JPS6137909B2

JPS6137909B2 -

Info

Publication number: JPS6137909B2
Application number: JP309080A
Authority: JP
Inventors: Ryohei Yamamoto; Kenichi Takami; Masaaki Yokoe; Tadahiko Inukai
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1980-01-17
Filing date: 1980-01-17
Publication date: 1986-08-26
Also published as: JPS56102788A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はペニシリウム属に属するベタインアル
デヒド脱水素酵素生産菌を培養し、得られた培養
菌体等の培養物からベタインアルデヒド脱水素酵
素を取得する方法に関するものである。ベタインアルデヒド脱水素酵素は、ベタインア
ルデヒドをNAD（Ｐ）存在下で酸化もしくは脱
水素し、ベタインを生成する反応を触媒する酵素
として知られており、その用途としてコリンエス
テラーゼ活性の測定あるいはレシチンの定量に供
せられうる。従来ベタインアルデヒド生産菌としてはシユー
ドモナス・エルギノーサＡ−16（Pseudomonas
aeruginosa Ａ−16）〔アグリカルチユアル・アン
ド・バイオロジカルケミストリー（Agricaltual
and Biological Chemistry）40巻1743〜1749頁
（1976年）に記載〕が知られる程度で、工業的生
産においても見るべきものはなかつた。本発明者等は、ベタインアルデヒド脱水素酵素
の工業的安価な製造法を求めて、広く微生物をス
クリーニングした結果、ペニシリウム属に属する
多くの菌株が高いベタインアルデヒド脱水素酵素
生産能を有することを見い出し本発明を完成し
た。本発明は、ペニシリウム属に属するベタインア
ルデヒド脱水素酵素生産菌を培養し、培養物から
ベタインアルデヒド脱水素酵素を採取することを
特徴とするベタインアルデヒド脱水素酵素の製造
法である。本発明における使用菌はペニシリウム属に属す
るベタインアルデヒド脱水素酵素生産菌である
が、例示すればの通りである。ペニシリウム・オクロ−クロロンNo.79
（Penicillium ochro−chloron No.79）ペニシリウム・カルネセンスIFO7955）
（Penicillium carnescens IFO7955）ペニシリウム・ジヤンシネラムIFO7905
（Penicillium janthinellum IFO7905）ペニシリウム・ジヤンシネラムIFO8070
（Penicillium janthinellum IFO8070）ペニシリウム・シトリナムIFO6026
（Penicillium citrinum IFO6026）このうち、Penicillium ochro−chloron No.79
は新たに土壌から分離された菌株で微工研に
FERM−Ｐ No.5303として寄託されている。次に、Penicillium ochro−chloron No.79、
FERM−Ｐ No.5303の菌学的性質を示す。即
ち、本菌株の麦芽エキス寒天培地およびツアペツ
ク寒天培地における形態的性質を（）に、生育
状態を（）に、生理的性質を（）に示す。 () 形態的性質分生子柄は気生菌糸または基生菌糸から生じ
多くは10〜150μ×２〜３μであるが500μに達
するものである。滑面またはやゝ粗面である。
非対称に分岐し、基底分枝（ブランチ）・基底
担子（メトレ）・フイアライドからなる分生子
構造を形成する。基底分枝と基底担子は広角度
に散開する。基底担子は10〜20μ×２〜３μ、
フイアライドはとつくり形で７〜11μ×２μで
ある。分生子はフイアライドから形成され連鎖
するが、柱状にはならない。亜球形〜楕円形で
一端がとがる。表面はわずかに粗面で2.8〜3.2
μ×2.0〜2.7μである。子のう胞子と菌核は形
成しない。 () 生育状態各培地での生育は23℃において10〜12日間培
養した結果である。ツアペツク寒天培地生育はやゝ遅く、コロニーの直径は30〜40
mm程度である。羊毛状。気生菌糸は白色〜黄
味白色である。分生子の形成は悪く灰味黄緑
色である。裏面はうす黄茶色である。水溶性
色素はない。麦芽エキス寒天培地よく生育しコロニーの直径は60〜70mmであ
る。羊毛状。気生菌糸はほぼ白色である。分
生子の形成は良く、灰味黄緑色である。裏面
はうす黄茶色〜にぶ黄色である。水溶性色素
はない。 () 生理的性質最適生育条件温度は30℃付近で、PHは４〜６である。生育の範囲７℃でわずかに生育する。37℃でよく生育
するが40℃では微弱で、45℃では生育しな
い。PH2.5〜PH９で生育する。分生子形成構造がフイアロ型分生子系に属し、
分生子柄の先端がペニシリ状となり、分生子が連
鎖するのでPenicillium属に分類される。Ａ
Manual of Penicilliaに従つて検索すると、分生
子形成構造が不規則に分岐し、基底分枝と基底担
子が広角度に散開し、フイアライドがとつくり形
であるので不対称体菌群の散開状亜群である。さ
らに分生子の色が灰味黄緑色であること、分生子
鎖がもつれた状態で、柱状ではないこと、コロニ
ーがなわ状ではないこと等によりPenicillium
janthinellum seriesに属する。しかも栄養菌糸お
よびコロニーの裏面が橙赤色・赤紫色に強く着色
しないこと、分生子柄が滑面またはやゝ粗面であ
ること、分生子がわずかに粗面であること、また
ツアペツク寒天培地および麦芽エキス寒天培地で
の生育の良否等により、菌株はPenicillium
ochro−chloronに属するものと同定された。
Raper、K.B.and C.Thom：Ａ Manual of
Penicillia、Hafner Publisning Co.、New York
and London（1968）本発明においてベタインアルデヒド脱水素酵素
生産菌の培養には、通常の栄養培地に、コリンあ
るいはコリン含有物を加えたものを用いる。コリンは炭素源、窒素源のいずれとしても利用
されるが、更に炭素源としてブドウ糖、デンプン
等、窒素源として硝酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、燐酸−アンモニウム、肉エキス、酵母エ
キス等を加えてもよい。無機塩としては燐酸二カリウム、硫酸マグネシ
ウム、食塩等を使用する。本発明に好適な培地成分の一例をあげるとコリ
ン塩酸塩１％、硝酸アンモニウム0.3％、リン酸
二カリウム0.2％、食塩0.1％、硫酸マグネシウム
0.05％、酵母エキス0.3％であり、なお培養条件
としては、温度は20〜40℃で好気的に１〜４日間
培養するのがよい。培地のPHは５〜７が望まし
い。培養で得られた菌体は洗浄後、破砕し、粗酵素
液を調製するが、菌体の破砕法としては、ガラス
ビーズ、活性アルミナ等と菌体を混合し磨砕する
方法、その他、超音波、水圧、凍結融解などの物
理的な力を利用する方法などいずれを用いてもよ
い。これらの方法によつて得られた菌体破砕物に水
または適当な緩衝液を加え、懸濁液とした後、遠
心分離または過によつて得られる上澄液又は
液を粗酵素液とする。こうして得られた粗酵素液はベタインアルデヒ
ド脱水素酵素以外に種々の酵素あるいは夾雑蛋白
質を含んでいる。これらの夾雑物を除くには、塩
析、ゲル過、イオン交換クロマトグラフイ、電
気泳動などが単独又は組合せて行なわれる。次に本発明において得られるPenicillium
ochro−chloron No.79より得られるベタインアル
デヒド脱水素酵素の性質について述べる。なお他
の菌株より得られるベタインアルデヒド脱水素酵
素についても同様の性質を示す。 (1) 作用：電子受容体（NAD等）の存在下でベ
タインアルデヒドを酸化し、ベタインを生成す
る。 (2) 反応至適PH：本酵素の反応至適PHは８〜９の
間にある（第１図に示される）。 (3) 安定性：25℃で１時間置いた場合、PH６から
PH８で安定である（第２図に示される）。 (4) 活性測定法：0.1Mリン酸緩衝液（PH８）0.7
ml、NAD溶液（10mg/ml）0.05ml、0.1Mベタイ
ンアルデヒド0.025ml、酵素液0.025mlを１ml容
の石英セル内で混合し、25℃で340nｍの吸光
度の増加を測定する。この条件で毎分１μモル
のベタインアルデヒドを酸化し得る酵素量を１
単位とする。次に、本発明の試験例及び実施例を示す。試験例１表１に示す各菌株をコリン塩酸塩１％、硝酸ア
ンモニウム0.3％、リン酸二カリウム0.2％、食塩
0.1％、硝酸マグネシウム0.05％、酵母エキス0.3
％からなる培地で２日間通気撹拌培養し、培養菌
体をアルミナにて磨砕処理し、更にトリトンＸ−
100を含むｍＭ燐酸緩衝液（PH8.0）で抽出して得
られる抽出液100ml当りのベタインアルデヒド脱
水素酵素活性を調べ、その結果を表１に示す。

【表】

【表】実施例１ Penicillium ochro−chloron No.79、FERM−
Ｐ No.5303をコリン塩酸塩１％、リン酸二カリ
ウム0.2％、食塩0.1％、硫酸マグネシウム0.05％
酵母エキス0.3％からなる培地５で30℃℃、２
日間好気的に培養し、培養菌体を得た。この菌体
を10ｍＭリン酸緩衝液（PH８）に懸濁しダイノ・
ミルでガラスビーズによつて破砕した後、菌体破
砕物懸濁液に最終濃度0.2％のトリトンＸ−100を
加え、遠心分離によつて抽出液800mlを得た。抽
出液には0.200単位／mlのベタインアルデヒド脱
水素酵素が含まれていた。実施例２ Penicillium citrinum IFO6026をコリン塩酸塩
１％、硝酸アンモニウム0.3％、リン酸二カリウ
ム0.2％、食塩0.1％、酵母エキス0.3％からなる培
地10で培養し、得られた菌体を実施例１に準じ
て処理し抽出液1.5を得た。抽出液には0.150単
位／mlのベタインアルデヒド脱水素酵素が含まれ
ていた。実施例３ Penicillium ochro−chloron No.79、FERM−
Ｐ No.5303を実施例１に準じて５培養し、更
に実施例１と同様の方法で抽出液を得た。この抽
出液に硫安を加え、0.2飽和から0.6飽和の間で得
られる沈澱物を10ｍＭリン酸緩衝液（PH８）に溶
解し、ベタインアルデヒド脱水素酵素含有液100
mlを得た。この液には1.52単位／mlのベタインア
ルデヒド脱水素酵素が含まれていた。比活性は抽
出液の約４培にすることができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の製造法によつて得られるベタ
インアルデヒド脱水素酵素のPH活性曲線であり、
第２図は同じくPH安定性を示すものである。〇は酢酸緩衝液、●はリン酸緩衝液、△はトリ
ス−塩酸緩衝液、▲は炭酸ソーダ緩衝液を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１ペニシリウム属に属するベタインアルデヒド
脱水素酵素生産菌を培養し、培養物からベタイン
アルデヒド脱水素酵素を採取することを特徴とす
るベタインアルデヒド脱水素酵素の製造法。