JPH0441783B2 - - Google Patents
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- JPH0441783B2 JPH0441783B2 JP59153993A JP15399384A JPH0441783B2 JP H0441783 B2 JPH0441783 B2 JP H0441783B2 JP 59153993 A JP59153993 A JP 59153993A JP 15399384 A JP15399384 A JP 15399384A JP H0441783 B2 JPH0441783 B2 JP H0441783B2
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- plasmin
- human
- plasmin inhibitor
- labeled
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
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Description
【発明の詳細な説明】
ａ 産業上の利用分野
本発明は、溶液状態にあるプラスミン−ヒトα2
−プラスミンインヒビター複合体（plasmin−α2
−plasmin inhibitor complex、plasmin−α2−
antiplasmin complex）を免疫学的に測定する試
薬及びそのキツトに関する。
−プラスミンインヒビター複合体（plasmin−α2
−plasmin inhibitor complex、plasmin−α2−
antiplasmin complex）を免疫学的に測定する試
薬及びそのキツトに関する。
更に詳しくは、ヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーを特異的に認識して結合するモノクローナル抗
体とプラスミン（plasmin）を認識して結合し得
る抗体を用いるサンドイツチ法によるプラスミン
−ヒトα2−プラスミンインヒビター複合体の免疫
学的測定試薬及びそのキツトに関する。
ーを特異的に認識して結合するモノクローナル抗
体とプラスミン（plasmin）を認識して結合し得
る抗体を用いるサンドイツチ法によるプラスミン
−ヒトα2−プラスミンインヒビター複合体の免疫
学的測定試薬及びそのキツトに関する。
ｂ 従来技術
ヒトのα2−プラスミンインヒビターは、青木と
諸井によつて最初に単離・精製され、線維素溶解
酵素のプラスミン（plasmin）のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビ
ターであり、11.7％の糖を含む分子量約67000の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られている
〔Moroi ＆ Aoki；The Journal of
Biological Chemistry，251，5956−5965（1976）
参照〕。
諸井によつて最初に単離・精製され、線維素溶解
酵素のプラスミン（plasmin）のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビ
ターであり、11.7％の糖を含む分子量約67000の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られている
〔Moroi ＆ Aoki；The Journal of
Biological Chemistry，251，5956−5965（1976）
参照〕。
一方ヒトのα2−プラスミンインヒビターには３
種類の活性部位があることが知られている。第１
はプラスミンの線維素溶解作用を阻止する部位
（以下これを“リアクテイブサイド”ということ
がある）〔B.Wiman ＆ D.Collen；The
Journal of Biological Chemistry，254，9291〜
9297（1979）参照〕であり、第２はカルボキシル
基末端側のプラスミン結合部位〔B.Wiman ＆
D.Collen；European Journal of
Biochemistry，84，573−578（1978）参照〕であ
り、第３はアミノ基末端のフイブリン結合部位で
ある〔Y.Sakata，et al.，Thrombosis
Research，16 279〜282（1979）参照〕。
種類の活性部位があることが知られている。第１
はプラスミンの線維素溶解作用を阻止する部位
（以下これを“リアクテイブサイド”ということ
がある）〔B.Wiman ＆ D.Collen；The
Journal of Biological Chemistry，254，9291〜
9297（1979）参照〕であり、第２はカルボキシル
基末端側のプラスミン結合部位〔B.Wiman ＆
D.Collen；European Journal of
Biochemistry，84，573−578（1978）参照〕であ
り、第３はアミノ基末端のフイブリン結合部位で
ある〔Y.Sakata，et al.，Thrombosis
Research，16 279〜282（1979）参照〕。
ヒトα2−プラスミンインヒビターは、プラスミ
ン活性をほとんど瞬間的に阻害し、α2−プラスミ
ンインヒビターは、プラスミンと１：１の割合で
結合し複合体を形成する。（B.Wiman ＆ D.
Collen；The Journal of Biological
Chemistry、254、9291〜9297（1979）、D.
Collen；Thrombosis and Haemostasis、43、
77−89（1980）参照） 汎発性血管内凝固（DIC）やウロキナーゼによ
る血栓溶解療法など、プラスミノーゲンの活性化
のみられる状態では、生成したプラスミンとα2−
プラスミンインヒビターは反応し、複合体を形成
する。
ン活性をほとんど瞬間的に阻害し、α2−プラスミ
ンインヒビターは、プラスミンと１：１の割合で
結合し複合体を形成する。（B.Wiman ＆ D.
Collen；The Journal of Biological
Chemistry、254、9291〜9297（1979）、D.
Collen；Thrombosis and Haemostasis、43、
77−89（1980）参照） 汎発性血管内凝固（DIC）やウロキナーゼによ
る血栓溶解療法など、プラスミノーゲンの活性化
のみられる状態では、生成したプラスミンとα2−
プラスミンインヒビターは反応し、複合体を形成
する。
最近、血漿中のプラスミン−α2−プラスミンイ
ンヒビター複合体の定量は、血栓溶解療法のモニ
ターやDICの診断等に有効であると考えられてい
る（例えばN.A.Booth ＆ B.Bennett：British
Journal of Haematology、50、537〜541（1982）
参照）。
ンヒビター複合体の定量は、血栓溶解療法のモニ
ターやDICの診断等に有効であると考えられてい
る（例えばN.A.Booth ＆ B.Bennett：British
Journal of Haematology、50、537〜541（1982）
参照）。
従つて、血液中のプラスミン−α2−プラスミン
インヒビター複合体の量を正確且つ簡便に測定す
ることができれば、種々の病気に対してその予
防、診断に極めて役立つことである。
インヒビター複合体の量を正確且つ簡便に測定す
ることができれば、種々の病気に対してその予
防、診断に極めて役立つことである。
従来知られたプラスミン−α2−プラスミンイン
ヒビター複合体の測定方法として、第１の方法は
二次元交叉免疫電気泳動を用いる方法であり、第
２の方法は抗血清より得た抗体を固定化し、酵素
抗体法を応用したいわゆるサンドイツチ法による
ものである。
ヒビター複合体の測定方法として、第１の方法は
二次元交叉免疫電気泳動を用いる方法であり、第
２の方法は抗血清より得た抗体を固定化し、酵素
抗体法を応用したいわゆるサンドイツチ法による
ものである。
しかし、前者の方法は感度と定量性が低いとい
う欠点があつた。また、後者の方法はきわめて感
度が高く有効な方法であるが、ヒトα2−プラスミ
ンインヒビターに対する一定の活性を有する抗血
清を安定して得ることが極めて困難という欠点が
あつた。
う欠点があつた。また、後者の方法はきわめて感
度が高く有効な方法であるが、ヒトα2−プラスミ
ンインヒビターに対する一定の活性を有する抗血
清を安定して得ることが極めて困難という欠点が
あつた。
ｃ 発明の構成
そこで本発明者らは、ヒトα2−プラスミンイン
ヒビターに対するモノクローナル抗体について研
究を重ねたところ、ヒトα2−プラスミンインヒビ
ターにおけるプラスミンの線維素溶解作用を阻止
する部位以外の場所を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を見出し、またこのモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞を創作し得、既
に提案した。
ヒビターに対するモノクローナル抗体について研
究を重ねたところ、ヒトα2−プラスミンインヒビ
ターにおけるプラスミンの線維素溶解作用を阻止
する部位以外の場所を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を見出し、またこのモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞を創作し得、既
に提案した。
本発明者らは、かゝる新しく見出した前記モノ
クローナル抗体の特異的な作用を利用すれば、溶
液状態にあるヒトプラスミン−α2−プラスミンイ
ンヒビター複合体の量を直接に且つ正確に測定し
得ることを見出し本発明に到達した。
クローナル抗体の特異的な作用を利用すれば、溶
液状態にあるヒトプラスミン−α2−プラスミンイ
ンヒビター複合体の量を直接に且つ正確に測定し
得ることを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明の、サンドイツチ法による免
疫学的測定試薬において、不溶性担体に結合した
抗体と標識抗体とはヒトα2−プラスミンインヒビ
ターを認識し結合するモノクローナル抗体及び、
ヒトプラスミンを認識し、結合する抗プラスミノ
ーゲル抗血清の抗体成分である。
疫学的測定試薬において、不溶性担体に結合した
抗体と標識抗体とはヒトα2−プラスミンインヒビ
ターを認識し結合するモノクローナル抗体及び、
ヒトプラスミンを認識し、結合する抗プラスミノ
ーゲル抗血清の抗体成分である。
一般に抗原の２つの異なつた位置に結合した抗
体を作つて抗原の有無又はその量を測定する方法
は、サンドイツチ法と呼ばれ、例えばワイド
（Wide）の「放射線免疫検定法
（Radiomunoassay Methods）」199−206（1970）
に記載されている。
体を作つて抗原の有無又はその量を測定する方法
は、サンドイツチ法と呼ばれ、例えばワイド
（Wide）の「放射線免疫検定法
（Radiomunoassay Methods）」199−206（1970）
に記載されている。
かくして本発明によれば、試薬の品質差がな
く、恒常的に精度よく溶液状態の（例えば血漿中
の）プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複
合体を測定することが可能となる。また直接プラ
スミン−α2−プラスミンインヒビター複合体を測
定するので他の挾雑物の影響は全く受けず正確に
且つ短時間に測定することができる。従つて、本
発明によれば、プラスミン−α2−プラスミンイン
ヒビター複合体を正確且つ迅速に測定し得る試薬
及びそのキツトが提供される。
く、恒常的に精度よく溶液状態の（例えば血漿中
の）プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複
合体を測定することが可能となる。また直接プラ
スミン−α2−プラスミンインヒビター複合体を測
定するので他の挾雑物の影響は全く受けず正確に
且つ短時間に測定することができる。従つて、本
発明によれば、プラスミン−α2−プラスミンイン
ヒビター複合体を正確且つ迅速に測定し得る試薬
及びそのキツトが提供される。
次に本発明による測定試薬及びプラスミン−α2
−プラスミンインヒビター複合体の含有量の測定
方法を具体的に説明する。
−プラスミンインヒビター複合体の含有量の測定
方法を具体的に説明する。
ヒトα2−プラスミンインヒビターに対するモノ
クローナル抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体
（例えばプラスチツク容器）に固定化する（以下
これを“固定化抗体”という）。ついで不溶性担
体と測定しようとする試薬又は検体試料との非特
異的結合を避けるために適当な物質（例えば牛血
清アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。
クローナル抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体
（例えばプラスチツク容器）に固定化する（以下
これを“固定化抗体”という）。ついで不溶性担
体と測定しようとする試薬又は検体試料との非特
異的結合を避けるために適当な物質（例えば牛血
清アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。
このようにして得られた第１抗体が固定化され
た不溶性担体を検体試料と一定時間及び温度で接
触させ反応させる。この間に固定化抗体（第１抗
体）と検体試料中のプラスミン−α2−プラスミン
インヒビター複合体が結合する。ついで適当な洗
浄液で洗つた後、適当な標識物質で標識したヒト
プラスミノーゲンに対する抗体（第２抗体）の溶
液（例えば水溶液）を、不溶性担体における固定
化抗体に結合したプラスミン−α2−プラスミンイ
ンヒビター複合体と一定時間及び温度で接触させ
第２抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗
い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標
識された標識物質の量を測定する。かくしてその
値から検体試料中のプラスミン−α2−プラスミン
インヒビター複合体の量を算出することができ
る。
た不溶性担体を検体試料と一定時間及び温度で接
触させ反応させる。この間に固定化抗体（第１抗
体）と検体試料中のプラスミン−α2−プラスミン
インヒビター複合体が結合する。ついで適当な洗
浄液で洗つた後、適当な標識物質で標識したヒト
プラスミノーゲンに対する抗体（第２抗体）の溶
液（例えば水溶液）を、不溶性担体における固定
化抗体に結合したプラスミン−α2−プラスミンイ
ンヒビター複合体と一定時間及び温度で接触させ
第２抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗
い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標
識された標識物質の量を測定する。かくしてその
値から検体試料中のプラスミン−α2−プラスミン
インヒビター複合体の量を算出することができ
る。
かくして本発明の測定試薬は、第１抗体が不溶
性担体に結合した固定化抗体と標識化された第２
抗体とより主として構成される。この試薬を能率
よく且つ簡便に利用するために、これら抗体以外
に種々の補助剤を含めてキツトを形成することが
できる。かゝる補助剤としては、例えば固体状の
試薬を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗
浄するために使用される洗浄剤、抗体の標識物質
として酵素を使用した場合、酵素活性を測定する
ための基質、その反応停止剤などの免疫学的測定
試薬のキツトとして通常使用されるものが挙げら
れる。
性担体に結合した固定化抗体と標識化された第２
抗体とより主として構成される。この試薬を能率
よく且つ簡便に利用するために、これら抗体以外
に種々の補助剤を含めてキツトを形成することが
できる。かゝる補助剤としては、例えば固体状の
試薬を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗
浄するために使用される洗浄剤、抗体の標識物質
として酵素を使用した場合、酵素活性を測定する
ための基質、その反応停止剤などの免疫学的測定
試薬のキツトとして通常使用されるものが挙げら
れる。
本発明の測定試薬に使用される不溶性担体とし
ては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリ
ル、弗素樹脂、架橋デキストラン、ポリサツカラ
イドなどの高分子、その他紙、ガラス、金属、ア
ガロース及びこれらの組合せなどを例示すること
ができる。
ては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリ
ル、弗素樹脂、架橋デキストラン、ポリサツカラ
イドなどの高分子、その他紙、ガラス、金属、ア
ガロース及びこれらの組合せなどを例示すること
ができる。
また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ
状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、
試験管などの種々の形状であることができる。
状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、
試験管などの種々の形状であることができる。
また標識物質としては放射性物質、酵素又は螢
光物質を使用するのが有利である。放射性物質と
しては 125I 131I、 14C、 3Hなどを、酵素として
はアルカリ性フオスフアターゼ、パーオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど、また螢光物
質としてはフルオレツセインイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
などを使用することができるが、これらは例示し
たものに限らず、免疫学的測定方法に使用し得る
ものであれば、他のものでも使用できる。
光物質を使用するのが有利である。放射性物質と
しては 125I 131I、 14C、 3Hなどを、酵素として
はアルカリ性フオスフアターゼ、パーオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど、また螢光物
質としてはフルオレツセインイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
などを使用することができるが、これらは例示し
たものに限らず、免疫学的測定方法に使用し得る
ものであれば、他のものでも使用できる。
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造
方法については、先に特許出願された（昭和59年
４月17日出願：発明の名称“モノクローナル抗
体、ハイブリドーマ細胞及びモノクローナル抗体
の製造方法”特願昭59−75778（特開60−
222426））。
方法については、先に特許出願された（昭和59年
４月17日出願：発明の名称“モノクローナル抗
体、ハイブリドーマ細胞及びモノクローナル抗体
の製造方法”特願昭59−75778（特開60−
222426））。
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造
方法については前記特許出願明細書に詳細に説明
されている通り、ヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーにおけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部
位以外の場所を特異的に認識して結合し得るモノ
クローナル抗体である。以下にその内容を簡単に
説明する。
方法については前記特許出願明細書に詳細に説明
されている通り、ヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーにおけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部
位以外の場所を特異的に認識して結合し得るモノ
クローナル抗体である。以下にその内容を簡単に
説明する。
≪モノクローナル抗体及びその製造方法≫
Ａ 抗原の単離、精製；
抗原に用いるヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーは、前記青木と諸井の方法によりヒト血漿中
より単離精製された。
ーは、前記青木と諸井の方法によりヒト血漿中
より単離精製された。
Ｂ ヒトα2−プラスミンインヒビターによるマウ
スの免疫； 雄Balb／ｃマウスを用いるが、他の系
（strains）のマウスを使用することもできる。
その際、免疫計画及びヒトα2−プラスミンイン
ヒビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに少量のヒトα2−プラスミン
インヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の
後、さらに数回静脈に投与した。最終免疫の数
日後に融合の為に脾臓細胞を取り出す。
スの免疫； 雄Balb／ｃマウスを用いるが、他の系
（strains）のマウスを使用することもできる。
その際、免疫計画及びヒトα2−プラスミンイン
ヒビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに少量のヒトα2−プラスミン
インヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の
後、さらに数回静脈に投与した。最終免疫の数
日後に融合の為に脾臓細胞を取り出す。
Ｃ 細胞融合
脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製する。それらの脾臓細胞を適当なラ
インからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞対骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１
の範囲である。約108個の脾臓細胞について0.5
〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。
濁液を調製する。それらの脾臓細胞を適当なラ
インからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞対骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１
の範囲である。約108個の脾臓細胞について0.5
〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。
細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られて
いるが、本発明では、P3−X63−Ag8−U1細
胞（以下P3−U1と略記する）〔Yelton，D.Eet
al.，Current Topics in Microbiolgy and
Immunology 81、１（1978）参照〕を用いた。
これは８−アザグアニン耐性の細胞ラインであ
り、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（hypoxanthine−
guanine phosphoribosyl transferase）が欠失
しており、それゆえにHAT（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）培地中では生存し
ない。また、この細胞ラインはそれ自体抗体を
分泌しない、いわゆる非分泌型である。
いるが、本発明では、P3−X63−Ag8−U1細
胞（以下P3−U1と略記する）〔Yelton，D.Eet
al.，Current Topics in Microbiolgy and
Immunology 81、１（1978）参照〕を用いた。
これは８−アザグアニン耐性の細胞ラインであ
り、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（hypoxanthine−
guanine phosphoribosyl transferase）が欠失
しており、それゆえにHAT（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）培地中では生存し
ない。また、この細胞ラインはそれ自体抗体を
分泌しない、いわゆる非分泌型である。
好ましい融合促進剤としては、例えば平均分
子量が1000〜4000のポリエチレングリコールを
有利に使用できるが、この分野で知られている
他の融合促進剤を使用することもできる。
子量が1000〜4000のポリエチレングリコールを
有利に使用できるが、この分野で知られている
他の融合促進剤を使用することもできる。
Ｄ 融合した細胞の選択；
別の容器内（例えばマイクロタイタープレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞
および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合
の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば前記HAT培地）が使
用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫
細胞は死滅する。また未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なのである一定期間後（約１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞
および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合
の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば前記HAT培地）が使
用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫
細胞は死滅する。また未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なのである一定期間後（約１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。
Ｅ 各容器中のα2−プラスミンインヒビターに対
する抗体の確認； かくしてハイブリドーマが細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒトα2−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体について酵素免疫
定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay）によりスクリーニングする。
する抗体の確認； かくしてハイブリドーマが細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒトα2−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体について酵素免疫
定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay）によりスクリーニングする。
Ｆ 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
クロー化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化
すると、抗体は２つの異なつた方法で産生され
る。その第１の方法によればハイブリドーマ細
胞を一定時間適当な培地で培養することにより
その培養上清から、そのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によればハイブリドーマ細胞は
同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの腹
腔に注射することができる。一定時間後の宿主
動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリド
ーマ細胞の産出するモノクローナル抗体を得る
ことができる。
クロー化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化
すると、抗体は２つの異なつた方法で産生され
る。その第１の方法によればハイブリドーマ細
胞を一定時間適当な培地で培養することにより
その培養上清から、そのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によればハイブリドーマ細胞は
同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの腹
腔に注射することができる。一定時間後の宿主
動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリド
ーマ細胞の産出するモノクローナル抗体を得る
ことができる。
本発明の測定試薬においては、かゝるモノクロ
ーナル抗体を第１抗体或いは第２抗体のいずれか
に使用する。すなわち、前記モノクローナル抗体
は、不溶性担体に結合させて固定化抗体として使
用することもできるし、また標識物質を付けて標
識抗体としても使用することもできる。
ーナル抗体を第１抗体或いは第２抗体のいずれか
に使用する。すなわち、前記モノクローナル抗体
は、不溶性担体に結合させて固定化抗体として使
用することもできるし、また標識物質を付けて標
識抗体としても使用することもできる。
前記モノクローナル抗体と共に使用される他の
抗体としては、ヒトプラスミンを認識し、結合し
得るものであればよい。
抗体としては、ヒトプラスミンを認識し、結合し
得るものであればよい。
以上本発明によれば、プラスミン−α2−プラス
ミンインヒビター複合体を含む検体（例えばヒト
血漿）中のプラスミン−α2−プラスミンインヒビ
ター複合体の量を正確に且つ容易に測定すること
が可能である。
ミンインヒビター複合体を含む検体（例えばヒト
血漿）中のプラスミン−α2−プラスミンインヒビ
ター複合体の量を正確に且つ容易に測定すること
が可能である。
以下実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例 １
本実施例で使用した第１及び第２抗体は、本発
明者らが先に出願した明細書（昭和59年４月17日
付出願；発明の名称“モノクローナル抗体、ハイ
ブリドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方
法”特願昭59−75778（特開昭60−222426））に記
載された方法によつて得られた下記のものを使用
した。
明者らが先に出願した明細書（昭和59年４月17日
付出願；発明の名称“モノクローナル抗体、ハイ
ブリドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方
法”特願昭59−75778（特開昭60−222426））に記
載された方法によつて得られた下記のものを使用
した。
第１抗体
前記出願明細書の実施例３において得られた
抗体名“1B10G11”微工研条寄第1782号
（FERMBP−1782）を使用し、これを下記の
如く不溶性担体（マイクロタイタープレート）
に固定化させて用いた。この抗体はα2−プラス
ミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素
溶解作用の阻止部位（リアクテイブサイト）以
外の部位を特異的に認識し得るモノクローナル
抗体である。
抗体名“1B10G11”微工研条寄第1782号
（FERMBP−1782）を使用し、これを下記の
如く不溶性担体（マイクロタイタープレート）
に固定化させて用いた。この抗体はα2−プラス
ミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素
溶解作用の阻止部位（リアクテイブサイト）以
外の部位を特異的に認識し得るモノクローナル
抗体である。
第２抗体
ウサギをヒトプラスミノーゲンで免疫して得
たヒトプラスミノーゲンに対する抗血清より抗
体成分を精製し、アルカリ性フオスフアターゼ
で標識化して使用した。
たヒトプラスミノーゲンに対する抗血清より抗
体成分を精製し、アルカリ性フオスフアターゼ
で標識化して使用した。
濃度20μg／mlのヒトα2−プラスミンインヒビ
ターを特異的に認識するモノクローナル抗体
（1B10G11）をマイクロタイタープレート上に４
℃で一晩放置し固定化した。これに１％牛血清ア
ルブミンを含む緩衝液（15mM Na2CO3、35mM
NaHCO3、3mM NaN3）を加え室温で４時間放
置した後、１％牛血清アルブミンを含む洗浄液
（20mMリン酸緩衝液、0.135M NaCl、2mM
NaN3、0.05％Tween20）で５回洗浄した。次に
希釈用溶液（20mMリン酸緩衝液、0.135M
NaCl）で種々の濃度となるように希釈したプラ
スミン−α2−プラスミンインヒビター複合体を加
え、室温で４時間放置した。
ターを特異的に認識するモノクローナル抗体
（1B10G11）をマイクロタイタープレート上に４
℃で一晩放置し固定化した。これに１％牛血清ア
ルブミンを含む緩衝液（15mM Na2CO3、35mM
NaHCO3、3mM NaN3）を加え室温で４時間放
置した後、１％牛血清アルブミンを含む洗浄液
（20mMリン酸緩衝液、0.135M NaCl、2mM
NaN3、0.05％Tween20）で５回洗浄した。次に
希釈用溶液（20mMリン酸緩衝液、0.135M
NaCl）で種々の濃度となるように希釈したプラ
スミン−α2−プラスミンインヒビター複合体を加
え、室温で４時間放置した。
その後前記洗浄液で５回洗浄し、さらにアルカ
リ性フオスフアターゼで標識したヒトプラスミノ
ーゲンに対する抗体を350ng／mlの濃度で加え４
℃で一晩放置した。前記洗浄液で洗浄後アルカリ
性フオスフアターゼ基質溶液を１mg／mlの濃度で
加え、ELISA ANALYZER〔東洋測器(株)製ETY
−96〕で405nmの波長における１分間当りの吸光
度変化を測定した。その結果を添付図面第１図に
示した。この図面からプラスミン−α2−プラスミ
ンインヒビター複合体の濃度と吸光度変化との関
係は直線関係になることが理解できる。従つてα2
−プラスミンインヒビターにおけるリアクテイブ
サイト以外の場所を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体をサンドイツチ法における一つの抗体と
して使用することによつて、プラスミン−α2−プ
ラスミンインヒビター複合体の量を容易に測定す
ることができる。
リ性フオスフアターゼで標識したヒトプラスミノ
ーゲンに対する抗体を350ng／mlの濃度で加え４
℃で一晩放置した。前記洗浄液で洗浄後アルカリ
性フオスフアターゼ基質溶液を１mg／mlの濃度で
加え、ELISA ANALYZER〔東洋測器(株)製ETY
−96〕で405nmの波長における１分間当りの吸光
度変化を測定した。その結果を添付図面第１図に
示した。この図面からプラスミン−α2−プラスミ
ンインヒビター複合体の濃度と吸光度変化との関
係は直線関係になることが理解できる。従つてα2
−プラスミンインヒビターにおけるリアクテイブ
サイト以外の場所を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体をサンドイツチ法における一つの抗体と
して使用することによつて、プラスミン−α2−プ
ラスミンインヒビター複合体の量を容易に測定す
ることができる。
添付図面は、本発明の実施例におけるプラスミ
ン−α2−プラスミンインヒビター複合体の濃度と
吸光度変化との関係を示すものである。
ン−α2−プラスミンインヒビター複合体の濃度と
吸光度変化との関係を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ サンドイツチ法による免疫学的測定試薬にお
いて、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体との
いずれか一方が、ヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーにおけるプラスミンの線維素溶解作用を阻止す
る部位以外の場所を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体であり、他の一方がヒトプラスミノーゲ
ンに対する抗体であることを特徴とする、ヒトα2
−プラスミンインヒビターに対するモノクローナ
ル抗体を用いたプラスミン−α2−プラスミンイン
ヒビター複合体の免疫学的測定試薬。 ２ 該不溶性担体が、プラスチツク容器、プラス
チツクビーズ、ラテツクスビーズ、ガラスビーズ
又は金属粒子である第１項記載の測定試薬。 ３ 該標識抗体が、酵素、放射性同位元素又は螢
光物質で標識化された抗体である第１項記載の測
定試薬。 ４ 不溶性担体に結合した抗体と標識抗体を含
み、これら抗体のいずれか一方はα2−プラスミン
インヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解作
用を阻止する部位以外の場所を特異的に認識する
モノクローナル抗体であり、他の一方はヒトプラ
スミノーゲンを抗原として認識して結合する抗体
であり、これに(a)溶解剤、(b)洗浄剤及び酵素で標
識化した抗体を用いる場合には、(c)酵素活性を測
定するための基質及びその反応停止剤を組合せて
なる免疫学的測定のためのキツト。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15399384A JPS6134465A (ja) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキツト |
| EP19850109227 EP0169549B1 (en) | 1984-07-26 | 1985-07-23 | Immunological determination of human plasmin/alpha2-plasmin inhibitor |
| DE19853586577 DE3586577T2 (de) | 1984-07-26 | 1985-07-23 | Immunologische bestimmung von menschlichem plasmin/alpha-2-plasmin-hemmstoff. |
| DK339985A DK339985A (da) | 1984-07-26 | 1985-07-25 | Immunologisk bestemmelse af humanplasmin/alfa2-plasmininhibitor samt reagenssystem til brug herved |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15399384A JPS6134465A (ja) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキツト |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6134465A JPS6134465A (ja) | 1986-02-18 |
| JPH0441783B2 true JPH0441783B2 (ja) | 1992-07-09 |
Family
ID=15574568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15399384A Granted JPS6134465A (ja) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | ヒトα↓２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6134465A (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH642458A5 (en) * | 1980-04-25 | 1984-04-13 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| DE3016575A1 (de) * | 1980-04-30 | 1981-11-05 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren zur immunologischen bestimmung von enzymen, mittel zur durchfuehrung des verfahrens und seine verwandung |
| DE3172143D1 (en) * | 1980-09-30 | 1985-10-10 | Cornell Res Foundation Inc | Process for determining inhibitor-enzyme complexes |
| JPS57136165A (en) * | 1981-02-18 | 1982-08-23 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Immunological measuring reagent |
| JPS58148963A (ja) * | 1982-03-02 | 1983-09-05 | Maruko Seiyaku Kk | サンドウイツチ法によるヒト体液中のアルフア−−１−アンチトリプシン・トリプシン結合物測定用試薬 |
-
1984
- 1984-07-26 JP JP15399384A patent/JPS6134465A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6134465A (ja) | 1986-02-18 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
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