヌクレオチドのみが液相中に残留するであろう。
この種のプローブポリヌクレオチド（ある場合には付着
可能な基はまだ存在しない）は種々の方法で、たとえば
バクテリアその他の適切な微生物から微生物の遺伝物質
の一部として単離された適切なプラスミドまたはウィル
スベクター中に、もしくはその一部として再現性をもっ
て製造でき、あるいは他の適切な生物学的供給源から得
られる。
可能な基はまだ存在しない）は種々の方法で、たとえば
バクテリアその他の適切な微生物から微生物の遺伝物質
の一部として単離された適切なプラスミドまたはウィル
スベクター中に、もしくはその一部として再現性をもっ
て製造でき、あるいは他の適切な生物学的供給源から得
られる。
一般に、プローブポリヌクレオチド配列（その一部が標
的結合領域を形成する）を含むごく小領域の核酸が組換
え技術によシこの種のクローニングベクターのいずれに
も挿入されるであろう。プローブポリヌクレオチド配列
でないクローニング挿入体の残部は（あるとすれば）標
的ヌクレオチド配列に対し異種のポリヌクレオチド配列
のいずれからも好都合に選択することができる。本発明
の特定の実施態様においては、この種の異種配列には特
定の特性（たとえば特異な制限酵素識別部位の存在）の
ために慎重に選ばれた配列が含まれる。
的結合領域を形成する）を含むごく小領域の核酸が組換
え技術によシこの種のクローニングベクターのいずれに
も挿入されるであろう。プローブポリヌクレオチド配列
でないクローニング挿入体の残部は（あるとすれば）標
的ヌクレオチド配列に対し異種のポリヌクレオチド配列
のいずれからも好都合に選択することができる。本発明
の特定の実施態様においては、この種の異種配列には特
定の特性（たとえば特異な制限酵素識別部位の存在）の
ために慎重に選ばれた配列が含まれる。
ある条件下では、遺伝子全体、または遺伝子全体を含む
配列を挿入体として使用できる（ベクタープラス挿入ヌ
クレオチド配列は環状または線状）。
配列を挿入体として使用できる（ベクタープラス挿入ヌ
クレオチド配列は環状または線状）。
プローブポリヌクレオチドが製造時に二本鎖である場合
には、普通は単離ののち変性（熱により、ｐＨ調整によ
り、または他の一般的方法による塩基対破壊により）を
行う。開裂（特に制限酵素妃よυ、または部位特異的な
化学的開裂によシ）を普通は用いて目的とする線状の二
本鎖セグメントを形成させ、また二本鎖の環状形態が生
長している場合は変性の前に開裂が行われるであろう。
には、普通は単離ののち変性（熱により、ｐＨ調整によ
り、または他の一般的方法による塩基対破壊により）を
行う。開裂（特に制限酵素妃よυ、または部位特異的な
化学的開裂によシ）を普通は用いて目的とする線状の二
本鎖セグメントを形成させ、また二本鎖の環状形態が生
長している場合は変性の前に開裂が行われるであろう。
場合によっては個々の連鎖を二本鎖構造から精製して個
々にプローブポリヌクレオチドとして（あるいは一方を
プローブポリヌクレオチドゞとし、一方を標識ポリヌク
レオチドとして）用いることが好ましい。この精製は標
準的方法、たとえば変性用ゲル電気泳動またはアフィニ
ティクロマトグラフイーにより行うことができる。場合
によっては、一本領ベクター（たとえばＭ３バクテリオ
ファージ）を用いる複製によりプローブポリヌクレオチ
ドが一本鎖分子として製造される。
々にプローブポリヌクレオチドとして（あるいは一方を
プローブポリヌクレオチドゞとし、一方を標識ポリヌク
レオチドとして）用いることが好ましい。この精製は標
準的方法、たとえば変性用ゲル電気泳動またはアフィニ
ティクロマトグラフイーにより行うことができる。場合
によっては、一本領ベクター（たとえばＭ３バクテリオ
ファージ）を用いる複製によりプローブポリヌクレオチ
ドが一本鎖分子として製造される。
他の場合には、ヌクレオチド配列が化学合成するのに十
分なほど短い場合（現在はヌクレオチド１００個以下の
長さ）、有機化学合成法によシプローブポリヌクレオチ
トゞ（またはプローブポリヌクレオチドの鋳型もしくは
モデル）の一部または全部を製造することができる。次
いでこの化学的に合成されたＤＮＡをプローブポリヌク
レオチドとして直接に使用することができ、あるいは適
切なプラスミドまたは他のベクターのゲノムに挿入し、
生物学的に複製することができる。複製されたＤＮＡ
（またはこれから転写されたＲＮＡ）は適切な操作、た
とえば制限酵素開裂および連鎖精製ののちにプローブポ
リヌクレオチドとして使用できる。化学的に合成された
ＤＮＡは最終的なプローブポリヌクレオチドまたはその
一部に相当するか、または相補的である。
分なほど短い場合（現在はヌクレオチド１００個以下の
長さ）、有機化学合成法によシプローブポリヌクレオチ
トゞ（またはプローブポリヌクレオチドの鋳型もしくは
モデル）の一部または全部を製造することができる。次
いでこの化学的に合成されたＤＮＡをプローブポリヌク
レオチドとして直接に使用することができ、あるいは適
切なプラスミドまたは他のベクターのゲノムに挿入し、
生物学的に複製することができる。複製されたＤＮＡ
（またはこれから転写されたＲＮＡ）は適切な操作、た
とえば制限酵素開裂および連鎖精製ののちにプローブポ
リヌクレオチドとして使用できる。化学的に合成された
ＤＮＡは最終的なプローブポリヌクレオチドまたはその
一部に相当するか、または相補的である。
結合セグメントがホモポリヌクレオチド配列（たとえば
ポＩＪ （ｄＣ） ） である場合、この配列を化学
的に合成し、同一ゲノムに挿入して最終的にプローブポ
リヌクレオチド配列内に出現させることができる。ある
いは（後記の例に示すように）ホモポリヌクレオチド配
列をプローブポリヌクレオチドに（ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼの場合はその３′末
端に）加入する（たとえばターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼによシ）ことができる。
ポＩＪ （ｄＣ） ） である場合、この配列を化学
的に合成し、同一ゲノムに挿入して最終的にプローブポ
リヌクレオチド配列内に出現させることができる。ある
いは（後記の例に示すように）ホモポリヌクレオチド配
列をプローブポリヌクレオチドに（ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼの場合はその３′末
端に）加入する（たとえばターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼによシ）ことができる。
本発明の試薬および方法に用いられる標識ポリヌクレオ
チドは一般にプローブポリヌクレオチドよりも小さなり
ＮＡ片またはＲＮＡ片であり、重要な２つの特色をもつ
。すなわち（ａｌプローズに特異的な座において安定に
、ただし可逆的に結合すること、およびｆｂ）特に置換
後の検出に対し標識が感受性であることである。これら
の特色についてここで別個に論じ、次いで特定の種類の
標識が安定性および置換に対して与える効果について考
察する。
チドは一般にプローブポリヌクレオチドよりも小さなり
ＮＡ片またはＲＮＡ片であり、重要な２つの特色をもつ
。すなわち（ａｌプローズに特異的な座において安定に
、ただし可逆的に結合すること、およびｆｂ）特に置換
後の検出に対し標識が感受性であることである。これら
の特色についてここで別個に論じ、次いで特定の種類の
標識が安定性および置換に対して与える効果について考
察する。
標識ポリヌクレオチドとプローブポリヌクレオチドの対
合は、試料の標的ヌクレオチド配列とプローブの対合よ
シも少数の塩基にわたって行われる。大部分の場合、標
識ポリヌクレオチドが特異的に結合するプローブポリヌ
クレオチドの塩基は、のちに試料のヌクレオチド配列に
結合するプローブの塩基のうちの部分群であり、従って
上記においてプローブの標的結合領域と呼ばれるものの
一部をなす。
合は、試料の標的ヌクレオチド配列とプローブの対合よ
シも少数の塩基にわたって行われる。大部分の場合、標
識ポリヌクレオチドが特異的に結合するプローブポリヌ
クレオチドの塩基は、のちに試料のヌクレオチド配列に
結合するプローブの塩基のうちの部分群であり、従って
上記においてプローブの標的結合領域と呼ばれるものの
一部をなす。
標識ポリヌクレオチド結合領域（ＬＢＨ） という語
は、ここでは複合体において標識ポリヌクレオチドが結
合するプローブ内塩基配列を意味する。
は、ここでは複合体において標識ポリヌクレオチドが結
合するプローブ内塩基配列を意味する。
好ましい実施態様（すべての図面に示されるもの）にお
いては、標識ポリヌクレオチド結合領域は全体として標
的結合領域の一部である。他の実施態様（米国特許出願
第６０７．８８５号明細書の第１Ｇ図を参照されたい）
においては標識結合領域の一部のみ（ただし大部分であ
ることが好ましい）が標的結合領域の一部である。プロ
ーブポリヌクレオチドの標的結合領域外の標識ポリヌク
レオチド結合領域の長さが塩基約１５個以上であるもの
は、唯一の付着がこの領域における対合を介して行われ
るとプローブから標識ポリヌクレオチドが会合解除され
るのが困難になる可能性があるため好ましくない。ある
種の好ましい実施態様においては、標識ポリヌクレオチ
ドが結合するプローブポリヌクレオチドの領域はプロー
ブポリヌクレオチドのこの比較的大きな領域の部分群で
あり、のちに結合する試料の標的ヌクレオチド配列の一
末端またはその付近にある。
いては、標識ポリヌクレオチド結合領域は全体として標
的結合領域の一部である。他の実施態様（米国特許出願
第６０７．８８５号明細書の第１Ｇ図を参照されたい）
においては標識結合領域の一部のみ（ただし大部分であ
ることが好ましい）が標的結合領域の一部である。プロ
ーブポリヌクレオチドの標的結合領域外の標識ポリヌク
レオチド結合領域の長さが塩基約１５個以上であるもの
は、唯一の付着がこの領域における対合を介して行われ
るとプローブから標識ポリヌクレオチドが会合解除され
るのが困難になる可能性があるため好ましくない。ある
種の好ましい実施態様においては、標識ポリヌクレオチ
ドが結合するプローブポリヌクレオチドの領域はプロー
ブポリヌクレオチドのこの比較的大きな領域の部分群で
あり、のちに結合する試料の標的ヌクレオチド配列の一
末端またはその付近にある。
標識ポリヌクレオチドへの他の形のプローブ付着もあシ
うるが、一般には好ましくない。このような他の付着は
、置換の前、途中またはその後（いずれにしろ本方法の
測定工程の前）に除く必要がある。一本領プローブ上の
多数標識ポリヌクレオチド（米国特許出願第６０７．８
８５号明細書の第６図およびこれに付随する記述中に示
される）は、１回の置換反応につきより多数の置換標識
が望まれる場合に特に利用できる本発明の一形態である
。
うるが、一般には好ましくない。このような他の付着は
、置換の前、途中またはその後（いずれにしろ本方法の
測定工程の前）に除く必要がある。一本領プローブ上の
多数標識ポリヌクレオチド（米国特許出願第６０７．８
８５号明細書の第６図およびこれに付随する記述中に示
される）は、１回の置換反応につきより多数の置換標識
が望まれる場合に特に利用できる本発明の一形態である
。
プローブの標識ポリヌクレオチド結合領域のサイズ自体
は本発明に決定的ではない。多様なこのサイズは、たと
えば置換工程（前記の接触工程（ｂ））の温度、および
試料標的ヌクレオチド配列が結合するプローブ領域のサ
イズを変更することにより補正できるからである。標識
ポリヌクレオチド結合領域（および対応する標識ポリヌ
クレオチドの塩基配列）に関する一般に好ましいサイズ
は、少なくとも約１５個の塩基、好ましくは少なくとも
約２０個の塩基、より好ましくは少なくとも約２５個の
塩基である。好ましい範囲は塩基約２０〜約５００個（
１０００個までの塩基も好ましい）、特に塩基約２５〜
約２００個である。異常に短い対合セグメント（ＧＣ塩
基含量などの因子に注目して）をもつ標識ポリヌクレオ
チドは、置換工程の温度が高すぎる場合（融点に影響を
与える塩濃度などの因子をも考慮して）、プローブから
非特異的に解離するであろう。ディー・フライフエルダ
ーらの”パイオボリマーズ１．７巻、８１−９３頁（１
９６９年）を参照されたい。異常に長い対合セグメント
（たとえば１０００個を越える塩基）には本質的な利点
はない。このように長い対合セグメントは時にはより好
ましくない。この場合、プローブの総体的な標的ヌクレ
オチド領域が長くなり、標識ポリヌクレオチドを効果的
に置換するためには必然的により長い標的ヌクレオチド
配列が必要だからである。また標的ポリヌクレオチドの
結合部分も、長すぎる場合には小型のポリヌクレオチド
に用いられる、あるいはこれに最適な特定の技術（たと
えば標識ポリヌクレオチド全体の有機化学合成）によっ
ては、もはや製造できないからである。有機化学合成は
現在のところ約１００以下、特に約６０以下の標識ポリ
ヌクレオチド結合領域については一般に比較的容易であ
るが、この種の合成技術の改良によってよシ長い配列も
容易に製造できるようになるであろう。
は本発明に決定的ではない。多様なこのサイズは、たと
えば置換工程（前記の接触工程（ｂ））の温度、および
試料標的ヌクレオチド配列が結合するプローブ領域のサ
イズを変更することにより補正できるからである。標識
ポリヌクレオチド結合領域（および対応する標識ポリヌ
クレオチドの塩基配列）に関する一般に好ましいサイズ
は、少なくとも約１５個の塩基、好ましくは少なくとも
約２０個の塩基、より好ましくは少なくとも約２５個の
塩基である。好ましい範囲は塩基約２０〜約５００個（
１０００個までの塩基も好ましい）、特に塩基約２５〜
約２００個である。異常に短い対合セグメント（ＧＣ塩
基含量などの因子に注目して）をもつ標識ポリヌクレオ
チドは、置換工程の温度が高すぎる場合（融点に影響を
与える塩濃度などの因子をも考慮して）、プローブから
非特異的に解離するであろう。ディー・フライフエルダ
ーらの”パイオボリマーズ１．７巻、８１−９３頁（１
９６９年）を参照されたい。異常に長い対合セグメント
（たとえば１０００個を越える塩基）には本質的な利点
はない。このように長い対合セグメントは時にはより好
ましくない。この場合、プローブの総体的な標的ヌクレ
オチド領域が長くなり、標識ポリヌクレオチドを効果的
に置換するためには必然的により長い標的ヌクレオチド
配列が必要だからである。また標的ポリヌクレオチドの
結合部分も、長すぎる場合には小型のポリヌクレオチド
に用いられる、あるいはこれに最適な特定の技術（たと
えば標識ポリヌクレオチド全体の有機化学合成）によっ
ては、もはや製造できないからである。有機化学合成は
現在のところ約１００以下、特に約６０以下の標識ポリ
ヌクレオチド結合領域については一般に比較的容易であ
るが、この種の合成技術の改良によってよシ長い配列も
容易に製造できるようになるであろう。
標識ポリヌクレオチド（および標識ポリヌクレオチド結
合領域）の最小の長さは、主として試薬複合体の安定性
に関係がある。長さ以外でこの安定性に影響を与える因
子には、ＧＯ塩基含量（これが融点に与える影響は周知
である）および内部塩基対不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）
が含まれる。融点測定は安定性、および１もしくは２以
上の内部塩基対不整合をもつ配列に関して同等の有効長
さを達成するために有用な方法である。たとえば内部不
整合１か所をもつ塩基３０個の配列（従って正確には２
９対のみ）はより短かい正確に整合した配列と同様な効
力をもつであろう（少なくとも試薬複合体の安定性に関
して）。塩基２９対の挙動との相違の種度は、塩基対不
整合の位置およびなされた塩基交換に依存するであろう
。有効長さは、不整合対がプリン／プリン、プリン／ピ
リミジン、またはピリミジン／ピリミジンのいずれであ
るかに応じて異なると予想できる。しかし融点測定によ
シ経験的に決定できる。この方法においては、アール・
エル・オルンスタインおよびジエイ・アール・フレスコ
、′バイオボリマーズ１．２２巻、１９７９−２０００
頁（１９８３年）などの報文に示されるように、１種ま
たは一連のプローブ／標識ポリヌクレオチド複合体に種
々の様式の温度を与える。プローブと不整合を含む標識
ポリヌクレオチドとの複合体の融点を測定し、この値を
同一プローブホＩＪヌクレオチド上のわずかに短い長さ
の対合（ただし対合領域内の整合は完全である）との複
合体の融点と比較することによって、不整合を含む標識
ポリヌクレオチドの有効対合長さを推定し、上記の好ま
しい範囲およびより好ましい範囲に適用できる。しかし
融点に基づく上記の相関は主として簡便な推定手段とし
て意図されるものである。一定の標識ポリヌクレオチド
結合領域に関する実際の慶位度は、一部は、試薬の貯蔵
に際して、または使用条件下で同種でない核酸と接触す
る際に標識ホＩＪヌクレオチドが実際にどの程度複合体
中に保留されるかに基づく（ただし標的ヌクレオチド配
列を含む核酸によってはなお置換される）。不整合は許
容されるが一般に好ましくはなく、存在する場合は一般
に対合領域のｂ以上を構成せず、好ましくは清０以上を
構成しない（たとえば標識ポリヌクレオチド／プローブ
ポリヌクレオチド対合の領域が塩基対３０の長さである
場合、不整合が最高３、整合が２７）。
合領域）の最小の長さは、主として試薬複合体の安定性
に関係がある。長さ以外でこの安定性に影響を与える因
子には、ＧＯ塩基含量（これが融点に与える影響は周知
である）および内部塩基対不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）
が含まれる。融点測定は安定性、および１もしくは２以
上の内部塩基対不整合をもつ配列に関して同等の有効長
さを達成するために有用な方法である。たとえば内部不
整合１か所をもつ塩基３０個の配列（従って正確には２
９対のみ）はより短かい正確に整合した配列と同様な効
力をもつであろう（少なくとも試薬複合体の安定性に関
して）。塩基２９対の挙動との相違の種度は、塩基対不
整合の位置およびなされた塩基交換に依存するであろう
。有効長さは、不整合対がプリン／プリン、プリン／ピ
リミジン、またはピリミジン／ピリミジンのいずれであ
るかに応じて異なると予想できる。しかし融点測定によ
シ経験的に決定できる。この方法においては、アール・
エル・オルンスタインおよびジエイ・アール・フレスコ
、′バイオボリマーズ１．２２巻、１９７９−２０００
頁（１９８３年）などの報文に示されるように、１種ま
たは一連のプローブ／標識ポリヌクレオチド複合体に種
々の様式の温度を与える。プローブと不整合を含む標識
ポリヌクレオチドとの複合体の融点を測定し、この値を
同一プローブホＩＪヌクレオチド上のわずかに短い長さ
の対合（ただし対合領域内の整合は完全である）との複
合体の融点と比較することによって、不整合を含む標識
ポリヌクレオチドの有効対合長さを推定し、上記の好ま
しい範囲およびより好ましい範囲に適用できる。しかし
融点に基づく上記の相関は主として簡便な推定手段とし
て意図されるものである。一定の標識ポリヌクレオチド
結合領域に関する実際の慶位度は、一部は、試薬の貯蔵
に際して、または使用条件下で同種でない核酸と接触す
る際に標識ホＩＪヌクレオチドが実際にどの程度複合体
中に保留されるかに基づく（ただし標的ヌクレオチド配
列を含む核酸によってはなお置換される）。不整合は許
容されるが一般に好ましくはなく、存在する場合は一般
に対合領域のｂ以上を構成せず、好ましくは清０以上を
構成しない（たとえば標識ポリヌクレオチド／プローブ
ポリヌクレオチド対合の領域が塩基対３０の長さである
場合、不整合が最高３、整合が２７）。
標識ホリヌクレオチドは対合領域のほかに、プローブポ
リヌクレオチドに特異的に結合しないヌクレオチドの領
域を含みうる。これらの領域は対合領域を検出可能な標
識に結合させる作用をもち、あるいは自身が標識され（
たとえば放射性標識により、あるいは間接的マーカーた
とえばアビジンまたはビオチンへの共有結合により）、
あるいは何ら特別な機能なしに存在する。標識ポリヌク
レオチド自体は線状または環状のいずれであってもよく
、対合領域以外の領域は二本鎖であってもよい（ただし
二本鎖でない方が好ましい）。標識ポリヌクレオチドは
プローブポリヌクレオチドゝが環状である場合には環状
でないことが好ましい。
リヌクレオチドに特異的に結合しないヌクレオチドの領
域を含みうる。これらの領域は対合領域を検出可能な標
識に結合させる作用をもち、あるいは自身が標識され（
たとえば放射性標識により、あるいは間接的マーカーた
とえばアビジンまたはビオチンへの共有結合により）、
あるいは何ら特別な機能なしに存在する。標識ポリヌク
レオチド自体は線状または環状のいずれであってもよく
、対合領域以外の領域は二本鎖であってもよい（ただし
二本鎖でない方が好ましい）。標識ポリヌクレオチドは
プローブポリヌクレオチドゝが環状である場合には環状
でないことが好ましい。
１個または２個以上の検出可能な標識が一般に標識ポリ
ヌクレオチドゝに沿った１か所または数か所に（特に標
識が放射性核種またはビオチンなどである場合）、ある
いは一方の末端に、あるいは内部の特定の位置１か所の
みに（たとえばプローブポリヌクレオチドに対する塩基
対合に関与していないプリンまたはピリミジン塩基に）
位置してもよい（常法による）。試薬複合体中において
対合しない標識ポリヌクレオチドの領域が少なくとも１
か所あるならは、標識はこのような対合していない領域
上またはその範囲内に存在するかまたは集中しているこ
とが好ましい。使用できる直接に検出可能な標識には放
射性核種（特に３２ｐ、３５Ｓ１１４Ｃまたは１２５Ｉ
標識ヌクレオチド）、蛍光分子（たとえば標識ホリヌ
クレオチドの遊離末端に、または標識ポリヌクレオチド
の非対合塩基１または２以上に付着したフルオレセイン
誘導体またはローダミン誘導体）、または他の手段（解
裂することを含みうる）により検出できる部分、たとえ
ばハプテン性部分であるニトロフェノールが含まれる。
ヌクレオチドゝに沿った１か所または数か所に（特に標
識が放射性核種またはビオチンなどである場合）、ある
いは一方の末端に、あるいは内部の特定の位置１か所の
みに（たとえばプローブポリヌクレオチドに対する塩基
対合に関与していないプリンまたはピリミジン塩基に）
位置してもよい（常法による）。試薬複合体中において
対合しない標識ポリヌクレオチドの領域が少なくとも１
か所あるならは、標識はこのような対合していない領域
上またはその範囲内に存在するかまたは集中しているこ
とが好ましい。使用できる直接に検出可能な標識には放
射性核種（特に３２ｐ、３５Ｓ１１４Ｃまたは１２５Ｉ
標識ヌクレオチド）、蛍光分子（たとえば標識ホリヌ
クレオチドの遊離末端に、または標識ポリヌクレオチド
の非対合塩基１または２以上に付着したフルオレセイン
誘導体またはローダミン誘導体）、または他の手段（解
裂することを含みうる）により検出できる部分、たとえ
ばハプテン性部分であるニトロフェノールが含まれる。
間接的に検出できる標識には、免疫化学その他のアフィ
ニティ反応により認識できる・抗原決定因子、アフィニ
ティ試薬、抗原または抗体、たとえば欧州特許第６３，
８７９号、国際特許出願公開８３１０２２７７号、およ
び欧州特許第９７、３７３号に記載されたもの、前記の
もの、ならびに標識ポリヌクレオチド中に存在するかま
たはこれに添加されたビオチニル化ヌクレオチドゝによ
り例示されるもの（たとえば多数のヌクレオチドを鋳型
連鎖の不存在下で標識１ ＋）ヌクレオチドの３′末端
に挿入する酵素ターミナルテオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼによって）が含まれる。他の間接標識に
は標識ポリスクレオチドに（特にプローグに対合した領
域から離れた遊離末端に）付着した酵素が含まれ、その
存在はこの方法の置換工程および分離工程後に、その酵
素に対する基質を添加し、酵素基質または好ましくは酵
素生成物を定量することにより測定できる。同様に、標
識はアポ酵素、補酵素、酵素系修飾剤などであってもよ
く、他の必要な試薬は通常は置換およびアフィニティ分
離後に適宜な酵素基質と共に添加される。もちろん、酵
素反応が１種（たとえば基質）を除くすべての成分が存
在しても起こり得ないならは、これらの他の試薬が前記
の置換工程（ｂ）に際して溶液中に存在しうる。標識ホ
ＩＪヌクレオチドの製造に際して（たとえばターミナル
テオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ酵素により
）、多数の標識を添加することができる。多重標識ホＩ
Ｊヌクレオチド、たとえば酬累（またはアイ酵素）を含
有するもの、および補酵素を含有するものも使用できる
。標識ホリヌクレオチドへの酵素の付着の一様式はアフ
ィニティ試薬、たとえばストレプトアビジン／ビオチン
を介したものである。第２Ｂ図に示すように、この様式
はビオチン標識ポリスクレオチドをプローブに７・イブ
リットゝ形成させ、次いでストレプトアビジン−酵素結
合体をビオチニル化ポリヌクレオチドに結合させること
により試薬複合体を製造し、次いでアフィニティ分離（
本発明方法の一部）により試薬複合体を未結合体から精
製し、次いで本方法の置換工程（ｂｌを行う実施態様に
使用できる。また、たとえばストレプトアビジン−酵素
をビオチン標識ポリヌクレオチドに結合させ、次いでこ
のストレプトアビジン−酵素標識ポリヌクレオチドゝを
プローブポリヌクレオチドに）・イズリツビ形成させ、
次いで前記のアフィニティ分離法により試薬複合体を未
結合のストレプトアビジン−酵素結合体から精製するこ
とができる。さらに、米国特許出願６０７．８８５号明
細書の第３Ａ−３Ｄ図に示されるように、試薬複合体中
の標識ポリヌクレオチドの標識と相互作用する別個の検
出可能な部分がプローブ上に存在してもよい。
ニティ反応により認識できる・抗原決定因子、アフィニ
ティ試薬、抗原または抗体、たとえば欧州特許第６３，
８７９号、国際特許出願公開８３１０２２７７号、およ
び欧州特許第９７、３７３号に記載されたもの、前記の
もの、ならびに標識ポリヌクレオチド中に存在するかま
たはこれに添加されたビオチニル化ヌクレオチドゝによ
り例示されるもの（たとえば多数のヌクレオチドを鋳型
連鎖の不存在下で標識１ ＋）ヌクレオチドの３′末端
に挿入する酵素ターミナルテオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼによって）が含まれる。他の間接標識に
は標識ポリスクレオチドに（特にプローグに対合した領
域から離れた遊離末端に）付着した酵素が含まれ、その
存在はこの方法の置換工程および分離工程後に、その酵
素に対する基質を添加し、酵素基質または好ましくは酵
素生成物を定量することにより測定できる。同様に、標
識はアポ酵素、補酵素、酵素系修飾剤などであってもよ
く、他の必要な試薬は通常は置換およびアフィニティ分
離後に適宜な酵素基質と共に添加される。もちろん、酵
素反応が１種（たとえば基質）を除くすべての成分が存
在しても起こり得ないならは、これらの他の試薬が前記
の置換工程（ｂ）に際して溶液中に存在しうる。標識ホ
ＩＪヌクレオチドの製造に際して（たとえばターミナル
テオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ酵素により
）、多数の標識を添加することができる。多重標識ホＩ
Ｊヌクレオチド、たとえば酬累（またはアイ酵素）を含
有するもの、および補酵素を含有するものも使用できる
。標識ホリヌクレオチドへの酵素の付着の一様式はアフ
ィニティ試薬、たとえばストレプトアビジン／ビオチン
を介したものである。第２Ｂ図に示すように、この様式
はビオチン標識ポリスクレオチドをプローブに７・イブ
リットゝ形成させ、次いでストレプトアビジン−酵素結
合体をビオチニル化ポリヌクレオチドに結合させること
により試薬複合体を製造し、次いでアフィニティ分離（
本発明方法の一部）により試薬複合体を未結合体から精
製し、次いで本方法の置換工程（ｂｌを行う実施態様に
使用できる。また、たとえばストレプトアビジン−酵素
をビオチン標識ポリヌクレオチドに結合させ、次いでこ
のストレプトアビジン−酵素標識ポリヌクレオチドゝを
プローブポリヌクレオチドに）・イズリツビ形成させ、
次いで前記のアフィニティ分離法により試薬複合体を未
結合のストレプトアビジン−酵素結合体から精製するこ
とができる。さらに、米国特許出願６０７．８８５号明
細書の第３Ａ−３Ｄ図に示されるように、試薬複合体中
の標識ポリヌクレオチドの標識と相互作用する別個の検
出可能な部分がプローブ上に存在してもよい。
標識ポリヌクレオチドの標識のほかに、標識ポリヌクレ
オチドのセクションが検出可能な標識として作動しても
よい。シー・バリーらの出願明細書（出願審査中）にお
いては、標識ポリヌクレオチドｆ（信号銀）の３′末端
リボヌクレオチド９セグメントは消化してリボヌクレオ
シドリン酸（ＡＤＰまたは場合によりＡＭＰを含む）と
なし、リン酸化してＡＴＰとなし、次いでルシフェリン
とのルシフェラーゼ触媒反応によって検出できる。上記
明細書のこれに関連する記述をここに参考として引用す
る。
オチドのセクションが検出可能な標識として作動しても
よい。シー・バリーらの出願明細書（出願審査中）にお
いては、標識ポリヌクレオチドｆ（信号銀）の３′末端
リボヌクレオチド９セグメントは消化してリボヌクレオ
シドリン酸（ＡＤＰまたは場合によりＡＭＰを含む）と
なし、リン酸化してＡＴＰとなし、次いでルシフェリン
とのルシフェラーゼ触媒反応によって検出できる。上記
明細書のこれに関連する記述をここに参考として引用す
る。
大部分の形の標識は、特にプローブに対する標識ホリヌ
クレオチトゝの対合領域から離れている場合は、試薬複
合体の融点がほとんどまたは全く低下しないことにより
、またより重要な点は標的ヌクレオチド配列とプローブ
ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成反応に対する影
響が無視できる程度であることにより証明されるように
（試験の目的で）、標識ポリヌクレオチドとプローブポ
リヌクレオチドとの塩基対合の強さにほとんど影響を与
えないであろう。ある様式の標識、たとえば標識ポリヌ
クレオチドの対合領域のヌクレオチド上に特定の化学的
方法により共有結合したビオチン、およびたとえばヌク
レオチドの対合領域またはその付近に結合した大型の酵
素分子または蛍光性部分は、試薬複合体の安定性に対し
て認識できるほどの影響をもつ。このような影響は一般
に標識ポリヌクレオチド／プローブポリヌクレオチド９
の結合の安定性を低下させる（従ってその融点を低下さ
せる）ことであろう。この影響は置換の速度を高めるの
には若干有益であるかも知れないが、標識ポリヌクレオ
チドの非特異的な解離または脱落を増大させる可能性が
ある。しかしこのような非特異的脱落は、置換工程に際
しての温度を高めることにより、標識ポリヌクレオチド
ゝ結合領域の長さを増大させることにより、二重らせん
形成を安定化する試薬、たとえばＭｇ＋＋ イオンまた
はスズルミジンを添加することにより、またはこの種の
他の物理的手段により通常は減少させることができる。
クレオチトゝの対合領域から離れている場合は、試薬複
合体の融点がほとんどまたは全く低下しないことにより
、またより重要な点は標的ヌクレオチド配列とプローブ
ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成反応に対する影
響が無視できる程度であることにより証明されるように
（試験の目的で）、標識ポリヌクレオチドとプローブポ
リヌクレオチドとの塩基対合の強さにほとんど影響を与
えないであろう。ある様式の標識、たとえば標識ポリヌ
クレオチドの対合領域のヌクレオチド上に特定の化学的
方法により共有結合したビオチン、およびたとえばヌク
レオチドの対合領域またはその付近に結合した大型の酵
素分子または蛍光性部分は、試薬複合体の安定性に対し
て認識できるほどの影響をもつ。このような影響は一般
に標識ポリヌクレオチド／プローブポリヌクレオチド９
の結合の安定性を低下させる（従ってその融点を低下さ
せる）ことであろう。この影響は置換の速度を高めるの
には若干有益であるかも知れないが、標識ポリヌクレオ
チドの非特異的な解離または脱落を増大させる可能性が
ある。しかしこのような非特異的脱落は、置換工程に際
しての温度を高めることにより、標識ポリヌクレオチド
ゝ結合領域の長さを増大させることにより、二重らせん
形成を安定化する試薬、たとえばＭｇ＋＋ イオンまた
はスズルミジンを添加することにより、またはこの種の
他の物理的手段により通常は減少させることができる。
各種不純物からの試薬複合体の予備分離は、しばしばそ
うであるように標識ポリヌクレオチドゝがプローブポリ
ヌクレオチドまたは複合体よりも大幅に小さい場合はサ
イズのみで、たとえばサイズ排除りＯマドグラフィー（
ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ）により行うことができる。小さな内部結合領域
以外は一本鎖状であると考えられる標識ポリヌクレオチ
ドまたはプローブポリヌクレオチド中に存在しないと思
われる複合体の二本鎖部分（プローブの標識ポリヌクレ
オチド結合領域における）に基づいてこのような分離を
行うこともできる。この特性により試薬複合体を未結合
標識ポリヌクレオチドまたはプローブ鎖から、たとえば
二本鎖に特異的な抗核酸抗体を用いるアフィニティクロ
マトグラフイー、またはヒト９０キシルアパタイトクロ
マトグラフイーにより分離することができる。
うであるように標識ポリヌクレオチドゝがプローブポリ
ヌクレオチドまたは複合体よりも大幅に小さい場合はサ
イズのみで、たとえばサイズ排除りＯマドグラフィー（
ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ）により行うことができる。小さな内部結合領域
以外は一本鎖状であると考えられる標識ポリヌクレオチ
ドまたはプローブポリヌクレオチド中に存在しないと思
われる複合体の二本鎖部分（プローブの標識ポリヌクレ
オチド結合領域における）に基づいてこのような分離を
行うこともできる。この特性により試薬複合体を未結合
標識ポリヌクレオチドまたはプローブ鎖から、たとえば
二本鎖に特異的な抗核酸抗体を用いるアフィニティクロ
マトグラフイー、またはヒト９０キシルアパタイトクロ
マトグラフイーにより分離することができる。
プローブポリヌクレオチド９と標識ポリヌクレオチドの
ハイブリッド形成により試薬複合体を形成させる処理工
程には（後記の理由から）過剰モルの標識ポリヌクレオ
チドが必要であろう。これらの条件下では特に、・・イ
ブリッド形成反応後に試薬複合体溶液から、・・イブリ
ッド形成反応に関与せず従って溶液中で遊離しているか
または・・イブリッドを形成していない標識ポリヌクレ
オチド分子を除去することが望ましい。
ハイブリッド形成により試薬複合体を形成させる処理工
程には（後記の理由から）過剰モルの標識ポリヌクレオ
チドが必要であろう。これらの条件下では特に、・・イ
ブリッド形成反応後に試薬複合体溶液から、・・イブリ
ッド形成反応に関与せず従って溶液中で遊離しているか
または・・イブリッドを形成していない標識ポリヌクレ
オチド分子を除去することが望ましい。
このために、本発明の可逆的結合工程で試薬複合体をプ
ローブポリヌクレオチドゝの結合セグメントに対する固
定化されたアフィニティ試薬上に導通する。一般にアフ
ィニティ試薬により固定化された試薬複合体の形成に続
いて、結合していない標識ポリヌクレオチド、ならびに
検出可能な標識もしくは他の標識部分と標識ポリヌクレ
オチドのヌクレオチドとの結合に用いられた他の化学試
薬（たとえばストレプトアビジン−酵素結合体）を洗浄
除去する。このような洗浄は、わずかに結合した（たと
えば目的とする結合部位における１５個以上の相補的塩
基によってではなく、プローブ上の他の位置でこれより
も少数の相補的塩基によって）、または非特異的な様式
で支持体に結合した標識ポリヌクレオチドをも除去する
ようにデザインされる。プローブポリヌクレオチドゝ、
およびかろうじて支持体に付着しているにすぎない、プ
ローブポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドとの複
合体もこの洗浄工程中に除去されるであろう。洗浄は、
その後本発明方法の置換工程（’ｂ）において特異的置
換とは無関係にプローブから分離するかまたは分離され
る標識ホ、 ＩＪヌクレオチド（プローブポリヌクレオ
チドを含むもの、または含まないもの）に基づく非特異
的バックグラウンド信号を実質的に除去するのに十分な
条件下で、それに十分な期間行うことが好ましい。支持
体上の非特異的結合部位を遮断するための試薬（たとえ
ば蛋白質）を使用してもよい。このような洗浄ののち、
たとえば低濃度のイオン種（たとえば１０ｍＭ・トリス
ＨＣｌ、 １． Ｑ ｍＭ −ＥＤＴＡ％ｐＨ７，５）
を含有する緩衝液でアフィニティマトリックスを洗浄す
ることにより、試薬複合体を固定化されたアフィニティ
試薬から離脱させる。このように低いイオン強度は、相
補的塩基対の短いセグメント（たとえば支持体上の塩基
３〜１０個のホ１Ｊ（ｄＧ）対プローブポリヌクレオチ
ドの結合セグメントにおける塩基３〜１０個のポ１ｃＬ
ｃ）） を結合解除するために有効である。
ローブポリヌクレオチドゝの結合セグメントに対する固
定化されたアフィニティ試薬上に導通する。一般にアフ
ィニティ試薬により固定化された試薬複合体の形成に続
いて、結合していない標識ポリヌクレオチド、ならびに
検出可能な標識もしくは他の標識部分と標識ポリヌクレ
オチドのヌクレオチドとの結合に用いられた他の化学試
薬（たとえばストレプトアビジン−酵素結合体）を洗浄
除去する。このような洗浄は、わずかに結合した（たと
えば目的とする結合部位における１５個以上の相補的塩
基によってではなく、プローブ上の他の位置でこれより
も少数の相補的塩基によって）、または非特異的な様式
で支持体に結合した標識ポリヌクレオチドをも除去する
ようにデザインされる。プローブポリヌクレオチドゝ、
およびかろうじて支持体に付着しているにすぎない、プ
ローブポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドとの複
合体もこの洗浄工程中に除去されるであろう。洗浄は、
その後本発明方法の置換工程（’ｂ）において特異的置
換とは無関係にプローブから分離するかまたは分離され
る標識ホ、 ＩＪヌクレオチド（プローブポリヌクレオ
チドを含むもの、または含まないもの）に基づく非特異
的バックグラウンド信号を実質的に除去するのに十分な
条件下で、それに十分な期間行うことが好ましい。支持
体上の非特異的結合部位を遮断するための試薬（たとえ
ば蛋白質）を使用してもよい。このような洗浄ののち、
たとえば低濃度のイオン種（たとえば１０ｍＭ・トリス
ＨＣｌ、 １． Ｑ ｍＭ −ＥＤＴＡ％ｐＨ７，５）
を含有する緩衝液でアフィニティマトリックスを洗浄す
ることにより、試薬複合体を固定化されたアフィニティ
試薬から離脱させる。このように低いイオン強度は、相
補的塩基対の短いセグメント（たとえば支持体上の塩基
３〜１０個のホ１Ｊ（ｄＧ）対プローブポリヌクレオチ
ドの結合セグメントにおける塩基３〜１０個のポ１ｃＬ
ｃ）） を結合解除するために有効である。
しかし後記の例２に示すように、場合によっては徹底的
な洗浄を行わないアフィニティカラムを用いても、未結
合の標識ポリヌクレオチドを含まない試薬複合体が適宜
に精製される。
な洗浄を行わないアフィニティカラムを用いても、未結
合の標識ポリヌクレオチドを含まない試薬複合体が適宜
に精製される。
使用する際には、試料材料（標的ヌクレオチド配列を含
む核酸を含有する可能性がある）との実際の接触まだは
置換の工程は、普通は上記の製造過程での洗浄工程より
も厳格でない温度、イオン強度および時間の条件下で（
従って標識ポリヌクレオチドの非特異的解離または結合
解除がよυ生じにくい）行われるであろう。接触工程に
おける望ましい温度範囲は、浴液のイオン強度、および
融点に影響を与える他の添加物に応じて、約１５〜約９
０℃である。最も有効な温度は、プローブへの試料のハ
イブリッド形成が最高またはほぼ最高の速度で起こる温
度であろう。しかし特定の場合、より好都合な（一般に
上記よりも低い）温度、たとえばほぼ室温（１５〜２５
℃）を採用してもよい。多数の文献〔たとえばジェイ・
ジー・ウェットムルおよびエヌ・ティビッドソン、１ジ
エイ・モｖ−バイオｏ ’ （Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、）、３１巻、３４９−３７０頁（１９６８年）およ
びシー・ミンソンおよびジー・ジービイ、′実用ウィル
ス学における新たな発展“、１巻、１８５−２２９頁（
１９８２年、アラン・リス社）〕に記載されるように、
ハイブリッド形成速度はｐＨ，および試料のヌクレオチ
ド濃度の関数でもある。さらに、少なくともある場合に
は先きに引用したウィリアムスらの米国特許出願第６８
４，３０８号明細書により詳細に記述されるように、こ
の工程に際して体積排除型ポリ？ −（Ｖｏｌｕｍｅ
ｅＸｃｌｕｄｉｎｇｐｏｌｙｍａｒ ） が存在する
ことが好ましい。他の試薬、たとえば硫酸テキストラン
も使用できる。置換反応に影響を与える酵素その他の蛋
白質、たとえば大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） Ａ Ｔ
Ｐ依存性ｒｅｃ Ａ蛋白質も本方法にきわめて有益であ
る（先きに引用したコリンズらの米国特許出願６８＝Ｌ
３０５号明細書に記載）。
む核酸を含有する可能性がある）との実際の接触まだは
置換の工程は、普通は上記の製造過程での洗浄工程より
も厳格でない温度、イオン強度および時間の条件下で（
従って標識ポリヌクレオチドの非特異的解離または結合
解除がよυ生じにくい）行われるであろう。接触工程に
おける望ましい温度範囲は、浴液のイオン強度、および
融点に影響を与える他の添加物に応じて、約１５〜約９
０℃である。最も有効な温度は、プローブへの試料のハ
イブリッド形成が最高またはほぼ最高の速度で起こる温
度であろう。しかし特定の場合、より好都合な（一般に
上記よりも低い）温度、たとえばほぼ室温（１５〜２５
℃）を採用してもよい。多数の文献〔たとえばジェイ・
ジー・ウェットムルおよびエヌ・ティビッドソン、１ジ
エイ・モｖ−バイオｏ ’ （Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、）、３１巻、３４９−３７０頁（１９６８年）およ
びシー・ミンソンおよびジー・ジービイ、′実用ウィル
ス学における新たな発展“、１巻、１８５−２２９頁（
１９８２年、アラン・リス社）〕に記載されるように、
ハイブリッド形成速度はｐＨ，および試料のヌクレオチ
ド濃度の関数でもある。さらに、少なくともある場合に
は先きに引用したウィリアムスらの米国特許出願第６８
４，３０８号明細書により詳細に記述されるように、こ
の工程に際して体積排除型ポリ？ −（Ｖｏｌｕｍｅ
ｅＸｃｌｕｄｉｎｇｐｏｌｙｍａｒ ） が存在する
ことが好ましい。他の試薬、たとえば硫酸テキストラン
も使用できる。置換反応に影響を与える酵素その他の蛋
白質、たとえば大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） Ａ Ｔ
Ｐ依存性ｒｅｃ Ａ蛋白質も本方法にきわめて有益であ
る（先きに引用したコリンズらの米国特許出願６８＝Ｌ
３０５号明細書に記載）。
試薬複合体の割合、情および濃度は個々に決定的なもの
ではなく、試料および試薬複合体のノ・イブリッド形成
混合物全体が実現可能な限り濃縮されていることが一般
的には望ましい。大部分の場合、標的ヌクレオチド配列
に対する結合部位を保有するプローブポリヌクレオチド
も試料中に予想される標的ヌクレオチド配列の水準の１
０倍モル以上過剰に（好ましくは１００倍モル以上）存
在することが好ｔ Ｌいであろう。試料自体は核酸を含
む可能性があり、核酸は完全にまたは一部が溶液中にあ
り（細胞膜、蛋白質などから分離して）かつ一本鎖状で
あることがアッセイのノ・イブリッド形成工程には好ま
しい。標的ヌクレオチド配列の補体が存在すること（二
本鎖試料ＤＮＡの変性によって）は妨害となる可能性が
ある。この妨害は少なくとも本発明の好ましい形態にお
いては少ないと思われる。選択的にプローブの固定化を
伴うハイブリッド形成（置換後）においては、置換され
た標識ポリヌクレオチドは溶液相中に存在し、また残存
し、次いでこの種の置換された標識ポリヌクレオチドが
試料核酸の相補的セグメントと再ハイブリッド形成した
か否かを測定する。新たに形成されたハイブリッドは結
合セグメントを含まず、従って固定化された試薬に対す
る親和性を示さないからである。多くの溶液ハイブリッ
ド形成においてこの妨害は動力学的効果により最小限に
抑えられるであろう。
ではなく、試料および試薬複合体のノ・イブリッド形成
混合物全体が実現可能な限り濃縮されていることが一般
的には望ましい。大部分の場合、標的ヌクレオチド配列
に対する結合部位を保有するプローブポリヌクレオチド
も試料中に予想される標的ヌクレオチド配列の水準の１
０倍モル以上過剰に（好ましくは１００倍モル以上）存
在することが好ｔ Ｌいであろう。試料自体は核酸を含
む可能性があり、核酸は完全にまたは一部が溶液中にあ
り（細胞膜、蛋白質などから分離して）かつ一本鎖状で
あることがアッセイのノ・イブリッド形成工程には好ま
しい。標的ヌクレオチド配列の補体が存在すること（二
本鎖試料ＤＮＡの変性によって）は妨害となる可能性が
ある。この妨害は少なくとも本発明の好ましい形態にお
いては少ないと思われる。選択的にプローブの固定化を
伴うハイブリッド形成（置換後）においては、置換され
た標識ポリヌクレオチドは溶液相中に存在し、また残存
し、次いでこの種の置換された標識ポリヌクレオチドが
試料核酸の相補的セグメントと再ハイブリッド形成した
か否かを測定する。新たに形成されたハイブリッドは結
合セグメントを含まず、従って固定化された試薬に対す
る親和性を示さないからである。多くの溶液ハイブリッ
ド形成においてこの妨害は動力学的効果により最小限に
抑えられるであろう。
一般に置換反応が十分な程度に起こるために必要な時間
は２時間以下、一般に１時間以下、しばしば１５分以下
でなければならない。これらの時間内に実質的に終了さ
せるために条件を調整することができる。しかしこれよ
りも長い時間が必ずしも不利ではない。速度制限工程は
試料すなわち標的ヌクレオチド配列がプローブポリヌク
レオチドの相補的配列を見出す工程であると考えられる
（シー・グリーンおよびシー・チベッツ、′ヌクレイツ
ク・アシッド・リサーチ）、９巻、１９０５−１８頁（
１９８１年））。いったん標的／プローブハイブリッド
修成が開始すると、標識ポリヌクレオチドの置換は１分
以内、しばしば１秒以内に起こると考えられる。
は２時間以下、一般に１時間以下、しばしば１５分以下
でなければならない。これらの時間内に実質的に終了さ
せるために条件を調整することができる。しかしこれよ
りも長い時間が必ずしも不利ではない。速度制限工程は
試料すなわち標的ヌクレオチド配列がプローブポリヌク
レオチドの相補的配列を見出す工程であると考えられる
（シー・グリーンおよびシー・チベッツ、′ヌクレイツ
ク・アシッド・リサーチ）、９巻、１９０５−１８頁（
１９８１年））。いったん標的／プローブハイブリッド
修成が開始すると、標識ポリヌクレオチドの置換は１分
以内、しばしば１秒以内に起こると考えられる。
置換反応混合物を急冷しくたとえば２０℃以下に冷却す
ることにより）、次いでアフィニティ力ラム（または前
記のように他の形の固定化されたアフィニティ試薬）に
導通する。一連の溶液をカラムに導通することにより一
連の画分が得られ、置換された標識ホＩＪヌクレオチド
は初期の液体画分中に存在する。残留する試薬複合体は
後期の両分中に見出されるようにする（結合セグメント
を固定化されたアフィニティ試薬から除去するのに十分
な溶液を用いて）か、あるいはカラムに残留させる。
ることにより）、次いでアフィニティ力ラム（または前
記のように他の形の固定化されたアフィニティ試薬）に
導通する。一連の溶液をカラムに導通することにより一
連の画分が得られ、置換された標識ホＩＪヌクレオチド
は初期の液体画分中に存在する。残留する試薬複合体は
後期の両分中に見出されるようにする（結合セグメント
を固定化されたアフィニティ試薬から除去するのに十分
な溶液を用いて）か、あるいはカラムに残留させる。
置換後分離に使用されるカラムの寸法は、特定の場合に
は重要なパラメーターとなる可能性がある。個々の置換
（接触）反応に小規模の試料を用いる場合、カラムから
採取する種々の画分も小規模であることが一般に望まし
い。後記の例４に示すように、２５ｍ９程度のオリゴ（
ｄＧ）セルロースにより試薬複合体の浸れた捕獲力が得
られる（例１〜３で用いた２５０ｍｑのアフィニティ物
質よりもむしろ）ので、このような少量のアフィニティ
試薬を用いることが好ましいであろう。これにより、濃
厚な置換反応混合物をカラムに負荷する前に、または大
量の洗浄液（たとえば第２Ｃ図に関連してのちに述べる
溶液１３４．１３６および１３８）で希釈する必要がな
くなる。溶出液の容積が小さいことによる効果は、すべ
ての、またはより大きな部分の溶出液につき信号（たと
えば酵素生成物または生物発光）を測定しうろことであ
る。
は重要なパラメーターとなる可能性がある。個々の置換
（接触）反応に小規模の試料を用いる場合、カラムから
採取する種々の画分も小規模であることが一般に望まし
い。後記の例４に示すように、２５ｍ９程度のオリゴ（
ｄＧ）セルロースにより試薬複合体の浸れた捕獲力が得
られる（例１〜３で用いた２５０ｍｑのアフィニティ物
質よりもむしろ）ので、このような少量のアフィニティ
試薬を用いることが好ましいであろう。これにより、濃
厚な置換反応混合物をカラムに負荷する前に、または大
量の洗浄液（たとえば第２Ｃ図に関連してのちに述べる
溶液１３４．１３６および１３８）で希釈する必要がな
くなる。溶出液の容積が小さいことによる効果は、すべ
ての、またはより大きな部分の溶出液につき信号（たと
えば酵素生成物または生物発光）を測定しうろことであ
る。
置換後分離が起こったのち、標識ホＩＪヌクレオチドの
存在および（しばしば）存在量の測定は初期液体画分に
つき、または後期液体画分もしくは固相につき行うこと
ができる。好ましくは測定は液相（初期液体画分）につ
いて行われる。置換された標識ポリヌクレオチドの存在
および量を液相で測定することは、バックグラウンド信
号が比較的低いという利点をもつ。パックグラウンド信
号は大部分が前記のように固体支持体からの非特異的解
離もしくは脱落により、または不完全な分離により生じ
たものでちろう。さらに、試料中に標的配列がない場合
は、液相中の標識ポリヌクレオチ！・ゞからの信号がな
い。比較のため、検出が固相のもの、゛またはアフィニ
ティカラムからの後期の溶出液のものである場合、最高
水準の標識ポリヌクレオチドゝは、陰性の結果について
検出されるであろう。特に高モル過剰の試薬複合体を用
いる場合、固体支持体上に残留する標識の測定は感度が
低下する。
存在および（しばしば）存在量の測定は初期液体画分に
つき、または後期液体画分もしくは固相につき行うこと
ができる。好ましくは測定は液相（初期液体画分）につ
いて行われる。置換された標識ポリヌクレオチドの存在
および量を液相で測定することは、バックグラウンド信
号が比較的低いという利点をもつ。パックグラウンド信
号は大部分が前記のように固体支持体からの非特異的解
離もしくは脱落により、または不完全な分離により生じ
たものでちろう。さらに、試料中に標的配列がない場合
は、液相中の標識ポリヌクレオチ！・ゞからの信号がな
い。比較のため、検出が固相のもの、゛またはアフィニ
ティカラムからの後期の溶出液のものである場合、最高
水準の標識ポリヌクレオチドゝは、陰性の結果について
検出されるであろう。特に高モル過剰の試薬複合体を用
いる場合、固体支持体上に残留する標識の測定は感度が
低下する。
前記のように、プローブポリヌクレオチドの結合セグメ
ントはホモポリヌクレオチド配列であってもよく、この
場合、製法および使用法の双方に用いられる固定化され
たアフィニティ試薬は相補的ホモポリヌクレオチド配列
である。可逆性の相違は、プローブ上の長い結合セグメ
ント（たとえばヌクレオチド２０以上）、試薬複合体の
製法に用いる固定化されたアフィニティ試薬としては短
い相補的ポリヌクレオチドセグメント（たとえばヌクレ
オチド約４〜１２）、診断的使用法に用いる固定化され
たアフィニティ試薬としてはよシ長い相補的ポリヌクレ
オチドセグメント（たとえばヌクレオチド２０以上）を
用いることによって特られる。製法−１：／とは置換後
の分離法に使用できる（かつ可逆的でもある）他の結合
セグメントには糖類側鎖基（たとえばマルトースセグ２
ノント）または化学的に結合しまた多糖類（たとえば汁
７す（グルコース））が含まれる。この種の糖型結合セ
グメントに対する固定化されたアフィニティ試薬にはレ
クチンおよびボロネー） （ｂｏｒｏｎａ、ｔｅ）が含
まれる。“固相生化学、分析的および合成的観点１、ダ
ブリュー・エッチ・スカウテン編、１７−７８頁および
１４９−１８８頁（ジョン・ワイリ・アンド・サンプ、
ニューヨーク；１９８３年）を参照されたい。
ントはホモポリヌクレオチド配列であってもよく、この
場合、製法および使用法の双方に用いられる固定化され
たアフィニティ試薬は相補的ホモポリヌクレオチド配列
である。可逆性の相違は、プローブ上の長い結合セグメ
ント（たとえばヌクレオチド２０以上）、試薬複合体の
製法に用いる固定化されたアフィニティ試薬としては短
い相補的ポリヌクレオチドセグメント（たとえばヌクレ
オチド約４〜１２）、診断的使用法に用いる固定化され
たアフィニティ試薬としてはよシ長い相補的ポリヌクレ
オチドセグメント（たとえばヌクレオチド２０以上）を
用いることによって特られる。製法−１：／とは置換後
の分離法に使用できる（かつ可逆的でもある）他の結合
セグメントには糖類側鎖基（たとえばマルトースセグ２
ノント）または化学的に結合しまた多糖類（たとえば汁
７す（グルコース））が含まれる。この種の糖型結合セ
グメントに対する固定化されたアフィニティ試薬にはレ
クチンおよびボロネー） （ｂｏｒｏｎａ、ｔｅ）が含
まれる。“固相生化学、分析的および合成的観点１、ダ
ブリュー・エッチ・スカウテン編、１７−７８頁および
１４９−１８８頁（ジョン・ワイリ・アンド・サンプ、
ニューヨーク；１９８３年）を参照されたい。
本発明の方法および試薬は種々の濃度の各種標的ヌクレ
オチド配列の検出および測定に使用できる。特にその核
酸（ゲノム その他）が標的となりうる感染性物質を含
む微生物には病原性のウィルス、細菌および真菌；たと
えばサイトメガロウィルスまたは淋菌（Ｎｅｉｓｑｅｒ
ｉａ ｇｏｎｏｒｒｈθａ）が含まれる。標的となりう
る遺伝的障害または状態にはβ−サラセミア、α１−サ
ラセミア、ネコ鳴き病、およびある種の網膜芽腫が含ま
れる。本発明の方法および試薬は主として、標的配列に
対する陰性として判定されるべき試料中に存在する最も
近似する配列から標的ヌクレオチド配列を区別するに際
し多重塩基ヌクレオチドの削除、挿入、置換または転位
を伴う場合に遺伝的障害または変異を検出することに適
用できる。本発明を単一塩基の変異による遺伝的障害に
適用できる範囲に対しては、置換された塩基もしくは他
の変異点および隣接するヌクレオチドの完全な相補がプ
ローブポリヌクレオチドの標的結合領域の一部であるこ
とが望ましく、この領域内におけるその塩基の位置が本
方法の選択性に影響を与えると思われる。構造遺伝子ま
たは調節遺伝子における変化のうち、遺伝子の表現、活
性化または転位の変化または差を、特にｍＲＮＡ を
標的することによる特定の状況につき、本発明方法によ
り検出できる。構造遺伝子の表現における他の乱れも検
出できる。本方法は組織移植のためのＨＬＡ型別、微生
物における抗体耐性遺伝子の決定、腫瘍形成配列の変化
または腫瘍形成表現水準の変化の検出にも、また食物、
医薬品および水の試料の、特定の感染性物質または他の
微生物についてのスクリーニングにも適用できる。
オチド配列の検出および測定に使用できる。特にその核
酸（ゲノム その他）が標的となりうる感染性物質を含
む微生物には病原性のウィルス、細菌および真菌；たと
えばサイトメガロウィルスまたは淋菌（Ｎｅｉｓｑｅｒ
ｉａ ｇｏｎｏｒｒｈθａ）が含まれる。標的となりう
る遺伝的障害または状態にはβ−サラセミア、α１−サ
ラセミア、ネコ鳴き病、およびある種の網膜芽腫が含ま
れる。本発明の方法および試薬は主として、標的配列に
対する陰性として判定されるべき試料中に存在する最も
近似する配列から標的ヌクレオチド配列を区別するに際
し多重塩基ヌクレオチドの削除、挿入、置換または転位
を伴う場合に遺伝的障害または変異を検出することに適
用できる。本発明を単一塩基の変異による遺伝的障害に
適用できる範囲に対しては、置換された塩基もしくは他
の変異点および隣接するヌクレオチドの完全な相補がプ
ローブポリヌクレオチドの標的結合領域の一部であるこ
とが望ましく、この領域内におけるその塩基の位置が本
方法の選択性に影響を与えると思われる。構造遺伝子ま
たは調節遺伝子における変化のうち、遺伝子の表現、活
性化または転位の変化または差を、特にｍＲＮＡ を
標的することによる特定の状況につき、本発明方法によ
り検出できる。構造遺伝子の表現における他の乱れも検
出できる。本方法は組織移植のためのＨＬＡ型別、微生
物における抗体耐性遺伝子の決定、腫瘍形成配列の変化
または腫瘍形成表現水準の変化の検出にも、また食物、
医薬品および水の試料の、特定の感染性物質または他の
微生物についてのスクリーニングにも適用できる。
特定の試験に用いる標的配列の選択は、標的となる生体
または状態に独特の、寸たは比較的独特の配列を決定す
ることによる。この標的配列を用いてこれに対し相補的
な標的結合領域を作成し、次いで適宜な長さの標識ポリ
ヌクレオチドを作成して標的結合領域の一部に結合させ
る。場合によっては、個々の標的配列が比較的独特でち
るにすぎない場合に改良された特異性を与えるために、
同一の生体または状態の核酸の異なる部分を標的とする
複数の試薬複合体を用いてもよい。
または状態に独特の、寸たは比較的独特の配列を決定す
ることによる。この標的配列を用いてこれに対し相補的
な標的結合領域を作成し、次いで適宜な長さの標識ポリ
ヌクレオチドを作成して標的結合領域の一部に結合させ
る。場合によっては、個々の標的配列が比較的独特でち
るにすぎない場合に改良された特異性を与えるために、
同一の生体または状態の核酸の異なる部分を標的とする
複数の試薬複合体を用いてもよい。
本発明の製法および診断用試薬複合体の一形態を第１図
に示す。プローブポリヌクレオチド鎖Ｐが修飾されてい
ない形で数字１ｏにより示される。
に示す。プローブポリヌクレオチド鎖Ｐが修飾されてい
ない形で数字１ｏにより示される。
これは検出を目的とする標的ヌクレオチド配列にプリン
／ピリミジン塩基対を介して水素結合しうる標的結合領
域ＴＢＲを陰む。標的結合領域ＴＢＲの部分群のポリヌ
クレオチド配列が標識ポリヌクレオチド結合領域ＬＢＨ
を指示し、前記および後記において標識ポリヌクレオチ
ドＬのノ＼イブリッド形成に関連して記述した機能をも
つ。
／ピリミジン塩基対を介して水素結合しうる標的結合領
域ＴＢＲを陰む。標的結合領域ＴＢＲの部分群のポリヌ
クレオチド配列が標識ポリヌクレオチド結合領域ＬＢＨ
を指示し、前記および後記において標識ポリヌクレオチ
ドＬのノ＼イブリッド形成に関連して記述した機能をも
つ。
本発明の製法、試薬および使用法に用いられるプローブ
は数字１２（および表示Ｐ’）により識別される構造に
より示されるように修飾され、図示されるように好まし
くは標的結合領域ＴＢＲから離れた結合セグメントＢＳ
ｉ含む。結合セグメントＢＳは修飾されたプローブＰ′
の一方の末端（３’末端）に示され、標的結合領域ＴＢ
Ｒは反対側の末端にあるものとして示されているが、い
ずれの特定の位置も要求されない。特に標的結合領域Ｔ
ＢＲは結合セグメントと別個の、好ましくは結合セグメ
ン１−ＢＳと間隔を置いたいかなる位置にあってもよい
。各側においては標的結合領域は２つの末端の中間にあ
り；各側のプローブポリヌクレオチドはＴＢＲの５′末
端とプローブポリヌクレオチドの５′末端との間に少な
くとも２０５個のヌクレオチドを含み、ＴＢＲの３′末
端と結合セグメント（３′末端ポＩＪ （ｄＣ）配列）
の間に少なくとも３４８個のヌクレオチドを含む。各側
における一部のプローブ鎖中の若干のプローブポリヌク
レオチドは、そこで用いた制限酵素によるプローブポリ
ヌクレオチド前駆鎖の消化が不完全であったため、ＴＢ
Ｒの５′側または３′側により多数のヌクレオチドを含
むであろう。
は数字１２（および表示Ｐ’）により識別される構造に
より示されるように修飾され、図示されるように好まし
くは標的結合領域ＴＢＲから離れた結合セグメントＢＳ
ｉ含む。結合セグメントＢＳは修飾されたプローブＰ′
の一方の末端（３’末端）に示され、標的結合領域ＴＢ
Ｒは反対側の末端にあるものとして示されているが、い
ずれの特定の位置も要求されない。特に標的結合領域Ｔ
ＢＲは結合セグメントと別個の、好ましくは結合セグメ
ン１−ＢＳと間隔を置いたいかなる位置にあってもよい
。各側においては標的結合領域は２つの末端の中間にあ
り；各側のプローブポリヌクレオチドはＴＢＲの５′末
端とプローブポリヌクレオチドの５′末端との間に少な
くとも２０５個のヌクレオチドを含み、ＴＢＲの３′末
端と結合セグメント（３′末端ポＩＪ （ｄＣ）配列）
の間に少なくとも３４８個のヌクレオチドを含む。各側
における一部のプローブ鎖中の若干のプローブポリヌク
レオチドは、そこで用いた制限酵素によるプローブポリ
ヌクレオチド前駆鎖の消化が不完全であったため、ＴＢ
Ｒの５′側または３′側により多数のヌクレオチドを含
むであろう。
結合セグメントを連結するための好ましい手段は、これ
が反復する天然のまたは修飾されたプリンまたはピリミ
ジンヌクレオシド（たとえばｄＡ１ｒＣｄＣ１ｄＧ％ｄ
Ｔまたはビオチニル化ｄＵ ） を含む天然の、また
は修飾されたパリヌクレオチドのセグメントである場合
、酵素、たとえばターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼ（Ｔａ’ｌ’）（ジー・アール・デン
グおよびアール・つ、（Ｒ。
が反復する天然のまたは修飾されたプリンまたはピリミ
ジンヌクレオシド（たとえばｄＡ１ｒＣｄＣ１ｄＧ％ｄ
Ｔまたはビオチニル化ｄＵ ） を含む天然の、また
は修飾されたパリヌクレオチドのセグメントである場合
、酵素、たとえばターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼ（Ｔａ’ｌ’）（ジー・アール・デン
グおよびアール・つ、（Ｒ。
Ｗｕ）、’ヌクレイツク・アシツヅ・リサーチ１．９巻
、４１７３−４１８８頁（１９８１年）参照）によシ酵
素付加に用いられる適宜なヌクレオシド−５７−三リン
酸の存在下で未修飾プローブＰを延長させるものである
。このような場合、結合セグメントは修飾されたプロー
ブ１２（第１図にｙにより示される）の３′末端にある
ホモポリマーセグメントであろう。このようなＴｄＴに
よる延長に際しては反応混合物中における３′末端の数
を最小限に抑えて、ホモパリマーセグメントを含む修飾
されたプローブ１２またはｙ以外のポリヌクレオチ、ド
を避けるかまたは最小限に抑えることが望ましいと考え
られる。
、４１７３−４１８８頁（１９８１年）参照）によシ酵
素付加に用いられる適宜なヌクレオシド−５７−三リン
酸の存在下で未修飾プローブＰを延長させるものである
。このような場合、結合セグメントは修飾されたプロー
ブ１２（第１図にｙにより示される）の３′末端にある
ホモポリマーセグメントであろう。このようなＴｄＴに
よる延長に際しては反応混合物中における３′末端の数
を最小限に抑えて、ホモパリマーセグメントを含む修飾
されたプローブ１２またはｙ以外のポリヌクレオチ、ド
を避けるかまたは最小限に抑えることが望ましいと考え
られる。
修飾されたプローブ１２を、次いでその少なくとも一部
がプローブ（ＰおよびＰ′双方）の標識ポリヌクレオチ
ド結合領域ＬＢＲに対し相補的であるポリヌクレオチド
鎖りからなる遊離の標識ポリヌクレオチド１４とハイブ
リッド形成させて、目的とする複合体１６（以下に詳述
する）を形成きせる。この製造操作に際しては過剰の標
識ホＩＪヌクレオチドを用いることが好ましい。たとえ
ばデオキシヌクレオチジルターミナルトランスフエラー
ゼにより媒介される反応ののちに若干の未修飾プローズ
鎖１０が残存する程度までは、これらは検出可能な標識
Ｔをもつ標識ポリヌクレオチドＬにハイブリッド形成し
た未修飾プローブＰｉそれぞれが含む試薬複合体（さら
に第１図の下方に数字２４として示す）をも形成する可
能性がある点を認識すべきである。
がプローブ（ＰおよびＰ′双方）の標識ポリヌクレオチ
ド結合領域ＬＢＲに対し相補的であるポリヌクレオチド
鎖りからなる遊離の標識ポリヌクレオチド１４とハイブ
リッド形成させて、目的とする複合体１６（以下に詳述
する）を形成きせる。この製造操作に際しては過剰の標
識ホＩＪヌクレオチドを用いることが好ましい。たとえ
ばデオキシヌクレオチジルターミナルトランスフエラー
ゼにより媒介される反応ののちに若干の未修飾プローズ
鎖１０が残存する程度までは、これらは検出可能な標識
Ｔをもつ標識ポリヌクレオチドＬにハイブリッド形成し
た未修飾プローブＰｉそれぞれが含む試薬複合体（さら
に第１図の下方に数字２４として示す）をも形成する可
能性がある点を認識すべきである。
目的とする複合体１６を含有するが、残存するプローブ
ポリヌクレオチド１０および１２、ならびに過剰のハイ
ブリッド形成していない標識ポリヌクレオチド１４、お
よび未修飾プローブＰを含む試薬複合体２４をも含有す
る反応混合物を、次いで使用前に精製する。上記実施態
様に関する精製手段は、ハイブリッド形成していない標
識ポリヌクレオチド°１４の大部分を、目的の試薬複合
体１６を含有する画分から分離するある種のサイズクロ
マトグラフィー（たとえばサイズ排除型樹脂カラム上を
導通する）に始まる。次いで目的の両分を第１図にクロ
マトグラフィーカラム１７として示した、結合セグメン
トＢＳに対する固定化されたアフィニティ試薬と接触さ
せた状態で導通する。第１図に示されるように、目的と
する画分を甘ずカラムに導通し、次いで一連の溶液をカ
ラムに導通する。第１溶液１８はカラムから結合セグメ
ントＢｓを含まない物質を洗い流すべくデザインされた
洗浄液である。従ってこれはアフィニティ試薬が結合セ
グメン１−ＢＳを強固に結合するものである。洗い出さ
れた物質にはハイブリッド形成していない標識ポリヌク
レオチド’１４．修飾されていないプローブポリヌクレ
オチド−ｉｏ、および修飾されていないプローブ鎖Ｐを
それぞれ含む試薬複合体２４が含まれる。また試薬複合
体の製造過程で導入され、目的とする試薬複合体と化学
的または物理的に会合していない他の過剰の試薬もこの
第１液１８中に溶出するであろう。従ってこれらの物質
はカラム１７から初期画分中に溶出し、これらは後記の
理由でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼ反応工程に再循環されずに、むしろ廃棄されるで
あろう。カラムに供給される第２液２０は、カラム１７
上のアフィニティ試薬と結合セグメントＢＳとのアフィ
ニティ結合を破壊し、標識ポリヌクレオチド結合領域Ｌ
ＢＨと標識パリヌクレオチドＬとの水素結合（特に目的
の試薬複合体１６中の）は破壊しないようにデザインさ
れたものである。このため、結合セグメントＢＳがホモ
ポリヌクレオチドセグメントである場合にそうであるよ
うに結合セグメントＢＳがカラム材料にプリン／ピリミ
ジン塩基対水素結合を介して結合している場合は、この
後者の結合は標識ポリヌクレオチドＬと標識ポリヌクレ
オチド結合領域ＬＢＨとの結合よりも累積結合強度がよ
り低いことが望ましい（標準条件下での融点がより低い
ことと関連するン。一般にこのボモパリヌクレオチドセ
グメントはヌクレオチド２０個以下の長さであり、一方
標識パリヌクレオチド結合領域は塩基２５〜５０個以上
の長さである。
ポリヌクレオチド１０および１２、ならびに過剰のハイ
ブリッド形成していない標識ポリヌクレオチド１４、お
よび未修飾プローブＰを含む試薬複合体２４をも含有す
る反応混合物を、次いで使用前に精製する。上記実施態
様に関する精製手段は、ハイブリッド形成していない標
識ポリヌクレオチド°１４の大部分を、目的の試薬複合
体１６を含有する画分から分離するある種のサイズクロ
マトグラフィー（たとえばサイズ排除型樹脂カラム上を
導通する）に始まる。次いで目的の両分を第１図にクロ
マトグラフィーカラム１７として示した、結合セグメン
トＢＳに対する固定化されたアフィニティ試薬と接触さ
せた状態で導通する。第１図に示されるように、目的と
する画分を甘ずカラムに導通し、次いで一連の溶液をカ
ラムに導通する。第１溶液１８はカラムから結合セグメ
ントＢｓを含まない物質を洗い流すべくデザインされた
洗浄液である。従ってこれはアフィニティ試薬が結合セ
グメン１−ＢＳを強固に結合するものである。洗い出さ
れた物質にはハイブリッド形成していない標識ポリヌク
レオチド’１４．修飾されていないプローブポリヌクレ
オチド−ｉｏ、および修飾されていないプローブ鎖Ｐを
それぞれ含む試薬複合体２４が含まれる。また試薬複合
体の製造過程で導入され、目的とする試薬複合体と化学
的または物理的に会合していない他の過剰の試薬もこの
第１液１８中に溶出するであろう。従ってこれらの物質
はカラム１７から初期画分中に溶出し、これらは後記の
理由でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼ反応工程に再循環されずに、むしろ廃棄されるで
あろう。カラムに供給される第２液２０は、カラム１７
上のアフィニティ試薬と結合セグメントＢＳとのアフィ
ニティ結合を破壊し、標識ポリヌクレオチド結合領域Ｌ
ＢＨと標識パリヌクレオチドＬとの水素結合（特に目的
の試薬複合体１６中の）は破壊しないようにデザインさ
れたものである。このため、結合セグメントＢＳがホモ
ポリヌクレオチドセグメントである場合にそうであるよ
うに結合セグメントＢＳがカラム材料にプリン／ピリミ
ジン塩基対水素結合を介して結合している場合は、この
後者の結合は標識ポリヌクレオチドＬと標識ポリヌクレ
オチド結合領域ＬＢＨとの結合よりも累積結合強度がよ
り低いことが望ましい（標準条件下での融点がより低い
ことと関連するン。一般にこのボモパリヌクレオチドセ
グメントはヌクレオチド２０個以下の長さであり、一方
標識パリヌクレオチド結合領域は塩基２５〜５０個以上
の長さである。
特定の条件下ではヌクレオチド２０個以上の長さのホモ
ポリヌクレオチドセグメント物質用いることが考慮され
るが、その場合標準ポリヌクレオチド結合領域は、標識
ポリヌクレオチドが試薬複合体中に結合したままの状態
で試薬複合体がカラムから会合解除しうるだめには下限
がいっそう厳格に制限されるであろう。第１の制限因子
は固体支持体に付着したＢＳないしはホモポリマーセグ
メントの短い方の長さである。
ポリヌクレオチドセグメント物質用いることが考慮され
るが、その場合標準ポリヌクレオチド結合領域は、標識
ポリヌクレオチドが試薬複合体中に結合したままの状態
で試薬複合体がカラムから会合解除しうるだめには下限
がいっそう厳格に制限されるであろう。第１の制限因子
は固体支持体に付着したＢＳないしはホモポリマーセグ
メントの短い方の長さである。
このアフィニティクロマトグラフイ一工程の結果、目的
の試薬複合体１６、および有意量で存在すると思われる
唯一のポリヌクレオチド系不純物として、ハイブリッド
形成していない修飾されたプローブポリヌクレオチド１
２を含有する画分が得られる。しかし標識ポリヌクレオ
チド”１４がハイズリラド形成工程で大過剰に用いられ
、ハイブリッド形成が完了するほど十分な期間（かつ他
の条件、たとえば強度および温度についても）行われた
場合は、修飾されたプローブ１２と目的の試薬複合体１
５との比率は小さいであろう。さらに複合体を置換反応
（本発明方法）に用いる場合、修飾されたプローグ１２
は偽信号を発することはなく、置換されたＲ識パリヌク
レオチドを生成せずに標的ポリヌクレオチド配列とハイ
ブリッド形成する結果となるにすぎない。従って唯一の
影響は、最大予想信号がＰ’ ／（Ｐ’ ＬＡＰ’ ）
にほぼ等しい係数だけ低下することであろう。この式中
Ｐ′は生成物画分２５中の修飾されたプローブ鎖１２の
量であり、Ｐ／ Ｌ は生成物画分２５中の目的とす
る試薬複合体１６の量である。試薬複合体が標識された
鎖１４にハイブリッド形成していないプローブ１２を許
容できないほど高い水準で含むという異例の場合は、こ
の物質を除去するためにさらに精製が必要であろう。こ
れはたとえばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ分
離（これは試薬複合体音その二本鎖領域に基づいて遅滞
させるであろう）、または標識ポリヌクレオチド結合領
域ＬＢＨもしくはその一部に対し相補的である固定化さ
れたポリヌクレオチド配列上におけるクロマトグラフィ
ー（これにより遊離のプローブポリヌクレオチド１２を
遅滞させる）である。これにより、生成物画分２５が特
異的に分画されて、第１図に示す試薬複合体１６に富む
生成物溶液が得られる。
の試薬複合体１６、および有意量で存在すると思われる
唯一のポリヌクレオチド系不純物として、ハイブリッド
形成していない修飾されたプローブポリヌクレオチド１
２を含有する画分が得られる。しかし標識ポリヌクレオ
チド”１４がハイズリラド形成工程で大過剰に用いられ
、ハイブリッド形成が完了するほど十分な期間（かつ他
の条件、たとえば強度および温度についても）行われた
場合は、修飾されたプローブ１２と目的の試薬複合体１
５との比率は小さいであろう。さらに複合体を置換反応
（本発明方法）に用いる場合、修飾されたプローグ１２
は偽信号を発することはなく、置換されたＲ識パリヌク
レオチドを生成せずに標的ポリヌクレオチド配列とハイ
ブリッド形成する結果となるにすぎない。従って唯一の
影響は、最大予想信号がＰ’ ／（Ｐ’ ＬＡＰ’ ）
にほぼ等しい係数だけ低下することであろう。この式中
Ｐ′は生成物画分２５中の修飾されたプローブ鎖１２の
量であり、Ｐ／ Ｌ は生成物画分２５中の目的とす
る試薬複合体１６の量である。試薬複合体が標識された
鎖１４にハイブリッド形成していないプローブ１２を許
容できないほど高い水準で含むという異例の場合は、こ
の物質を除去するためにさらに精製が必要であろう。こ
れはたとえばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ分
離（これは試薬複合体音その二本鎖領域に基づいて遅滞
させるであろう）、または標識ポリヌクレオチド結合領
域ＬＢＨもしくはその一部に対し相補的である固定化さ
れたポリヌクレオチド配列上におけるクロマトグラフィ
ー（これにより遊離のプローブポリヌクレオチド１２を
遅滞させる）である。これにより、生成物画分２５が特
異的に分画されて、第１図に示す試薬複合体１６に富む
生成物溶液が得られる。
これに対し、置換が溶液中で行われ、置換後分離が結合
セグメン）ＢＳに対して特異的なアフィニティ試薬を用
いて行われる場合、生成物画分２５に混入するハイブリ
ツ１ご形成していない標識ポリヌクレオチド１４または
試薬複合体２４により偽（非特異的）信号が発せられる
であろう。
セグメン）ＢＳに対して特異的なアフィニティ試薬を用
いて行われる場合、生成物画分２５に混入するハイブリ
ツ１ご形成していない標識ポリヌクレオチド１４または
試薬複合体２４により偽（非特異的）信号が発せられる
であろう。
貯蔵および使用の前に生成物画分をさらに分離する必要
はないが、行うことができる他の工程には透析（より低
いイオン強度）、蒸発濃度、および／または凍結乾燥が
含まれる。これらの後続工程においては、標識ポリヌク
レオチドＬを試薬複合体１６から解離（融解）させる条
件のイオン強度と温度の組合せを生じないように注意す
べきである。
はないが、行うことができる他の工程には透析（より低
いイオン強度）、蒸発濃度、および／または凍結乾燥が
含まれる。これらの後続工程においては、標識ポリヌク
レオチドＬを試薬複合体１６から解離（融解）させる条
件のイオン強度と温度の組合せを生じないように注意す
べきである。
第１液】８および第２液２０の通過ののち、再生用液２
２を通過させて、固定化されたアフィニティ試薬以外の
残留物質をカラム１７から移動させることが望ましい。
２を通過させて、固定化されたアフィニティ試薬以外の
残留物質をカラム１７から移動させることが望ましい。
ここでカラムは再びハイブリッド形成反応混合物を注入
するのに適した条件（たとえばイオン強度）に再平衡化
しうる状態となる。
するのに適した条件（たとえばイオン強度）に再平衡化
しうる状態となる。
第１図に示した方法における多数の変法が考慮される。
たとえばプローブＰへの標識ポリヌクレオチドＬのハイ
ブリッド形成に先立ってホモポリマーセグメン） （Ｈ
３、これは結合配列Ｂｓの一形態である）をプローブＰ
に添加することができる。しかしこの場合は、同様、な
ＨＳテイル（ｔ、ａｉｌ）が多数の標識ポリヌクレオチ
ドに添加される可能性があると思われる。結合した標識
ポリヌクレオチド上におけるこのようなＨＳティルによ
って、これらの標識ポリヌクレオチドが結合していない
形のものである場合ですら、（試薬複合体から置換され
たのち非結合状態となったのであろう）、これらが連鎖
置換後の分離工程でアフィニティマトリックスに付着す
る可能性があると思われる。
ブリッド形成に先立ってホモポリマーセグメン） （Ｈ
３、これは結合配列Ｂｓの一形態である）をプローブＰ
に添加することができる。しかしこの場合は、同様、な
ＨＳテイル（ｔ、ａｉｌ）が多数の標識ポリヌクレオチ
ドに添加される可能性があると思われる。結合した標識
ポリヌクレオチド上におけるこのようなＨＳティルによ
って、これらの標識ポリヌクレオチドが結合していない
形のものである場合ですら、（試薬複合体から置換され
たのち非結合状態となったのであろう）、これらが連鎖
置換後の分離工程でアフィニティマトリックスに付着す
る可能性があると思われる。
これにより検出可能な信号の減少または損失が生じるの
は、標識ポリヌクレオチドの適宜な末端をあらかじめ遮
断することによって防止できる（たとえばＨＳテイルを
試薬複合体に添加する前に標識ポリヌクレオチドの３′
末端をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼでリン酸化することによる）。
は、標識ポリヌクレオチドの適宜な末端をあらかじめ遮
断することによって防止できる（たとえばＨＳテイルを
試薬複合体に添加する前に標識ポリヌクレオチドの３′
末端をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼでリン酸化することによる）。
第１図の方法における他の変法には、プローブポリヌク
レオチド１２内の標的結合領域ＴＢＲおよび結合セグメ
ン）ＢＳの位置の種々の変更が含まれる。
レオチド１２内の標的結合領域ＴＢＲおよび結合セグメ
ン）ＢＳの位置の種々の変更が含まれる。
第１図の第１の実施態様における他の変法は第２Ａ、２
Ｂ、２Ｃおよび２Ｄ図に示される第２の実施態様によっ
て表わされる。これは第２Ａ図において、修飾されたプ
ローブ鎖Ｐ′および標識ポリヌクレオチトパ鎖１１４を
含む中間構造１１５から始まる。第１図に示した実施態
様の場合と同様に、修飾されたプローブポリヌクレオチ
ドＰ′は標的結合領域ＴＢＲ（ここではヌクレオチド約
１．１００個（１，ｘＫｂ）の長さとして示される）お
よび３′末端結合領域ＢＳ（ここではデオキシシチジレ
ート残基の配列として示され、従って結合セグメントＢ
Ｓはこの実施態様においてはホモポリマーセグメントＨ
８として示される）を含む。後記の各列においてはＴＢ
ＲがバクテリオファージＭ１３ｍｐ ９にクローニン
グされたプラスミドｐＢＲ３２２の一部として導かれた
、修飾されたプローブポリヌクレオチドを用いる。ＴＢ
Ｒは５′末端からヌクレオチド少なくとも２０５個、ホ
モポリマー型結合セグメントＨ３からヌクレオチド′少
なくとも３４８個の間隔を置く。第１実施態様（第１図
）の標識ポリヌクレオチド１４と異なり、第２実施態様
の標識ポリヌクレオチド鎖１１４は間接標識を含む。す
なわちビオチン部分Ｂが、標識ポリヌクレオチド鎖の３
′末端にあるデオキシウリジンヌクレオチドＵの短いセ
グメントにペンダントされている。このセグメントは標
識ポリヌクレオチド鎖に（プローブポリヌクレオチド−
ｐ／にハイブリット“形成させる前に）ターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼによシ媒介され
る連鎖延長によって付着させることができる（たとえば
ワードらの前記特許出願明細書参照）。修飾されたプロ
ーブＰ′の製造、および標識ポリヌクレオチド鎖１１４
へのプローブのハイブリッド形成は、第１図に関連する
本文および対応する工程に関する各列の本文中に記載さ
れた手順によって行うことかできる。精製は、特にノ・
イブリッド形成していない標識ポリヌクレオチド鎖１１
４または（場合により）ノ・イブリッド形成していない
プローブ鎖を除去するサイズ排除クロマトグラフィーに
より行うことができる。次いでアビジンまたはストレプ
トアビジンに対する酵素Ｅの結合体（この結合体は第２
図にＡ−Ｅとして示される）を添加する。これかにンダ
ントビオチンに対するビオチン−アビジンまたはビオチ
ン−ストレプトアビジンの親和性によって、標識ポリヌ
クレオチド鎖１１４の３′末端においてインダントビオ
チンに結合スる。標識ポリヌクレオチド鎖１１４と酵素
結合体Ａ−Ｅの組合せが、この第２実施態様について標
識ポリヌクレオチドＬと呼ばれる。ここに示した方法の
変法においては、標識ポリヌクレオチドＬをプローブ鎖
Ｐ′にノ翫イズリッド形成させて試薬複合体１１６を形
成する前に、酵素結合体を標識ポリヌクレオチド鎖１１
４と反応させて標識ポリヌクレオチドＬを形成させるこ
とができる。
Ｂ、２Ｃおよび２Ｄ図に示される第２の実施態様によっ
て表わされる。これは第２Ａ図において、修飾されたプ
ローブ鎖Ｐ′および標識ポリヌクレオチトパ鎖１１４を
含む中間構造１１５から始まる。第１図に示した実施態
様の場合と同様に、修飾されたプローブポリヌクレオチ
ドＰ′は標的結合領域ＴＢＲ（ここではヌクレオチド約
１．１００個（１，ｘＫｂ）の長さとして示される）お
よび３′末端結合領域ＢＳ（ここではデオキシシチジレ
ート残基の配列として示され、従って結合セグメントＢ
Ｓはこの実施態様においてはホモポリマーセグメントＨ
８として示される）を含む。後記の各列においてはＴＢ
ＲがバクテリオファージＭ１３ｍｐ ９にクローニン
グされたプラスミドｐＢＲ３２２の一部として導かれた
、修飾されたプローブポリヌクレオチドを用いる。ＴＢ
Ｒは５′末端からヌクレオチド少なくとも２０５個、ホ
モポリマー型結合セグメントＨ３からヌクレオチド′少
なくとも３４８個の間隔を置く。第１実施態様（第１図
）の標識ポリヌクレオチド１４と異なり、第２実施態様
の標識ポリヌクレオチド鎖１１４は間接標識を含む。す
なわちビオチン部分Ｂが、標識ポリヌクレオチド鎖の３
′末端にあるデオキシウリジンヌクレオチドＵの短いセ
グメントにペンダントされている。このセグメントは標
識ポリヌクレオチド鎖に（プローブポリヌクレオチド−
ｐ／にハイブリット“形成させる前に）ターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼによシ媒介され
る連鎖延長によって付着させることができる（たとえば
ワードらの前記特許出願明細書参照）。修飾されたプロ
ーブＰ′の製造、および標識ポリヌクレオチド鎖１１４
へのプローブのハイブリッド形成は、第１図に関連する
本文および対応する工程に関する各列の本文中に記載さ
れた手順によって行うことかできる。精製は、特にノ・
イブリッド形成していない標識ポリヌクレオチド鎖１１
４または（場合により）ノ・イブリッド形成していない
プローブ鎖を除去するサイズ排除クロマトグラフィーに
より行うことができる。次いでアビジンまたはストレプ
トアビジンに対する酵素Ｅの結合体（この結合体は第２
図にＡ−Ｅとして示される）を添加する。これかにンダ
ントビオチンに対するビオチン−アビジンまたはビオチ
ン−ストレプトアビジンの親和性によって、標識ポリヌ
クレオチド鎖１１４の３′末端においてインダントビオ
チンに結合スる。標識ポリヌクレオチド鎖１１４と酵素
結合体Ａ−Ｅの組合せが、この第２実施態様について標
識ポリヌクレオチドＬと呼ばれる。ここに示した方法の
変法においては、標識ポリヌクレオチドＬをプローブ鎖
Ｐ′にノ翫イズリッド形成させて試薬複合体１１６を形
成する前に、酵素結合体を標識ポリヌクレオチド鎖１１
４と反応させて標識ポリヌクレオチドＬを形成させるこ
とができる。
第１図に示した試薬複合体］６の場合と同様に、プロー
ブＰ′に付着したホモポリマーセグメントに対するアフ
ィニティリガンドを含むカラム１７に導通することによ
り試薬複合体１１６を精製しうる。これを第２Ｃ図の最
初に概略的に示す。一般に、第１実施態様に関するこの
種のカラムの操作についての記述がここでも適用される
。しかし若干嵩高な、ビオチン、ストレプトアビジン（
またはアビジン）および酵素の複合体が標識パリヌクレ
オチドＬ上に存在するため、カラム１７の操作に際して
一定の予防措置が必要となる。まず、ノ・イブリッド形
成していない標識ポリヌクレオチドＬが最終的にクロマ
トグラフィー生氏物２５中に入るのを防ぐために、標識
ポリヌクレオチドの成分のうち１種または２種以上を引
きつける（そしてクロマトグラフィー操作期間中、遅滞
させる）カラム上の部位をいずれも可能な限り排除すべ
きである。例２に示すようにこの種の部位を排除する一
方法は、カラムを普通に使用する前にビオチン飽和デオ
キシウリジン、あるいはそのモノ−、ジー、もしくはト
リホスフェートまたは他の修飾された形のもので飽和さ
せることである。上記の例においてはビオチンはウリジ
ンの不在下では効力が低かった。アフィニティカラム１
７はホモポリマー型結合セグメントＨ８を含まないプロ
ーブ鎖Ｐ１および結合していないＡ−Ｅ複合体を除去す
ることができる。
ブＰ′に付着したホモポリマーセグメントに対するアフ
ィニティリガンドを含むカラム１７に導通することによ
り試薬複合体１１６を精製しうる。これを第２Ｃ図の最
初に概略的に示す。一般に、第１実施態様に関するこの
種のカラムの操作についての記述がここでも適用される
。しかし若干嵩高な、ビオチン、ストレプトアビジン（
またはアビジン）および酵素の複合体が標識パリヌクレ
オチドＬ上に存在するため、カラム１７の操作に際して
一定の予防措置が必要となる。まず、ノ・イブリッド形
成していない標識ポリヌクレオチドＬが最終的にクロマ
トグラフィー生氏物２５中に入るのを防ぐために、標識
ポリヌクレオチドの成分のうち１種または２種以上を引
きつける（そしてクロマトグラフィー操作期間中、遅滞
させる）カラム上の部位をいずれも可能な限り排除すべ
きである。例２に示すようにこの種の部位を排除する一
方法は、カラムを普通に使用する前にビオチン飽和デオ
キシウリジン、あるいはそのモノ−、ジー、もしくはト
リホスフェートまたは他の修飾された形のもので飽和さ
せることである。上記の例においてはビオチンはウリジ
ンの不在下では効力が低かった。アフィニティカラム１
７はホモポリマー型結合セグメントＨ８を含まないプロ
ーブ鎖Ｐ１および結合していないＡ−Ｅ複合体を除去す
ることができる。
試薬複合体１１６およびノ・イブリッド形成していない
プローブ鎖Ｐ′を含有する精製試薬２５を、次いで核酸
（このうちあるもの（Ｇ）が標的ヌクレオチド配列ＴＳ
を含む）を含有する試料と共に置換反応器１３０に添加
する。これを第２Ｃ図に概略的に示す。米国特許出願第
６０７．８８５号明細書の第１Ｂ図に示すように、標的
ヌクレオチド配列ＴＳはまずプローブ（試薬複合体１１
６のｐ／ ）の標的結合領域ＴＢＲの一部にノ・イブリ
ッド形成するであろう。米国特許出願第６０７，８８５
号明細書の第１Ｃ１１Ｄお゛よび１８図に示されるよう
に、標的ヌクレオチド配列ＴＳによるハイブリッド形成
点は次いで標識ポリヌクレオチド結合領域ＬＢＲ内へ移
動し、試薬複合体１１６中のプローブポリヌクレオチド
Ｐ′から標識ポリヌクレオチドを置換する。
プローブ鎖Ｐ′を含有する精製試薬２５を、次いで核酸
（このうちあるもの（Ｇ）が標的ヌクレオチド配列ＴＳ
を含む）を含有する試料と共に置換反応器１３０に添加
する。これを第２Ｃ図に概略的に示す。米国特許出願第
６０７．８８５号明細書の第１Ｂ図に示すように、標的
ヌクレオチド配列ＴＳはまずプローブ（試薬複合体１１
６のｐ／ ）の標的結合領域ＴＢＲの一部にノ・イブリ
ッド形成するであろう。米国特許出願第６０７，８８５
号明細書の第１Ｃ１１Ｄお゛よび１８図に示されるよう
に、標的ヌクレオチド配列ＴＳによるハイブリッド形成
点は次いで標識ポリヌクレオチド結合領域ＬＢＲ内へ移
動し、試薬複合体１１６中のプローブポリヌクレオチド
Ｐ′から標識ポリヌクレオチドを置換する。
第１図に関する記述について示したように、他の試薬が
反応器１３０内に存在してもよい。これには特に先きに
引用したウィリアムスらの明細書（米国特許出願第６８
４，３０８号）およびコリンズらの明細書（同第６８４
，３０５号）において考察されたものが含まれる。
反応器１３０内に存在してもよい。これには特に先きに
引用したウィリアムスらの明細書（米国特許出願第６８
４，３０８号）およびコリンズらの明細書（同第６８４
，３０５号）において考察されたものが含まれる。
適宜な期間ののち、ホモポリマー セグメントＨ８に対
する固定化されたアフィニティ試薬を保有するカラム１
３２に置換反応混合物を負荷する。
する固定化されたアフィニティ試薬を保有するカラム１
３２に置換反応混合物を負荷する。
カラム１３２の固定化されたアフィニティ試薬とホモポ
リマー セグメン）［８との結合は不可逆的であっても
よく、あるいは後記のように制御可能な程度に可逆的で
あってもよい。第１図に関連して考察した調製用カラム
１７の場合と同様に、置換反応混合物を導入したのちカ
ラムに一連の溶液１３４．１３６および１３８を導通し
てもよい。
リマー セグメン）［８との結合は不可逆的であっても
よく、あるいは後記のように制御可能な程度に可逆的で
あってもよい。第１図に関連して考察した調製用カラム
１７の場合と同様に、置換反応混合物を導入したのちカ
ラムに一連の溶液１３４．１３６および１３８を導通し
てもよい。
しかし使い捨てカラム１３２を用いるある種の形態にお
いては、第１液（洗浄液１３４）が必要とされるにすぎ
ない。この１回の洗浄による溶出液（または一連の溶液
を用いた場合の初期溶出液）は置換された標識ポリヌク
レオチドのすべてまたは実質上すべてを含有し、この存
在および量は分析すべき試料中の標的ヌクレオチド配列
ＴＳの存在および量と関数関係にある。定量はたとえば
分析される溶出液中の酵素Ｅの存在および量と関数関係
にある量の、検出可能な蛍光性、吸光性または発光性の
信号を生じる酵素反応体を用いて初期溶出液を常法によ
シ酵素分析することによって行うことができる。
いては、第１液（洗浄液１３４）が必要とされるにすぎ
ない。この１回の洗浄による溶出液（または一連の溶液
を用いた場合の初期溶出液）は置換された標識ポリヌク
レオチドのすべてまたは実質上すべてを含有し、この存
在および量は分析すべき試料中の標的ヌクレオチド配列
ＴＳの存在および量と関数関係にある。定量はたとえば
分析される溶出液中の酵素Ｅの存在および量と関数関係
にある量の、検出可能な蛍光性、吸光性または発光性の
信号を生じる酵素反応体を用いて初期溶出液を常法によ
シ酵素分析することによって行うことができる。
最小量の塩溶液１３６を用いて試薬複合体１１６をカラ
ム１３２から洗い出して後期溶出液を得ることがしばし
ば望まれる。この浴出液を同様に酵素分析することによ
って、先きの分析結果を量的に調整しかつ解釈する数値
が得られるかも知れない。カラム１３２を廃棄せずに再
使用することを希望する場合は、カラム１３２を再生用
液１３８で（および／またはさらに再平衡化用液で）洗
浄することができる。試料ポリヌクレオチド”Ｇの一部
が結合した（標的結合領域ＴＢＲに標的ヌクレオチド配
列ＴＳが相補的塩基対合することにより）プローブＰ′
は、最小量の塩溶液１３６または再生用液１３８中に、
未変化の過剰な試薬複合体と共にカラムから溶出するで
あろう。
ム１３２から洗い出して後期溶出液を得ることがしばし
ば望まれる。この浴出液を同様に酵素分析することによ
って、先きの分析結果を量的に調整しかつ解釈する数値
が得られるかも知れない。カラム１３２を廃棄せずに再
使用することを希望する場合は、カラム１３２を再生用
液１３８で（および／またはさらに再平衡化用液で）洗
浄することができる。試料ポリヌクレオチド”Ｇの一部
が結合した（標的結合領域ＴＢＲに標的ヌクレオチド配
列ＴＳが相補的塩基対合することにより）プローブＰ′
は、最小量の塩溶液１３６または再生用液１３８中に、
未変化の過剰な試薬複合体と共にカラムから溶出するで
あろう。
カラムからのアリコートをたとえば酵素活性につきアッ
セイすることにより（第２Ｄ図の下部に曲線１４０によ
って概略的に示すように）、活性ＰＤＬ ＰおよびｐＲ
ｃのピークを観察することができる。ここでＰＤＬＰは
アフィニティカラム１３２から回収された置換された標
識ポリヌクレオチドの量を表わし、ＰＲＯは試薬複合体
の量を表わす。第２Ｄ図において曲線の左端は最大保持
時間に相当する。ピークＰＲＣおよびＰＤＬＰは各ピー
クにおいて測定される要素（第２Ｄ図）の下方に示され
る。
セイすることにより（第２Ｄ図の下部に曲線１４０によ
って概略的に示すように）、活性ＰＤＬ ＰおよびｐＲ
ｃのピークを観察することができる。ここでＰＤＬＰは
アフィニティカラム１３２から回収された置換された標
識ポリヌクレオチドの量を表わし、ＰＲＯは試薬複合体
の量を表わす。第２Ｄ図において曲線の左端は最大保持
時間に相当する。ピークＰＲＣおよびＰＤＬＰは各ピー
クにおいて測定される要素（第２Ｄ図）の下方に示され
る。
このアッセイについてはこれらのピークのうち一方のみ
を定量すれば十分である。置換された標識ポリヌクレオ
チドの量はＯ（またはバンクグラウンド値）から試料中
に存在する標的ヌクレオチド配列ＴＳの量に比例して増
加するので、ピークＰＤＬＰ ′！ｉ一定量することが
好ましい。これに対し、予想される標的ヌクレオチド配
列の水準よシも大過剰の複合体が普通は用いられるので
、ピークＰＲＧは普通は大きく、試料中の標的ヌクレオ
チド配列ＴＳの存在の関数として相対的に小さな低下を
示すにすぎないであろう。
を定量すれば十分である。置換された標識ポリヌクレオ
チドの量はＯ（またはバンクグラウンド値）から試料中
に存在する標的ヌクレオチド配列ＴＳの量に比例して増
加するので、ピークＰＤＬＰ ′！ｉ一定量することが
好ましい。これに対し、予想される標的ヌクレオチド配
列の水準よシも大過剰の複合体が普通は用いられるので
、ピークＰＲＧは普通は大きく、試料中の標的ヌクレオ
チド配列ＴＳの存在の関数として相対的に小さな低下を
示すにすぎないであろう。
例１
同位体標識されたポリヌクレオチドおよびオリゴ（ｄＧ
）セルロースアフィニティクロマトグラフイーを用いる
連鎖置換後アッセイ法 プローブポリヌクレオチド これらの例に用いたＭ１３１００親クローニングビヒク
ルはヨアヒム・メツシングらによシ最初に構成された（
ジエイ・メツシングら、“ブロン・ナショナル・アカデ
・サイ・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。
）セルロースアフィニティクロマトグラフイーを用いる
連鎖置換後アッセイ法 プローブポリヌクレオチド これらの例に用いたＭ１３１００親クローニングビヒク
ルはヨアヒム・メツシングらによシ最初に構成された（
ジエイ・メツシングら、“ブロン・ナショナル・アカデ
・サイ・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ ）
’、７４巻、３６４２頁（１９７７年）、ジエイ・メツ
シング、′メソツズ・イン・エンサイモロジー”、１０
１巻、２０−７８頁（１９８３年））。これらの一本領
ノＺクテリオファージを遺伝的に処理して遺伝マーカー
、および目的とする外来ＤＮＡの選択的挿入を可能にす
る各種制限部位を含有させた。大腸菌にＭ１３ファージ
粒子を感染させることによシ一本領ファージＤＮＡ’ｉ
含有するヴイリオンを増殖培地中に放出されるので、Ｍ
１３クローニングビヒクルを用いることは以下の０例に
おいて特に有用である。ここで用いる種々のクローン番
号（たとえばＭ１３ｍｐ９クローンｌｌ−１６）はこれ
らのウィルス株の親形態に対するメツ７ングの命名法を
採用したバクテリオ７アージクローンの識別点である。
’、７４巻、３６４２頁（１９７７年）、ジエイ・メツ
シング、′メソツズ・イン・エンサイモロジー”、１０
１巻、２０−７８頁（１９８３年））。これらの一本領
ノＺクテリオファージを遺伝的に処理して遺伝マーカー
、および目的とする外来ＤＮＡの選択的挿入を可能にす
る各種制限部位を含有させた。大腸菌にＭ１３ファージ
粒子を感染させることによシ一本領ファージＤＮＡ’ｉ
含有するヴイリオンを増殖培地中に放出されるので、Ｍ
１３クローニングビヒクルを用いることは以下の０例に
おいて特に有用である。ここで用いる種々のクローン番
号（たとえばＭ１３ｍｐ９クローンｌｌ−１６）はこれ
らのウィルス株の親形態に対するメツ７ングの命名法を
採用したバクテリオ７アージクローンの識別点である。
この例および以下の各別において用いたプローブポリヌ
クレオチドは組み換えＤＮＡＭ１３ｍｐ９クローン■−
１６から誘導された。
クレオチドは組み換えＤＮＡＭ１３ｍｐ９クローン■−
１６から誘導された。
このＭ１３ｍｐ９クローンｌｌ−１６ＤＮＡは複製二本
鎖型Ｍ１３ｍｐ９に１）ＢＲ３２２ＤＮＡのＰＳｔＩ／
Ｂａｍ Ｈ工制限酵素消化により得られた１、 ｔ Ｋ
ｂの断片を挿入することによって製造された。１１Ｋｂ
挿人体は十分に生長した（ｍａｔｕｒｅ） （一本領）
形のＭ１３ｍｐ９りｏ−７Ｕ−１５ＤＮＡにオイて、選
ばれた標識４１Ｊヌクレオチド（ハイブリツド形成した
場合）の５′末端が環状または線状のプローブポリヌク
レオチドの挿入ＤＮＡ中のＢａｍＨ王制限部位（または
残存部分）に隣接するように配置される。クローン化さ
れたｐＢＲ３２２ＤＮＡ挿入体を含むＭ１３ｍｐ９クロ
ーン■−１６で受容細菌細胞を転換したのち、大量の一
本鎖型のＭ１３ｍｐ ９ＤＮＡが得られた。次いでこ
の一本鎖環状ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｆ Ｉ で徹底的
に消化し、完全に消化された時点で約２５の断片が得ら
れた。このうち１種のみが目的の配列（ｐＢＲ挿入体）
を含んでいた。環状ウィルスＤＮＡセグメント当たりの
Ｈｉｎｆ ｌ断片の数はＭ１３ｍｐ９ＤＮＡ中のＨｉｎ
ｆ ■制限酵素認識部位の数に基づいて推定される。ｐ
ＢＲ３２２Ｂａｍ ＨニーＰｓｔ ｌ断片は内部Ｈｉｎ
ｆ Ｔ認識部位をもたない。ｐＢＲ３２２ＤＮＡ挿入体
を含む完全消化生成物断片は長さ約１．６ Ｋｂであり
、分子の５′方向に伸びるもとのＭ１３ｍｐ９ＤＮＡか
らの塩基約２０５個および３′ 方向に伸びる約３４８
個の塩基のほかに、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ （１，Ｉ Ｋ
ｂ） からなる。Ｍ１３ｍｐ ９りｏ −：ｙＴｌ
−１５ＤＮＡのＨｉｎｆ Ｉ消化生成物（ｐＢＲ３２
２挿入体を含む断片を含む）につき、次いでターミナル
デオキシヌクレオチジルトランス７エラーゼ（ＴａＴ）
によるホモポリマー付加（ｆテイル形成’ （ｔａｉｌ
ｉｎｇ））反応を行った。
鎖型Ｍ１３ｍｐ９に１）ＢＲ３２２ＤＮＡのＰＳｔＩ／
Ｂａｍ Ｈ工制限酵素消化により得られた１、 ｔ Ｋ
ｂの断片を挿入することによって製造された。１１Ｋｂ
挿人体は十分に生長した（ｍａｔｕｒｅ） （一本領）
形のＭ１３ｍｐ９りｏ−７Ｕ−１５ＤＮＡにオイて、選
ばれた標識４１Ｊヌクレオチド（ハイブリツド形成した
場合）の５′末端が環状または線状のプローブポリヌク
レオチドの挿入ＤＮＡ中のＢａｍＨ王制限部位（または
残存部分）に隣接するように配置される。クローン化さ
れたｐＢＲ３２２ＤＮＡ挿入体を含むＭ１３ｍｐ９クロ
ーン■−１６で受容細菌細胞を転換したのち、大量の一
本鎖型のＭ１３ｍｐ ９ＤＮＡが得られた。次いでこ
の一本鎖環状ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｆ Ｉ で徹底的
に消化し、完全に消化された時点で約２５の断片が得ら
れた。このうち１種のみが目的の配列（ｐＢＲ挿入体）
を含んでいた。環状ウィルスＤＮＡセグメント当たりの
Ｈｉｎｆ ｌ断片の数はＭ１３ｍｐ９ＤＮＡ中のＨｉｎ
ｆ ■制限酵素認識部位の数に基づいて推定される。ｐ
ＢＲ３２２Ｂａｍ ＨニーＰｓｔ ｌ断片は内部Ｈｉｎ
ｆ Ｔ認識部位をもたない。ｐＢＲ３２２ＤＮＡ挿入体
を含む完全消化生成物断片は長さ約１．６ Ｋｂであり
、分子の５′方向に伸びるもとのＭ１３ｍｐ９ＤＮＡか
らの塩基約２０５個および３′ 方向に伸びる約３４８
個の塩基のほかに、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ （１，Ｉ Ｋ
ｂ） からなる。Ｍ１３ｍｐ ９りｏ −：ｙＴｌ
−１５ＤＮＡのＨｉｎｆ Ｉ消化生成物（ｐＢＲ３２
２挿入体を含む断片を含む）につき、次いでターミナル
デオキシヌクレオチジルトランス７エラーゼ（ＴａＴ）
によるホモポリマー付加（ｆテイル形成’ （ｔａｉｌ
ｉｎｇ））反応を行った。
この酵素はＤＮＡ分子の３’−ＯＨ末端へのデオキシヌ
クレオチド付加を解媒する。この例においては、ＤＮＡ
（ＨｉｎｆＴ消化生成物）６０〜７゜ｐｍｏｌをＴａＴ
４７２単位およびａＣＴＰ ７．４ ｎｍｏｌ（３’
−ＯＨ末端よシも１１４倍モル過剰のｄ Ｃ’ｌ’Ｐ
）と混合することによｐａＣ−テイル付’ＤＮＡが製造
された。次いで適宜なディル形成用緩衝液を添加し、混
合物を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベ
ーションののチ、 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ全添加しく最終濃度
１０ｍＭ）、混合物を３分間煮沸することにより、酵素
活性を破壊した。この混合物を精製することなく直接に
用いて、標識ポリヌクレオチドとのハイブリッドを形成
させた。
クレオチド付加を解媒する。この例においては、ＤＮＡ
（ＨｉｎｆＴ消化生成物）６０〜７゜ｐｍｏｌをＴａＴ
４７２単位およびａＣＴＰ ７．４ ｎｍｏｌ（３’
−ＯＨ末端よシも１１４倍モル過剰のｄ Ｃ’ｌ’Ｐ
）と混合することによｐａＣ−テイル付’ＤＮＡが製造
された。次いで適宜なディル形成用緩衝液を添加し、混
合物を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベ
ーションののチ、 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ全添加しく最終濃度
１０ｍＭ）、混合物を３分間煮沸することにより、酵素
活性を破壊した。この混合物を精製することなく直接に
用いて、標識ポリヌクレオチドとのハイブリッドを形成
させた。
標識ポリヌクレオチド この例および以下の各側に用い
た標識ポリヌクレオチドは ５’−ＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＣＧＣＣＡ
ＴＧＡＴＣ−３’の配列の化学的に合成されたオリゴヌ
クレオチド（２７ｍｅｒ）から誘導された。この未標識
オリゴヌクレオチドヲこれらの実験に用いるために３２
ｐで５′末端標識した。５’−０ｔ（リン酸化ののち、
取込まれなかった〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ をＤＥＡＥ
−セファデックス Ａ−２５イオン交換クロマトグラ
フイーにより除去し、標識ポリヌクレオチドを、さらに
精製することなく使用した。得られた一般的な比放射能
は約３０００ Ｃｉ／ｍｍｏＡ （２７ｍａｒ）であ
り、定量的な移行が推定された。
た標識ポリヌクレオチドは ５’−ＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＣＧＣＣＡ
ＴＧＡＴＣ−３’の配列の化学的に合成されたオリゴヌ
クレオチド（２７ｍｅｒ）から誘導された。この未標識
オリゴヌクレオチドヲこれらの実験に用いるために３２
ｐで５′末端標識した。５’−０ｔ（リン酸化ののち、
取込まれなかった〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ をＤＥＡＥ
−セファデックス Ａ−２５イオン交換クロマトグラ
フイーにより除去し、標識ポリヌクレオチドを、さらに
精製することなく使用した。得られた一般的な比放射能
は約３０００ Ｃｉ／ｍｍｏＡ （２７ｍａｒ）であ
り、定量的な移行が推定された。
ハイブリッド ５倍モル過剰の末端標識２７ ｍｅｒを
５ＸＳＳＧ（０，７５Ｍ−ＮａＣｌ＋０．０７５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）の存在下でＣ−テイル付プローブポリ
ヌクレオチドと混合することにより試薬複合体すなわち
ハイブリッドを形成した。一般に約２．５ｐｍｏｌのＣ
−ティル付プローブポリヌクレオチド（ｐＢＲ３２２種
人体を含む断片）ＤＮＡを末端標識２７ ｍａｒ約１２
．５ ｐｍｏｌに暴露し、混合物を５０℃に１時間保持
した。ハイブリッド混合物を徐々に室温にまで冷却し、
次いでセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 、登録商標
）４Ｂ（ファＡ／？シア）のカラム（７ｍｍＸ １７０
ｗｍ）に施し、ＴＥ（１゜ｍＭ トリｙ、−ＨＣＪ
＋ １ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，１）緩衝液で溶離し
た。溶出液を２滴または３滴の画分て採取し、ラジオア
ッセイした。高分子量のハイブリッドは早期に（カラム
の空隙率付近で〕溶出し、ハイブリッド形成していない
２７ｍａｒははるかに大きな保持時間で溶出した。こう
して、ハイブリッド形成していない標識オリゴヌクレオ
チドは試薬溶液から除去された。高分子量の画分はＭ１
３ｍｐ９りｏ −ンＩＩ −１６のＣ−テイル付Ｈｉｎ
ｆ ｌ断片からなり、これは標識ポリヌクレオチドにハ
イブリッド形成したｐＢＲ３２２挿人体（プローブポリ
ヌクレオチド）を保有する断片を含み、かつハイブリッ
ド形成が必ずしも１００％完了するまで進行したわけで
はないのでハイブリッド形成したプローブポリヌクレオ
チドをも含んでいた。一般にハイブリッド形成の効率４
０〜５０チが認められた。ハイブリッドを含有する高分
子量の両分の容積を次いで６００〜７００μｅから約１
００！１１にまで減少させ、後続の置換実験に用いた。
５ＸＳＳＧ（０，７５Ｍ−ＮａＣｌ＋０．０７５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）の存在下でＣ−テイル付プローブポリ
ヌクレオチドと混合することにより試薬複合体すなわち
ハイブリッドを形成した。一般に約２．５ｐｍｏｌのＣ
−ティル付プローブポリヌクレオチド（ｐＢＲ３２２種
人体を含む断片）ＤＮＡを末端標識２７ ｍａｒ約１２
．５ ｐｍｏｌに暴露し、混合物を５０℃に１時間保持
した。ハイブリッド混合物を徐々に室温にまで冷却し、
次いでセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 、登録商標
）４Ｂ（ファＡ／？シア）のカラム（７ｍｍＸ １７０
ｗｍ）に施し、ＴＥ（１゜ｍＭ トリｙ、−ＨＣＪ
＋ １ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，１）緩衝液で溶離し
た。溶出液を２滴または３滴の画分て採取し、ラジオア
ッセイした。高分子量のハイブリッドは早期に（カラム
の空隙率付近で〕溶出し、ハイブリッド形成していない
２７ｍａｒははるかに大きな保持時間で溶出した。こう
して、ハイブリッド形成していない標識オリゴヌクレオ
チドは試薬溶液から除去された。高分子量の画分はＭ１
３ｍｐ９りｏ −ンＩＩ −１６のＣ−テイル付Ｈｉｎ
ｆ ｌ断片からなり、これは標識ポリヌクレオチドにハ
イブリッド形成したｐＢＲ３２２挿人体（プローブポリ
ヌクレオチド）を保有する断片を含み、かつハイブリッ
ド形成が必ずしも１００％完了するまで進行したわけで
はないのでハイブリッド形成したプローブポリヌクレオ
チドをも含んでいた。一般にハイブリッド形成の効率４
０〜５０チが認められた。ハイブリッドを含有する高分
子量の両分の容積を次いで６００〜７００μｅから約１
００！１１にまで減少させ、後続の置換実験に用いた。
標的ポリヌクレオチド この例および以下の例における
連鎖置換を証明するための標的７１９１Ｊヌクレオチド
（１被分析体（ａｎａｌｙｔｅ） ’および１競合体（
ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ） ’ Ｄ Ｎ Ａとも呼ばれる
）は、Ｍ１３ｍｐ ９ＩＩ−１６ＤＮＡ中のｐＢ３２２
挿入体に対し相補的なｐＢＲ３２２ＤＮＡ （すなわち
Ｍ１３ｍｐ９クローン■−１６中に見出されないｐＢＲ
３２２ＤＮＡのＰｓｔ Ｔ ／Ｂａｍ Ｈ１２個消化に
より得られるＤＮＡ鎖）を含む一本領プラスミドＭ１３
ｍｐ８クローｙ２０ＤＮＡであった。Ｍ１３ｍｐ ８
り０−ン２０ＤＮＡとＭ１３ｍｐ９クローンＴｌ−１６
ＤＮＡの有意の相同領域は、隣接する多数のクロー二／
グ部位ＤＮＡ配列を含む挿入ｐＢＲ３２２配列の領域の
みであった。
連鎖置換を証明するための標的７１９１Ｊヌクレオチド
（１被分析体（ａｎａｌｙｔｅ） ’および１競合体（
ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ） ’ Ｄ Ｎ Ａとも呼ばれる
）は、Ｍ１３ｍｐ ９ＩＩ−１６ＤＮＡ中のｐＢ３２２
挿入体に対し相補的なｐＢＲ３２２ＤＮＡ （すなわち
Ｍ１３ｍｐ９クローン■−１６中に見出されないｐＢＲ
３２２ＤＮＡのＰｓｔ Ｔ ／Ｂａｍ Ｈ１２個消化に
より得られるＤＮＡ鎖）を含む一本領プラスミドＭ１３
ｍｐ８クローｙ２０ＤＮＡであった。Ｍ１３ｍｐ ８
り０−ン２０ＤＮＡとＭ１３ｍｐ９クローンＴｌ−１６
ＤＮＡの有意の相同領域は、隣接する多数のクロー二／
グ部位ＤＮＡ配列を含む挿入ｐＢＲ３２２配列の領域の
みであった。
表１
競合体ニブローブ Ｉ Ｍ −ＮａＣｌ＋ＴＥ緩衝液中
に１、 ０ １０
．７２、 ０．０６４：１ ２２．８
３、 ０．１６：１ ２６．７４、
０．３２：１ ４１．２５、
０．６４：１ ６５．５６、 １
．６：１ ７７．９置換 連鎖置換反
応は溶液中で試薬複合体０．１７ｐｍｏ ｌを用いて行
われた。試薬複合体を含む溶液に競合体ＤＮＡを表１に
示すモル比で添加した。
に１、 ０ １０
．７２、 ０．０６４：１ ２２．８
３、 ０．１６：１ ２６．７４、
０．３２：１ ４１．２５、
０．６４：１ ６５．５６、 １
．６：１ ７７．９置換 連鎖置換反
応は溶液中で試薬複合体０．１７ｐｍｏ ｌを用いて行
われた。試薬複合体を含む溶液に競合体ＤＮＡを表１に
示すモル比で添加した。
プローブおよび競合体のＤＮＡ濃度は電気泳動において
均質なりＮＡ調整液の光学的測定によシ判定された。置
換反応はｚｘＳＳＣ中で５０℃において、１７．５μｌ
の反応容積で３時間行われた。
均質なりＮＡ調整液の光学的測定によシ判定された。置
換反応はｚｘＳＳＣ中で５０℃において、１７．５μｌ
の反応容積で３時間行われた。
前記の各実験のほかに、相同競合体ＤＮＡの代わシに非
相同ＤＮＡ （）ζクテリオファージラムダＨｉｎｄ
ｍ消化断片、試薬複合体と１：１のモル比において）を
用いる実験も行った。
相同ＤＮＡ （）ζクテリオファージラムダＨｉｎｄ
ｍ消化断片、試薬複合体と１：１のモル比において）を
用いる実験も行った。
溶液置換後に、試料をＩ Ｍ −ＮａＣ１１＋Ｔ？−緩
衝液２５０μｌで希釈し、オリゴ（ｄＧ）セルロースを
含有するアフィニティカラムに導通した。これらの塩濃
度および温度の条件下で、修飾された（ｃ−テイル付）
ＤＮＡはオリ：／（ｄＧ）アフィニティ物質とのＣ−Ｇ
塩基対合によりこのカラムマトリックスに対する親和性
を示し、一方未修飾ＤＮＡ（置換された標識オリゴヌク
レオチドを含む）は親和性をもたず、従ってカラムを速
やかに通過するはずである。この実験に用いたオリゴ（
ｄＧ）セルロース（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（登録商標
）から入手）はヌクレオチド２０個までのホモポリマー
鎖状でセルロースに化学的に結合したグアニル酸から成
る。オリゴ（ｄＧ）セルロース１ｇは１００■までのグ
アニル酸を含有し、供給業者の製品説明書によれば１０
〜２０Ａ２６ｏ 単位のポリ（ｃ）を可逆的に結合す
るであろう。オリゴ（ｄＧ）セルロースをＴＥ緩衝液中
で洗浄し、Ｉ Ｍ−ＮａＣ１十ＴＥ緩衝液中で平衡化し
、次いでスラリーとしてアイソラボ（工５ｏｌａｂ １
登録商標）クィックーセプ（Ｑｕ ｉｋ −８ｅｐ ）
使い捨てポリプロピレン製カラム（容量５ｍ／り（ガラ
スミクロファイバーディスクを装填）中へ注入した。オ
リゴ（ｄＧ ）セルロース０．２５ｇを含むカラム（カ
ラム原寸法１ｏｗｎ×１５鵡）を用いて各置換を個々に
アッセイした。
衝液２５０μｌで希釈し、オリゴ（ｄＧ）セルロースを
含有するアフィニティカラムに導通した。これらの塩濃
度および温度の条件下で、修飾された（ｃ−テイル付）
ＤＮＡはオリ：／（ｄＧ）アフィニティ物質とのＣ−Ｇ
塩基対合によりこのカラムマトリックスに対する親和性
を示し、一方未修飾ＤＮＡ（置換された標識オリゴヌク
レオチドを含む）は親和性をもたず、従ってカラムを速
やかに通過するはずである。この実験に用いたオリゴ（
ｄＧ）セルロース（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（登録商標
）から入手）はヌクレオチド２０個までのホモポリマー
鎖状でセルロースに化学的に結合したグアニル酸から成
る。オリゴ（ｄＧ）セルロース１ｇは１００■までのグ
アニル酸を含有し、供給業者の製品説明書によれば１０
〜２０Ａ２６ｏ 単位のポリ（ｃ）を可逆的に結合す
るであろう。オリゴ（ｄＧ）セルロースをＴＥ緩衝液中
で洗浄し、Ｉ Ｍ−ＮａＣ１十ＴＥ緩衝液中で平衡化し
、次いでスラリーとしてアイソラボ（工５ｏｌａｂ １
登録商標）クィックーセプ（Ｑｕ ｉｋ −８ｅｐ ）
使い捨てポリプロピレン製カラム（容量５ｍ／り（ガラ
スミクロファイバーディスクを装填）中へ注入した。オ
リゴ（ｄＧ ）セルロース０．２５ｇを含むカラム（カ
ラム原寸法１ｏｗｎ×１５鵡）を用いて各置換を個々に
アッセイした。
試料を施したのち、オリゴ（ｄＧ）セルロースアフィニ
ティカラムを１５℃で３０分間インキュＲ−トし、それ
ぞれ１ｍｇアリコート４回ずつのＩＭ・ＮａＣ１＋ＴＫ
、 ０．２Ｍ−Ｎａｃｌ＋ＴＥ、 ’Ｉ’Ｅ、最後に０
． Ｉ Ｎ−ＮａＯＨで順次溶離した。カラム画分をす
べて採取し、放射能分析した。
ティカラムを１５℃で３０分間インキュＲ−トし、それ
ぞれ１ｍｇアリコート４回ずつのＩＭ・ＮａＣ１＋ＴＫ
、 ０．２Ｍ−Ｎａｃｌ＋ＴＥ、 ’Ｉ’Ｅ、最後に０
． Ｉ Ｎ−ＮａＯＨで順次溶離した。カラム画分をす
べて採取し、放射能分析した。
叩 同位体標識したホＩＪヌクレオチドおよびオリゴ（
ｄＧ）セルロースアフィニティクロマトグラフイーを用
いたこの例の連鎖置換実験の結果を表１に示す。相同競
合体ＤＮＡの代わりに非相同バクテリオファージラムダ
（ＨｉｎｄＩＩｌ断片）ＤＮＡを用いた実験の結果は、
７．２チの放射能がＩＭ・ＮａＣＡ＋ＴＥ画分中に溶出
したことを示した。これは競合体ＤＮＡを用いなかった
場合と有意差がなかった（表１）。表１に見られるよう
に、ＩＭ・ＮａＣｌ＋ Ｔ Ｅ画分中の放射能の溶出に
よって測定された置換は競合体ＤＮＡの濃度の関数とし
て増大した。
ｄＧ）セルロースアフィニティクロマトグラフイーを用
いたこの例の連鎖置換実験の結果を表１に示す。相同競
合体ＤＮＡの代わりに非相同バクテリオファージラムダ
（ＨｉｎｄＩＩｌ断片）ＤＮＡを用いた実験の結果は、
７．２チの放射能がＩＭ・ＮａＣＡ＋ＴＥ画分中に溶出
したことを示した。これは競合体ＤＮＡを用いなかった
場合と有意差がなかった（表１）。表１に見られるよう
に、ＩＭ・ＮａＣｌ＋ Ｔ Ｅ画分中の放射能の溶出に
よって測定された置換は競合体ＤＮＡの濃度の関数とし
て増大した。
例 ２
酵素標識したｚ ＩＪヌクレオチドおよびオリゴ（ｄＧ
）セルロースアフィニティクロマトグラフイーを用いる
連鎖置換後アッセイ プローブイリスクレオチド この例で用いたプローブポ
リヌクレオチドは例１に記載したものと同一であった。
）セルロースアフィニティクロマトグラフイーを用いる
連鎖置換後アッセイ プローブイリスクレオチド この例で用いたプローブポ
リヌクレオチドは例１に記載したものと同一であった。
標識、ｓ６ ＋）ヌクレオチド この例においては連鎖
置換の尺度としてワサビダイコン（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄ
ｉｓｈ）パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素活性を採用し
た。
置換の尺度としてワサビダイコン（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄ
ｉｓｈ）パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素活性を採用し
た。
ｆ（ＲＰｉ、Ｊポリヌクレオチドは、まず例１の場合と
同一の２７ ｍａｒをターミナルデオキシヌクレオチダ
ルトランスフェラーゼ（ＴａＴ）に関連して用いたビオ
チニル化ｄＵＴＰ でテイル形成し、次いでビオチンを
含有する修飾されたオリゴヌクレオチドをストレプトア
ビジン−ＨＲＰ （ＳＡ−ＨＲＰ）と結合させることに
より製造された。ビオチン修飾されたオリゴヌクレオナ
ト′の合成に際して同位体標識された２ ７ ｍａｒ
（５’ −３２Ｐ ）を使用し、種種の生成物画分に
おけるオリゴヌクレオチドの存在についての独立した尺
度を得た。リン酸化反応（例１に記載）から得られる末
端放射性標識された２７ｍｅｒ生成物をテイル形成の前
にまずエタノール沈殿させて、比較的塩不含のオリゴヌ
クレオチドにした。塩類はＴａＴ 酵素を妨害するから
である。次いで２７ｍｅｒ （１０−１５℃ｍｏｌ）
ｋ。
同一の２７ ｍａｒをターミナルデオキシヌクレオチダ
ルトランスフェラーゼ（ＴａＴ）に関連して用いたビオ
チニル化ｄＵＴＰ でテイル形成し、次いでビオチンを
含有する修飾されたオリゴヌクレオチドをストレプトア
ビジン−ＨＲＰ （ＳＡ−ＨＲＰ）と結合させることに
より製造された。ビオチン修飾されたオリゴヌクレオナ
ト′の合成に際して同位体標識された２ ７ ｍａｒ
（５’ −３２Ｐ ）を使用し、種種の生成物画分に
おけるオリゴヌクレオチドの存在についての独立した尺
度を得た。リン酸化反応（例１に記載）から得られる末
端放射性標識された２７ｍｅｒ生成物をテイル形成の前
にまずエタノール沈殿させて、比較的塩不含のオリゴヌ
クレオチドにした。塩類はＴａＴ 酵素を妨害するから
である。次いで２７ｍｅｒ （１０−１５℃ｍｏｌ）
ｋ。
ＤＮＡおよびｒｄＴ に対し５０倍モル過剰の修飾され
たデオキシヌクレオチド（約５０単位）を用いて、ビオ
チニル化ｄＵＴＰ と混合した。適宜なテイル形成用
緩衝液を添加したのち混合物を３７℃で１時間インキュ
ベートした。次いで、テイルをもたない２７ｍａｒをサ
イズ基準として用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によりテイルの長さを調べた。最初の実験ではこのビ
オチン−ｄＵＴＰ テイル付オリゴヌクレオチドをその
まま用いて、例１に記載したと同様なＣ−テイル付プロ
ーブポリヌクレオチドとのハイブリッドを製造した。次
いで、ハイブリッド形成していないビオチニル化オリゴ
ヌクレオチドおよび過剰のビオチン−ｄＵＴＰ を例１
に記載したと同様にセファロース４Ｂサイズ排除クロマ
トグラフイーにより除去した。セファロース４Ｂカラム
から得られる高分子前の両分（ハイブリッドを含有する
）を次いで５０倍モル過剰の５Ａ−ＨＲＰ（存在する・
・イブリッドの量に対する）と結合させた。結合反応は
リン酸塩緩衝化食塩液（ｐＨ７，４）中で３７℃におい
て３０分間行われた。結合した物質を次いで２５０μｌ
に希釈し、最終ＮａＣ１濃度ＩＭにした。結合したハイ
ブリッド、ハイブリッド形成していないＣ−テイル付ブ
ロープパリヌクレオテド、および未結合Ｓ Ａ −ＨＲ
Ｐ を含む混合物を次いでオリゴ（ｄＧ）セルロース
アフィニティ力ラムに導通して、結合していない酵素を
除去した。カラムのプロトコールは本質的には例１に記
載したものと同じであったが、ただしすべてのカラム画
分におけるＨＲＰ活性を測定した（後記参照）。未結合
５Ａ−ＨＲＰおよびテイル未形成プローブポリヌクレオ
チドはいずれもＩ Ｍ−ＮａＣ４＋ＴＥ緩衝液画分中に
溶出すると予想された。ＴＥ緩衝液のみの両分（結合し
た複合体を含有する）をプールし、下記の置換実験に用
いた。
たデオキシヌクレオチド（約５０単位）を用いて、ビオ
チニル化ｄＵＴＰ と混合した。適宜なテイル形成用
緩衝液を添加したのち混合物を３７℃で１時間インキュ
ベートした。次いで、テイルをもたない２７ｍａｒをサ
イズ基準として用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によりテイルの長さを調べた。最初の実験ではこのビ
オチン−ｄＵＴＰ テイル付オリゴヌクレオチドをその
まま用いて、例１に記載したと同様なＣ−テイル付プロ
ーブポリヌクレオチドとのハイブリッドを製造した。次
いで、ハイブリッド形成していないビオチニル化オリゴ
ヌクレオチドおよび過剰のビオチン−ｄＵＴＰ を例１
に記載したと同様にセファロース４Ｂサイズ排除クロマ
トグラフイーにより除去した。セファロース４Ｂカラム
から得られる高分子前の両分（ハイブリッドを含有する
）を次いで５０倍モル過剰の５Ａ−ＨＲＰ（存在する・
・イブリッドの量に対する）と結合させた。結合反応は
リン酸塩緩衝化食塩液（ｐＨ７，４）中で３７℃におい
て３０分間行われた。結合した物質を次いで２５０μｌ
に希釈し、最終ＮａＣ１濃度ＩＭにした。結合したハイ
ブリッド、ハイブリッド形成していないＣ−テイル付ブ
ロープパリヌクレオテド、および未結合Ｓ Ａ −ＨＲ
Ｐ を含む混合物を次いでオリゴ（ｄＧ）セルロース
アフィニティ力ラムに導通して、結合していない酵素を
除去した。カラムのプロトコールは本質的には例１に記
載したものと同じであったが、ただしすべてのカラム画
分におけるＨＲＰ活性を測定した（後記参照）。未結合
５Ａ−ＨＲＰおよびテイル未形成プローブポリヌクレオ
チドはいずれもＩ Ｍ−ＮａＣ４＋ＴＥ緩衝液画分中に
溶出すると予想された。ＴＥ緩衝液のみの両分（結合し
た複合体を含有する）をプールし、下記の置換実験に用
いた。
あとの実験においては、まず５Ａ−ＨＲＰ をビオチ
ン−ａ Ｕ ’ｒ Ｐテイル付オリゴヌクレオチド（セ
ファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、 登録商標）、Ｇ−
２５（ファルマシア）上で精製）に結合させ、次いでＣ
−テイル付プローブポリヌクレオチドとのハイブリッド
を製造することが決められた。ビオチン−ｄＵＴＰテイ
ル付オリゴヌクレオチドを前記と同様に製造し、精製せ
ずにＳＡ −ＨＲＰに総モル比１：１（総ビオチン：５
Ａ−ｆ（ＲＰ）で暴露した。混合物を３７℃で１時間、
次いで室温で一夜インキユベートした。結合したオリゴ
ヌクレオチドを次いで３倍モル過剰の標識オリゴヌクレ
オチドを用いてＣ−テイル付プローブポリヌクレオチド
と混合した。これらのＤ Ｎ Ａ ’ｉ ３７℃で１時
間、次いで室温で３時間ハイブリッド形成させた。・・
イブリッド形成後にＮａＣ１溶液濃度を１Ｍに高め、試
薬複合体を前記のようにオリゴ（ｄＧ）セルロースカラ
ムに導通することにより精製した。
ン−ａ Ｕ ’ｒ Ｐテイル付オリゴヌクレオチド（セ
ファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、 登録商標）、Ｇ−
２５（ファルマシア）上で精製）に結合させ、次いでＣ
−テイル付プローブポリヌクレオチドとのハイブリッド
を製造することが決められた。ビオチン−ｄＵＴＰテイ
ル付オリゴヌクレオチドを前記と同様に製造し、精製せ
ずにＳＡ −ＨＲＰに総モル比１：１（総ビオチン：５
Ａ−ｆ（ＲＰ）で暴露した。混合物を３７℃で１時間、
次いで室温で一夜インキユベートした。結合したオリゴ
ヌクレオチドを次いで３倍モル過剰の標識オリゴヌクレ
オチドを用いてＣ−テイル付プローブポリヌクレオチド
と混合した。これらのＤ Ｎ Ａ ’ｉ ３７℃で１時
間、次いで室温で３時間ハイブリッド形成させた。・・
イブリッド形成後にＮａＣ１溶液濃度を１Ｍに高め、試
薬複合体を前記のようにオリゴ（ｄＧ）セルロースカラ
ムに導通することにより精製した。
カラムの画分をすべて放射能分析し、各画分につきＨＲ
Ｐ活性も測定した。ＴＥ緩衝液のみの画分（結合したハ
イブリッド複合体を含有する）をプールし、次いで置換
実験に用いた。
Ｐ活性も測定した。ＴＥ緩衝液のみの画分（結合したハ
イブリッド複合体を含有する）をプールし、次いで置換
実験に用いた。
置換実験 連鎖置換反応を本質的には例１に記載したも
のと同じ溶液中で行った。ただし競合体ＤＮＡを競合体
／プローブポリヌクレオチドのモル比０，１．２５．１
０および２０の値で添加した。競合体およびプローブＤ
ＮＡの濃度は例１に示したと同様に計算された。置換反
応は２ ｘ ＳＳＣ中で３７℃において３時間行われた
。熱に対して不安定なＨＲＰ酵素が存在するため、比較
的低い反応温度および比較的高い水準の競合体ＤＮＡが
必要であった。溶液置換反応ののち試料をすべて２５０
μｌｌに希釈し、塩濃度ｉ １ Ｍ −Ｎａ（Ｊに高
め、次いで反応液をオリゴ（ｄＧ）セルロースカラムに
導通した。カラムの条件および緩衝液は例１に記載した
ものと同じであった。ただし使用前にカラムをビオチン
−ｄＵＴＰ で処理して、ビオチニル化ＤＮＡがポリプ
ロピレン製カラム中のアフィニティマトリックスに非特
異的に結合するのを少なくした。カラムの画分をすべて
採取し、各画分のアリコートヲ例１に記載したと同様に
放射能分析した。カラムの画分におけるＨＲＰ活性測定
のだめのオルトフェニレンジアミン（Ｏ）’Ｄ） 溶
液（０，１Ｍクエン酸ナトリウム中１．１■／ｍ１）１
５０μｅは０．１ Ｍクエン酸ナトリウム中の０．０１
２チＨ２Ｏ２１５０μｌであり、この混合物にＨＲＰ含
有含有試料溶液２５０μ壕！を添加した。
のと同じ溶液中で行った。ただし競合体ＤＮＡを競合体
／プローブポリヌクレオチドのモル比０，１．２５．１
０および２０の値で添加した。競合体およびプローブＤ
ＮＡの濃度は例１に示したと同様に計算された。置換反
応は２ ｘ ＳＳＣ中で３７℃において３時間行われた
。熱に対して不安定なＨＲＰ酵素が存在するため、比較
的低い反応温度および比較的高い水準の競合体ＤＮＡが
必要であった。溶液置換反応ののち試料をすべて２５０
μｌｌに希釈し、塩濃度ｉ １ Ｍ −Ｎａ（Ｊに高
め、次いで反応液をオリゴ（ｄＧ）セルロースカラムに
導通した。カラムの条件および緩衝液は例１に記載した
ものと同じであった。ただし使用前にカラムをビオチン
−ｄＵＴＰ で処理して、ビオチニル化ＤＮＡがポリプ
ロピレン製カラム中のアフィニティマトリックスに非特
異的に結合するのを少なくした。カラムの画分をすべて
採取し、各画分のアリコートヲ例１に記載したと同様に
放射能分析した。カラムの画分におけるＨＲＰ活性測定
のだめのオルトフェニレンジアミン（Ｏ）’Ｄ） 溶
液（０，１Ｍクエン酸ナトリウム中１．１■／ｍ１）１
５０μｅは０．１ Ｍクエン酸ナトリウム中の０．０１
２チＨ２Ｏ２１５０μｌであり、この混合物にＨＲＰ含
有含有試料溶液２５０μ壕！を添加した。
アッセイ液を室温で３０分間緩和に振とうしたのチ２Ｍ
−Ｈ２ＳＯ４１５０１Ｉｌｌを添加して反応を停止させ
た。次いでアッセイ用試験管の内容物をＡ４９０値につ
き、未希釈条件下または希釈条件下で分析した。希釈が
必要な場合は０．１ Ｍクエン酸す） ＩＪウム緩衝液
中で行った。
−Ｈ２ＳＯ４１５０１Ｉｌｌを添加して反応を停止させ
た。次いでアッセイ用試験管の内容物をＡ４９０値につ
き、未希釈条件下または希釈条件下で分析した。希釈が
必要な場合は０．１ Ｍクエン酸す） ＩＪウム緩衝液
中で行った。
結果 一連の連鎖置換実験の結果から、標識ポリヌクレ
オチドは競合体ＤＮＡ量の増加に正比例する量で置換さ
れることが証明された。ＨＲＰ活性および放射性標識を
共にすべてのカラム画分において追跡した。ＩＭ−Ｎａ
Ｃｌ＋ＴＥ緩衝液中のＨＲＰ活性および放射能は、試薬
複合体の量を一定にしたとき競合体ＤＮＡ濃度に比例し
て増加した。同時に、ＴＥのみの緩衝液の画分中のＨＲ
Ｐ活性の量は、反応試料中の競合体ＤＮＡ濃度が高まる
のに伴って減少した（データは示されていない）。
オチドは競合体ＤＮＡ量の増加に正比例する量で置換さ
れることが証明された。ＨＲＰ活性および放射性標識を
共にすべてのカラム画分において追跡した。ＩＭ−Ｎａ
Ｃｌ＋ＴＥ緩衝液中のＨＲＰ活性および放射能は、試薬
複合体の量を一定にしたとき競合体ＤＮＡ濃度に比例し
て増加した。同時に、ＴＥのみの緩衝液の画分中のＨＲ
Ｐ活性の量は、反応試料中の競合体ＤＮＡ濃度が高まる
のに伴って減少した（データは示されていない）。
例３
大腸菌Ｒｅｃ Ａ 蛋白質の存在下での同位体標識ポ
リヌクレオナト、およびオリ＝ｆ（ｄＧ）セルロースア
フィニティクロマトグラフイーを用いる連鎖置換後アツ
セイ ープパリヌクレオチドはＭ１３ｍｐ９クローン５−５ま
たはＭ１３ｍｐ１９り０−７３−２から誘導された。こ
れらのクローンは例１に記載したクローンＭ１３ｍｐ９
クローン■−１６に相当する後期分離体（ｉｓｏｌａ、
ｔｅ） であった。
リヌクレオナト、およびオリ＝ｆ（ｄＧ）セルロースア
フィニティクロマトグラフイーを用いる連鎖置換後アツ
セイ ープパリヌクレオチドはＭ１３ｍｐ９クローン５−５ま
たはＭ１３ｍｐ１９り０−７３−２から誘導された。こ
れらのクローンは例１に記載したクローンＭ１３ｍｐ９
クローン■−１６に相当する後期分離体（ｉｓｏｌａ、
ｔｅ） であった。
例１に記載したと同様にして製造された。
ハイブリッド ハイブリッド試薬複合体は１モル過剰の
末端放射性標識２７ｍａｒ（標識ポリヌクレオチド）を
２ｘＳＳＣの存在下でＣ−ティル付プローブポリヌクレ
オチドと混合することによシ製造された。混合物を５０
℃に１時間放置したのち例１に詳述したように精製した
。
末端放射性標識２７ｍａｒ（標識ポリヌクレオチド）を
２ｘＳＳＣの存在下でＣ−ティル付プローブポリヌクレ
オチドと混合することによシ製造された。混合物を５０
℃に１時間放置したのち例１に詳述したように精製した
。
ヌクレオチドは環状Ｍ１３ｍｐ８クローン２０Ｃ−２で
あった。このクローンは例１に記載したＭ１３ｍｐ８ク
ローン２０に相当する後期分離体であった。
あった。このクローンは例１に記載したＭ１３ｍｐ８ク
ローン２０に相当する後期分離体であった。
置換 ０．１４ ｐｍｏｌのハイブリッド試薬複合体を
用いて連鎖置換反応を行った。ハイブリッド試薬複合体
を含有する溶液に競合体ＤＮＡを表２に示す比率で添加
した。各反応液にはｒｅｃＡ蛋白質（大腸菌から精製；
ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（メリーランド州
ガイテルスバーグ）から市販されている）６４μ９も含
まれていた。置換反応はｌ Ｘ ｒ６ｃＡ緩衝液（２０
ｍＭ）リスーＨＣｌ、ｐＨ７，５，２５ｍ Ｍ−Ｍ ９
Ｃｔ；！ ２．２ｍＭジチオスレイトール、１００ ｔ
１ｇ／ｙｔｌ ＢＳＡ、 ２ｍＭ −ＡＴＰ） 中
で３７℃において１時間、約２０μｌの反応容積におい
て行われた。
用いて連鎖置換反応を行った。ハイブリッド試薬複合体
を含有する溶液に競合体ＤＮＡを表２に示す比率で添加
した。各反応液にはｒｅｃＡ蛋白質（大腸菌から精製；
ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（メリーランド州
ガイテルスバーグ）から市販されている）６４μ９も含
まれていた。置換反応はｌ Ｘ ｒ６ｃＡ緩衝液（２０
ｍＭ）リスーＨＣｌ、ｐＨ７，５，２５ｍ Ｍ−Ｍ ９
Ｃｔ；！ ２．２ｍＭジチオスレイトール、１００ ｔ
１ｇ／ｙｔｌ ＢＳＡ、 ２ｍＭ −ＡＴＰ） 中
で３７℃において１時間、約２０μｌの反応容積におい
て行われた。
競合体およびプローブＤＮＡの濃度は例１に示したと同
様に計算された。各反応液に添加されたｒｅｃＡ蛋白質
の量は約１２００：１（モル）でｒｅｃＡ蛋白質がプロ
ーブＤＮ、Ａよりも過剰であった。
様に計算された。各反応液に添加されたｒｅｃＡ蛋白質
の量は約１２００：１（モル）でｒｅｃＡ蛋白質がプロ
ーブＤＮ、Ａよりも過剰であった。
置換後に各試料を例１に記載したと同様にオリゴ（ｄＧ
）セルロースアフィニティカラムに導通した。
）セルロースアフィニティカラムに導通した。
結果 ｒｅｃＡ蛋白質の存在下で同位体標識ポリヌクレ
オチドを用いた連鎖置換反応の結果を表２に列記する。
オチドを用いた連鎖置換反応の結果を表２に列記する。
表２
競合体ニブロープ １Ｍ−ＮａＣ１十ＴＥ緩衝液中に
１・ ０４，３ ２・ ・０４：１ １２．０３・
・２：１ ４０．４４・
・４ ： １ ５７．５同様に、
非相同ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２挿人体を含まない環状Ｍｌ
３ｍｐ ８ＤＮＡ ）はモル比 、５：１ （Ｍｌ
３ｍｐ３ ＤＮＡ ：試薬複合体）ニオイテＬＭ−Ｎａ
（Ｊ＋ＴＥ緩衝液画分中に９．０％の放射能を生じた。
１・ ０４，３ ２・ ・０４：１ １２．０３・
・２：１ ４０．４４・
・４ ： １ ５７．５同様に、
非相同ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２挿人体を含まない環状Ｍｌ
３ｍｐ ８ＤＮＡ ）はモル比 、５：１ （Ｍｌ
３ｍｐ３ ＤＮＡ ：試薬複合体）ニオイテＬＭ−Ｎａ
（Ｊ＋ＴＥ緩衝液画分中に９．０％の放射能を生じた。
例 ４
参考のためここにカルビン・ピー・エッチ・バリーらの
１ポリヌクレオチド置換、分離、酵素による開裂、およ
びアデノシンリン酸検出に用いる診断用試薬、キットお
よび方法°と題する出願明細書の一例２を引用する。そ
の実験を表３にまとめる。
１ポリヌクレオチド置換、分離、酵素による開裂、およ
びアデノシンリン酸検出に用いる診断用試薬、キットお
よび方法°と題する出願明細書の一例２を引用する。そ
の実験を表３にまとめる。
第１図は本発明の一形態の試薬複合体を製造するための
本発明方法の一実施態様に示す略図である。 第２Ａ図は本発明の試薬複合体への前駆物質１１５の形
態を示す略図である。 第２Ｂ図は第２Ａ図の前駆物質１１５からストレプトア
ビジン−酵素結合体（Ａ−Ｅ）の添加により製造された
試薬複合体１１６を第２Ａ図に比して引伸ばした図であ
る。 第２Ｃ図は、本発明方法の分離工程（ｃ１）の一実施態
様による試薬複合体の精製を示し、かつ本発明方法の一
実施態様により核酸試料（Ｇ）中の標的ヌクレオチド配
列（ＴＳ）ｔ−検出するために試薬複合体１１６を使用
することを示す略図である。 第２Ｄ図は、第２Ｃ図のカラム１３２より採取されたア
リコートからの酵素反応出力を概略的にグラフで示した
もの、および対応するアリコート中に見出される分子形
をグラフで示したものであり；この図は試薬複合体に対
するピーク（ＰＲｃ）および置換された標識ポリヌクレ
オチドに対するピーク（ＰＤＬＰ）を示す。従って第２
Ｄ図は本発明方法の測定工程（ｃ２）の一実施態様の出
力を示す。 各図において記号は下記のものを表わす。 ｐ（１ｏ）：プロープボリヌクレオテドＴＢＲ：標的結
合領域 ＬＢＨ：ｉａ’ｔ’リヌクレオテド結合領域Ｌ （１４
，１１４）：標識ポリヌクレオチドＰ′（１つ：修飾さ
れたＰ ＢＳ：結合セグメント Ｔ：標識 Ｈ８：ホモポリマーセグメント Ｂ：ビオチン Ｕ：ウリジンヌクレオチド Ａ−Ｅ ：アビジンー酵素結合体 ＴＳ：標的ヌクレオチド配列 １６．１１６：試薬複合体 １７、１３２ ：カラム １ｓ、２０．２２，１３４，１３６，１３８ ：溶離液
２４：Ｐ＋Ｌ ２５：生成物画分 １１５：ｐ’＋Ｌ １３０ ：置換反応器 １４０ ：活性曲線 （外５名） ＦＩＧ、１
本発明方法の一実施態様に示す略図である。 第２Ａ図は本発明の試薬複合体への前駆物質１１５の形
態を示す略図である。 第２Ｂ図は第２Ａ図の前駆物質１１５からストレプトア
ビジン−酵素結合体（Ａ−Ｅ）の添加により製造された
試薬複合体１１６を第２Ａ図に比して引伸ばした図であ
る。 第２Ｃ図は、本発明方法の分離工程（ｃ１）の一実施態
様による試薬複合体の精製を示し、かつ本発明方法の一
実施態様により核酸試料（Ｇ）中の標的ヌクレオチド配
列（ＴＳ）ｔ−検出するために試薬複合体１１６を使用
することを示す略図である。 第２Ｄ図は、第２Ｃ図のカラム１３２より採取されたア
リコートからの酵素反応出力を概略的にグラフで示した
もの、および対応するアリコート中に見出される分子形
をグラフで示したものであり；この図は試薬複合体に対
するピーク（ＰＲｃ）および置換された標識ポリヌクレ
オチドに対するピーク（ＰＤＬＰ）を示す。従って第２
Ｄ図は本発明方法の測定工程（ｃ２）の一実施態様の出
力を示す。 各図において記号は下記のものを表わす。 ｐ（１ｏ）：プロープボリヌクレオテドＴＢＲ：標的結
合領域 ＬＢＨ：ｉａ’ｔ’リヌクレオテド結合領域Ｌ （１４
，１１４）：標識ポリヌクレオチドＰ′（１つ：修飾さ
れたＰ ＢＳ：結合セグメント Ｔ：標識 Ｈ８：ホモポリマーセグメント Ｂ：ビオチン Ｕ：ウリジンヌクレオチド Ａ−Ｅ ：アビジンー酵素結合体 ＴＳ：標的ヌクレオチド配列 １６．１１６：試薬複合体 １７、１３２ ：カラム １ｓ、２０．２２，１３４，１３６，１３８ ：溶離液
２４：Ｐ＋Ｌ ２５：生成物画分 １１５：ｐ’＋Ｌ １３０ ：置換反応器 １４０ ：活性曲線 （外５名） ＦＩＧ、１
Claims (9)
- （１）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基対の水素結合を介
して標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプローブ
ヌクレオチド、および （ｉｉ）プリン／ピリミジン塩基対の水素結合を介して
、プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に
塩基対結合しうる領域と少なくとも部分的に共通の範囲
をもつ（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）プローブポリヌクレ
オチドの領域においてプローブポリヌクレオチドに塩基
対結合することにより結合した標識ポリヌクレオチド からなる、生物学的試料の核酸中のあらかじめ定められ
た標的ヌクレオチド配列の存在を測定するための診断用
試薬複合体において、 標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオチドとの
間で起こりうる塩基対結合が試薬複合体から標識ポリヌ
クレオチドを置換しうるものであって； プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に塩
基対結合しうる領域から遠位において（すなわち間隔を
置いて）、プローブポリヌクレオチドが結合セグメント
を含み； プローブポリヌクレオチドのこの結合セグメントに、標
識ポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドに結合
した状態を保つ条件下で、アフィニティ試薬が可逆的に
結合しうる ことを特徴とする診断用試薬複合体。 - （２）結合セグメントがホモポリヌクレオチドセグメン
トである、特許請求の範囲第１項に記載の診断用試薬。 - （３）ホモポリヌクレオチドセグメントがポリ（ｄＣ）
、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＵ）、ポリ（
ビオチン−ｄＵ）、ポリ（ｒＣ）、ポリ（ｒＧ）、およ
びポリ（ｒＵ）よりなる群から選ばれる、特許請求の範
囲第２項に記載の診断用試薬。 - （４）プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配
列に塩基対結合しうる標的結合領域、および複合体にお
いて標識ポリヌクレオチドの塩基にプリン／ピリミジン
塩基対結合により結合した標識ポリヌクレオチド結合領
域を含み、かつ標識ポリヌクレオチド結合領域が標的結
合領域に含まれる、特許請求の範囲第２項に記載の診断
用試薬。 - （５）標識ポリヌクレオチドがアフィニティ部分に共有
結合した酵素を含み、かつ標識ポリヌクレオチドのヌク
レオチドがアフィニティ部分およびそれに対しアフィニ
ティ部分が特異的であるリガンド部分を介して酵素に結
合している、特許請求の範囲第１項に記載の診断用試薬
。 - （６）（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基対の水素結
合を介して標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプ
ローブポリヌクレオチド、および（ｉｉ）プリン／ピリ
ミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌクレ
オチドが標的ヌクレオチド配列に結合しうる領域と少な
くとも部分的に共通の範囲をもつプローブポリヌクレオ
チドの領域においてプローブポリヌクレオチドに塩基対
結合することにより結合した標識ポリヌクレオチドの試
薬複合体を供給し； （ｂ）試薬複合体を溶液中で、標的ヌクレオチド配列が
存在する場合プローブポリヌクレオチドに結合しかつ複
合体から標識ポリヌクレオチドを置換する条件下におい
て試料と接触させ；（ｃ１）接触工程（ｂ）ののち反応
溶液の一部から残留する試薬複合体を分離し、そして （ｃ２）分離後の溶液相中の置換された標識ポリヌクレ
オチドの存在を測定する 工程からなる生物学的試料の核酸中のあらかじめ定めら
れた標的ヌクレオチド配列の存在を測定するための方法
であって； プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に塩
基対結合しうる領域から遠位において、プローブポリヌ
クレオチドが結合セグメントを含み； 分離工程（ｃ１）が、接触工程（ｂ）の溶液生成物を上
記結合セグメントに対する固定化されたアフィニティ試
薬と接触した状態で通過させ、固定化されたアフィニテ
ィ試薬から結合セグメントを含有するポリヌクレオチド
は実質的に含まない溶液相を回収し、この溶液相につい
て測定工程（ｃ２）を実施し、その際、固定化されたア
フィニティ試薬と試薬複合体の結合が可逆的である ことを特徴とする方法。 - （７）結合セグメントはホモポリヌクレオチドセグメン
トであり、アフィニティ試薬は該ホモポリヌクレオチド
セグメントのヌクレオチドに対して相補的であるヌクレ
オチドの反復セグメントが懸垂した（ａｐｐｅｎｄｅｄ
）マトリックスである、特許請求の範囲第６項に記載の
方法。 - （８）標識ポリヌクレオチドがアフィニティ部分に共有
結合した酵素を含み、かつ標識ポリヌクレオチドのヌク
レオチドがアフィニティ部分およびそれに対しアフィニ
ィティ部分が特異的であるリガンド部分を介して酵素に
結合している、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 - （９）（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基対の水素結
合を介して標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領
域をもつプローブポリヌクレオチド、および （ｉｉ）プリン／ピリミジン塩基対の水素結合を介して
、プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列に
塩基対結合しうる領域と少なくとも部分的に共通の範囲
をもつプローブポリヌクレオチドの領域においてプロー
ブポリヌクレオチドに塩基対結合しうる標識ポリヌクレ
オチド をハイブリッド形成させ； プローブポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチ
ドが標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる領域から
遠位にある結合セグメントを含み； （ｂ）該結合セグメントにおける選択的な可逆的吸着に
より、試薬複合体をプローブポリヌクレオチドに結合し
ていない標識ポリヌクレオチドから分離する 工程からなる、生物学的試料の核酸中におけるあらかじ
め定められた標的ヌクレオチド配列の存在を測定するの
に有用な診断用試薬の製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72950185A | 1985-05-02 | 1985-05-02 | |
| US729501 | 1985-05-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61288158A true JPS61288158A (ja) | 1986-12-18 |
| JPH0710239B2 JPH0710239B2 (ja) | 1995-02-08 |
Family
ID=24931334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10188986A Expired - Lifetime JPH0710239B2 (ja) | 1985-05-02 | 1986-05-01 | 診断用ポリヌクレオチド試薬複合体、溶液中での試薬複合体からの置換およびアフイニテイ分離を含むその使用法、ならびにその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0710239B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20230241530A1 (en) * | 2022-02-01 | 2023-08-03 | W. L. Gore & Associates, Inc. | Affinity chromatography devices containing a heat treated fibrillated polymer membrane for the separation of mrna and viral vectors from an aqueous mixture |
-
1986
- 1986-05-01 JP JP10188986A patent/JPH0710239B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0710239B2 (ja) | 1995-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5424188A (en) | Amplified hybridization assay | |
| JP2577881B2 (ja) | ポリヌクレオチド連鎖を利用する検定方法 | |
| US4752566A (en) | Displacement polynucleotide method and reagent complex employing labeled probe polynucleotide | |
| US5210015A (en) | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase | |
| US4775619A (en) | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites | |
| EP0357336B1 (en) | Method for detection of specific nucleic acid sequences | |
| US5476769A (en) | Method for assays of nucleic acid, a reagent combination and a kit therefor | |
| US4767699A (en) | Diagnostic reagent, kit and method employing polynucleotide displacement, separation, enzymatic cleavage and adenosine phosphate detection | |
| CA2358992C (en) | Method for controlling the extension of an oligonucleotide | |
| JPS6131100A (ja) | 置換ポリヌクレオチド検定法およびそのポリヌクレオチド複合体試薬 | |
| JP2002503089A (ja) | ポリヌクレオチド増幅方法 | |
| JPH03501211A (ja) | 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬 | |
| CA2005557A1 (en) | Chemical preparation of high specific activity nucleotide probes | |
| JPH05168472A (ja) | ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体 | |
| JPS60244300A (ja) | 組換えタンパク質を用いる置換ポリヌクレオチド検定および診断用キツド | |
| WO2003102212A2 (en) | In vitro evaluation of nucleic acid ligands | |
| KR20020013517A (ko) | 고상 지지체로부터 핵산의 절단 | |
| US5616465A (en) | Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes | |
| AU1378300A (en) | Method and test kit for analyzing DNA repair | |
| JPS61288158A (ja) | 診断用ポリヌクレオチド試薬複合体、溶液中での試薬複合体からの置換およびアフイニテイ分離を含むその使用法、ならびにその製法 | |
| WO2000043543A1 (en) | Detection of differences between polynucleotides | |
| US6238867B1 (en) | Compositions, methods and kits for identifying naturally occurring RNA sequences having affinity for RNA-binding proteins | |
| CN120519631A (zh) | 一种基于dna多通节、可检测不同类型靶标的试剂盒和检测方法 | |
| Kimoto et al. | Unit Title | |
| Rashtchian | Differential incorporation of biotinylated nucleotides by terminal deoxynucleotidyl transferase |