JPS6134465A - ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキツト - Google Patents
ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキツトInfo
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- JPS6134465A JPS6134465A JP15399384A JP15399384A JPS6134465A JP S6134465 A JPS6134465 A JP S6134465A JP 15399384 A JP15399384 A JP 15399384A JP 15399384 A JP15399384 A JP 15399384A JP S6134465 A JPS6134465 A JP S6134465A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ａ、産業上の利用分野
本発明は、溶液状態にあるプラスミン−ヒトα、−プラ
スミンインヒビター複合体（ｐｌａｓｍｉｎ −ａ、
−ｐｌａｓｍｉｎ １ｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ ＋ ｐｌａｓｍｉｎ−ａ、 −ａｎｔｉｐｌａｓｍ
ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ）を免疫学的に測定する試薬及
びそのキットに関する。
スミンインヒビター複合体（ｐｌａｓｍｉｎ −ａ、
−ｐｌａｓｍｉｎ １ｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ ＋ ｐｌａｓｍｉｎ−ａ、 −ａｎｔｉｐｌａｓｍ
ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ）を免疫学的に測定する試薬及
びそのキットに関する。
更に詳しくは、ヒトα２−プラスミンインヒビターを特
異的に認識して結合するモノクローナル抗体とプラスミ
ン（ｐｌａｓｍｉｎ） ヲｉ！ ｌ＆ して結合し得る
抗体を用いるサンドイッチ法によるプラスミン−ヒトα
２−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定試薬
及びそのキットに関する。
異的に認識して結合するモノクローナル抗体とプラスミ
ン（ｐｌａｓｍｉｎ） ヲｉ！ ｌ＆ して結合し得る
抗体を用いるサンドイッチ法によるプラスミン−ヒトα
２−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定試薬
及びそのキットに関する。
ｂ、従来技術
ヒトのα、−プラスミンインヒビタ−は、青水と路弁に
よって最初に単離・ＮｊＩｌ！され、線ｍｓ溶解酵素の
プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ ） のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−で
あり、１１．７Ｎの糖を含む分子量約６７、（１００の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られているＣ Ｍｏｒ
ｏｉ ＆Ａｏｋｔ ； ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ２５
１ 、５９５６−５９６５（１９７６）参照〕。
よって最初に単離・ＮｊＩｌ！され、線ｍｓ溶解酵素の
プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ ） のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−で
あり、１１．７Ｎの糖を含む分子量約６７、（１００の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られているＣ Ｍｏｒ
ｏｉ ＆Ａｏｋｔ ； ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ２５
１ 、５９５６−５９６５（１９７６）参照〕。
−１ヒトのα−−プラスミンインヒビタ−には３ａ類の
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線維素溶解作用を阻止する部位（以下これを１す７ク
テイブサイド”ということがある） （Ｂ、Ｗｉｍａｎ
＆Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ ； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
＋２５４．９２９１〜９２９７（１９７９）参照〕
であり、第２はカルボキシル基末端側のプラスミン結合
部位ＣＢ 、’Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ
； ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔ ８４ ＋ ５７３−５７８（１
９７８）参照〕であり、第３はアミ７基末端のフィブリ
ン結合部位である（ Ｙ、５ａｋａｔａ ＋ｅｔａｌ−
＋ ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｇｅａｒｃｈ ＋ １６
２７９〜２８２（１９７９）参照〕、。
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線維素溶解作用を阻止する部位（以下これを１す７ク
テイブサイド”ということがある） （Ｂ、Ｗｉｍａｎ
＆Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ ； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
＋２５４．９２９１〜９２９７（１９７９）参照〕
であり、第２はカルボキシル基末端側のプラスミン結合
部位ＣＢ 、’Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ
； ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔ ８４ ＋ ５７３−５７８（１
９７８）参照〕であり、第３はアミ７基末端のフィブリ
ン結合部位である（ Ｙ、５ａｋａｔａ ＋ｅｔａｌ−
＋ ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｇｅａｒｃｈ ＋ １６
２７９〜２８２（１９７９）参照〕、。
ヒトα２−プラスミンインヒビタ−は、プラスミン活性
をけとんど瞬間的に阻害し、α、−プラスミンインヒビ
タ−は、プラスミンと１：ｌの割合で結合し複合体を形
成する。
をけとんど瞬間的に阻害し、α、−プラスミンインヒビ
タ−は、プラスミンと１：ｌの割合で結合し複合体を形
成する。
（Ｂ 、Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ ； Ｔ１
１ｒ； Ｊｏｕｒｎａｋ ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ ｉＣｂｅｍｉａｔｒｙ ＋２６４ ＋ ９
２９１〜９２９７ （１９７９） ＋Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ
ｓ ’ｌ’ｈｒａｍｔ＋ｏｇｉｓ ａｎｄ ）
ｆａｅｒｒ＋ｏａｔａｓｉｒ、 ＋ ４ ３ ＋
７ ７−８９（１９８０）＃）￥１） 汎発性血管内凝固ＣＤＩＣ）やつｐキナーゼＨよる血栓
溶解療法など、プラスミノーゲンの活性化のみられる状
態では、生成したプラスミンとα、−プラスミンインヒ
ビタ−は反応し、複合体を形成する。
１ｒ； Ｊｏｕｒｎａｋ ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ ｉＣｂｅｍｉａｔｒｙ ＋２６４ ＋ ９
２９１〜９２９７ （１９７９） ＋Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ
ｓ ’ｌ’ｈｒａｍｔ＋ｏｇｉｓ ａｎｄ ）
ｆａｅｒｒ＋ｏａｔａｓｉｒ、 ＋ ４ ３ ＋
７ ７−８９（１９８０）＃）￥１） 汎発性血管内凝固ＣＤＩＣ）やつｐキナーゼＨよる血栓
溶解療法など、プラスミノーゲンの活性化のみられる状
態では、生成したプラスミンとα、−プラスミンインヒ
ビタ−は反応し、複合体を形成する。
最近、血漿中のプラスミン−ａ、−プラスミンインヒビ
タ−複合体の定量は、血栓溶解療法のモニターやＤＩＣ
の診断等圧有効であると考えられている（例えばＮ、Ａ
、Ｂｏｏｔｈ ＆ ＋Ｂ＝Ｂｅｎｎｅｔｔ ：
Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａ
ｔｏｌｏｇｙ ＋ ５０ ＊５３７〜５４１（１９８２
）参照）。
タ−複合体の定量は、血栓溶解療法のモニターやＤＩＣ
の診断等圧有効であると考えられている（例えばＮ、Ａ
、Ｂｏｏｔｈ ＆ ＋Ｂ＝Ｂｅｎｎｅｔｔ ：
Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａ
ｔｏｌｏｇｙ ＋ ５０ ＊５３７〜５４１（１９８２
）参照）。
従って、血液中のプラスミン−α、−プラスミンインヒ
ビター複合体の量を正確且つ簡便に測定することができ
れば、種々の病気に対してその予防９診断に＆めて役立
つことである。
ビター複合体の量を正確且つ簡便に測定することができ
れば、種々の病気に対してその予防９診断に＆めて役立
つことである。
従来知られたプラスミン−α、−プラスミンインヒビタ
ー複合体の測定方法として、蕗１の方法は二次元交叉免
疫電気泳動を用いる方法であり、第２の方法は抗血清よ
り得た抗体を固定化し、酵素抗体法を応用したいわゆる
サンドイッチ法によるものである。
ー複合体の測定方法として、蕗１の方法は二次元交叉免
疫電気泳動を用いる方法であり、第２の方法は抗血清よ
り得た抗体を固定化し、酵素抗体法を応用したいわゆる
サンドイッチ法によるものである。
しかし、ｌ￥ｆＴ者の方法は感度と定量性が低いという
欠点があった。また、後者の方法はきわめて感度が高（
有効な方法であるが、ヒトα２−プラスミンインヒビタ
ーに対する一定の活性を有する抗血清を安定して得るこ
とが極めて困難という欠点かぁ、つた。
欠点があった。また、後者の方法はきわめて感度が高（
有効な方法であるが、ヒトα２−プラスミンインヒビタ
ーに対する一定の活性を有する抗血清を安定して得るこ
とが極めて困難という欠点かぁ、つた。
・０発明の構成
そこで本発明者らは、ヒトα２−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体について研究を重ねたと
ころ、ヒトａ、−プラスミンインヒビタ−におけるプラ
スミンの線維素溶解作用阻止部位を特異的に認識し、ヒ
トａ、−プラスミンインヒビタ−の線維素溶解阻止作用
を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を見出し、
またこのモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ
細胞を創作し得。
ーに対するモノクローナル抗体について研究を重ねたと
ころ、ヒトａ、−プラスミンインヒビタ−におけるプラ
スミンの線維素溶解作用阻止部位を特異的に認識し、ヒ
トａ、−プラスミンインヒビタ−の線維素溶解阻止作用
を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を見出し、
またこのモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ
細胞を創作し得。
既に提案した、
本発明者らは、か〜る新しく見出した前記モノクローナ
ル抗体の特異的な作用を利用すれば、溶液状態にあるヒ
トα２−プラスミンインヒビターの量を直接に且つ正確
に測定し得ることを見出し本発明に到達した。
ル抗体の特異的な作用を利用すれば、溶液状態にあるヒ
トα２−プラスミンインヒビターの量を直接に且つ正確
に測定し得ることを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明の、サンドイッチ法による免疫学的測
定試薬において、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体
とはヒトα２−プラスミンインヒビターを１＆ｉｉ！識
し結合するモノクローナル抗体及び、ヒトプラスミンを
ｌｌｌｉｇｉｉｉ＊Ｌ、結合する抗プラスミノーグル抗
血情の抗体成分である。
定試薬において、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体
とはヒトα２−プラスミンインヒビターを１＆ｉｉ！識
し結合するモノクローナル抗体及び、ヒトプラスミンを
ｌｌｌｉｇｉｉｉ＊Ｌ、結合する抗プラスミノーグル抗
血情の抗体成分である。
一般に抗原の２つの異なった位置に結合した抗体を作っ
て抗原の有無又はその童を測定する方法は、サンドイッ
チ法と呼ばれ１例えばワイド（Ｗｉｄｅ）の「放射線免
疫検定法（Ｒａｄｉｏｍｕｎｏａｇａａｙ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ） Ｊ １９９−２０６ （１９７０）に記載さ
れている、 かくして本発明によれば、試薬の品質差がなく、恒常的
ＫＭ度よく溶液状態の（例えば血Ｊｔ中の）プラスミン
−ａ、−プラスミンインヒビタ−複合体を測定すること
が可能となる。
て抗原の有無又はその童を測定する方法は、サンドイッ
チ法と呼ばれ１例えばワイド（Ｗｉｄｅ）の「放射線免
疫検定法（Ｒａｄｉｏｍｕｎｏａｇａａｙ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ） Ｊ １９９−２０６ （１９７０）に記載さ
れている、 かくして本発明によれば、試薬の品質差がなく、恒常的
ＫＭ度よく溶液状態の（例えば血Ｊｔ中の）プラスミン
−ａ、−プラスミンインヒビタ−複合体を測定すること
が可能となる。
また直接プラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複
合体を測定するので他の挾雑物の影響は全く受けず正確
に且つ短時間に測定することができる。従って１本発明
によれば、プラスミン−α、−プラスミンインヒビター
複合体を正確且つ迅速に測定し得る試薬及びそのキット
が提供される。
合体を測定するので他の挾雑物の影響は全く受けず正確
に且つ短時間に測定することができる。従って１本発明
によれば、プラスミン−α、−プラスミンインヒビター
複合体を正確且つ迅速に測定し得る試薬及びそのキット
が提供される。
次に本発明による測定試薬及びプラスミン−α、−プラ
スミンインヒビター複合体の含有量の測定方法を具体的
に説明する。
スミンインヒビター複合体の含有量の測定方法を具体的
に説明する。
ヒトα２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロー
ナル抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラ
スチック容器）に同定化する（以下これを１向定化抗体
”という）。
ナル抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラ
スチック容器）に同定化する（以下これを１向定化抗体
”という）。
ついで不溶性担体と測定しようとする試薬又・は検体資
料との非特異的結合を避けるために適当な物質（例えば
牛血ｆｆフルブミン）で不溶性担体の表面を被＆する。
料との非特異的結合を避けるために適当な物質（例えば
牛血ｆｆフルブミン）で不溶性担体の表面を被＆する。
このようＫして得られた第１抗体が固定化された不溶性
担体な検体資料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に同定化抗体（ｋｌ抗体）と検体資料中のプ
ラスミン゛−Ｑｔ−プラスミンインヒビタ−複合体が結
合する。ついで適当な洗浄液で洗った後、適当な標識物
質で標識したヒトプラスミノーゲンに対する抗体（第２
抗体）の溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における
固定化抗体に結合したプラスミンαヨープラスミンイン
ヒビタ−複合体と一定時間及び温度で接触させ第２抗体
と反応させる１、これを適当な洗浄液で洗い、次いで不
溶性担体上に存在する第２抗体ＫｔｌＡＩ＆された標識
物質の量を測定する。かくしてその値から検体資料中の
プラスミン−α、−プラスミンインヒビター複合体の量
を算出することができる。
担体な検体資料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に同定化抗体（ｋｌ抗体）と検体資料中のプ
ラスミン゛−Ｑｔ−プラスミンインヒビタ−複合体が結
合する。ついで適当な洗浄液で洗った後、適当な標識物
質で標識したヒトプラスミノーゲンに対する抗体（第２
抗体）の溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における
固定化抗体に結合したプラスミンαヨープラスミンイン
ヒビタ−複合体と一定時間及び温度で接触させ第２抗体
と反応させる１、これを適当な洗浄液で洗い、次いで不
溶性担体上に存在する第２抗体ＫｔｌＡＩ＆された標識
物質の量を測定する。かくしてその値から検体資料中の
プラスミン−α、−プラスミンインヒビター複合体の量
を算出することができる。
か（して本発明の測定試薬は、第、ｌ抗体が不溶性担体
に結合した固定化抗体と標識化された第２抗体とより主
として格成される。この試薬を能率よ（且つ簡便に利用
するために。
に結合した固定化抗体と標識化された第２抗体とより主
として格成される。この試薬を能率よ（且つ簡便に利用
するために。
これら抗体以外に種々の補助剤を含めてキットを形成す
ることができる。かへる補助剤としては、例えば固体状
の試薬を溶解させるための溶解剤、不溶化担体な洗浄す
るために使用される洗浄剤、抗体の標識物質として酵素
を使用した場合、酵素活性を測定するための基質、その
反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットとして通常
使用されるものが挙げられる。
ることができる。かへる補助剤としては、例えば固体状
の試薬を溶解させるための溶解剤、不溶化担体な洗浄す
るために使用される洗浄剤、抗体の標識物質として酵素
を使用した場合、酵素活性を測定するための基質、その
反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットとして通常
使用されるものが挙げられる。
本発明の測定試薬に使用される不溶性担体としては、例
えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポ
リエステル、ポリアクリルニトリル、弗素−・脂、架橋
テキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、その他
紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せなど
を例示することができる。
えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポ
リエステル、ポリアクリルニトリル、弗素−・脂、架橋
テキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、その他
紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せなど
を例示することができる。
また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状９球状
、ＩＩｍ、錐状９棒状、盤状、容器状。
、ＩＩｍ、錐状９棒状、盤状、容器状。
セル、試験管などの極々の形状であることができる。
また標識物質としては放射性物質、Ｗ素又は螢光物質を
使用するのが有利である。防剤性物質としては１２５１
．１３１１．１４Ｃ，３Ｈなどを、酵素としてはアルカ
リ性フォスファターゼ。
使用するのが有利である。防剤性物質としては１２５１
．１３１１．１４Ｃ，３Ｈなどを、酵素としてはアルカ
リ性フォスファターゼ。
パーオキシターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなと、ま
た螢光物質としてはフルオレツセインインチオシアネー
ト、テトラメチルローグミンインチオシアネートなどを
使用することかで鎗るが、これらは例示したものに限ら
ず、免疫学的測定方法忙使用し得るものであれば、他の
ものでも使用で？！−る。
た螢光物質としてはフルオレツセインインチオシアネー
ト、テトラメチルローグミンインチオシアネートなどを
使用することかで鎗るが、これらは例示したものに限ら
ず、免疫学的測定方法忙使用し得るものであれば、他の
ものでも使用で？！−る。
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては、先に特許出願された（昭和５９年４月１７日出
Ｎｉ：発明の名称１モノクロ一ナル抗体、ハイプリドー
マ細胞及び七ツクｐ−ナル抗体の製造方法°′）。
いては、先に特許出願された（昭和５９年４月１７日出
Ｎｉ：発明の名称１モノクロ一ナル抗体、ハイプリドー
マ細胞及び七ツクｐ−ナル抗体の製造方法°′）。
丁
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては前記特許出願明細書に詳細に説明されている通り
、ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して結合
し得るモノクローナル抗体である。以下にその内容を簡
単に説明する。
いては前記特許出願明細書に詳細に説明されている通り
、ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して結合
し得るモノクローナル抗体である。以下にその内容を簡
単に説明する。
抗原に用いるヒトα２−プラスミンインヒビターは、前
記青水と路弁の方法によりしト血漿中より単離精製され
た。
記青水と路弁の方法によりしト血漿中より単離精製され
た。
雄Ｂａ１ｂ／ｃマウスを用いるが、他の系（ｓ ｔｒａ
ｉｎｓ ）のマウスを使用することもできる。その際
、免疫計画及びヒトα２−プラスミンインヒビターの濃
度は十分な盟の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されろ
よう選ばれるべきである。例えばマウスに少量のヒトα
オープラスミンインヒビタ′ｌ −で成る間隔で腹腔に数回免疫の振、さらに数回静脈に
投与した１、最終免疫の数日後に融合の為に膵臓細胞を
取り出誓″。
ｉｎｓ ）のマウスを使用することもできる。その際
、免疫計画及びヒトα２−プラスミンインヒビターの濃
度は十分な盟の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されろ
よう選ばれるべきである。例えばマウスに少量のヒトα
オープラスミンインヒビタ′ｌ −で成る間隔で腹腔に数回免疫の振、さらに数回静脈に
投与した１、最終免疫の数日後に融合の為に膵臓細胞を
取り出誓″。
Ｃ６細胞融合
膵臓を無菌的に取り出し、それから単
細胞懸濁液を調製する。それらの膵臓細胞を適当なライ
ンからのマウス骨髄鹿細胞と適当な融合促進剤の使用忙
より細胞融合させる。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい
比率は約２０＝１〜約２＝１の範囲である。約１０６個
の膵臓細胞について０．５〜１．５１１７の融合媒体の
使用が適当である。
ンからのマウス骨髄鹿細胞と適当な融合促進剤の使用忙
より細胞融合させる。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい
比率は約２０＝１〜約２＝１の範囲である。約１０６個
の膵臓細胞について０．５〜１．５１１７の融合媒体の
使用が適当である。
細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知
られているが１本発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ
ｌ細胞（以下Ｐ３−Ｕｌ と略記する） 〔Ｙｅｌｔ
ｏｎ＋ Ｄ、Ｅ ｅｔ ａｌ、＋ ＣｕｒｒｅｎｔＴｏ
ｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８１１Ｉ（１９７８）参照〕を用
いた。これは８−７ザグ７ニン耐性の細胞ラインであり
、Ｉ＃Ｌ素ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ （ｈｙｐｏｍｎｔｈｉｎｅ −ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ）
が欠失しており、それゆえにＨＡＴ （ヒボキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）培地中では生存しない
。
ｌ細胞（以下Ｐ３−Ｕｌ と略記する） 〔Ｙｅｌｔ
ｏｎ＋ Ｄ、Ｅ ｅｔ ａｌ、＋ ＣｕｒｒｅｎｔＴｏ
ｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８１１Ｉ（１９７８）参照〕を用
いた。これは８−７ザグ７ニン耐性の細胞ラインであり
、Ｉ＃Ｌ素ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ （ｈｙｐｏｍｎｔｈｉｎｅ −ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ）
が欠失しており、それゆえにＨＡＴ （ヒボキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）培地中では生存しない
。
また、この細胞ラインはそれ自体抗体を分泌しない、い
わゆる非分泌屋である。
わゆる非分泌屋である。
好ましい融合促進剤としては、例え・ば平均分子量が１
０００〜４０００のポリエチレングリフールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。
０００〜４０００のポリエチレングリフールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。
Ｄ、融合した細胞の選択：
別の容器内（例えばマイクロタイター
プレート）で未融合の膵臓細胞、未融合の骨髄腫細胞お
よび融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支
持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させる
のに十分な時間（約１週間）培養する。培地は薬物抵抗
性（例えば８−７ザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫
細胞を支持しないもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用
される。この選択培地中では未融合の骨髄腹細胞は死滅
する。筺た未融合の膵臓細胞は非ｓ１ｍ性細胞なのであ
る一定期間後（約１週間後）死滅する。
よび融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支
持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させる
のに十分な時間（約１週間）培養する。培地は薬物抵抗
性（例えば８−７ザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫
細胞を支持しないもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用
される。この選択培地中では未融合の骨髄腹細胞は死滅
する。筺た未融合の膵臓細胞は非ｓ１ｍ性細胞なのであ
る一定期間後（約１週間後）死滅する。
これらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の肺癌性
と領膵臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中に生
存できる。
と領膵臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中に生
存できる。
かくしてハイプリドーマが細胞が検出
された後、その培養上清を採取し、ヒトａ、−プラスミ
ンインヒビタ−に対する抗体について酵素免疫定量法（
ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅ
ｎｔ Ａｓ５ａｙ ） Ｋよりスクリーニングする。
ンインヒビタ−に対する抗体について酵素免疫定量法（
ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅ
ｎｔ Ａｓ５ａｙ ） Ｋよりスクリーニングする。
目的の抗体を産生するハイプリドーマ−細胞を適当な方
法（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なつた方法で産生される。その第１の方法によれ
ばハイプリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養する
ことによりその培養上清から、そのハイプリドーマ細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によれば／−イプリドーマ細胞は同質遺伝子又
は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することがで
きる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、
その・・イブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗
体を得ることができる。
法（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なつた方法で産生される。その第１の方法によれ
ばハイプリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養する
ことによりその培養上清から、そのハイプリドーマ細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によれば／−イプリドーマ細胞は同質遺伝子又
は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することがで
きる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、
その・・イブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗
体を得ることができる。
本発明の測定試薬においては、か〜るモノクー−ナル抗
体を第１抗体或いは第２抗体のいずれかに使用する。す
なわち、前記モノクーーナル抗体は、不溶性担体に結合
させて固定化抗体として使用することもできるし、また
標識物質を付けて椋脆抗体としても使用することもでき
る。
体を第１抗体或いは第２抗体のいずれかに使用する。す
なわち、前記モノクーーナル抗体は、不溶性担体に結合
させて固定化抗体として使用することもできるし、また
標識物質を付けて椋脆抗体としても使用することもでき
る。
前記モノクロ−アル抗体と共に使用される他の抗体とし
ては、ヒトプラスミンをｙ；ｉｔｍシ、結合し得るもの
であればよい。
ては、ヒトプラスミンをｙ；ｉｔｍシ、結合し得るもの
であればよい。
以上本発明によれば、プラスミン−α、−プラスミンイ
ンヒビター複合体を含む検体（例えばヒト血漿）中のイ
ンヒビターの量を正確に且つ容易Ｋ ＩＩＩ定すること
が可能である。
ンヒビター複合体を含む検体（例えばヒト血漿）中のイ
ンヒビターの量を正確に且つ容易Ｋ ＩＩＩ定すること
が可能である。
以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例１
本実施例で使用したル１及び第２抗体は、本発明者らが
先に出願した明＃＋沓（昭和５９年４月１７日付出願；
発明の名称１モノクロ一ナル抗体、ハイプリドーマ細胞
及びモノクローナル抗体の製造方法”）に記載された方
法によって得られた下記のものを使用した。
先に出願した明＃＋沓（昭和５９年４月１７日付出願；
発明の名称１モノクロ一ナル抗体、ハイプリドーマ細胞
及びモノクローナル抗体の製造方法”）に記載された方
法によって得られた下記のものを使用した。
第１抗体
前記出願明細書の実施例３において得られた抗体基”
ＩＢＩＯＧＩＩ”を使用し、これを下記の如く不溶性担
体（マイクロタイタープレート）に固定化させて用いた
。この抗体ハα、−プラスミンインヒビタ−におけるプ
ラスミンの線維素溶解作用の阻止部位（リアクティブサ
イト）以外の部位を特異的Ｋｌｌ臓し得るモノクローナ
ル抗体である。
ＩＢＩＯＧＩＩ”を使用し、これを下記の如く不溶性担
体（マイクロタイタープレート）に固定化させて用いた
。この抗体ハα、−プラスミンインヒビタ−におけるプ
ラスミンの線維素溶解作用の阻止部位（リアクティブサ
イト）以外の部位を特異的Ｋｌｌ臓し得るモノクローナ
ル抗体である。
第２抗体
ウサギをヒトプラスミノーゲンで免疫して得たヒトプラ
スミノーゲンに対する抗血清より抗体成分を精製し、ア
ルカリ性フォスファターゼで標識化して使用した。
スミノーゲンに対する抗血清より抗体成分を精製し、ア
ルカリ性フォスファターゼで標識化して使用した。
濃度２０ ｔｔｔｔ／ｇのヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＩＢＩ
ＯＧＩＩ）をマイクロタイタープレート上に４℃で一晩
放置し固定化した。これに１％牛血清アルブミンを含む
緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ、ＣＯａ ｓ ３５ ｍＭ Ｎ
ａＨＣＯ３，３ｍＭ ＮａＮＢ ）を加え室温で４時間
放置した後、１％牛血清アルブミンを含む洗浄液（２０
ｍＭ リン酸緩衝液＋ ０．１３５ Ｍ ＮａＣ１＋２
ｍＭＮａＮ、 ＋ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０ ）で
５回洗浄した。次に希釈用溶液（２０ｍＭ ’）ン酸緩
伽液、 ０．１３５ Ｍ Ｎａ（Ｊ ）で種々の濃度と
なるように希釈したプラスミン−α、−プラスミンイン
ヒビター複合体を加え、室温で４時間放置した。
ビターを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＩＢＩ
ＯＧＩＩ）をマイクロタイタープレート上に４℃で一晩
放置し固定化した。これに１％牛血清アルブミンを含む
緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ、ＣＯａ ｓ ３５ ｍＭ Ｎ
ａＨＣＯ３，３ｍＭ ＮａＮＢ ）を加え室温で４時間
放置した後、１％牛血清アルブミンを含む洗浄液（２０
ｍＭ リン酸緩衝液＋ ０．１３５ Ｍ ＮａＣ１＋２
ｍＭＮａＮ、 ＋ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０ ）で
５回洗浄した。次に希釈用溶液（２０ｍＭ ’）ン酸緩
伽液、 ０．１３５ Ｍ Ｎａ（Ｊ ）で種々の濃度と
なるように希釈したプラスミン−α、−プラスミンイン
ヒビター複合体を加え、室温で４時間放置した。
その後帥配洗浄液で５回洗浄し、さらにアルカリ性フォ
ス７７ターゼで５ｗ１ｔシたヒトプラスミノーゲンに対
する抗体を３５０Ｊ／ｉｕの濃度で加え４℃で一晩放置
した。
ス７７ターゼで５ｗ１ｔシたヒトプラスミノーゲンに対
する抗体を３５０Ｊ／ｉｕの濃度で加え４℃で一晩放置
した。
曲配洗浄液で洗浄後アルカリ性フォスファターゼ基質溶
液を１９／就の濃度で加え、ＥＬＩＳＡ ＡＮＡＬＹＺ
ＥＲ（東洋側番＠ ＃ ＥＴＹ −９６〕で４０．５ｎ
ｍの波長における１分間当りのＷ！Ｌ−ｙｔ度変化を測
定した。その結果を碓付図面第１図に示した。この図面
からプラスミン−α、−プラスミンインヒビター複合体
の濃度と吸光度゛変化との関係は直線関係になることが
理解できる。従って一−プラスミンインヒビターにおけ
るリアクティブサイト以外の場所を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体をサンドイツチ法における一つの抗体
として使用することによつ【、プラスミン−α、−プラ
スミンインヒビター複合体の量を容品に測定することが
できる。
液を１９／就の濃度で加え、ＥＬＩＳＡ ＡＮＡＬＹＺ
ＥＲ（東洋側番＠ ＃ ＥＴＹ −９６〕で４０．５ｎ
ｍの波長における１分間当りのＷ！Ｌ−ｙｔ度変化を測
定した。その結果を碓付図面第１図に示した。この図面
からプラスミン−α、−プラスミンインヒビター複合体
の濃度と吸光度゛変化との関係は直線関係になることが
理解できる。従って一−プラスミンインヒビターにおけ
るリアクティブサイト以外の場所を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体をサンドイツチ法における一つの抗体
として使用することによつ【、プラスミン−α、−プラ
スミンインヒビター複合体の量を容品に測定することが
できる。
添付図面は、本発明の実施例におけるプラスミン−α２
−プラスミンインヒビタ−複合体の濃度と吸光度変化と
の関係を示すものである。
−プラスミンインヒビタ−複合体の濃度と吸光度変化と
の関係を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、サンドイッチ法による免疫学的測定試薬において、
不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれか一方
が、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターを特異的に認
識するモノクローナル抗体であり、他の一方がヒトプラ
スミノーゲンに対する抗体であることを特徴とするヒト
α＿２−プラスミンインヒビターに対するモノクローナ
ル抗体を用いたプラスミン−α＿２−プラスミンインヒ
ビター複合体の免疫学的測定試薬。 ２ 該不溶性担体が、プラスチック容器、プラスチック
ビーズ、ラテックスビーズ、ガラスビーズ又は金属粒子
である第１項記載の測定試薬。 ３、該標識抗体が、酵素、放射性同位元素又は螢光物質
で標識化された抗体である第１項記載の測定試薬。 ４、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体を含み、これ
らの抗体のいずれか一方はヒトα＿２−プラスミンイン
ヒビターを抗原として認識して結合するモノクローナル
抗体であり、他の一方はヒトプラスミノーゲンを抗原と
して認識して結合する抗体であり、これに（ａ）溶解剤
、（ｂ）洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場合
には、（ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその反
応停止剤を組合せてなる免疫学的測定のためのキット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15399384A JPS6134465A (ja) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキツト |
| EP19850109227 EP0169549B1 (en) | 1984-07-26 | 1985-07-23 | Immunological determination of human plasmin/alpha2-plasmin inhibitor |
| DE19853586577 DE3586577T2 (de) | 1984-07-26 | 1985-07-23 | Immunologische bestimmung von menschlichem plasmin/alpha-2-plasmin-hemmstoff. |
| DK339985A DK339985A (da) | 1984-07-26 | 1985-07-25 | Immunologisk bestemmelse af humanplasmin/alfa2-plasmininhibitor samt reagenssystem til brug herved |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15399384A JPS6134465A (ja) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキツト |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6134465A true JPS6134465A (ja) | 1986-02-18 |
| JPH0441783B2 JPH0441783B2 (ja) | 1992-07-09 |
Family
ID=15574568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15399384A Granted JPS6134465A (ja) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6134465A (ja) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57551A (en) * | 1980-04-30 | 1982-01-05 | Merck Patent Gmbh | Immunologic measuring method and means of enzyme |
| JPS5716355A (en) * | 1980-04-25 | 1982-01-27 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| JPS5794660A (en) * | 1980-09-30 | 1982-06-12 | Behringwerke Ag | Measurement of inhibitor-enzyme compound |
| JPS57136165A (en) * | 1981-02-18 | 1982-08-23 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Immunological measuring reagent |
| JPS58148963A (ja) * | 1982-03-02 | 1983-09-05 | Maruko Seiyaku Kk | サンドウイツチ法によるヒト体液中のアルフア−−１−アンチトリプシン・トリプシン結合物測定用試薬 |
-
1984
- 1984-07-26 JP JP15399384A patent/JPS6134465A/ja active Granted
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5716355A (en) * | 1980-04-25 | 1982-01-27 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| JPS57551A (en) * | 1980-04-30 | 1982-01-05 | Merck Patent Gmbh | Immunologic measuring method and means of enzyme |
| JPS5794660A (en) * | 1980-09-30 | 1982-06-12 | Behringwerke Ag | Measurement of inhibitor-enzyme compound |
| JPS57136165A (en) * | 1981-02-18 | 1982-08-23 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Immunological measuring reagent |
| JPS58148963A (ja) * | 1982-03-02 | 1983-09-05 | Maruko Seiyaku Kk | サンドウイツチ法によるヒト体液中のアルフア−−１−アンチトリプシン・トリプシン結合物測定用試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0441783B2 (ja) | 1992-07-09 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |