JPS6140220A - ソマトメジンの製造法 - Google Patents
ソマトメジンの製造法Info
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- JPS6140220A JPS6140220A JP16326784A JP16326784A JPS6140220A JP S6140220 A JPS6140220 A JP S6140220A JP 16326784 A JP16326784 A JP 16326784A JP 16326784 A JP16326784 A JP 16326784A JP S6140220 A JPS6140220 A JP S6140220A
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- JP
- Japan
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- somatomedin
- medium
- culture
- producing
- cells
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はツマセメジンの新規な製造法に関する。
さらに詳しくは、ソマトメジンを産生ずる能力を有する
ヒト下垂体細胞株を動物細胞培養培地に培養し、生成し
たソマトメジンを採取することを特徴とするソマトメジ
ンの製造法に関する。
ヒト下垂体細胞株を動物細胞培養培地に培養し、生成し
たソマトメジンを採取することを特徴とするソマトメジ
ンの製造法に関する。
従来の技術
ソマトメジン類は一群のポリペプチド性の細胞増殖因子
として知られており、成長ホルモンによる個体の成長は
成長ホルモンが直接骨や軟骨に作用するのではなく、ソ
マトメジン類を介して行われるものと考えられている。
として知られており、成長ホルモンによる個体の成長は
成長ホルモンが直接骨や軟骨に作用するのではなく、ソ
マトメジン類を介して行われるものと考えられている。
現在までに確認されているソマトメジン類としては、ソ
マトメジン−Ａ （Ｆｒｙｋｌｕｎｄら、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
マトメジン−Ａ （Ｆｒｙｋｌｕｎｄら、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｎ＋ｏｎ、＋第６
１巻、９５７−９６２頁。
１巻、９５７−９６２頁。
１９７４年）、ソマトメジン−Ｃ（Ｓｖｏｂｏｄａら。
Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ、第１９巻、７９０−７
９７頁、 １９８０年）、イジスリン様成長因子（ｉ
ｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ、
以下ｒｌＧＦＪという）−１および■（Ｒｉｎｄｅｒｋ
ｎｅｃｈｔら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、＋第２５
３巻。
９７頁、 １９８０年）、イジスリン様成長因子（ｉ
ｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ、
以下ｒｌＧＦＪという）−１および■（Ｒｉｎｄｅｒｋ
ｎｅｃｈｔら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、＋第２５
３巻。
２７６９−２７７６頁、 １９７８年、およびＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ、、第８９巻、２８３−２８６頁、 １９７
８年）、および細胞増殖促進因子（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ −ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ。
Ｌｅｔｔ、、第８９巻、２８３−２８６頁、 １９７
８年）、および細胞増殖促進因子（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ −ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ。
以下ｒＭｓＡＪという） ’ （Ｍａｒｑｕａｒｄｔら
。
。
Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｏ＋、＋第 ２５６巻、 ６
８５９−６８６５頁、 １９８１年）が知られている
。しかし、これらソマトメジン類の理化学的、生物学的
性質は依然として不明の部分も多く、最近ではソマトメ
ジン−ＣとＩＧＦ−１は同一物質であると考えられてい
る。
８５９−６８６５頁、 １９８１年）が知られている
。しかし、これらソマトメジン類の理化学的、生物学的
性質は依然として不明の部分も多く、最近ではソマトメ
ジン−ＣとＩＧＦ−１は同一物質であると考えられてい
る。
ソマトメジン類の共通の性質としては、（１）血清中の
濃度は成長ホルモン量に依存している、（２）多くの組
織に対してインスリン様活性（脂肪組織におけるグルコ
ース酸化の促進、脂肪合成など）を示す、（３） 軟
骨組織のプロテオグリカンへの硫酸基の取り込みを促進
する、（４）線維芽綱胞を増殖させる、（５） 血中
では大分子の結合蛋白と結合して存在する、（６）
酸および熱に対して安定である、ことが知られている。
濃度は成長ホルモン量に依存している、（２）多くの組
織に対してインスリン様活性（脂肪組織におけるグルコ
ース酸化の促進、脂肪合成など）を示す、（３） 軟
骨組織のプロテオグリカンへの硫酸基の取り込みを促進
する、（４）線維芽綱胞を増殖させる、（５） 血中
では大分子の結合蛋白と結合して存在する、（６）
酸および熱に対して安定である、ことが知られている。
−またソマトメジン類のその他の理化学的性質は第１表
に示すようなことが知られている。
に示すようなことが知られている。
第１表
ソマトメジン類の体内における産生器官は未だ明確では
ないが、肝臓が主な産生器官であるとの見解が一般的で
ある。そこで肝臓の組織培養ないしは細胞培養を行い、
その培養上清にソマトメジン類の生成を見いだした報告
がいくつかある。例えば、Ｂｉｎｏｕｘらは正常ラット
肝臓の組織培養を行い培養液中にソマトメジン類に特徴
的な生物学的活性であるニワトリ胚軟骨細胞への硫酸基
のとりごみを促す活性を見いだし、かつソマトメジン−
ＡやＩＧＦ−１をリガンドとしたプロティン・バインデ
ィング・アッセイ （ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｓｓａｙ ）により交叉性を確認している（ Ｂｉｎ
ｏｕｘら；＾ｅｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、第９３
巻、７３−８２頁、 １９８０年、同第９３巻、８３
−９０頁、 １９８０年、および同第９９巻、４２２−
４３０頁、 １９８２年）。Ｓｈｉｍｐｆｆらは正常ヒ
ト肝臓及び結合組織の組織培養によりＢｉｎｏｕｘらと
同様のニワトリ胚軟骨への硫酸基の取り込み活性を見い
だし、かつヒト成長ホルモンの添加によりその活性が上
昇すると報告した（Ｓｈｉ＋ａｐｆｆら； ＡｃｔａＥ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、＋第９８＠、 ２４−２８頁、
１９８１年）、。
ないが、肝臓が主な産生器官であるとの見解が一般的で
ある。そこで肝臓の組織培養ないしは細胞培養を行い、
その培養上清にソマトメジン類の生成を見いだした報告
がいくつかある。例えば、Ｂｉｎｏｕｘらは正常ラット
肝臓の組織培養を行い培養液中にソマトメジン類に特徴
的な生物学的活性であるニワトリ胚軟骨細胞への硫酸基
のとりごみを促す活性を見いだし、かつソマトメジン−
ＡやＩＧＦ−１をリガンドとしたプロティン・バインデ
ィング・アッセイ （ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｓｓａｙ ）により交叉性を確認している（ Ｂｉｎ
ｏｕｘら；＾ｅｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、第９３
巻、７３−８２頁、 １９８０年、同第９３巻、８３
−９０頁、 １９８０年、および同第９９巻、４２２−
４３０頁、 １９８２年）。Ｓｈｉｍｐｆｆらは正常ヒ
ト肝臓及び結合組織の組織培養によりＢｉｎｏｕｘらと
同様のニワトリ胚軟骨への硫酸基の取り込み活性を見い
だし、かつヒト成長ホルモンの添加によりその活性が上
昇すると報告した（Ｓｈｉ＋ａｐｆｆら； ＡｃｔａＥ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、＋第９８＠、 ２４−２８頁、
１９８１年）、。
１［ａｇａｅｍａらは単離精製したラット肝実質細胞の
初代単層培養を行い、その培養上清にソマトメジン−へ
の存在を報告している（ Ｋａｇａｗａら；＾ｃｔａＥ
ｒ＋ｄｏｃｒｉｎｏ１．＋第１０３巻、 ３８５−３９
０頁、 １９８３年）。
初代単層培養を行い、その培養上清にソマトメジン−へ
の存在を報告している（ Ｋａｇａｗａら；＾ｃｔａＥ
ｒ＋ｄｏｃｒｉｎｏ１．＋第１０３巻、 ３８５−３９
０頁、 １９８３年）。
また、杉本はヒト肝臓癌細胞をマウスなどに移植して増
殖せしめ、これよりＭＳＡを得る方法を開示している（
特開昭５７−１１４５２４号公報）、さらに肝臓以外の
組織又は細胞によるソマトメジン類の産生に関する報告
としては、ある種のガン細胞（Ｈｙｏｄｏら、 Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、 Ｍｅｔａｂ、
＋第４４巻、 １１７５−１１８４頁、 １９７７
年、およびＤｅ Ｌｉ１ｒｃｏら。
殖せしめ、これよりＭＳＡを得る方法を開示している（
特開昭５７−１１４５２４号公報）、さらに肝臓以外の
組織又は細胞によるソマトメジン類の産生に関する報告
としては、ある種のガン細胞（Ｈｙｏｄｏら、 Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、 Ｍｅｔａｂ、
＋第４４巻、 １１７５−１１８４頁、 １９７７
年、およびＤｅ Ｌｉ１ｒｃｏら。
Ｎａｔｕｒｅ、第２７２巻、 ３５Ｂ−３５８頁、 １
９７８年）、ヒト線維芽細胞（Ａｔｋｉｎｓｏｎら、
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 、第１０６巻、 ２００
６−２０１２頁、 １９８０年、およびＣｌｅｍｎ＋
ｏｎｓら＊ Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、第
６７巻、１０−１９頁、 １９８１年）、およびラット
の下垂体組織並びに脳の色々な組織（Ｂｉｎｏｕｘら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、、第１２４巻、１７Ｂ−１８
４頁、 １９８１年）などによる生産が知られている。
９７８年）、ヒト線維芽細胞（Ａｔｋｉｎｓｏｎら、
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 、第１０６巻、 ２００
６−２０１２頁、 １９８０年、およびＣｌｅｍｎ＋
ｏｎｓら＊ Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、第
６７巻、１０−１９頁、 １９８１年）、およびラット
の下垂体組織並びに脳の色々な組織（Ｂｉｎｏｕｘら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、、第１２４巻、１７Ｂ−１８
４頁、 １９８１年）などによる生産が知られている。
発明が解決しようとする問題点
ソマトメジン類は特定の生成、貯蔵器官を持たず、生成
されると直ちに血中に分泌されるため、ソマトメジン類
は主に血液を出発原料としてこれから分離、採取されて
おり、原料数トンかられずか数■のソマトメジン類しか
得られない。従ってソマトメジン類の入手はきわめて困
難な状況にあり、ヒトの疾病の診断、予防、治療などへ
の応用を研究する上で大きな障害となっている。また前
述のように種々生体組織またはその細胞を使用したソマ
トメジン類の生産が報告されているが、未だその生産量
は十分ではなく、かつそこで得られたソマトメジン類の
性質は解明されているとは言えない場合が多い。例えば
、前述のＢｉｎｏｕｘらによるラット下垂体の組織培養
により生産されるソマトメジンはＩＧＦであるとされて
いるが、その生物学的活性の記載はなく、また一般にこ
の先行技術におけるような組織培養では使用される細胞
は継代できず、−回限りであることが多く、がっ増殖率
が低くて工業的な生産には不向きであるとされている。
されると直ちに血中に分泌されるため、ソマトメジン類
は主に血液を出発原料としてこれから分離、採取されて
おり、原料数トンかられずか数■のソマトメジン類しか
得られない。従ってソマトメジン類の入手はきわめて困
難な状況にあり、ヒトの疾病の診断、予防、治療などへ
の応用を研究する上で大きな障害となっている。また前
述のように種々生体組織またはその細胞を使用したソマ
トメジン類の生産が報告されているが、未だその生産量
は十分ではなく、かつそこで得られたソマトメジン類の
性質は解明されているとは言えない場合が多い。例えば
、前述のＢｉｎｏｕｘらによるラット下垂体の組織培養
により生産されるソマトメジンはＩＧＦであるとされて
いるが、その生物学的活性の記載はなく、また一般にこ
の先行技術におけるような組織培養では使用される細胞
は継代できず、−回限りであることが多く、がっ増殖率
が低くて工業的な生産には不向きであるとされている。
本発明は容易に継代可能でかつ増殖速度の速いヒトの組
織より樹立された細胞株を用いてソマトメジンを大量に
生産することを目的とする。
織より樹立された細胞株を用いてソマトメジンを大量に
生産することを目的とする。
問題を解決するための手段
本発明者らはソマトメジン類を大量かつ容易に生産する
方法について、細胞培養技術を駆使して鋭意研究を重ね
た結果、ヒト下垂体良性腫瘍組織から樹立された１８−
５４．ＳＦｌ［胞株がその培養上清中にソマトメジン様
の活性を有する物質を産生ずることを見いだし、本発明
を完成するに至１ −た・ 本発明で用いるヒト下垂体細胞株はヒト下垂体組織より
当分野における常套手段により樹立された細胞株であり
、好ましい例としてはヒト下垂体良性腫瘍組織より樹立
された細胞株、特に好ましくはヒト下垂体良性腫瘍組織
より樹立された１８−５４．ＳＦ細胞株が挙げられる。
方法について、細胞培養技術を駆使して鋭意研究を重ね
た結果、ヒト下垂体良性腫瘍組織から樹立された１８−
５４．ＳＦｌ［胞株がその培養上清中にソマトメジン様
の活性を有する物質を産生ずることを見いだし、本発明
を完成するに至１ −た・ 本発明で用いるヒト下垂体細胞株はヒト下垂体組織より
当分野における常套手段により樹立された細胞株であり
、好ましい例としてはヒト下垂体良性腫瘍組織より樹立
された細胞株、特に好ましくはヒト下垂体良性腫瘍組織
より樹立された１８−５４．ＳＦ細胞株が挙げられる。
１８−５４゜ＳＦ細胞株の取得方法は−ｙｃｈｅらの報
告に記載されている（Ｗｙｃｈｅら； Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、第１０４巻。
告に記載されている（Ｗｙｃｈｅら； Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、第１０４巻。
１７６５−１７７３頁、 １９７９年）。即ち、ヒト末
端肥大症患者から生検により下垂体の上皮細胞組織を得
、これを形態的にいくつがのクラスに分け、得られた一
つのクローンを１２．５％馬血清および２．５％牛脂児
血清を含むＧＩＢ培地（グランド・アイランド・バイオ
ロジカル社製）にて５４代継代培養した。
端肥大症患者から生検により下垂体の上皮細胞組織を得
、これを形態的にいくつがのクラスに分け、得られた一
つのクローンを１２．５％馬血清および２．５％牛脂児
血清を含むＧＩＢ培地（グランド・アイランド・バイオ
ロジカル社製）にて５４代継代培養した。
次いで、血清を含まないクーン改変Ｆ−１２培地（Ｃｏ
ｏｎ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆ −１２培地、以下ｒ
ＣＦ−１２培地」という、ＫＣバイオロジカル社製）に
て継代培養した。このようにして得られた１８−５４、
ＳＦ細胞株はプロラクチンを作ることがら下垂体細胞に
間違いないことが確認された。
ｏｎ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆ −１２培地、以下ｒ
ＣＦ−１２培地」という、ＫＣバイオロジカル社製）に
て継代培養した。このようにして得られた１８−５４、
ＳＦ細胞株はプロラクチンを作ることがら下垂体細胞に
間違いないことが確認された。
１８−５４，５Ｆ１４１胞株は昭和５９年（西暦１９８
４年）７月２１日付けで工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託申請したが受託を拒否された。
４年）７月２１日付けで工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託申請したが受託を拒否された。
本発明においてヒト下垂体細胞株を培養するための培地
としては通常の動物細胞培養用の培地が用いられるが、
特に好ましくはＣＦ−１２培地が用いられる。通常の細
胞培養では培地に５〜１０％の血清の添加を必須とし、
血清を含まない場合は増殖はおろか生存すら困難なもの
が多い。また、培地に血清が含まれる場合は培養液より
目的物質を回収する時に血清に含まれるさまざまな因子
が大きな障害となってくる。しかしながら１８−５４、
ＳＦ細胞株は血清が含まれる培地には勿論生育するが、
血清が全く含まれない培地でも活発に細胞分裂を行い、
また継代培養もきわめて容易である。
としては通常の動物細胞培養用の培地が用いられるが、
特に好ましくはＣＦ−１２培地が用いられる。通常の細
胞培養では培地に５〜１０％の血清の添加を必須とし、
血清を含まない場合は増殖はおろか生存すら困難なもの
が多い。また、培地に血清が含まれる場合は培養液より
目的物質を回収する時に血清に含まれるさまざまな因子
が大きな障害となってくる。しかしながら１８−５４、
ＳＦ細胞株は血清が含まれる培地には勿論生育するが、
血清が全く含まれない培地でも活発に細胞分裂を行い、
また継代培養もきわめて容易である。
ヒト下垂体細胞株の培養は、好ましくは次のように行わ
れる。ヒト下垂体細胞株を細胞密度が０．５〜４ Ｘ
１０５個／ｍｌ！となるように培地に懸濁し、大気巾約
５％の二酸化炭素の存在下、約３７℃で４〜６日間培養
する。培養方法は、フラスコを用いた静置培養法、ロー
ラーボトルを用いた回転培養法、または細胞培養用キャ
リアーを用いた攪拌培養法などが用いられる。培養液を
回収した後、新しく培地を入れ替えて培養を継続するこ
ともできる。以上のようにして得た培養液は遠心分離し
て上清液を得る。上清液はそのままでも粗製のソマトメ
ジンとして使用可能であるが、これよりさらに精製して
純品とすることもできる。精製手段は公知の方法を使用
して行われる。例えば、塩析、限外ろ過、透析、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画、凍結
乾燥などの手段を任意の順序で、また繰り返すことによ
り精製される。特に好ましくは次の方法により精製され
る。
れる。ヒト下垂体細胞株を細胞密度が０．５〜４ Ｘ
１０５個／ｍｌ！となるように培地に懸濁し、大気巾約
５％の二酸化炭素の存在下、約３７℃で４〜６日間培養
する。培養方法は、フラスコを用いた静置培養法、ロー
ラーボトルを用いた回転培養法、または細胞培養用キャ
リアーを用いた攪拌培養法などが用いられる。培養液を
回収した後、新しく培地を入れ替えて培養を継続するこ
ともできる。以上のようにして得た培養液は遠心分離し
て上清液を得る。上清液はそのままでも粗製のソマトメ
ジンとして使用可能であるが、これよりさらに精製して
純品とすることもできる。精製手段は公知の方法を使用
して行われる。例えば、塩析、限外ろ過、透析、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画、凍結
乾燥などの手段を任意の順序で、また繰り返すことによ
り精製される。特に好ましくは次の方法により精製され
る。
培養上清液をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ ） ｓｏｘ
８ （ダウケミカルカンパニー社製）を用いたイオン交
換クロマトグラフィーにかけ、ソマトメジンを吸着せし
めた後、アンモニア水で溶出する。次いで、溶出液をセ
ファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）を用いたゲ
ルろ過により分画し分子量１２，０００〜３ 、０００
の両分を集める。これをＤＥＡＥ−セル、ロース（ブラ
ウン社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで分
画し、さらにセファデックスＧ−５０（ファルマシア社
製）によるゲルろ過、次いで凍結乾燥を行うことにより
精製標品が得られる。
８ （ダウケミカルカンパニー社製）を用いたイオン交
換クロマトグラフィーにかけ、ソマトメジンを吸着せし
めた後、アンモニア水で溶出する。次いで、溶出液をセ
ファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）を用いたゲ
ルろ過により分画し分子量１２，０００〜３ 、０００
の両分を集める。これをＤＥＡＥ−セル、ロース（ブラ
ウン社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで分
画し、さらにセファデックスＧ−５０（ファルマシア社
製）によるゲルろ過、次いで凍結乾燥を行うことにより
精製標品が得られる。
本発明物質は次の理化学的性質を有する。
■ 分子量： ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により測定した分子量は約７，０００である。
法により測定した分子量は約７，０００である。
■ 等電点：等電点ゲルディスク電気泳動法により測定
した等電点は中性（ｐｌ＝７付近）である。
した等電点は中性（ｐｌ＝７付近）である。
■ 熱およびｐｎに対する安定性：酸性ないし中性にお
いて９５℃、５分間の処理に安定。
いて９５℃、５分間の処理に安定。
■ 阻害：チオール試薬で阻害される。
■ 活性の測定法： Ｔａｋａｎｏらの方法に準じてラ
ジオ・リセプター・アッセイ法により測定した（ Ｔａ
ｋａｎｏら； Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第８
０巻、１４〜３１頁、 １９７５年）。即ち、ｌＺｉ
１でラベルしたソマトメジン−Ａ Ｉ５，０００ ｃ
ｐｍ、ヒト胎盤よりｍ製したメンブレンレセプター１１
００ｐおよび被検試料を゛１％ヒトアルブミンを含む５
０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４） ２０ＯｐＨ
中に加え、４℃で１６時間インキュベーションする。次
ぎに、上記同緩衝液０．８１１１を加え、６，０００
Ｘ ｇ 、 １０分間遠心分離して沈澱を集め、１−の
同緩衝液で洗浄して再度遠心分離を行った後、沈澱物の
放射能をＴカウンターで測定する。活性の表示はヒト標
準血清１−が有する活性を１単位と定義した。
ジオ・リセプター・アッセイ法により測定した（ Ｔａ
ｋａｎｏら； Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第８
０巻、１４〜３１頁、 １９７５年）。即ち、ｌＺｉ
１でラベルしたソマトメジン−Ａ Ｉ５，０００ ｃ
ｐｍ、ヒト胎盤よりｍ製したメンブレンレセプター１１
００ｐおよび被検試料を゛１％ヒトアルブミンを含む５
０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４） ２０ＯｐＨ
中に加え、４℃で１６時間インキュベーションする。次
ぎに、上記同緩衝液０．８１１１を加え、６，０００
Ｘ ｇ 、 １０分間遠心分離して沈澱を集め、１−の
同緩衝液で洗浄して再度遠心分離を行った後、沈澱物の
放射能をＴカウンターで測定する。活性の表示はヒト標
準血清１−が有する活性を１単位と定義した。
上記方法により測定したとき、本発明物質の有する活性
は１．４８０単位／■であった。
は１．４８０単位／■であった。
本発明物質の生物学的活性は次のとおりである。
■ プロテオグリカン合成促進活性（硫酸基取り込み活
性）： Ｋａ ｔｏらの方法に準じて測定した（１（ａｔｏら：
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、
Ａ、＋第７８巻、 ６８３１〜６８３５頁、１９８１年
）。即ち、マイクロウェル（１６敲径）に増殖させたウ
サギ肋軟骨培養細胞（初代培養）を０．３％牛脂児血清
を含むＭＥＭ培地（フロウラポラトリー社製）に２４時
間インキュベーションした後、０．５μＣｔの３５３０
４２−および被検試料を加えて１８時間反応せしめる。
性）： Ｋａ ｔｏらの方法に準じて測定した（１（ａｔｏら：
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、
Ａ、＋第７８巻、 ６８３１〜６８３５頁、１９８１年
）。即ち、マイクロウェル（１６敲径）に増殖させたウ
サギ肋軟骨培養細胞（初代培養）を０．３％牛脂児血清
を含むＭＥＭ培地（フロウラポラトリー社製）に２４時
間インキュベーションした後、０．５μＣｔの３５３０
４２−および被検試料を加えて１８時間反応せしめる。
次いで、１ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５％トリクロル
酢酸を加えて反応を停止し、ゴム製ポリスマンで細胞を
集め、５％トリクロル酢酸で細胞を５回洗浄した後、０
．２ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） １ ｗ
！に懸濁させる。次ぎにプロナーゼＥ（科研化学社製）
１■を加えて５５℃において１０時間消化を行った後、
コンドロイチン硫酸３■を加え、次いで、１％セチルビ
リジウムクロリドＩＩＩＩｌ！を加えてコンドロイチン
硫酸を沈澱せしめ、沈澱を遠心分離により集める。沈澱
を１％セチルピリジウムクロリドで洗浄した後、その放
射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。
酢酸を加えて反応を停止し、ゴム製ポリスマンで細胞を
集め、５％トリクロル酢酸で細胞を５回洗浄した後、０
．２ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） １ ｗ
！に懸濁させる。次ぎにプロナーゼＥ（科研化学社製）
１■を加えて５５℃において１０時間消化を行った後、
コンドロイチン硫酸３■を加え、次いで、１％セチルビ
リジウムクロリドＩＩＩＩｌ！を加えてコンドロイチン
硫酸を沈澱せしめ、沈澱を遠心分離により集める。沈澱
を１％セチルピリジウムクロリドで洗浄した後、その放
射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。
試料として本発明物質０．１ｐｇを使用したときの３５
３０４２−の結合は６，２７０±；９６ ｄｐｗ ／
ｗｅｌｌであり、一方対照として生理食塩水を使用した
場合は４，２０８±２７６ ｄｐｍ ／ ｗｅｌｌであ
った。
３０４２−の結合は６，２７０±；９６ ｄｐｗ ／
ｗｅｌｌであり、一方対照として生理食塩水を使用した
場合は４，２０８±２７６ ｄｐｍ ／ ｗｅｌｌであ
った。
■ ＤＮＡ合成促進活性：
Ｃａｒｐｅｎ ｔｅｒらの方法（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、、第８８巻、２２７〜２３８頁、 １９７
６年）に準じて測定した。即ち、ヒトの皮膚より得られ
た線維芽細胞１０４個をマイクロウェル（１６寵径）中
の３．０％子牛血清を含むＤＭＥ培地（フロウラボラト
リー社製）に植え、３７℃、６時間インキュベージシン
する。次いで、培地を０．２％子牛血清を含むＤＭＥ培
地に変えて、３７℃、４８時間インキュベーションした
後、被検試料を加えて１６時間インキュベーションし、
次に０．５μＣｉの〔３Ｈ〕チミジンを加え３時間反応
する。細胞を等張リン酸緩衝液（ｐＨ７，４） 、次い
で１０％トリクロル酢酸で順次洗浄した後、０．５Ｎ水
酸化ナトリウムを用い細胞に取り込まれた〔３Ｈ〕チミ
ジンを抽出し、その放射能を液体シンチレーションカウ
ンターで測定する。
ｙｓｉｏｌ、、第８８巻、２２７〜２３８頁、 １９７
６年）に準じて測定した。即ち、ヒトの皮膚より得られ
た線維芽細胞１０４個をマイクロウェル（１６寵径）中
の３．０％子牛血清を含むＤＭＥ培地（フロウラボラト
リー社製）に植え、３７℃、６時間インキュベージシン
する。次いで、培地を０．２％子牛血清を含むＤＭＥ培
地に変えて、３７℃、４８時間インキュベーションした
後、被検試料を加えて１６時間インキュベーションし、
次に０．５μＣｉの〔３Ｈ〕チミジンを加え３時間反応
する。細胞を等張リン酸緩衝液（ｐＨ７，４） 、次い
で１０％トリクロル酢酸で順次洗浄した後、０．５Ｎ水
酸化ナトリウムを用い細胞に取り込まれた〔３Ｈ〕チミ
ジンを抽出し、その放射能を液体シンチレーションカウ
ンターで測定する。
試料として本発明物質０．１Ｊｊｇを使用したときの〔
３Ｈ〕チミジンの取り込みは１５，７６２±３３４ｄｐ
ａ＋／ｗｅｌｌであり、一方対照としてリン酸緩衝液を
使用した場合は１．６２９土５０ ｄｐｍ／ ｗｅｌｌ
であった。
３Ｈ〕チミジンの取り込みは１５，７６２±３３４ｄｐ
ａ＋／ｗｅｌｌであり、一方対照としてリン酸緩衝液を
使用した場合は１．６２９土５０ ｄｐｍ／ ｗｅｌｌ
であった。
本発明物質の理化学的並びに生物学的性質を公知のソマ
トメジン類と比較すると次のことが言える。即ち、本発
明物質は、分子量が約７，０００であること、熱および
酸に対して安定であること、軟骨細胞への硫酸基の取り
込み促進作用およびヒト線維芽細胞のＤＮＡ合成促進作
用を有すること、およびラジオ・リセプター・アッセイ
によりソマトメジン−ＡおよびＭＳＡとよく交叉するこ
とからソマトメジン類に分類される物質であり、さらに
これら性質および等電点が中性であること、チオール試
薬で阻害されるからジスルフィド結合を有することが公
知のＩＧＦ−ｆｆの性質と一致することより本発明物質
はＩＧＦ−ＩＩであると決定された。
トメジン類と比較すると次のことが言える。即ち、本発
明物質は、分子量が約７，０００であること、熱および
酸に対して安定であること、軟骨細胞への硫酸基の取り
込み促進作用およびヒト線維芽細胞のＤＮＡ合成促進作
用を有すること、およびラジオ・リセプター・アッセイ
によりソマトメジン−ＡおよびＭＳＡとよく交叉するこ
とからソマトメジン類に分類される物質であり、さらに
これら性質および等電点が中性であること、チオール試
薬で阻害されるからジスルフィド結合を有することが公
知のＩＧＦ−ｆｆの性質と一致することより本発明物質
はＩＧＦ−ＩＩであると決定された。
実施例１
細胞培養用大型ローラーボトル（直径１１ＣＩ１１、長
さ５７ｃｍ、内容量２，０００＋ｄ、ベルコ社製）にＣ
Ｆ−１２培地５００ｄを入れ、１１１５４．ＳＦ＠胞を
１ ６ Ｘ １０７個植えて、３７℃、
０．５回転／分にて一週間培養した。細胞が増殖してボ
トル壁にほぼいっばいになったところで培養液を取り出
し、別に新しい培地を入れてさらに一週間培養を続けた
。この操作を繰り返すことにより１本のボトルから２．
５〜３７！の培養液を回収することができた。以上のよ
うにして集められた培養液は０．５単位／−の活性を有
していた。
さ５７ｃｍ、内容量２，０００＋ｄ、ベルコ社製）にＣ
Ｆ−１２培地５００ｄを入れ、１１１５４．ＳＦ＠胞を
１ ６ Ｘ １０７個植えて、３７℃、
０．５回転／分にて一週間培養した。細胞が増殖してボ
トル壁にほぼいっばいになったところで培養液を取り出
し、別に新しい培地を入れてさらに一週間培養を続けた
。この操作を繰り返すことにより１本のボトルから２．
５〜３７！の培養液を回収することができた。以上のよ
うにして集められた培養液は０．５単位／−の活性を有
していた。
上述のようにして得られた培養液４０ｎを遠心分離して
細胞の破片や不溶物を除いた後、上清液を９５℃で５分
間加熱処理をしてプロテアーゼを失活せしめ、次いでＩ
Ｎ酢酸でｐＨ５，０に調整した後、０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＦｌ ５．０）に
て平衡化したＮａ＋型のＤｏｗｅｘ ５０Ｘ８カラム（
ベッド容量２，０００ｙｍ）に通してソマトメジンを吸
着せしめた。カラムを上記同緩衝液で洗浄した後、０．
ＩＮアンモア水でソマトメジンを溶出した。溶出液は直
ちにＩＮ酢酸でｐＨ５，０に調整し、次いで１００−ま
で減圧濃縮した。次ぎに、ＩＮ酢酸で平衡化したセファ
デックスＧ−７５カラム（ベッド容量２，０００ｍＥ）
を用いてゲルろ過を行い、分子量１２，０００−３，０
００の画分を集め、凍結乾燥をしたところ３０■の標品
を得た。これを０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０） １００ ｍに溶解し、不溶物を遠心分離にて除去
した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（ベッド容量１００−）に通してソマトメジンを吸
着せしめた。
細胞の破片や不溶物を除いた後、上清液を９５℃で５分
間加熱処理をしてプロテアーゼを失活せしめ、次いでＩ
Ｎ酢酸でｐＨ５，０に調整した後、０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＦｌ ５．０）に
て平衡化したＮａ＋型のＤｏｗｅｘ ５０Ｘ８カラム（
ベッド容量２，０００ｙｍ）に通してソマトメジンを吸
着せしめた。カラムを上記同緩衝液で洗浄した後、０．
ＩＮアンモア水でソマトメジンを溶出した。溶出液は直
ちにＩＮ酢酸でｐＨ５，０に調整し、次いで１００−ま
で減圧濃縮した。次ぎに、ＩＮ酢酸で平衡化したセファ
デックスＧ−７５カラム（ベッド容量２，０００ｍＥ）
を用いてゲルろ過を行い、分子量１２，０００−３，０
００の画分を集め、凍結乾燥をしたところ３０■の標品
を得た。これを０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０） １００ ｍに溶解し、不溶物を遠心分離にて除去
した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（ベッド容量１００−）に通してソマトメジンを吸
着せしめた。
カラムを上記同緩衝液で洗浄した後、０．０５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む上記同緩衝液で溶出し、溶出液の活性画
分を集め、ＩＮ酢酸に対して透析後、凍結乾燥すること
により１曙の標品を得た。これを１−の酢酸に溶解し、
セファデックスＧ−５０カラム（ベッド容量１５軸０を
用いてゲルろ過を行い、活性画分を凍結乾燥することに
より精製標品０．５■が得られた。
トリウムを含む上記同緩衝液で溶出し、溶出液の活性画
分を集め、ＩＮ酢酸に対して透析後、凍結乾燥すること
により１曙の標品を得た。これを１−の酢酸に溶解し、
セファデックスＧ−５０カラム（ベッド容量１５軸０を
用いてゲルろ過を行い、活性画分を凍結乾燥することに
より精製標品０．５■が得られた。
木精製標品はＳＤＳポリアクリルアミドを用いた電気泳
動において単一バンドを示し、また等電点ゲルディスク
電気泳動においても単一なピークを示した。ラジオ・リ
セプター・アンセイ法による活性は１ 、４８０単位／
■であった。
動において単一バンドを示し、また等電点ゲルディスク
電気泳動においても単一なピークを示した。ラジオ・リ
セプター・アンセイ法による活性は１ 、４８０単位／
■であった。
実施例２
実施例１において使用したと同しローラーボトルに３％
仔牛血清を含むＣＦ−１２培地５００−を入れ、１８−
５４．ＳＦ細胞を３ Ｘ １０７個植え、３７℃、０．
５回転／分にて一週間培養した。細胞が増殖してボトル
壁にほぼいっばいになったところで培地を捨て、等張リ
ン酸緩衝／＆（ｐＨ７，４） １２５−を加えて細胞
を洗浄して血清を除き、次いで、ＣＦ−１２培地２５０
ｉを加えて一晩回転培養した。
仔牛血清を含むＣＦ−１２培地５００−を入れ、１８−
５４．ＳＦ細胞を３ Ｘ １０７個植え、３７℃、０．
５回転／分にて一週間培養した。細胞が増殖してボトル
壁にほぼいっばいになったところで培地を捨て、等張リ
ン酸緩衝／＆（ｐＨ７，４） １２５−を加えて細胞
を洗浄して血清を除き、次いで、ＣＦ−１２培地２５０
ｉを加えて一晩回転培養した。
細胞内に取り込まれた血清成分を除くために培養液を捨
て、新しくＣＦ−１２培地５００−を加えて一週間培養
し、培養液を得た。この培養上清の活性は０．６単位／
−であった。
て、新しくＣＦ−１２培地５００−を加えて一週間培養
し、培養液を得た。この培養上清の活性は０．６単位／
−であった。
実施例３
遊離細胞培養用のキャリアーであるＣｙｔｏｄｅに２お
よび３ （ファルマシア社製） ０．３ｇを含むＣＦ
−１２培地４０１１１！に１×１０７個の１１１５４．
ＳＦ細胞を懸濁して培養槽に入れ、３７°Ｃにおいて２
０回転／分で一晩培養した。キャリアーに細胞が十分接
着したところで培地を１００−に増やし２５回転／分で
３日間攪拌培養した。攪拌を止めキャリアーを沈めた後
、培養上清を回収し、別に新しくＣＦ−１２培地を加え
て、以下繰り返して培養を行った。この方法では３ケ月
以上に渡って培養を続けることができた。この培養上清
の活性は１．０単位／−であった。
よび３ （ファルマシア社製） ０．３ｇを含むＣＦ
−１２培地４０１１１！に１×１０７個の１１１５４．
ＳＦ細胞を懸濁して培養槽に入れ、３７°Ｃにおいて２
０回転／分で一晩培養した。キャリアーに細胞が十分接
着したところで培地を１００−に増やし２５回転／分で
３日間攪拌培養した。攪拌を止めキャリアーを沈めた後
、培養上清を回収し、別に新しくＣＦ−１２培地を加え
て、以下繰り返して培養を行った。この方法では３ケ月
以上に渡って培養を続けることができた。この培養上清
の活性は１．０単位／−であった。
発明の効果
継代培養が可能で、かっ血清を全く含まない培地でも活
発に細胞分裂を行うヒト下垂体細胞株を培養することに
より容易にソマトメジンの大量生産が可能となった。
発に細胞分裂を行うヒト下垂体細胞株を培養することに
より容易にソマトメジンの大量生産が可能となった。
本発明のソマトメジンはヒトの疾病、例えば末端肥大症
、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、骨折、創傷など
の診断、予防並びに治療への利用が期待される。
、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、骨折、創傷など
の診断、予防並びに治療への利用が期待される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ソマトメジンを産生する能力を有するヒト下垂体細
胞株を動物細胞培養培地に培養し、生成したソマトメジ
ンを採取することを特徴とするソマトメジンの製造法。 ２ ソマトメジンがＩＧＦ−IIである特許請求の範囲第
１項記載のソマトメジンの製造法。 ３ ヒト下垂体細胞株がヒト下垂体良性腫瘍組織から樹
立された細胞株である特許請求の範囲第１項記載のソマ
トメジンの製造法。 ４ ヒト下垂体良性腫瘍組織から樹立された細胞株が１
８−５４、ＳＦ細胞株である特許請求の範囲第３項記載
のソマトメジンの製造法。 ５ 動物細胞培養培地が血清を含まない培地である特許
請求の範囲第１項記載のソマトメジンの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16326784A JPS6140220A (ja) | 1984-08-01 | 1984-08-01 | ソマトメジンの製造法 |
| DE19853525945 DE3525945A1 (de) | 1984-08-01 | 1985-07-18 | Verfahren zur darstellung von menschlichem, insulinaehnlichem wachstumsfaktor ii |
| FR8511179A FR2568587A1 (fr) | 1984-08-01 | 1985-07-22 | Procede de preparation d'un facteur de croissance ii analogue a l'insuline humaine |
| GB08519191A GB2163751A (en) | 1984-08-01 | 1985-07-30 | Human insulin-like growth factor II |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16326784A JPS6140220A (ja) | 1984-08-01 | 1984-08-01 | ソマトメジンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6140220A true JPS6140220A (ja) | 1986-02-26 |
Family
ID=15770555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16326784A Pending JPS6140220A (ja) | 1984-08-01 | 1984-08-01 | ソマトメジンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6140220A (ja) |
| DE (1) | DE3525945A1 (ja) |
| FR (1) | FR2568587A1 (ja) |
| GB (1) | GB2163751A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8510177D0 (en) * | 1985-04-22 | 1985-05-30 | Public Health Laborotory Servi | Isolating pituitary glycoprotein hormones |
| US5736363A (en) * | 1991-07-29 | 1998-04-07 | British Bio-Technology Limited | IGF-II analogues |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6030657B2 (ja) * | 1980-12-31 | 1985-07-17 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト細胞増殖促進因子の製造方法 |
-
1984
- 1984-08-01 JP JP16326784A patent/JPS6140220A/ja active Pending
-
1985
- 1985-07-18 DE DE19853525945 patent/DE3525945A1/de not_active Withdrawn
- 1985-07-22 FR FR8511179A patent/FR2568587A1/fr not_active Withdrawn
- 1985-07-30 GB GB08519191A patent/GB2163751A/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3525945A1 (de) | 1986-02-06 |
| GB2163751A (en) | 1986-03-05 |
| FR2568587A1 (fr) | 1986-02-07 |
| GB8519191D0 (en) | 1985-09-04 |
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