JPS61290352A - 荷電物質の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、たんばく質、細胞等の荷電物質を他の物質と
分離して一端する荷電物質の分離方法に係り、特に電気
泳動法を利用して荷電物質の分離を行なうものに関する
。

〔発明の背景〕

従来の、たんぼ（質、核酸、細胞等の荷電物質（以下１
代表例としてたんばく質を記す）の分離精製法は、１［
気泳動法、膜分離法及び液体クロマトグラフィ等をあげ
ることができる。膜分離法は。

腰の孔の大きさによりたんばく質を分離する方法で、連
続処理ができるがたんば（質の分離能が劣る欠点がある
。液体クロマトグラフィは、たんばく質な担体充填カラ
ム中を通しで分離する方法で。

分離能はすσれているがバッチ操作のため工業規模の大
量処理にはむいていない。電気泳動法は、たんばく質の
荷電差を利用して１１！場中で分離精製する方法である
。この電気泳動には、ゲル等の担体を用いる担体電気泳
動法と、担体を用いず自由溶液中で行なう無担体電気泳
動法がある。担体電気泳動法はバッチ式であるため、大
量処理を行なうような工業化には無担体電気泳動法が連
続処理できる声から適している。

無担体電気泳動法については、エレクトロフォレシス　
１９８２．　３．　　Ｐ２３５〜Ｐ２４３　　（Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　　１９８２．　３．　２３
５−２４３）にカート・ハニング（Ｋｕｒｔ　Ｈａｎｎ
ｉｎｇ　）Ｃよって発衰されたものが公知である。その
方法を次に示す。

泳動室内で１場を横切って一定速度で流下する分離パイ
ファー中に注入口から連続的に分離すべきたんばく質混
合物を注入する。各たんばく質は。

それぞれ荷電量が異なるため電場中での移動速度は異な
る。そのため分離バブファー中を流下中に分離バッファ
ーの流速とのかねあいでそれぞれに偏向されて分離され
る。このように本方法は連続的に分離することができる
ため、工業規模のたんばく質の分離精製に対して有効で
あることがわかる。本方法で分離性能を高めるためには
分離用チャンバ内の分離バッファーの流速を常に一定に
保つことが重要である。ところが１分離バッファーには
電涛を流すためジュール熱が必ず発生し、その熱により
分離バブファーに対涛、現象が生じ１分離バブファーの
流れが乱れる。そのためたんばく質の分離能は低下する
。そこで、この点を改善するため従来、無担体電気泳動
ｇｌＷｔは分離バッファーの温度や流速を±０２％と極
めて精度良くコントロールする必要があり、そのために
１分層チャンバーを薄い平板形で極力小さくせざるを得
す、処理量が少なく、工業規模に大型化する場合の問題
となっている。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、大量処理に適し、高濃度、高回収率を
実現する荷電物質の分離方法を提供することである。

〔発明の概要〕

上記した従来技術の問題点をなくすために１発明者は、
新規な電気泳動ユニットを完成させることに成功した。

このユニットは１分離すべき荷電物質と分離バブファー
との混合液を分離用チャンバー内の泳動室内で強制循環
させ、更に二の混合液に対して両［１から直流電圧を印
加し、荷電物質の循環による移動および電気泳動による
移動の作用により、荷電物質な泳動室内の端部１極管寄
りに濃縮させ、この濃縮部位から荷電物質が濃縮された
分離液を抜出すようにしたものである。

本発明は、この種電気泳動ユニットを複数組備え、上流
側の電気泳動ユニットの抜出口から抜出された分離液を
下流側の電気泳動ユニブトの注入口に順次供給し、下流
側の電気泳動ユニットの抜出口から濃縮された分離液を
取出すと共に、その分離液の一部を上流側の電気泳動ユ
ニットの注入口に戻すようにしたことを特徴とする。こ
のような電気泳動ユニットの直列連結および下流側ユニ
ットで取出された分離液の一部を上流側に返送すること
によって、高濃度、高回収率を達成する。

〔発明の実施例〕

以下、本発明を図面に示す具体的な実施例によって詳細
に説明する。

まず、最初に１本発明の一実施例に用いられる電気泳動
ユニブトを第３図によって説明する。上述したように、
この電気泳動ユニブトは、本発明者によって開発された
ものである。１ｇ３図において、分離チャンバ２内に形
成される泳動室３内に分離バッファーを注入して循環ポ
ンプ１０等により強制循環を生じさせておき、続いて１
分離すべき荷電物質を分離バブファーに溶解させた混合
液を注入口１３から泳動室内に注入する。この結果、こ
の混合液は、泳動室３内で強制循環することになる。こ
の状態で、泳動室３の両側に設けた膜８で仕切られた電
極室４，５内に夫々配設された電極６．７に直流電圧を
印加する。ここで、混合液として泳動室内に供給される
荷電物質は、たんばく質Ａ、Ｂ二成分からなり、その等
電点を夫々ＰＩ□。

ＰＩＢとする。また１分離バブフ１−のＰ、ＨはＰＨＢ
とし、これらの間の関係はＰＩＡ＜　ＰＨＢ＜　ＰＩ、
となるように設定する。したがって、この場合、泳動室
内の混合液中の各たんばく質は、Ａがマイナス（−）、
Ｂがプラス（＋）に帯電されることになる。こｎらの結
果、泳動室３内のたんばく質入の挙動は、陽電極６側に
泳動しながら、全体として強制循環されているので、泳
動室３の下端で陽電極６寄りの位置に設置される抜出口
１５付近に集まる。つまＩ）、たんば＜質Ａは、泳動室
内の抜出口１５付近に分離され濃縮される。一方、たん
ば々質Ｂの挙動は、自身がプラスに帯電しているので陰
電極７側に泳動しながら、強制循環による移動によって
、泳動室３の上端で陰電極７寄りの位置に設置される抜
出口１４付近に集まる。つまり、たんばく質Ｂは、泳動
室３内の抜出口１４付近に分離され濃縮される。このよ
うにして、荷電物質を分離することができ、分離された
分離液は夫々の抜出口から泳動室外に抜出される。なお
、９は循環流を一様に整えるためのガイド部材であり、
たんばく質の通過可能な多孔性材料を用いる。１１は電
極室に供給する分離バッファの温度を調節する温度調節
器、１２は分離バッファを電極室に供給するポンプであ
る。

以下、第３図に示した如き電気泳動ユニブトを複数組用
いて荷電物質を分離する本発明の詳細な説明する。

第１図は、本発明の一実施例を示す図である。

第１図において、２１〜２６は、夫々電気泳動ユニット
であり、詳細は第３図に示す如きものであるつ２１０　
、２２０　、２３０　、２４０　、２５０　、２６０は
、各ユニブトにおける混合液の注入口である。２１１　
、２２１　、２３１　、２４１　、２５１　。

２６１　は、各ユニットにおける下部抜出口である。

２１２、２２２．２３２．２ｕ、　２５２．２６２は、
各ユニットにおける上部抜出口である。ｎは、分離バッ
ファー交換器である。公は、ＰＨ調整器である。この実
施例は、３種のたんば吸質Ａ、Ｂ、Ｃを含む混合液から
、夫々のたんｔンク質を分離して取出す場合を示す。こ
こでは、３種のたんばく質をｐ７体的には、Ａ＝アルブ
ミン（ウシ血清２笠電点ＰＩＡ＝４．９）、Ｂ＝ミオグ
ロビン（ウマ、等電点ＰＩＢ＝７．３）、Ｃ＝リゾチー
ム（卵白２等電点ＰＩｃ＝１１２）　　として以下説明
する。これらＡ−Ｃの物質を分離バッファー（具体的に
は、ＰＨ＝６．０のリン酸バッファーを使用）を溶解し
た混合液な準備する。この混合液は、ユニブト２１の注
入口２１０から泳動室内へ連続的に供給される。ユニブ
ト２１において、上述した如き混合液の強制循環と電極
間への電圧印加を行なって分離処理を実施する。

この結果、ユニット乙の上部抜出口２１２からは、ミオ
グロビン（Ｂ）およびリゾチーム（Ｃ）を多く含む分離
液、すなわち分離液（Ｂ、（ｌが得られる。また、下部
抜出口２１１からは、アルブミン（Ａ）を多く含む分離
液、すなわち分離液（Ａ）が得られる。上部抜出口２Ｌ
２から抜出された分離液（Ｂ、Ｃ’ｌは、ユニットｎの
注入口２２０から泳動室内に導びかれる。ユニットｎに
おいて、同様の分離処理を実施すると、上部抜出口２２
２からは分離液（Ｂ、Ｃ）がより濃縮されて得られる。

一方、下部抜出口２２′１　からは、アルブミンを多く
含むリン酸バッファー、すなわち分離液（Ａ）が得られ
る。ユニット乙の下部抜出口２１１から抜出された分離
液（Ａ）は、ユニットｎの注入口２３０から泳動室に供
給され、ここで同様の分離処理が行なわれる。この結果
、ユニット田の下部抜出口２３１からは、より高濃度の
アルブミンを含む分離液（Ａ）が得られる。また、上部
桟出口２３２う）らは、ユニットｎに供給される分離誕
（Ａ）に含まれていたＢ、Ｃの物質を多く含む分離液（
Ｂ、Ｃ）が得られる。ユニット田の下部抜出口２３１　
で得られた分離液（Ａ）は、ユニット乙の下部抜出口２
１１で書られたものより濃縮されており、液中のアルブ
ミンの濃度は高い。また、ユニットこの上部抜出口２２
２　で得られた分離液（Ｂ、Ｃ）は、ユニット２１の上
部抜出口２１２で得られたものより濃縮されており、液
中のミオグロビンおよびリゾチームの含有量は高い。こ
のよう番二、多段に連結することによって、分離すべき
物質の濃度を高くすることができる。一方、ユニット乙
の上部抜出口２３２で得られる分離液（Ｂ、Ｃ）には、
物質Ｂ、　　Ｃが多く含まれている。同様に、二二＝ト
２２の下部抜出口２２１で得られる分離液（Ａ）には、
物質Ａが多（含まれている。したがって、これらの分離
液は、その上流供（１のユニット２１の注入側に返送す
る。

これによって１回収率が格段に向上する。ユニツト２２
の上部抜出口２２２から抜出された分離液（Ｂ。

Ｃ）は、二つの物質Ｂ、Ｃを含んでいるので、これらを
夫々分離するには、更に処理を行なう。この分離液（Ｂ
、Ｃ）は、パブファー交換器２７．　　ＰＨ５１整器３
を詳て、ＰＨ＝９．０に調節されたミオクロビン（Ｂ）
とりゾチーム（Ｃ）を多く含む分離パブファーの溶液で
ある混合液（Ｂ、Ｃ）　となり、ユニット夙に供給さｎ
る。ユニブト別での分離処理によって、ミオグロビンと
りゾチームが分離され、下部取出口２４１からはミオグ
ロビンの濃縮された分離液（Ｂ）が得られる。また、上
部取出口２４２からはリゾチームの濃縮された分離液（
Ｃ）が得られる。この例では、リゾチームを更に濃縮す
るために、更番こユニット５，２６が使用すれている。

すなわち、ユニット冴で得られた分離液（Ｃ）は、注入
口２５０からユニットδ内の泳動室に供給され、分離処
理が行なわれる。この結果。

上部取出口２５２からは、リゾチームが更に濃縮された
分離液（Ｃ）が得らｎる。下部取出口２５１からは、ミ
オグロビンな含む分離液（Ｂ）が得られる。この分離液
（Ｂ）は、回収率を向上させるため゛に１．上流側のユ
ニット冴の注入側に返送される。

上部取出口２５２で取出された分離液（Ｃ）は、ユニブ
ト別に供給され、更に分離処理が行なわれる。

この結果、上部抜出口２６２からは、リゾチームが濃縮
された分離液（Ｃ）が得られる。下部抜出口２６１　で
抜出された分離液（Ｂ）は、上流側のユニ噌ト５の注入
側に返送され１回収率向士に寄与する。

この実施例に示したプロセスにおいて、ユニットあの抜
出口２６２が得られたりゾチームの純度は９９、９１と
非常に高く、また回収率は８１０チであり良好であった
。また、Ｉ：Ｌニットｎの抜出口２３１から得られたア
ルブミンと、ユニブトあの抜出口２４１から得られたミ
オグロビンの各値は、次の通りであった。

アルブミン；純度９７８％１回収率８８．９チミオグロ
ビン；純度９０．７％、回収率９４．９−二のように、
この実施例によれば、極めて、高濃度、高回収率が達成
できた。

次に、第２図により本発明の他の実施例を説明する。ｇ
Ｊ２図において、ガル田は各電気泳動ユニブトである。

この例では１分離すべき荷電物質を２種類とした場合を
示す。この場合に用いた荷電物質は、アルブミン（ウシ
血清９箸電点４．９）とチトクロームＣ（ウマ、等電点
１０．６）である。

この荷電物質をＰＨ＝８．０に調整したトリスバッファ
（分離バッファ）に溶解し、混合液を電気泳動ユニット
乙の注入口２１０から泳動室に供給し、分離処理を行な
わせる。

この結果、上部抜出口２１２からチトクロムＣを多く含
んだ分４離液が得られ、下部抜出口２１１からアＪｌ／
　フＥンを多く含んだ分離液が得られた。次に、これら
の液は、夫々下流側の電気泳動ユニットｎ。

ｎに供給され１分離処理を行なう。これによって、ユニ
ット四の上部抜出口２２２からは、高濃度のチトクロム
Ｃが得られる。一方、ユニブト久の下部抜出口２３１か
らは、高濃度のアルブミンが得られる。ユニブトｎの下
部抜出口２２１からは、アルブミンを多（含む分離液が
得られ、これは上流側のユニット２１の液注入側に返送
される。また、ユニット乙の上部抜出口２３２からは、
チトクロムＣを多く含む分離液が得られ、同様に土？Ｍ
仰のユニット乙の注入側に返送する。二〇によって、高
濃度で、しかも高回収率の分離を実現できる。この実施
例におけるアルブミンとチトクロムＣの純度は９７、８
　％で、回収率は８８．９　％であった。

〔発明の効果〕

以上説明したように１本発明によれば、分離された荷電
物質は高濃度で、しかもその回収率は高い。

【図面の簡単な説明】 第１図および第２図は、夫々本発明の一実施例を示す図
、第３図は電気泳動ユニット例を示す図である。 ２・・・・・・分離用チャンバ、３・・曲泳動室、４，
５・・・・・・ｗｉ極室、６．７・・・・・・電極、８
・曲・膜、９・・・・・・ガイド部材、１０・・・・・
・循環ポンプ、１１・・四ｍ度調節器、１２・・・・・
・ポンプ、１４・・・・・・上部抜出口、１５・・・・
・・下部抜出０．２１〜２６・・・・・・電気泳動ユニ
ット、２７・・・・・・／＜、、７アー交換器、２８−
・Ｐ　Ｈ調整器７７〜−５ 代理人　弁理士　　小　川　勝　男・：５゜才１図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　分離用チャンバと、該分離用チャンバ内の泳動室に
   直流電圧を印加する電極対と、該泳動室に分離すべき荷
   電物質と分離バッファとを含む混合液を供給する注入口
   と、前記泳動室の一端であって前記電極対の一方の電極
   寄りの位置および前記泳動室の他端であって前記電極対
   の他方の電極寄りの位置に夫々設けられる分離液の抜出
   口と、前記泳動室内の混合液を循環させる循環手段とを
   有する電気泳動ユニットを複数組備え、上流側の該電気
   泳動ユニットの前記抜出口から抜出された分離液を下流
   側の該電気泳動ユニットの前記注入口に順次供給し、該
   下流側の電気泳動ユニットの前記抜出口から前記荷電物
   質が濃縮された分離液を取出すと共に、該濃縮された分
   離液の一部を前記上流側の電気泳動ユニットの注入側に
   戻して更に分離を行なわせる荷電物質の分離方法。