JPH02265478A - 新規なザルコシンオキシダーゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は熱安定性に優れ、かつＫｍ値の小さい新規なザ
ルコシンオキシダーゼ及びその製法に関するものである
。

本発明の新規なザルコシンオキシダーゼは、血清、尿中
のクレアチン、クレアチニンの定にに用いられる。

（従来の技術） 従来からザルコシンオキシダーゼは、バチルス属（特開
昭５４−５２７８９号公報）、コリネバクテリウム属（
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＬＬ。

５９９、（１９８１））、シリンドロカルボン属（特開
昭５Ｅ３−９２７９０号公報）、アルスロバクタ−属（
特開Ｋｉ　５４−２８８９３号公報）、シュードモナス
属（特開昭８０−４３３７９号公報）等の菌株が生産す
ることが知られている。しかしながらいずれの菌株の生
産するザルコシンオキシダーゼも熱安定性が［・分でな
く、もしくはＫｒｎ値が大きく、実用１・０問題があっ
た。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは下記の背景を踏まえ、従来のザルコシンオ
キシダーゼよりも熱安定性に優れ、かつＫｍ値の小さい
、より実用的なザルコシンオキシダーゼを見い出そうと
試みた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは１−記問題点を解決するため鋭意研究を市
ねた結果、石用県加賀市内の土壌より分離した、アルス
ロバクタ−属に属すると同定された菌株、ＴＥ１８２Ｅ
ｌから従来のザルコシンオキシダーゼよりも熱安定性に
優れ、かつＫｍ値の小さいザルコシンオキシダーゼを見
い出した。

すなわち本発明は、下記性質■〜■を有する新規なザル
コシンオキシダーゼである。

■　下記の反応を触媒する。

ザルコシン＋Ｈ＊Ｏ＋０□→グリシン＋ホルムアルデヒ
ド＋Ｈ，０□ ■　安定ｐＨが６．５〜９．０付近である。

■　至適ｐＨが７．０〜８．５付近である。

■　熱安定性が約５５℃以ドである。

■　至適温度が４０〜５０℃付近である。

■　ザルコシンに対するＫｍ値が約２．８×１０−’Ｍ
である。

■　分子量が約６５，０００である（ゲルろ適法）。

また本発明は、Ｌ記性質■〜■を有する新規なザルコシ
ンオキシダーゼを産生ずるアルスロバクタ−属菌を栄養
培地にて培養し、該培養物から前記ザルコシンオキシダ
ーゼを採取することを特徴とする新規なザルコシンオキ
シダーゼの！！！ｌ去である。

本発明に用いる微生物は、」ユ記性質を有するザルコシ
ンオキシダーゼを産生しうるアルスロバクタ−属菌であ
って、好適な例としてはアルスロバクター−ＸＸピー（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、）　Ｔ　Ｅ　Ｌ　８
２６があげられる。アルスロバクタ−・エスピー（Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、）　Ｔ　Ｅ　１８２　Ｂ
は本発明者らが土壌中より新たに分離した菌株であり、
その菌学的性質は下記のとおりである。

（ａ）形能 （１）細胞の大きさ二〇、５〜０．７Ｘ１．０〜１０．
０／ＪＪの桿菌。

■　細胞の多形性：生活環にともなう多形性有り。

（：３）運動性二なし。

（２）胞子の有無：なし。

■　ダラム染色性：陽性。

■　抗酸性：陰性。

（ｂ）各培地における生育状態 （１）肉ｔ１−寒天甲板培養：３７℃、２４時間培養で
淡褐色円形のコロニーを形成する。表面はなめらかで鈍
い光沢をイ「シ、不透明である。

色素の生成はない。

■　肉汁寒天斜面培ａ：生育は良好で（１）に同じ。

＜３）肉汁液体培養：静置培養は生育悪く、振とう培養
にて良好に生育する。

（２）肉汁ゼラチン穿刺培４！ｉｉ：］一部のみ生育し
、層状に液化する。

■　リドマスミルク：全く変化しない。

（ｃ）生理的性質 （１）硝酸塩の還元：陽性。

（２）脱窒反応：ｌ１３性。

（３）ＭＲテスト：陰性。

（４）ＶＰテスト：ｇ３性。

（５）インドールの生成二つ性。

（６）硫化水素の生成二〇性。

（７）デンプンの加水分解：陽性。

（８）クエン酸の利用：シモン培地で陰性、クリステン
セン培地で陽性。

（９）無機窒素源の利用：アンモニウム塩は利用するが
弱い。硝酸塩はほとんど利用しない。

（１０）色素の生成：陰性。

（ＩＩ）ウレアーゼ：陽性。

（１２）オキシダーゼ：嶋性。

（３）カタラーゼ：陽性。

（１４）生育の範囲：生育ｐＨ域は５．０〜８．５、生
育温度域は１０〜４５℃。

（＋５）酸素に対する態度：好気性。

（ＩＧ）０−　Ｆテスト二〇（酸化） （１７）糖からの酸の生成 り一アラビノース １〕−キシロース　　　　　− ｌ〕−グルコース　　　　　＋ Ｄ−マンノース　　　　　− Ｄ−フラクトース ！〕−ガラクトース 麦芽糖（マルトース）　　＋ ７６糖（サブ力ロース）　＋ 乳糖（ラクトース） トレハロース　　　　　　＋ Ｄ−ソルビット　　　　　　＋ １）−マンニット　　　　　＋ イノジット グリセリン　　　　　　　十 デンプン　　　　　　　　　＋ １−記菌学的性質の同定のための実験法は主として長谷
用武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学会出版セ
ンター（１９６５年）によって行った。

また分類同定の基準として「バージイス・マニュアル・
オブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版（
１９７４年）を参考にした。

以にの菌学的性状における木菌ＴＥ１８２Ｂは生活環に
ともなう多形性が認められ、ダラム染色は陽性の無胞子
桿菌で、通常栄養培地に良好に生育し、極めて好気的で
あることより、アルスロバクタ−属に属するとみなされ
、アルスロバクター−ｘスビー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔ
ｅｒ　ｓ＋ｐ、）　Ｔ　Ｅ　１８２　Ｂと命名した。な
お木菌は工業技術院微生物り業技術研究所に、微−Ｌ研
菌寄第１０８３７号として寄託されている。

本発明の酵素を製造するにあたっては、１−記ザルコシ
ンオキシダーゼ生産菌を酵素を生産する通常の方法で培
養する。使用する培地組成としては使用菌株が資化しう
る炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適１
武含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも
使用できる。本発明においてはクレアチン又はクレアチ
ニン又はザルコシンを含有する培地で培養したときにザ
ルコシンオキシダーゼが最も収Ｍ良く得られる。培養は
通常振とう培養あるいは通気撹拌培養で行う。培ａ潟度
は３０℃〜４０℃で杼うことが好ましい。

これら以外の条件ドでも使用する菌株が生育すれば実施
できる。通常１〜２１１の培養期間で生育し、菌体内に
ザルコシンオキシダーゼが生成蓄積される。

本発明酵素の精製法は一般に使用されている精製法を用
いることができる。例えば抽出法には超ｎ波破砕、ガラ
スピーズを用いる機械的破砕、フレンチプレス、界面活
性剤、溶菌酵素などいずれを用いてもよい。さらに抽出
液については硫安やご硝などの塩析法、塩化マグネシウ
ムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやエ
チレンイミンポリマーなどの凝集法、熱処理、さらには
イオン交換クロマトグラフィーなどにより精製すること
ができる。

次に本発明のザルコシンオキシダーゼの活性測定法を示
す。９５ｍＭザルコシン、０．４７ｍＭ４−アミノアン
チピリン、２ｍＭフェノール、４．５Ｕ／ｍＱペルオキ
シダーゼ、０．０４５％トリトンＸ−１００を含む４８
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を調製した後、１
．０ｍ＋（！を試験管に分取し、３７℃で−を備加温す
る。適当な濃度の酵素液０．０５ａ＋Ｑを添加し、３７
℃、１０分間反応させ、次にこれに０．２５％ラウリル
硫酸すトリウム水溶液を添加して反応を停止させ、分光
光度計にて５００　ｎｍにおける吸光度変化と求める。

ザルコシンオキシダーゼの活性の表示は、１−、記条件
下で１分間にｌ”フィクロモルのＨ２Ｏ。を生成する酵
素活性を１！１１位（Ｕ）とする。

次に本発明の酵素の理化学的な性質について述べる。

（１）作用及び基質特異性 ザルコシンを酸化分解して、グリシン、ホルムアルデヒ
ドと過酸化水素を生成する反応を触媒する。なおザルコ
ミンに対するＫｍ値は３７℃、ｐＨ８，０（）リス塩酸
緩衝液）で約２．８Ｘ１０−Ｍである。

■　安定ｐＨ 本発明の酵素と０．１Ｍジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ５，５〜６．５）、０、ＩＭＫ−リン酸緩
衝液（ｐＨ６，５〜７．５）、Ｏ，１Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５〜８．５）、Ｏ，１Ｍグリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ８，５〜９．５）、０．１Ｍグリシ７−
ＮａＣＱ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，０〜１０．０）中
で２５℃、２４時間保温後、残存する酵素活性を測定し
た。その結果は第１図に示す通りであって、安定ｐＨは
６．５〜９．０付近であった。

（３）　　至適ｐＨ Ｏ，ＩＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ５，５〜７．５）、０
．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５〜８．５）　、Ｏ
，１Ｍグリシ７−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８，０〜９．０
）、０．１Ｍグリシ７−ＮａＣＱ−ＮａＯＨ！衝液（ｐ
Ｈ９，０〜１０．０）中での酵素活性を測定した。その
結果は第２図に示す通りであって、至適ｐＨは７．０〜
８．５付近であった。

（Φ　熱安定性 本発明の酵素を５０ｍＭＫ−！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）中で２５〜６０℃、１０分間保温した後、残存する
酵素活性を測定した。

その結果は第３図に示す通りであって約５５℃まで安定
であった。

■　至適温度 ２５〜６０℃の各温度における酵素活性を測定した。そ
の結果は第４図に示す通りであって、至適温度は４０〜
５０℃付近であった。

■　分子噛 ＨＰＬＣ用カラムＡｓａｈｉｐａｋ　　ＧＦＡ−５０（
旭化成Ｊ−業製）を用いたゲルろ適法を行った結果、分
子頃は約６５．０００であった。

（実施例） 以ド、実施例をあげ本発明を具体的に示す。

実施例１ ザルコシン０．５％、クレアチ７０．５％、肉エキス０
．３％、ポリペプトン０．３％、酵１：Ｌエキス０．３
％、ＫＨ２ＰＯ，Ｏ，・１％、Ｋ２ＨＰＯ，０，２２％
、Ｍｇ５Ｏｎ・７Ｈ２００，０５％を含む培地（ｐＨ７
、０）　５　ｍＱを３０、Ｑ容試験管に移し、１２１’
Ｃ１１５分間オートクレーブ殺菌を行なった。種菌とし
てアルスロバクタ−・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔ
ｅｒ　ｓｐ、）　Ｔ　Ｅ　１８２６（微−［研菌寄第１
０８３７号）を１１金耳植菌し、３７℃で１６時間娠と
う培養し、種培ａ岐とした。次に同培地５００　ｒａＱ
を２Ｑ容坂［１フラスコに移し、１２１℃、１５分間オ
ートクレーブを行った。これに種培養液５−を移し、３
７℃で２４時間振とう培養した。培養終了時のザルコシ
ンオキシダーゼ活性は０．３Ｕ／ｍＱであった。

培養液５００　ｙａＱを遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ
Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）５０＋ｍＯにて懸濁し
た。超音波破砕機（海上電気製、１９ＫＨｚ）にて２０
分間処理し、遠心分離にてその上清液４５−を得た。硫
酸アンモニウム２２ｇを添加、溶解し、遠心分離にて塩
析沈殿物を得た。これを５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）２５−にて懸濁し、遠心分離にて七清液を得
た。上清液を５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液にて平衡化した
セファデックスＧ−２５（ファルマシア製）で脱塩を行
なった。次に同級衝岐にて・１４衡化したＤＥＡＥ−セ
フｒロースＣＬ−６Ｂ、（ファルマシア製）カラｌ、ク
ロマトグラフィーに供し、０〜０．４ＭＮａＣＱ容出画
分にザルコシンオキシダーゼ酵素活性を得た。溶出液を
５５℃、１時間熱処理した後、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）にて平衡化したセファデックスＧ−２
５（ファルマシア製）で脱塩を行った。その結果６５Ｕ
の酵素が得られた。得られた酵素の理化学的性質は前述
の通りであった。

比較例１ 比較のために先行技術文献に記載されているザルコシン
オキシダーゼの理化学的性質を第１表を示す。

以ド余自 （発明の効果） 本発明では熱安定性に優れ、かつＫｍ値の小さい新規な
ザルコシンオキシダーゼが（りられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のザルコシンオキシダーゼのｐＨ安定性
を示す。 第２図は本発明のザルコシンオキシダーゼの至適ｐＨを
示す。 第３図は本発明のザルコシンオキシダーゼの熱安定性を
示す。 第４図は本発明のザコシンオキシダーゼの至適温度を示
す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記性質［１］〜［７］を有する新規なザルコシ
   ンオキシダーゼ。 ［１］下記の反応を触媒する。 ザルコシン＋Ｈ＿２Ｏ＋Ｏ＿２→グリシン＋ホルムアル
   デヒド＋Ｈ＿２Ｏ＿２ ［２］安定ｐＨが６．５〜９．０付近である。 ［３］至適ｐＨが７．０〜８．５付近である。 ［４］熱安定性が約５５℃以下である。 ［５］至適温度が４０〜５０℃付近である。 ［６］ザルコシンに対するＫｍ値が約２．８×１０＾−
   ＾３Ｍである。 ［７］分子量が約６５，０００である（ゲルろ過法）。
2. （２）下記性質［１］〜［７］を有する新規なザルコシ
   ンオキシダーゼを産生するアルスロバクター属菌を栄養
   培地にて培養し、該培養物から前記ザルコシンオキシダ
   ーゼを採取することを特徴とする新規なザルコシンオキ
   シダーゼの製法。 ［１］下記の反応を触媒する。 ザルコシン＋Ｈ＿２Ｏ＋Ｏ＿２→グリシン＋ホルムアル
   デヒド＋Ｈ＿２Ｏ＿２ ［２］安定ｐＨが６．５〜９．０付近である。 ［３］至適ｐＨが７．０〜８．５付近である。 ［４］熱安定性が約５５℃以下である。 ［５］至適温度が４０〜５０℃付近である。 ［６］ザルコシンに対するＫｍ値が約２．８×１０＾−
   ＾３Ｍである。 ［７］分子量が約６５，０００である（ゲルろ過法）。