JPS61289893A - Ｌ−プロリンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−プロリンの製造方法Info
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- JPS61289893A JPS61289893A JP61084416A JP8441686A JPS61289893A JP S61289893 A JPS61289893 A JP S61289893A JP 61084416 A JP61084416 A JP 61084416A JP 8441686 A JP8441686 A JP 8441686A JP S61289893 A JPS61289893 A JP S61289893A
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- proline
- brevibacterium flavum
- brevibacterium
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/13—Brevibacterium
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は微生物工業に関し、さらにと９わけＬ−ノロリ
ン生産性の微生物を用いる発酵によってＬ−プロリンを
製造する方法に関する。
ン生産性の微生物を用いる発酵によってＬ−プロリンを
製造する方法に関する。
Ｌ−プロリンは最も重要なアミノ酸の１つである。Ｌ−
プロリンはアミノ酸混合物の剤型で非経口的栄養物とし
ておよび神経系の活性化剤として主に医薬において用い
られている。さらに、Ｌ−プロリンは食品工業の分野に
おいて食品の補助物質としての用途が見い出されている
。
プロリンはアミノ酸混合物の剤型で非経口的栄養物とし
ておよび神経系の活性化剤として主に医薬において用い
られている。さらに、Ｌ−プロリンは食品工業の分野に
おいて食品の補助物質としての用途が見い出されている
。
Ｌ−プロリンの生産者として、アミノ酸二り一インロイ
シンまたはＬ−アルギニン要求性（米国特許第３．３２
９．５７７号参照）のおよびスルファグアニジン耐性（
米国特許第３，８１９，４８３号参照）のおよびヌクレ
オシドおよびプリン塩基またはピリミジン塩基の類似化
合物耐性（ヨーロッノ臂特許番号００９８１２２Ａ２／
１９８４）の微生物の変異体ケ用いる発酵によってＬ−
プロリンを製造する方法が当業者に知られている。
シンまたはＬ−アルギニン要求性（米国特許第３．３２
９．５７７号参照）のおよびスルファグアニジン耐性（
米国特許第３，８１９，４８３号参照）のおよびヌクレ
オシドおよびプリン塩基またはピリミジン塩基の類似化
合物耐性（ヨーロッノ臂特許番号００９８１２２Ａ２／
１９８４）の微生物の変異体ケ用いる発酵によってＬ−
プロリンを製造する方法が当業者に知られている。
これらの方法が保証するＬ−ノロリンの収率は比較的低
い水準である（１５〜” ５９／ｌ ： ａ ５１１／
ｌの収率はＬ−グルタミン酸の存在において発酵を行な
う場合にのみ達成される）ので、所望の生成物の製造の
コストが増大する。
い水準である（１５〜” ５９／ｌ ： ａ ５１１／
ｌの収率はＬ−グルタミン酸の存在において発酵を行な
う場合にのみ達成される）ので、所望の生成物の製造の
コストが増大する。
Ｌ−プロリンの類似化合物に耐性でありゾロリンオキシ
ダーゼに関して不十分であるセレイシ７−−ｒｙ声ッセ
ンづ（Ｓｓｒｒａｔｉａ ｍａｒ悶μ遍す）属の微生物
の変異体を用いた発酵によるＬ−プロリンの製造も当業
者に知られている（ヨーロッパ特許番号００７６５１６
参照）、この方法により ６２．５１１／１の収率でＬ
−プロリンを得ることが可能であるが、その発酵は相当
量の糖（２（１）の存在において行なわれ、そして発酵
時間は９６時間である。
ダーゼに関して不十分であるセレイシ７−−ｒｙ声ッセ
ンづ（Ｓｓｒｒａｔｉａ ｍａｒ悶μ遍す）属の微生物
の変異体を用いた発酵によるＬ−プロリンの製造も当業
者に知られている（ヨーロッパ特許番号００７６５１６
参照）、この方法により ６２．５１１／１の収率でＬ
−プロリンを得ることが可能であるが、その発酵は相当
量の糖（２（１）の存在において行なわれ、そして発酵
時間は９６時間である。
３．４−デヒドロ−Ｄ、Ｌ−プロリンに耐性であるツレ
ヴイパクテリウム属、コリネノ々クテリウム属およびミ
クロバクテリウム（Ｍｉｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
に属する微生物の変異体を用いた発酵によるＬ−ノロＩ
Ｊ ｙの製造方法も当業者に公知である（米国特許第４
，２２４，４０９号参照）。１０チの初期糖含有蓋にお
けるＬ−ノロリンの最大収率３６．２ｇ／ｌは、この方
法において、Ｌ−インロイシン蚕求性、スルファグアニ
ジン耐性および３．４−デヒドローＤ、Ｌ−７’ｏリン
耐性の微生物ブレヴィバクテリウム・フラグ７ Ａ （
Ｂｒｓｖｌｂａａｔｓｒ稗町工嶋ワ卑）の変異体を用い
た場合に達成される。
ヴイパクテリウム属、コリネノ々クテリウム属およびミ
クロバクテリウム（Ｍｉｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
に属する微生物の変異体を用いた発酵によるＬ−ノロＩ
Ｊ ｙの製造方法も当業者に公知である（米国特許第４
，２２４，４０９号参照）。１０チの初期糖含有蓋にお
けるＬ−ノロリンの最大収率３６．２ｇ／ｌは、この方
法において、Ｌ−インロイシン蚕求性、スルファグアニ
ジン耐性および３．４−デヒドローＤ、Ｌ−７’ｏリン
耐性の微生物ブレヴィバクテリウム・フラグ７ Ａ （
Ｂｒｓｖｌｂａａｔｓｒ稗町工嶋ワ卑）の変異体を用い
た場合に達成される。
この方法は、微生物工業の従来からの対象物、グルタメ
ート生産性細菌を用いた場合に存する好都合、ペロリン
の前駆物質を用いずに比較的高い収率のＬ−プロリンが
得られる可能性を有しているが、この方法は十分に高収
率のＬ−プロリンをなお保証するものではない。
ート生産性細菌を用いた場合に存する好都合、ペロリン
の前駆物質を用いずに比較的高い収率のＬ−プロリンが
得られる可能性を有しているが、この方法は十分に高収
率のＬ−プロリンをなお保証するものではない。
本発明の目的は所望の生成物の収率を増大させ得るＬ−
プロリンの製造方法を提供することにある。
プロリンの製造方法を提供することにある。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明の目的は、炭素および窒素の供給源、無機塩およ
び増殖刺激剤を含有する栄養培地でブレヴィバクテリウ
ム属の微生物を培養し、引き続いて培養液から所望の生
成物を単離することによって達成される。この方法にお
いて、本発明に従って、ブレヴィバクテリウム属の微生
物として３．４−デヒドロプロリンおよび培地の増大し
た浸透圧の双方に同時に耐性のおよび／またはＬ−プロ
リンを異化不能の変異体を用いる。
び増殖刺激剤を含有する栄養培地でブレヴィバクテリウ
ム属の微生物を培養し、引き続いて培養液から所望の生
成物を単離することによって達成される。この方法にお
いて、本発明に従って、ブレヴィバクテリウム属の微生
物として３．４−デヒドロプロリンおよび培地の増大し
た浸透圧の双方に同時に耐性のおよび／またはＬ−プロ
リンを異化不能の変異体を用いる。
本発明により、Ｌ−プロリンの収率は９０〜１００９／
ｌの高い値となり、その間発酵培地中にＬ−プロリンの
任意の前駆物質を導入することなく７２時間の発酵にわ
たって炭素供給源の１５％が消費される。
ｌの高い値となり、その間発酵培地中にＬ−プロリンの
任意の前駆物質を導入することなく７２時間の発酵にわ
たって炭素供給源の１５％が消費される。
本発明によれば、オール−ユニオン・リサーチ・インス
ティテユト・オヴ・ソエネティクス・アンド・セレクシ
ョン・オヴ・インダストリアル・マイクロオーガニズム
ス（Ａｔｔ−Ｕｎｉｏｎ ＲａａｅａｒｃｈＩｎｓｔｉ
ｔｕｔ＠ｏｆ Ｇｅｎ５ｔｌｅｓ ａｎｄ Ｓｅｌ＠ｃ
ｔｉｏｎ ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉｍｌ Ｍｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｌｍｍｍ）の下のオール−ユニオン・コレクシＢ
７ （Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ Ｃｏ１１ｓｃｔｉｏｎ）
に寄託されているブレヴィバクテリウム釉の微生物の以
下の変異体を用いることが勧められる；ブレヴィバクテ
リウム・フラヴァムＡＰＩ０８株、登録番号Ｂ５３２０
： ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１０９株、登録
番号Ｂ５３１９； ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１０株、登録
番号Ｂ３３１８： ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１１株、登録
番号Ｂ５２５８ ； ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１２株、登録
番号Ｂ５２５９：および ブレグイバクテリウム・７ラグアムＡＰ１１３株、登録
番号Ｂ３２６０゜ 本発明の一態様は、培地の３．４−デヒドロプロリンお
よび増大した浸透圧の双方に同時に耐性であるブレヴィ
バクテリウム属の微生物の変異体を用いて７０〜８０１
１／ｌの高収率のＬ−ノロリンを得ることを可能とする
ことに存する。このような変異体の特定の例はブレグイ
バクテリウム・７ラグアムＡＰ１１１株また社プレヴイ
バクテリウム・ ｊフラグアムＡＰ１１２株、ま
たはブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１０９株で
ある。
ティテユト・オヴ・ソエネティクス・アンド・セレクシ
ョン・オヴ・インダストリアル・マイクロオーガニズム
ス（Ａｔｔ−Ｕｎｉｏｎ ＲａａｅａｒｃｈＩｎｓｔｉ
ｔｕｔ＠ｏｆ Ｇｅｎ５ｔｌｅｓ ａｎｄ Ｓｅｌ＠ｃ
ｔｉｏｎ ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉｍｌ Ｍｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｌｍｍｍ）の下のオール−ユニオン・コレクシＢ
７ （Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ Ｃｏ１１ｓｃｔｉｏｎ）
に寄託されているブレヴィバクテリウム釉の微生物の以
下の変異体を用いることが勧められる；ブレヴィバクテ
リウム・フラヴァムＡＰＩ０８株、登録番号Ｂ５３２０
： ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１０９株、登録
番号Ｂ５３１９； ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１０株、登録
番号Ｂ３３１８： ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１１株、登録
番号Ｂ５２５８ ； ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１２株、登録
番号Ｂ５２５９：および ブレグイバクテリウム・７ラグアムＡＰ１１３株、登録
番号Ｂ３２６０゜ 本発明の一態様は、培地の３．４−デヒドロプロリンお
よび増大した浸透圧の双方に同時に耐性であるブレヴィ
バクテリウム属の微生物の変異体を用いて７０〜８０１
１／ｌの高収率のＬ−ノロリンを得ることを可能とする
ことに存する。このような変異体の特定の例はブレグイ
バクテリウム・７ラグアムＡＰ１１１株また社プレヴイ
バクテリウム・ ｊフラグアムＡＰ１１２株、ま
たはブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１０９株で
ある。
本発明の別の態様は、Ｌ−プロリンを異化することがで
きないブレヴィバクテリウム・フラヴァム種の微生物を
用いて３０ ｉ／１１に達する収率でＬ−プロリンを得
ることを可能とすることに存する。
きないブレヴィバクテリウム・フラヴァム種の微生物を
用いて３０ ｉ／１１に達する収率でＬ−プロリンを得
ることを可能とすることに存する。
この変異体の特定の例はブレヴィバクテリウム・フラヴ
ァムＡＰＩ０８株である。
ァムＡＰＩ０８株である。
本発明のさらに別の態様は、３，４−デヒドロプロリン
および増大した浸透圧の双方に同時に耐性であシかつＬ
−ノロリンを異化することができないブレヴィバクテリ
ウム・フラヴァム種の微生物を用いることにおる。この
ような変異体の例としてブレヴィバクテリウム・フラヴ
ァムＡＰＩ １３株をあげることができる。
および増大した浸透圧の双方に同時に耐性であシかつＬ
−ノロリンを異化することができないブレヴィバクテリ
ウム・フラヴァム種の微生物を用いることにおる。この
ような変異体の例としてブレヴィバクテリウム・フラヴ
ァムＡＰＩ １３株をあげることができる。
本発明の一層の目的および好都合は以下のＬ−プロリン
の製造方法の詳細な記載および本方法の実施の特定例か
らより十分に明白なものとなろう。
の製造方法の詳細な記載および本方法の実施の特定例か
らより十分に明白なものとなろう。
Ｌ−プロリンの製造方法を実施するために、培地の３，
４−デヒドロプロリンおよび増大した浸透圧の双方に同
時に耐性であるブレヴィバクテリウム・フラヴァム種の
微生物の変異体を用いることが勧められる。さらに、Ｌ
−プロリンを異化することができない（すなわち、増殖
のために唯一の炭素供給源または唯一の窒素供給源また
は同時に炭素および窒素の唯一の供給源としてＬ−プロ
リンと同化することができない）ブレヴィバクテリウム
・フラヴァム種の微生物の変異体を用いることが勧めら
れる。上記した性質の双方を同時に有する微生物ブレヴ
ィバクテリウム・フラヴァムの変異体を用いることがさ
らに勧められる。
４−デヒドロプロリンおよび増大した浸透圧の双方に同
時に耐性であるブレヴィバクテリウム・フラヴァム種の
微生物の変異体を用いることが勧められる。さらに、Ｌ
−プロリンを異化することができない（すなわち、増殖
のために唯一の炭素供給源または唯一の窒素供給源また
は同時に炭素および窒素の唯一の供給源としてＬ−プロ
リンと同化することができない）ブレヴィバクテリウム
・フラヴァム種の微生物の変異体を用いることが勧めら
れる。上記した性質の双方を同時に有する微生物ブレヴ
ィバクテリウム・フラヴァムの変異体を用いることがさ
らに勧められる。
本発明に係る変異体の選択のための親株として、ブレヴ
ィバクテリウム属に属する微生物の任意の菌株を用いる
ことができる。Ｌ−プロリンの製造に関する本発明に係
る変異についての正の効果はＬ−プロリンの過剰合成に
寄与する他の公知の変異との組合せにおいて示される。
ィバクテリウム属に属する微生物の任意の菌株を用いる
ことができる。Ｌ−プロリンの製造に関する本発明に係
る変異についての正の効果はＬ−プロリンの過剰合成に
寄与する他の公知の変異との組合せにおいて示される。
このような公知の変異の例はインロイシンについて不十
分の変異である（米国特許第３，３２９，５７７号参照
）。
分の変異である（米国特許第３，３２９，５７７号参照
）。
上記した性質の組合せを有するＬ−プロリンの生産者で
ある、オール−ユニオン・リサーチ・インスティテユト
・オヴ昏ジェネティクス・アンド・セレクション・オヴ
・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（ＵＳＳ
Ｒ、モスクワ）の下のオール−ユニオン・コレクション
・オヴ・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに
対応する登録番号で寄託されている菌株の例は、ブレヴ
ィバクテリウム・フラヴアム種の微生物の以下の変異体
である：ＡＰ１０８株（Ｂ３３２０）、ＡＰ１１１株（
Ｂ３２５８）、ＡＰ１０９株（Ｂ３３１９）、ＡＰ１１
０株（Ｂ３３１８）、ＡＰ１１２株（Ｂ３２５９）およ
びＡＰ１１３株（Ｂ ３２６０）。
ある、オール−ユニオン・リサーチ・インスティテユト
・オヴ昏ジェネティクス・アンド・セレクション・オヴ
・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（ＵＳＳ
Ｒ、モスクワ）の下のオール−ユニオン・コレクション
・オヴ・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに
対応する登録番号で寄託されている菌株の例は、ブレヴ
ィバクテリウム・フラヴアム種の微生物の以下の変異体
である：ＡＰ１０８株（Ｂ３３２０）、ＡＰ１１１株（
Ｂ３２５８）、ＡＰ１０９株（Ｂ３３１９）、ＡＰ１１
０株（Ｂ３３１８）、ＡＰ１１２株（Ｂ３２５９）およ
びＡＰ１１３株（Ｂ ３２６０）。
これらの新規な株はブレヴィバクテリウム・フラヴアム
ＡＴＣＣ１４０６７株（Ｂ−４２）から遺伝学的なおよ
び選択の方法によってつくった。
ＡＴＣＣ１４０６７株（Ｂ−４２）から遺伝学的なおよ
び選択の方法によってつくった。
ＡＰ１０９株、ＡＰ１１１株およびＡＰ１１２株は、培
地の３，４−デヒドロ−Ｄ、Ｌ−ノロリン（ＤＰ）およ
び増大した浸透圧に対して同時に耐性である変異体であ
シ、そしてＡＰ１０８株はＬ−プロリンを異化すること
ができない変異体である。
地の３，４−デヒドロ−Ｄ、Ｌ−ノロリン（ＤＰ）およ
び増大した浸透圧に対して同時に耐性である変異体であ
シ、そしてＡＰ１０８株はＬ−プロリンを異化すること
ができない変異体である。
さらに、ＡＰ１０８株、ＡＰ１１１株、Ａ Ｐ １１２
株およびＡＰ１１３株はその増殖に対してＬ−イソロイ
シン要求性の変異体でもある。ＡＰＩ０８株、ＡＰ１０
９株、ＡＰ１１０株、ＡＰ１１１株、ＡＰ１１２株およ
びＡＰ１１３株は、培養上の形態学的特性および培養上
の生理学的特性において、上記した性質およびゾロリン
生産能を除いてはブレヴィバクテリウム・フラγアムＡ
ＴＣＣ１４０６７株と同様である。
株およびＡＰ１１３株はその増殖に対してＬ−イソロイ
シン要求性の変異体でもある。ＡＰＩ０８株、ＡＰ１０
９株、ＡＰ１１０株、ＡＰ１１１株、ＡＰ１１２株およ
びＡＰ１１３株は、培養上の形態学的特性および培養上
の生理学的特性において、上記した性質およびゾロリン
生産能を除いてはブレヴィバクテリウム・フラγアムＡ
ＴＣＣ１４０６７株と同様である。
・ＤＰおよび増大した浸透圧耐性、Ｌ−プロリン異化不
能性およびＬ−インロイシン要求性の変異は、任意の順
序で段階的アプローチにより、各工程に任意の常法（例
えば、Ｎ−メチル−■−ニトローＮ−ニトロソグアニジ
ンまたはＵＶ照射による処理）を用いて細菌を変異誘発
し、そして引き続いて対応する変異体を同定することに
よって得ることができる。これらの変異は別々の菌株に
おいて得、そしてそれらを任意の遺伝的交換方法、例え
ば、ゾロドプラストの融合を用いて１のダノム中に組込
むこともできる。培地の浸透圧を増大させる化合物とし
て、サッカロースまたはアルカリ金属の塩化物、例えば
、塩化す） ＩＪウム、塩化カリウム等を用いることが
できる。
能性およびＬ−インロイシン要求性の変異は、任意の順
序で段階的アプローチにより、各工程に任意の常法（例
えば、Ｎ−メチル−■−ニトローＮ−ニトロソグアニジ
ンまたはＵＶ照射による処理）を用いて細菌を変異誘発
し、そして引き続いて対応する変異体を同定することに
よって得ることができる。これらの変異は別々の菌株に
おいて得、そしてそれらを任意の遺伝的交換方法、例え
ば、ゾロドプラストの融合を用いて１のダノム中に組込
むこともできる。培地の浸透圧を増大させる化合物とし
て、サッカロースまたはアルカリ金属の塩化物、例えば
、塩化す） ＩＪウム、塩化カリウム等を用いることが
できる。
以下に、本発明に係るＬ−プロリンの生産株の調製に用
いる特定の方法を述べる。
いる特定の方法を述べる。
ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１０９株の調製
ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＴＣＣ１４０６７
株を肉−ペプトンプロス（以下、八ＦＢという）中で３
０℃の温度において通気条件下に培養して１０９細胞／
ｍｌの力価を得る。細胞を洗浄して遠心分離によってＭ
ＰＢを除去し、ｐＨ５，５のクエン酸緩衝液″ で濯ぎ
、遠心分離によって再度沈殿させそして−５，５のクエ
ン酸緩衝液中に再懸濁させる。得られる懸濁液にＮ−メ
チル−マーニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、Ｎ
Ｇという）を最終濃度３００μｇ／ｆｎｌまで加え、そ
してこれを通気下に３０℃の温度において２０分間イン
キュベーションする。次いで、細胞を冷ＭＰＨによって
洗浄して変異誘発物質を除去した後、ＭＰＢ１０尻ｊを
有する試験管内に移して３０℃の温度において通気下に
１８時間インキュベーションする。得られるＮＧ変異誘
発培養物を遠心分離によって沈殿させ、以下の組成（■
／ｍｌ）を有するＡ１培地：サッカロース−２５０、Ｎ
ａ２Ｓ０４−２、Ｋ２ＨＰＯ４−３、ＫＨ２ＰＯ４−１
、ＭｇＳＯ４・７Ｎ（２０−０，１、ＮＨ２Ｃｌ−５、
ＮＨ４Ｎｏ５−１、ＭｎＳＯ４’５Ｈ２０−１刈０
、ＦｅＳＯ４’７Ｈ２０−１刈０ 、ビオチン−２刈０
−５、塩化チアミン−１刈０−４およびＤ Ｐ −１，
５、ｐＨ＝７．４を持った試験管内に移して培養物の最
初の力価を１０５細胞／ ｌｌｌ１に等しくなるように
する。
株を肉−ペプトンプロス（以下、八ＦＢという）中で３
０℃の温度において通気条件下に培養して１０９細胞／
ｍｌの力価を得る。細胞を洗浄して遠心分離によってＭ
ＰＢを除去し、ｐＨ５，５のクエン酸緩衝液″ で濯ぎ
、遠心分離によって再度沈殿させそして−５，５のクエ
ン酸緩衝液中に再懸濁させる。得られる懸濁液にＮ−メ
チル−マーニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、Ｎ
Ｇという）を最終濃度３００μｇ／ｆｎｌまで加え、そ
してこれを通気下に３０℃の温度において２０分間イン
キュベーションする。次いで、細胞を冷ＭＰＨによって
洗浄して変異誘発物質を除去した後、ＭＰＢ１０尻ｊを
有する試験管内に移して３０℃の温度において通気下に
１８時間インキュベーションする。得られるＮＧ変異誘
発培養物を遠心分離によって沈殿させ、以下の組成（■
／ｍｌ）を有するＡ１培地：サッカロース−２５０、Ｎ
ａ２Ｓ０４−２、Ｋ２ＨＰＯ４−３、ＫＨ２ＰＯ４−１
、ＭｇＳＯ４・７Ｎ（２０−０，１、ＮＨ２Ｃｌ−５、
ＮＨ４Ｎｏ５−１、ＭｎＳＯ４’５Ｈ２０−１刈０
、ＦｅＳＯ４’７Ｈ２０−１刈０ 、ビオチン−２刈０
−５、塩化チアミン−１刈０−４およびＤ Ｐ −１，
５、ｐＨ＝７．４を持った試験管内に移して培養物の最
初の力価を１０５細胞／ ｌｌｌ１に等しくなるように
する。
この試験管内の培養物を濁りが生ずるまで通気下に３０
℃の温度で増殖させ、次いで追加的に２チの寒天を含有
するＡ１培地の表面に接種し、そして３０℃の温度で４
８時間インキュベージ、ンする。増殖したコロニーを清
浄にし、そのゾロリン生産能を以下に記載の実施例１の
条件下に試験した。このようにして選択したＬ−プロリ
ン生産性変異体の１つをブレヴィバクテリウム・フラヴ
アムＡＰ１０９として示した。
℃の温度で増殖させ、次いで追加的に２チの寒天を含有
するＡ１培地の表面に接種し、そして３０℃の温度で４
８時間インキュベージ、ンする。増殖したコロニーを清
浄にし、そのゾロリン生産能を以下に記載の実施例１の
条件下に試験した。このようにして選択したＬ−プロリ
ン生産性変異体の１つをブレヴィバクテリウム・フラヴ
アムＡＰ１０９として示した。
ブレヴィバクテリウム・）２ヴアムＡＰ１１１株の調製
ＡＴＣＣ１４０６７株の変異誘発した培養物（変異誘発
の条件はＡＰ１１０株の調製について前述したと同様で
ある）を、以下の組成（■／ｍｅ）を有するＡ２培地ニ
ゲルコース−２０、Ｎａ２５ｏ４−２、Ｋ２ＨＰＯ４−
３、ＫＨ２ＰＯ４−１、ＮＨ２Ｃｌ−３、ＮＨ４Ｎｏ５
−１ 。
の条件はＡＰ１１０株の調製について前述したと同様で
ある）を、以下の組成（■／ｍｅ）を有するＡ２培地ニ
ゲルコース−２０、Ｎａ２５ｏ４−２、Ｋ２ＨＰＯ４−
３、ＫＨ２ＰＯ４−１、ＮＨ２Ｃｌ−３、ＮＨ４Ｎｏ５
−１ 。
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２〇−旧、ＭｎＳＯ４’５Ｈ２０−Ｉ
ＸＩＯ、ＦｅＳＯ４’７Ｈ２０−ＩＸＩＯ−’、ビオチ
ン−５刈０−５、塩化チアミン−ｌＸｌ０−４、Ｌ−イ
ンロイシン−０５および寒天−２０、ｐｌ（＝７．４上
に接種］〜だ。この培地に増殖したコロニーの中で、３
０℃の温度における４８時間のインキュベーションの彼
、Ｌ−イソロイシンを含有しないＡ２培地で増殖するこ
とができない変異体を取シ出した。得られるＬ−イソロ
イシン要求株をＮＧを用いて再び変異誘発し、Ａ１培地
中に２５０Ｔｎ９７ｍｌのサッカロースに代えて２０■
／ｍｌのグルコースおよび２８〜／コのＮａＣ１，なら
びにＱ、 ５ ｍｙ ／ ｍｌのＬ−イソロイシンを加
えたという相違点を除いてＡＰ１０９株の調製について
前述し°たと同じ手順に従って培地のＤＰおよび増大し
た浸透圧に耐性の変異体を選択した。このようにして選
ばれた多量のＬ−プロリン生産性の変異体の１つをブレ
ヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１１として示す。
ＸＩＯ、ＦｅＳＯ４’７Ｈ２０−ＩＸＩＯ−’、ビオチ
ン−５刈０−５、塩化チアミン−ｌＸｌ０−４、Ｌ−イ
ンロイシン−０５および寒天−２０、ｐｌ（＝７．４上
に接種］〜だ。この培地に増殖したコロニーの中で、３
０℃の温度における４８時間のインキュベーションの彼
、Ｌ−イソロイシンを含有しないＡ２培地で増殖するこ
とができない変異体を取シ出した。得られるＬ−イソロ
イシン要求株をＮＧを用いて再び変異誘発し、Ａ１培地
中に２５０Ｔｎ９７ｍｌのサッカロースに代えて２０■
／ｍｌのグルコースおよび２８〜／コのＮａＣ１，なら
びにＱ、 ５ ｍｙ ／ ｍｌのＬ−イソロイシンを加
えたという相違点を除いてＡＰ１０９株の調製について
前述し°たと同じ手順に従って培地のＤＰおよび増大し
た浸透圧に耐性の変異体を選択した。このようにして選
ばれた多量のＬ−プロリン生産性の変異体の１つをブレ
ヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１１として示す。
ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ Ｉ １２株の
調製 ＡＰ１１１株の調製について前述したと同様な方法でＮ
Ｇを用いて誘発したＡＴＣＣ１４０６７株のＬ−イソロ
イシン要求株を再度ＮＧを用いて処理し、Ａ１培地が０
．５ ｍｇ） ／ ｍｌのＬ−イソロイシンを含有する
という相違点を除いてはＡＰ１０９株の調製について前
述したと同様にしてＡ１培地におけるＤＰおよび増大し
た濃度のサッカロースに耐性の変異体を選択する。この
ようにして選択した多量のＬ−プロリン生産性の変異体
の１つをブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１２
として表示する。
調製 ＡＰ１１１株の調製について前述したと同様な方法でＮ
Ｇを用いて誘発したＡＴＣＣ１４０６７株のＬ−イソロ
イシン要求株を再度ＮＧを用いて処理し、Ａ１培地が０
．５ ｍｇ） ／ ｍｌのＬ−イソロイシンを含有する
という相違点を除いてはＡＰ１０９株の調製について前
述したと同様にしてＡ１培地におけるＤＰおよび増大し
た濃度のサッカロースに耐性の変異体を選択する。この
ようにして選択した多量のＬ−プロリン生産性の変異体
の１つをブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１２
として表示する。
ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１０８株２、ユ
、−一―−−−１□““１“１１０−一一−−−−陽の
調製 ＡＰ１１１株の調製について前述したと同様な方法でＮ
Ｇを用いて誘発したＡＴＣＣ１４０６７株のインロイシ
ン要求株を再度ＮＧを用いて変異誘発し、そして２０ｍ
ｇ／ｍｌの寒天を含有するＡ２培地に接種する。３０℃
の温度で４８時間のインキュベーションの後この培地に
増殖した個々のコロニーについて、増殖のだめの唯一の
炭素および窒素の供給源としてＬ−プロリンを含有する
Ａ３培地におけるその増殖能を調べる。Ａ３培地の組成
（ｍｙ／ｍｌ ）は次の通りである：Ｌ−プロリンー１
０、Ｎａ ２ＳＯ４−２、Ｋ２ＨＰＯ４−３、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４−１、ＭｇＳＯ４・７Ｔ（２０一〇、１、ＭｎＳＯ
４−５Ｈ２ｏ−１刈０ ％ＦｅＳＯ４−１刈０ 、ビ
オチン−５刈０１塩化チアミン−１×１０ 、Ｌ−イ
ソロイシン−０，５および寒天−２０、ｐｌ（＝７゜４
．３０℃の温度で９６時間のインキュイージョンの抜Ａ
３培地で増殖できなかった変異体の１つをブレヴィバク
テリウム・フラヴアムＡ Ｐ １０８として示す。
、−一―−−−１□““１“１１０−一一−−−−陽の
調製 ＡＰ１１１株の調製について前述したと同様な方法でＮ
Ｇを用いて誘発したＡＴＣＣ１４０６７株のインロイシ
ン要求株を再度ＮＧを用いて変異誘発し、そして２０ｍ
ｇ／ｍｌの寒天を含有するＡ２培地に接種する。３０℃
の温度で４８時間のインキュベーションの後この培地に
増殖した個々のコロニーについて、増殖のだめの唯一の
炭素および窒素の供給源としてＬ−プロリンを含有する
Ａ３培地におけるその増殖能を調べる。Ａ３培地の組成
（ｍｙ／ｍｌ ）は次の通りである：Ｌ−プロリンー１
０、Ｎａ ２ＳＯ４−２、Ｋ２ＨＰＯ４−３、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４−１、ＭｇＳＯ４・７Ｔ（２０一〇、１、ＭｎＳＯ
４−５Ｈ２ｏ−１刈０ ％ＦｅＳＯ４−１刈０ 、ビ
オチン−５刈０１塩化チアミン−１×１０ 、Ｌ−イ
ソロイシン−０，５および寒天−２０、ｐｌ（＝７゜４
．３０℃の温度で９６時間のインキュイージョンの抜Ａ
３培地で増殖できなかった変異体の１つをブレヴィバク
テリウム・フラヴアムＡ Ｐ １０８として示す。
プレヴイバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１０株の調製
最初の段階として、ＡＰ１０９株の調製について前述し
た方法を用いてＤＰおよび増大した濃度のサッカロース
に対して同時に耐性である変異体を選択する。次いで、
得られた変異体を親株として用いて、ＡＰＩ０８株の調
製について前述した方法によ＃）Ｌ−プロワ／を異化す
ることができない変異体を選択する。選択された多量の
Ｌ−プロリン生産性の変異体の１つをブレヴィバクテリ
ウム・フラヴアムＡＰ１１０として表示する。
た方法を用いてＤＰおよび増大した濃度のサッカロース
に対して同時に耐性である変異体を選択する。次いで、
得られた変異体を親株として用いて、ＡＰＩ０８株の調
製について前述した方法によ＃）Ｌ−プロワ／を異化す
ることができない変異体を選択する。選択された多量の
Ｌ−プロリン生産性の変異体の１つをブレヴィバクテリ
ウム・フラヴアムＡＰ１１０として表示する。
ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１３株の調製
ＡＴＣＣ１４０６７株から、ＡＰ１０８株の調製につい
て前述した方法を用いてＬ−ノロリンを異化することが
できない変異体を選択する。次の段階として、得られｆ
ｃ、Ｌ−プロリン異化不能法から、Ａ、 Ｐ １０９株
の調製について前述した方法を用いてＤＰおよび増大し
た濃度のサッカロースに耐性である変異体を選択する。
て前述した方法を用いてＬ−ノロリンを異化することが
できない変異体を選択する。次の段階として、得られｆ
ｃ、Ｌ−プロリン異化不能法から、Ａ、 Ｐ １０９株
の調製について前述した方法を用いてＤＰおよび増大し
た濃度のサッカロースに耐性である変異体を選択する。
Ｌ−プロリン異化不能でありかつ培地のＤＰおよび増大
した浸透圧に耐性である得られた二重変異体において、
Ａ２１１１株の調製について記載した方法を用いてその
増殖に対してＬ−インロイシン要求性の変異体を選択す
る。このようにして調製した多量のＬ−プロリン生産性
の変異体の１つをブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡ
Ｐ１１３として表示する。
した浸透圧に耐性である得られた二重変異体において、
Ａ２１１１株の調製について記載した方法を用いてその
増殖に対してＬ−インロイシン要求性の変異体を選択す
る。このようにして調製した多量のＬ−プロリン生産性
の変異体の１つをブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡ
Ｐ１１３として表示する。
互いに他とおよびＡＴＣＣ１４０６７株と比較した本発
明に用いる変異体株の着順な特徴を以下の第１表に示す
。
明に用いる変異体株の着順な特徴を以下の第１表に示す
。
第１表
リンを有する
培地での増１ｆｉ ０ ０．７５ １．０ １．５
２．Ｏｎヒ ＡＴＣＣ１４０６７＋ １００ １３ １２
１２ ８ＡＰ１０８ − １０
０ ２５ １７ １７ １３ＡＰ１０９
＋ １００ ５３ ３５ ２９２５
ＡＰ１１０−１００７６６７５３４６ ＡＰ１１１ ＋ １００ ３５
３０ ２８２０ＡＰ１１２ ＋
１００ ８０ ７９ ７６４１Ｌ−プロリ
ンを異化する能力は、第１表に記載した菌株の懸濁液の
滴をＡ３寒天培地（その組成は前述した）の表面に適用
して３０℃で９６時間のインキュベーションを行なった
後、その適用領域における増殖の出現によって測定した
。増殖の出現は記号「十」によって表示し、増殖がない
場合は記号「−」で表わす。
２．Ｏｎヒ ＡＴＣＣ１４０６７＋ １００ １３ １２
１２ ８ＡＰ１０８ − １０
０ ２５ １７ １７ １３ＡＰ１０９
＋ １００ ５３ ３５ ２９２５
ＡＰ１１０−１００７６６７５３４６ ＡＰ１１１ ＋ １００ ３５
３０ ２８２０ＡＰ１１２ ＋
１００ ８０ ７９ ７６４１Ｌ−プロリ
ンを異化する能力は、第１表に記載した菌株の懸濁液の
滴をＡ３寒天培地（その組成は前述した）の表面に適用
して３０℃で９６時間のインキュベーションを行なった
後、その適用領域における増殖の出現によって測定した
。増殖の出現は記号「十」によって表示し、増殖がない
場合は記号「−」で表わす。
培地のＤＰおよび増大した浸透圧に対する耐性の測定に
対して、第１表に示した菌株の細菌を、２５０ｒＲ９／
ｍｌのサッカロースおよび種々の濃度のＤＰを含有する
Ａ１液体培地（その組成は前記した）を有する試験管内
に１０５細胞／ ｍｌの割合で導入した（ＡＰ１０８株
、ＡＰ１１１株、Ａ Ｐ １１２株、ＡＰ１１３株の場
合にはＡ１培地はさらに０．５■／ｍｌの濃度のＬ−イ
ソロイシンを含有）。
対して、第１表に示した菌株の細菌を、２５０ｒＲ９／
ｍｌのサッカロースおよび種々の濃度のＤＰを含有する
Ａ１液体培地（その組成は前記した）を有する試験管内
に１０５細胞／ ｍｌの割合で導入した（ＡＰ１０８株
、ＡＰ１１１株、Ａ Ｐ １１２株、ＡＰ１１３株の場
合にはＡ１培地はさらに０．５■／ｍｌの濃度のＬ−イ
ソロイシンを含有）。
試験管を３０℃の温度で通気下に２４時間インキエペー
ションした後、培養物の光学濃度を５４０μｍで測定し
た。第１表に示すデータは、ＤＰを含まないＡ１培地で
増殖した培養物の光学濃度の百分率優）として表わされ
ている。
ションした後、培養物の光学濃度を５４０μｍで測定し
た。第１表に示すデータは、ＤＰを含まないＡ１培地で
増殖した培養物の光学濃度の百分率優）として表わされ
ている。
次の発酵のための生産株の接種材料は、任意の常法によ
って、例えば、同化できる炭素および窒素の供給源、無
機塩および微生物の増殖を保証する有機物質を含有する
固体寒天栄養培地の表面で旨Ｊ 増殖させるによって制量することができる。
って、例えば、同化できる炭素および窒素の供給源、無
機塩および微生物の増殖を保証する有機物質を含有する
固体寒天栄養培地の表面で旨Ｊ 増殖させるによって制量することができる。
有機物質は、ビタミン（ビオチン、チアミン）、ならび
にそれらが特定の生産株の増殖に必須のものである場合
にはアミノ酸を含む他の化合物を表わしている。
にそれらが特定の生産株の増殖に必須のものである場合
にはアミノ酸を含む他の化合物を表わしている。
本発明に従って用いられるプレヴイパクテリウ□ム・フ
ラグア人種の微生物の変異体を培養するだめの栄養発酵
培地として、同化できる炭素および窒素の供給源、無機
塩および微生物の増殖およびＬ−プロリンの蓄積を刺激
する有機物質を含有する任意の栄養培地を用いることが
できる。
ラグア人種の微生物の変異体を培養するだめの栄養発酵
培地として、同化できる炭素および窒素の供給源、無機
塩および微生物の増殖およびＬ−プロリンの蓄積を刺激
する有機物質を含有する任意の栄養培地を用いることが
できる。
同化できる炭素の供給源として、炭水化物、例工ば、サ
ッカロース、グルコース、フルクトース、マルトース、
マンノース、澱粉、澱粉の加水分解産物および糖蜜；多
価アルコール、例えば、グリセロールおよびソルビトー
ル；有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マ
レイン酸およびプロピオン酸；アルコール、例えば、メ
タノールおよびエタノールを用いることができる。これ
らの炭素供給源は、個別にまたは種々の重量割合で互い
に他と種々に組合わせて用いることができる。
ッカロース、グルコース、フルクトース、マルトース、
マンノース、澱粉、澱粉の加水分解産物および糖蜜；多
価アルコール、例えば、グリセロールおよびソルビトー
ル；有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マ
レイン酸およびプロピオン酸；アルコール、例えば、メ
タノールおよびエタノールを用いることができる。これ
らの炭素供給源は、個別にまたは種々の重量割合で互い
に他と種々に組合わせて用いることができる。
この物質、炭素供給源の全量は発酵の初めに導入するか
、または発酵過程に何回かに分けて導入することができ
る。
、または発酵過程に何回かに分けて導入することができ
る。
同化できる窒素の供給源として、アンモニウムの有機塩
および無機塩、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、乳酸アンモニウムオ
ヨヒアンモニウム；尿素、種々の天然に存在する９素含
有化合物、例えばペプトン、酵母の加水分解産物、肉エ
キスおよび植物タンパク質の加水分解産物を用いること
ができる。
および無機塩、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、乳酸アンモニウムオ
ヨヒアンモニウム；尿素、種々の天然に存在する９素含
有化合物、例えばペプトン、酵母の加水分解産物、肉エ
キスおよび植物タンパク質の加水分解産物を用いること
ができる。
無機塩として、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、鉄、マンガンおよび
亜鉛の塩、および炭酸カルシウムを用いることができる
。
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、鉄、マンガンおよび
亜鉛の塩、および炭酸カルシウムを用いることができる
。
前記１−た微生物の菌株の増殖に必須の有機物質として
、（例えば、塩酸塩、臭化物）、ビオチン−またはその
代用物〔例えば、デスチオビオチン、ビオシチン、７．
８−ジアミノペラルゴン酸（７，８−ｄｌａｒｎｌｎｏ
ｐｅｌａｒｇｌａ ａｃｉｄ） ：］、ならびにそれら
が微生物の増殖に必須である限りにおいてアミノ酸、例
えば、イソロイシンを用いることができる。このような
有機物質が栄養培地の他の成分中に十分量で存在する場
合には、これらの純粋な形の有機物質ケ培地中に加える
必要はない。
、（例えば、塩酸塩、臭化物）、ビオチン−またはその
代用物〔例えば、デスチオビオチン、ビオシチン、７．
８−ジアミノペラルゴン酸（７，８−ｄｌａｒｎｌｎｏ
ｐｅｌａｒｇｌａ ａｃｉｄ） ：］、ならびにそれら
が微生物の増殖に必須である限りにおいてアミノ酸、例
えば、イソロイシンを用いることができる。このような
有機物質が栄養培地の他の成分中に十分量で存在する場
合には、これらの純粋な形の有機物質ケ培地中に加える
必要はない。
本発明に係る発酵培地は以下の組成によって例示するこ
とができる： サッカロース゛またはグルコース １００〜２２０ｇ／
ｌ；硫酸アンモニウム ４０〜８０．！ｉＩ
／ｌ ：硫酸マグネシウム １０ｇ／
ｌｌ；リン酸水素カリウム Ｉ Ｅｌ
／ｌ ：硫酸亜鉛、硫酸鉄および硫酸マンガン；ビオチ
ン、チアミン。
とができる： サッカロース゛またはグルコース １００〜２２０ｇ／
ｌ；硫酸アンモニウム ４０〜８０．！ｉＩ
／ｌ ：硫酸マグネシウム １０ｇ／
ｌｌ；リン酸水素カリウム Ｉ Ｅｌ
／ｌ ：硫酸亜鉛、硫酸鉄および硫酸マンガン；ビオチ
ン、チアミン。
Ｌ−プロリンの蓄イ責は、２０〜３７℃の範囲内の温度
および６．０〜９．０のＰＩＩ値における通気条件下で
の培養の際に起こる。
および６．０〜９．０のＰＩＩ値における通気条件下で
の培養の際に起こる。
Ｌ−ノロリンの出現は、発酵の開始の後８〜１０時間以
内に観察される。しかしながら、培養液中のＬ−ノロリ
ンの最大址は、エネルギーおよび炭素の供給源の完全な
消費の結果として達成される（用いるエネルギーおよび
炭素の供給源の濃度に依存して発酵の開始後２６時間お
よびそれ以上）。
内に観察される。しかしながら、培養液中のＬ−ノロリ
ンの最大址は、エネルギーおよび炭素の供給源の完全な
消費の結果として達成される（用いるエネルギーおよび
炭素の供給源の濃度に依存して発酵の開始後２６時間お
よびそれ以上）。
培養液および他の溶液中のＬ−プロリンの畦は、ペーパ
ークロマトグラフィーおよびイサチンを用いた盾色法に
よって、またはアミノ酸分析器によって測定する。
ークロマトグラフィーおよびイサチンを用いた盾色法に
よって、またはアミノ酸分析器によって測定する。
蓄積したＬ−ノロリンは、ｆｉＥ意の常法によって、例
えば、遠心分離゛またはν過による微生物および他の不
溶性粒子の除去、イオン交換樹脂によるＬ−プロリンの
吸着、そしてそれに続くＬ−プロリンの溶離、濃縮およ
び結晶化によって培養液から “単離すること
ができる。
えば、遠心分離゛またはν過による微生物および他の不
溶性粒子の除去、イオン交換樹脂によるＬ−プロリンの
吸着、そしてそれに続くＬ−プロリンの溶離、濃縮およ
び結晶化によって培養液から “単離すること
ができる。
口下余白
〔実施例〕
実施例１
無菌条件下で、２５０ｍ１の発酵フラスコ内に、以下の
組成（９／１１ ） ：サッカロース−１５０、（ＮＨ
４）２ＳＯ４−５５、Ｋｆ（２Ｐ０４−１、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２０−１０、ＣａＣＯ３−５０、ＦｅＳＯ４引１
２０−０．旧、ＭｎＳＯ４’５Ｈ２０−０，０１、Ｚｎ
ＳＯ４・７Ｉｉ２０−０．０１、ビオチン−０，０００
５、塩化チアミン−０，０００５を有しｐＨが８．０で
ある滅菌した発酵培地の１０ｍ１部分を入れる。各フラ
スコに、以下の菌株：ブレヴ１バクテリウム・フラグ・
ｒムＡＰ １０９、ブレヴィバクテリウム・フラグ・ｒ
ムＡＰ１１１およびブレヴィバクテリウム・フラヴアム
ＡＰ１１２の１つ全接種する。このフラスコ？振盪下に
３０℃の温度において７２時間インキュベーションする
。発酵の終了後に得られるｌ＠俟液液中Ｌ−プロリンの
蕗汀量を以下の第２火に示す。同じ発酵条件下で、ゾレ
ヴイノ９クテリウム・フラヴアムＡＴＣＣ１４０６７ｉ
の培養液中のし一ゾロリンのき付置は４Ｎと越えず、一
方ＡＴＣＣ１４０Ｇ ’７のインロイシン要求株の培養
液中のＬ−プロリン含有量は２０ ｇ／ｌを越えなかっ
た。
組成（９／１１ ） ：サッカロース−１５０、（ＮＨ
４）２ＳＯ４−５５、Ｋｆ（２Ｐ０４−１、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２０−１０、ＣａＣＯ３−５０、ＦｅＳＯ４引１
２０−０．旧、ＭｎＳＯ４’５Ｈ２０−０，０１、Ｚｎ
ＳＯ４・７Ｉｉ２０−０．０１、ビオチン−０，０００
５、塩化チアミン−０，０００５を有しｐＨが８．０で
ある滅菌した発酵培地の１０ｍ１部分を入れる。各フラ
スコに、以下の菌株：ブレヴ１バクテリウム・フラグ・
ｒムＡＰ １０９、ブレヴィバクテリウム・フラグ・ｒ
ムＡＰ１１１およびブレヴィバクテリウム・フラヴアム
ＡＰ１１２の１つ全接種する。このフラスコ？振盪下に
３０℃の温度において７２時間インキュベーションする
。発酵の終了後に得られるｌ＠俟液液中Ｌ−プロリンの
蕗汀量を以下の第２火に示す。同じ発酵条件下で、ゾレ
ヴイノ９クテリウム・フラヴアムＡＴＣＣ１４０６７ｉ
の培養液中のし一ゾロリンのき付置は４Ｎと越えず、一
方ＡＴＣＣ１４０Ｇ ’７のインロイシン要求株の培養
液中のＬ−プロリン含有量は２０ ｇ／ｌを越えなかっ
た。
第 ２ 表
！レヴイパクテリウム・フラヴアムＡＰ１０９
２８．４ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１
１１ ５６．６得られた３８．２ｇのＬ−プ
ロリンを含有するブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡ
Ｐ１１２株の培養液５００蝉を遠心分離して細菌および
他の不溶物を除去する。得られる一ヒ澄液と、Ｌ−プロ
リンの吸着のために＜−を形のイオン交換樹脂を付す乙
カラムに通す。カラム全２容量の水で洗浄し、吸着して
い乙し−ノロリン？３藁のアンモニア水溶液で溶離する
。寿られ九溶出液計九空下に濃縮し、冷時にそこからＬ
−プロリンと結晶比する。ｆ、 −ノロリンの収率は２
０．８９であ乙。
２８．４ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１
１１ ５６．６得られた３８．２ｇのＬ−プ
ロリンを含有するブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡ
Ｐ１１２株の培養液５００蝉を遠心分離して細菌および
他の不溶物を除去する。得られる一ヒ澄液と、Ｌ−プロ
リンの吸着のために＜−を形のイオン交換樹脂を付す乙
カラムに通す。カラム全２容量の水で洗浄し、吸着して
い乙し−ノロリン？３藁のアンモニア水溶液で溶離する
。寿られ九溶出液計九空下に濃縮し、冷時にそこからＬ
−プロリンと結晶比する。ｆ、 −ノロリンの収率は２
０．８９であ乙。
実施しｕ２
ブレヴイパクテリウム・フラヴアムＡＰＩ０８株を、実
施例１に記載した条件下で培養する。発酵から得られる
培養液中のＬ−プロリン含有量は２８、２９／ｌに等し
い。
施例１に記載した条件下で培養する。発酵から得られる
培養液中のＬ−プロリン含有量は２８、２９／ｌに等し
い。
実施例１に記載した方法を用いて培養液１１からＬ−プ
ロリンを精製した後、１５．４９のＬ−プロリンが得ら
れる。
ロリンを精製した後、１５．４９のＬ−プロリンが得ら
れる。
実施例３
それぞれのフラスコに、微生物ブレヴィバクテリウム・
フラヴアムＡＰ１１０株およびブレヴィバクテリウム・
フラヴアムＡＰ１１３株を接種する。発酵培地の組成お
よび培養の条件は実施例１に記載したものと同じである
。ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１０株の培
養液中のＬ−プロリンの含有量は４０．５９／ｌに等し
く、ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１３株の
培養液中のＬ−プロリンの含有量は９７．５ ｇ／ｌに
等しい。Ｌ−プロリンは、実施例１にＨど載の方法を用
いて、得られたブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ
１１３株の培養液５００ゴから精製して結晶Ｌ−プロリ
ン２７．２ Ｖｌを得る。
フラヴアムＡＰ１１０株およびブレヴィバクテリウム・
フラヴアムＡＰ１１３株を接種する。発酵培地の組成お
よび培養の条件は実施例１に記載したものと同じである
。ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１０株の培
養液中のＬ−プロリンの含有量は４０．５９／ｌに等し
く、ブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ１１３株の
培養液中のＬ−プロリンの含有量は９７．５ ｇ／ｌに
等しい。Ｌ−プロリンは、実施例１にＨど載の方法を用
いて、得られたブレヴィバクテリウム・フラヴアムＡＰ
１１３株の培養液５００ゴから精製して結晶Ｌ−プロリ
ン２７．２ Ｖｌを得る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、３，４−デヒドロプロリンおよび増大した浸透圧の
双方に対して同時に耐性である微生物の性質およびＬ−
プロリンを異化することができない微生物の性質からな
る群より選ばれる性質の少なくとも一方を有する￥ブレ
ヴィバクテリウム￥属の微生物を用い、炭素および窒素
の供給源、無機塩および微生物の増殖の刺激剤を含有す
る栄養培地中で培養液中に所望の生成物が蓄積されるま
で前記￥ブレヴィバクテリウム￥属の微生物を増殖させ
、前記培養液から所望の生成物を回収することを含むＬ
−プロリンの製造方法。 ２、オール−ユニオン・リサーチ・インスティテュト・
オブ・ジェネティクス・アンド・セレクション・オブ・
インダストリアル・マイクロオーガニズムスの下のオー
ル−ユニオン・コレクションに寄託された下記の￥ブレ
ヴィバクテリウム・フラヴァム￥種の微生物の変異体： ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１０８株、登録
番号Ｂ３３２０； ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１０９株、登録
番号Ｂ３３１９； ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１０株、登録
番号Ｂ３３１８： ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１１株、登録
番号Ｂ３２５８； ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１２株、登録
番号Ｂ３２５９；および ブレヴィバクテリウム・フラヴァムＡＰ１１３株、登録
番号Ｂ３２６０ を用いる特許請求の範囲第１項記載のＬ−プロリンの製
造方法。 ３、３，４−デヒドロプロリンおよび培地の増大した浸
透圧の双方に対して同時に耐性であるブレヴィバクテリ
ウム・フラヴァムＡＰ１１１株、ブレヴィバクテリウム
・フラヴァムＡＰ１１２株またはブレヴィバクテリウム
・フラヴァムＡＰ１０９株を用いる特許請求の範囲第２
項記載のＬ−プロリンの製造方法。 ４、Ｌ−プロリンを異化することができないブレヴィバ
クテリウム・フラヴァムＡＰ１０８株を用いる特許請求
の範囲第２項記載のＬ−プロリンの製造方法。 ５、３，４−デヒドロプロリンおよび増大した浸透圧の
双方に対して同時に耐性でありかつＬ−プロリンを異化
することができないブレヴィバクテリウム・フラヴァム
ＡＰ１１０株またはブレヴィバクテリウム・フラヴァム
ＡＰ１１３株を用いる特許請求の範囲第２項記載のＬ−
プロリンの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU853884279A SU1409659A1 (ru) | 1985-05-11 | 1985-05-11 | Способ получени L-пролина |
| SU3884279 | 1985-05-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61289893A true JPS61289893A (ja) | 1986-12-19 |
Family
ID=21173149
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61084416A Pending JPS61289893A (ja) | 1985-05-11 | 1986-04-14 | Ｌ−プロリンの製造方法 |
| JP61106875A Granted JPS6211099A (ja) | 1985-05-11 | 1986-05-12 | Ｌ−プロリンの製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61106875A Granted JPS6211099A (ja) | 1985-05-11 | 1986-05-12 | Ｌ−プロリンの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS61289893A (ja) |
| DE (1) | DE3612077A1 (ja) |
| HU (1) | HU199898B (ja) |
| SU (1) | SU1409659A1 (ja) |
| YU (1) | YU49286A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7166456B2 (en) | 2002-12-05 | 2007-01-23 | Cj Corp. | Microorganism for producing riboflavin and method for producing riboflavin using the same |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5860995A (ja) * | 1981-10-06 | 1983-04-11 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 発酵法によるｌ−プロリンの製法 |
| JPS6078591A (ja) * | 1983-10-05 | 1985-05-04 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−プロリンの製造法 |
-
1985
- 1985-05-11 SU SU853884279A patent/SU1409659A1/ru active
-
1986
- 1986-03-28 YU YU00492/86A patent/YU49286A/xx unknown
- 1986-04-10 DE DE19863612077 patent/DE3612077A1/de not_active Withdrawn
- 1986-04-14 JP JP61084416A patent/JPS61289893A/ja active Pending
- 1986-05-09 HU HU861939A patent/HU199898B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-05-12 JP JP61106875A patent/JPS6211099A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7166456B2 (en) | 2002-12-05 | 2007-01-23 | Cj Corp. | Microorganism for producing riboflavin and method for producing riboflavin using the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3612077A1 (de) | 1986-11-27 |
| SU1409659A1 (ru) | 1988-07-15 |
| YU49286A (en) | 1987-12-31 |
| JPS6211099A (ja) | 1987-01-20 |
| HU199898B (en) | 1990-03-28 |
| JPH0425799B2 (ja) | 1992-05-01 |
| HUT41070A (en) | 1987-03-30 |
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