JPS6143995A - 枝切り酵素製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、澱粉を糖類に酵素変換する酵素の分野に属す
る。詳述すれば、本発明はアミロペクチン及びプルラン
におけるアルファー１，６−グリコシド結合を加水分解
しうる新規波切シ酵素に関する。この新規酵素Ｆｉプル
ラナーゼ型の枝切り酵素として分類することができる。

本発明は更に新規波切シ酵素の裳遣方法及び澱粉をデキ
ストロース及び／またはマルトースを含む澱粉加水分解
生成物、ｓえばデキストロース及びマルトースシロップ
に変換するための該酵素の用途に関する。

過去１０年の間に、澱粉をシロップに変える全酵素加水
分解は澱粉処理工業に広く、常に禮加して受容されてき
た。世界的ＶＣＦｉ、澱粉からデ午ストロースシロップ
の酵素による生産は、１０年前の約４０万トンに比べて
現在でＦｉ１年当シ３００万トン（乾物として計算）を
越えると思われる。

澱粉の酵素−酵素加水分解に一般に採用される方法は、
液化及び糖化の連続工程を含み、液化工程はアルファー
アミラーゼ、例えば熱安定性バチルス・リヘニフォルミ
ス（Ｂ、ｌｉ＠ｈｅｎｌｆｏｒｍｉｍ　）アルファーア
ミラーゼ、例えばデンマークのノグオ・インダストリイ
社（Ｎ０ＶＯＩｎｄｕｓｔｒｉ　ｌｖ’ｓ　）によって
供給されたターマきル（ＴＥＲＭＡＭＹＩ、′ＰＫよっ
て接触され、デキストロース（Ｄ−グルコース）への糖
化は前記の会社からも得られるＡＭＧ　−１５ＯＬのよ
うな、通常、菌に由来するグルコアミラーゼの存在で行
なわれる。デキストロースシロップ製造者が、酵素及び
エネルギーの消費量をできるだけ少なくしながら出来る
だけ高いデキストロース収率を得ることを目指している
ことは明らかである。

３０〜４０優（重量）の澱粉懸濁液を用いて出発し、３
０優の乾物（Ｄ、Ｓ、）で糖化する従来法ＶＣより得ら
れる最高のデキストロ−スレベルは約９６１１ｉ（重量
）のデキストロース（９６ＤＸ）である。従来の澱粉変
換法がその限度をほとんど越えない理由は本質的に２つ
ある。

第一に、アミロペクチン（トウモロコシ澱粉を含めて、
多くの工業的に重要な澱粉の約８０優を構成する）は、
相当数のアルファー１，６−グリコシド結合を含む点で
分枝鎖構造を示す。アルファーアはラーゼは実際にアル
ファー１．６−グルコシダーゼ活性を有しないので、ア
ミロペクチンはアルファーアミラーゼによって部分的に
しか分解されないので、アルファー１，６−グリコシド
結合をも加水分解するグルコアミラーゼによって触媒さ
れるその後の糖化工程において、アルファー制限デキス
トリンを含めて分枝オリゴ糖の実質的加水分解が起る。

しかしながら、糖化反応はアルファー１，４−結合の対
応する加水分解よシ著しく低い速度で進行し、これＫよ
〕完全な糖化が妨げられる。それよシ多くのゲルコアき
ラーゼを添加することによって状況を解法する試みは第
二の障害（よシ高い酵素費を賛することを別として）、
即ちデキストロース重合（いわゆる逆反応）を触媒する
グルコアミラーゼの能力と衝突する。

ちなみに、澱粉の変換を約９６ＤＸから約９８ＤＸに増
加すると（これはデキストランのある用途には著しい改
良とみなされる）、非デキストロース狭絨物の含有率が
約５０優だけ減少するが、このような澱粉の変換は、基
質を約１５１０．Ｓ、に希釈すると共に、比較的高レベ
ルのグルコアミラーゼを使用することによって達成する
ことができる（米国特許第４０１７３６３号明細書参照
）、シかしこのようなデキストロース溶液を後に一層高
い常用の乾物レベルに濃縮する釦は、エネルギーを消費
する。

先行文献は、デキストロ−スレベルを著シく増加するた
めグルコアミラーゼ及び波切シ酵素を同時に使用するこ
とを示唆しておシ、枝切り酵素が分枝鎖オリゴ糠中に存
在する特殊なアルファー１．６−グリコシド結晶及び一
定のアルファー制限デキストリンを有効に加水分解する
ことが判ったことを根拠にしている。この点くついて、
米国特許第３８９７３０５号明細書はゲルコアきナーゼ
及びエアロバクター・エアログネス（Ａｅｒｏｂａｅｔ
ｅｒａａｒｏｇｅｎｅｇ）〔クレブシーラ・ニエーモニ
アエ（Ｋｌｅｂｓｌｅｌｌａ　ｐｎ＠ｕｍｏｎｉａ＠）
）ゾルラナーゼを併用し、それによう少なくとも３０係
の乾物を含むシロップに関して２％までのＤＸの顕著な
増加を達成しうろことを開示している。グルコアミラー
ゼ及び別の波切シ酵素、即ち英国特許出願第８１０７２
８７号明細書に記載されているシェードモナス・アξロ
デラモーサ（Ｐｓ＠ｕｄｏｍｏｎａｓａｍｙｌｏｄａｒ
ａｍｏｓａ　）インアミラーゼの作用を合せても同様の
結果が証明された。

しかし第一の例では、クレプシーラ・ニネーモニアエの
ゾルラナーゼの一最適範囲によ）糖化を比較的高いｐ）
Ｉ（５，５〜６）で行なうことを余儀なくされ、この−
ではグルコアミラーゼの活性は急激に減少するので、ゲ
ルコアはラーゼは実ｖＡＫは節約されない。

同じ問題は、グルコアミラーゼの最適Ｐ）（Ｋ著しく接
近した最適ｐＨを有するイソアミラーゼを用いる場合Ｖ
ＣＦｉ起らず、従ってグルコアミラーゼの用量を実質的
に減少（約５０優だけ）することができ、同時に１〜２
ｔｓのＤＸ値の増加を達成しうる。

しかしながらインアミラーゼ法（及び現実には公知のプ
ルラナーゼ法にもある）の重大な欠点は文献に公知の波
切シ酵素が熱に不安定なことである。

このことは、従来波切シ酵素の存在での糖化が約５５℃
以上では工業的に行なわれず、グルコアミラーゼ自体が
６０℃でさえ適切に安定であシ、この温度水準で基質の
微生物汚染の危険がそれよシ低い温度と比べて著しく減
少することを意味する。

ベーターアミラーゼを用いて澱粉を高いマルトース含有
率ゾに変換する際にも前記と同様の障害に遭遇する。ア
ルファーアミラーゼと同様に、ベーターアミラーゼは、
１，６−アルファ分枝点に近づくに従って加水分解が停
止するので、アはロペクチンを部分的にしか分解できな
い。ベーターアミラーゼの作用を波切シ酵素、例えばプ
ルラナーゼまたはイソアミラーゼの作用と組合せること
によって、英国特許第１１４４９５０号及び米国特許第
３６１７８９６号明細書に開示されているように、マル
トース含有率の著しい増加を達成することができる。し
かし５５℃以上の糖化温度は波切シ酵素が熱に不安定で
あるため適当でなく、これによ１細菌汚染の危険が著し
く増加する。

本発明の目的は、ゲルコアきラーゼの温度安定性に匹敵
する温度安定性を有し、更にグルコアミラーゼの最適−
に接近した…最適域を有する新規波切り酵素を供給する
ことによって従来公知の波切夛酵素の欠点を解消するこ
とである。

本発明け、このような性質を有するプルラナーゼ型の新
規波切）酵素が日本特許出願番号５６−８８３１９に規
定された分類に属するバチルス属の新しく発見された微
生物によって産生されるという意外な発見に基づく。

本発明は第一の態様によう、下記の特性を有する： ａ）菌株バチルスアシドグルリテイクス（Ｂａａｌｌｌ
ｕａ　ａｅｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｅｕｍ　）ＮＣｌ
Ｂ１１６３９又はその変異株もしくは突然変異株を適当
な栄養培地中で培養することＫよって製造された発酵液
から得られ。

ｂ）バチルスアシドプルリテイクス基準株ＮＣＩＢ　１
１６０７から誘導された枝切り酵素と部分的に同一の酵
素化学的性質を示し、 ｃ）−４〜５で酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ　）中で測定
して最適活性が６５℃〜７０″ｃＫあシ。

ｄ）最適−が、約６０℃の酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）
中で測定して３．５〜５，５の範囲にあり、・）少なく
とも５０チのＰ）１５のデキストロース溶液（３０重景
憾乾物として）中で測定して７２時間後６０℃で残留活
性を有する。

プルラナーゼ型の新規波切シ酵素を含む枝切り酵素製品
を提供するものである。

枝切り酵ｘｓ、！ｉ！ＩＦｉ固体または液体の形であっ
てよく、一般にｌ’当り１０〜３５０，０００プルラナ
ーゼ単位（以下に定義する）の範囲に活性を有する・本
発明の好ましい実施態様では、枝切り酵素製品の活性は
１２当シ１００〜１５，０００ゾルラナ一ゼ単位の範囲
にある。

本発明の別の態様によれば、約６０℃又はそれ以上で最
適活性、３．５〜５．５の絹範囲で最適−及び６０℃、
で良好な熱安定性を示す波切シ酵素を含む波切シ酵素製
品を製造する方法が提供され、＃方法は炭素源、窒素源
及び無機塩類を含む適当な栄養培地中で、全ての実施上
の目的に対し、適当な栄養培地中でバチルス・アンドプ
ルリティクス（ＢａＣ目Ｊｕｇ　ａｅｉｄｏｐｕｌｌｕ
ｌｙｔｌｅｕｍ　）　ＮＣｌＢ１１６３９又は枝切り酵
素産生のその突然変異株を培養し、続いて常法により波
切シ酵素生成物を回収することから成る。

更に別の態様によれば、本発明はデキストロース及び／
またはマルトースを含むシロップに澱粉を変換する方法
を提供するものであり、該方法は場合により、しかし好
ましくは予め液化工程を行なって澱粉加水分解生成物を
形成してから、前記の新規波切り酵素の有効量並び忙グ
ルコアミラーゼ及びベーターアミラーゼから成る群から
選択され九糖化酵素から成る酵素系の存在で糖化を行な
うことから成る。

本発明の波切シ酵素を使用する好ましい態様においては
、澱粉加水分解生成物の乾燥固形分は少なくとも３０重
量優であシ、その糖化け５５〜６５℃の範囲、好ましく
Ｆｉ６３℃以下の温度で３．５〜５．５の…範囲で実施
する。グルコアミラーゼ及びベーターアミラーゼの好ま
しい用量はそれぞれ０．０５〜０．５ＡＧ単位及びα０
０５〜０．３ベ一ターアミラーゼ単位の範囲にあり、枝
切り酵素の好ましい用量は澱粉加水分解生成物中の乾物
１１当りｏ、ｏｏｓ〜５プルラナーゼ単位（以下に定義
する）の範囲にある。

好ましい付加的態様では、糖化酵素はグルコアミラーゼ
であシ、これＫよシ澱粉を高いＤＸデキストロースシロ
ップに変エル。

微生物 単離；本発明の波切シ酵素を産生ずる微生物は、日本特
許出願第５６−８８３１９号に開示される方法によって
選択した： 微生物及びその突然変異株を、スコツトランド、アバデ
ィーンのナシ冒ナル・コレクシ日ン・オプ・インダスト
リアル・バクテリア、トリ４・リサーチ・スティシ冒ン
（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＩｎ
ｄｕ＋ｓｔｒｉｍｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｏｒｒｙ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｔａｔ１ｏｎ）に寄託し、下記の第
］表忙示す受託番号を得た。

第ｒ表 ＮＣＩＢＡ　　　寄託年月日　　　　　　起　源本発明
の微生物の微生物学的性質は、日本特許出願第５６−８
８３１９号で開示した微生物のそれと適合し、それらは
その基準株がＮＣＩＢ　１１６０７でアルバチルスアシ
ドプルリティクスとして該出願中に規定された分類グル
ープに属する。

プルラナーゼ活性の測定 １プルラナーゼ単位（ＰＵ　）は、標準条件（温度６０
℃及びｐ）１５．０）下で毎分１μモルのグルコースと
当量の還元性基の形成に相当する速度でゾルランを加水
分解する酵素の量と定義する。

酢酸塩＊＊液（０，１Ｍ　、…５）中のプルラン〔シグ
トケξカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｌａａｌ　Ｃｏ、
）Ｋよって供給される〕の４重量係溶液（ｌＲ１）を６
０℃で１０分間予め加熱し、続いて１ＩＩＬｌ当シ０．
０４〜０．１５ＰＵＫ相当する濃度で脱イオン水に溶か
した酵素の溶液（１ｄ）を添加する。カーがネート緩衝
液、ｐＪ（１０（０，５Ｍ溶液３−）を添加することに
よ９３０分後に反応を停止する。次に、遊離した還元性
基の濃度をソモギイーネルソン（Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎ＠
１ｓｏｎ　）法（Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、１５３（
１９４４）　３７５−８０　、同、１６０（１９４５）
、６１−６８に１９測定する。

波切シ酵素製品の製造 本発明の波切シ酵素を産生しうる微生物を通常、適当な
発酵培地中で好気性条件下で培養する前に固体基質上で
増殖させる。両方の培地は、コーンステイー！・リカー
および酵母エキス又はンイビーンミール（液体培地）ま
たはトリジトン（固体基質）のような生長促進栄養素と
一緒に％同化しうる炭素源（例えば液体培地用にグルコ
ース及び固体培地用に７ミロペクチン）及び窒素源とし
て例えば硫酸アンモニウムを含む基礎塩類組成物（前記
参照）を含む。発酵を少し高めた温度で、一般に３０〜
３５℃の範囲で、６以下、好ましくけ５．０〜６．０の
範囲の−で実施するのが典型的であり、自動装置によシ
はぼ一定に保持するのが好ましい。酵素は培地中に分泌
される。

生じる、通常的０．１〜５０ＰＵ／ｌｌ　′ｆｒ含む発
酵液から細菌細胞、崩壊物を他の固形分と一緒Ｋ例えば
遠心分離によシ除去することができる。酵素を含む上澄
液を更に例えばｐ過または遠心分離により清澄にし、次
に必要に応じ例えば限外−過によるか、ま友は減圧下に
蒸発器中で濃縮し、得られた濃縮液を必要に応じて、例
えば凍結乾燥またけ噴霧乾燥によって乾燥することがで
きる。生ずる粗製酵素製品は、１００〜１５，０ＯＯＰ
Ｕ、４の範囲の活性を示すのが代表的である。

本発明の粗波切り酵素は、例えば下記の例１で得られる
濃縮液から、例えば例３で述べる方法を用い、電気泳動
的均質性まで精製できる。精製酵素け、ナトリウムドデ
シルスルフェートポリアクリルアミドグル電気泳動〔ブ
ラウン（Ｓ、Ｇ、Ｂｒａｕｎ）ら、Ｊ、Ｖｌｒｏｌｏｇ
ｙ　、　１０巻（１９７２年〕２２１頁〕で、単一の蛋
白質バンドを示した。分子量は約９５，０００ダルトン
すなわち基準様ＮＣｒＢ１１６０７によって産生される
枝切り酵素の分子量よりも約５０００ダルトン小さい。

本発明の酵素および日本特許出願第５６−８３１９号で
開示されたＮＣＩＢ　１１６０７　（又はそれらの突然
変異株、例えば株ＮＣＩＥ　１１６３８および基準様Ｎ
ＣＩＢ　１１６４７　）Ｋよって産生される酵素との差
異を実証するため、次の試験結果を示す。

Ａ０等電点（ｐｉ）およびｐ−ヒドロキシ安息香酸水銀
（ＰＭＢ）を用いて処理することによる抑制ＮＣＩＢ　
１１６３９　　　５．６　　　　　−ＮＣＩＢ　　１１
７７７　　　　　５．６　　　　　　　　−これらの結
果は、次の事実を示す。すなわち、本発明の酵素の活性
は、基準様からの酵素に反し、その活性部位付近のスル
ホヒドリル基の存在と独立である、ということである。

Ｂ、温度の関数としてのデルナラーゼ活性（他の反応条
件は、ゾルラナーゼ活性の検査に対する上述の記載条件
である） 活性＃ｉ６０℃の活性のノｅ−セントとして示される。

以下余白 ｃ、　　ｐ）Ｉおよび温度レベルを変化させた場合のグ
ルコース溶液（約３０優の乾物）中の熱安定性の比較 酵素製品を、脱イオン水に溶解もしくは脱イオン水で希
釈し、１ｙｎｌＫ対し約３ＰＵ含有する溶液を得た。酵
素溶液（１−）を、選定したーの０．１Ｍミドレート−
ホスフェート緩衝液（１１１ｔ）と混合し次いでその溶
液中にグルコース（ｏ、ｓｙ）を溶解するととくよ多試
料を調製した。選定した温度で試料を７２時間インキ纂
ベージ■ンした後、残留アミロペクチン波切り活性（後
記参照）を測定した。残留アミロペクチンは、４℃で保
持された同一の試料の活性度のパーセントとして示され
る。

アミロペクチンのアルファーｘ、６−ｆｔｉ合の加水分
解は、青色沃素−７ミロペクチン錯体の色強度（６１０
ｎｍで測定）の増加を起す。この増加は加水分解したア
ルファー１．６−結合の量に左右される。

波切シ酵素及びインアミラーゼｒｃついてそれぞれ１〜
２ＰＵ／１１１及び２０〜４０Ｉヤ値に相当する浸度に
脱イオン水で希釈し次酵素溶液（ｌ−）を酢酸塩Ｍ漬液
（０，５Ｍ、ｐ）＋４．５．１ＩＬｌ）及びアミロにク
チン［ＣＰＣ、スノウフレイク（ＳＮωＶＦＬＡＫＥ　
）０４２０１澱粉〕の１チ溶液（５−）と混合する。混
合物を５０℃で３０分間イン′ｊＰＳベージ冒ンする。

少ｉ（０，５１Ｌｔ）を０．０２Ｎ　　Ｈ２Ｓｏ４１５
１Ｌｌ及び沃素溶液（０，２％沃化カリウム中の０．０
１Ｍ沃Ｘ）０．５−と混合する 室温で１５分後、６１０　ｎｍでの光学密度を酵素を含
まないブランクのそれと比較する。

Ｄ、　　ｐＨおよび温度が予じめ定められた値に調整し
た反応混合物を用い、種々の温度レベルでの３．５〜５
．５の範囲におけるＰＨＶｃ対する本発明の波切シ醇素
の作用の依存性を、上記のプルラナーゼ活性を測定する
几めの方法によって測定した。６０℃、６５℃、および
７０℃における−に対しプロットしたＮＣＩＢ　１１６
３９の波切シ酵素の構対的活性を示す添付図面を参照さ
れたい。

これらの結果は次の内容を示している。すなわち、本発
明の波切り酵素は日本特許願第５６−８８３１９に従っ
九基準株およびその突然変異株によって産生される酵素
よりも６０℃以上の温度でかつｐｌ（４，５以下でより
安定である。

免疫学的性質 本発明の酵素製品を、基準株、すなわちＮＣｌＢ１１６
４７の突然変異株に対し生じた単因子抗血清を用い、日
本特許出願第５６−８８３１９号に開示した免疫学的試
験に委ねた。本発明の酵素のイムノグラムは、基準株の
それＶＣ転べ部分的免疫化学的同一性を示す。

次ＶＣ，本発明の例を非制限的に示す。

例１ 菌株ＮＣＩＢ　１１６３９からの波切シ裏品の久造菌株
ＮＣＩＢ　１１６３９の増殖、培養および発酵を、日本
特許出願第５６−８８３１９号の例１で開示した如く行
なワた。

発酵培地は次の組成を有した： 大豆ミールエキスリ　　　　　２．０優コーンステイー
グリカー　　　　　　０．５％Ｍｇ８０４・７Ｈ２００
，Ｏ２５係 に２ＨＰＯ４０，１係 （ＮＨ４）２Ｓｏ４０．０５％ り大豆ミールの抽出はｐ）１４．５および５０℃で４時
間で可能である。不溶性物質は遠心分離によって除去さ
る。

１３０℃で６０分、オートクレーブ処理する前に、−を
４．　ＯＫ調整した。

培養の間、水酸化ナトリウム溶液（２係）を添加してＦ
Ｊ（を５．６±０．１に保持した。温度は３０．０±０
．１℃であり、攪拌速度５３０〜５６５　ｒｐｍのもと
通気速度は３２０１１Ｌｌ／分であった。

発酵は、０．０３〜０．０５　ｈｒ　　の希釈速度で１
８６時間連続的に行なったが、その時溢流培養液の採取
が始まった。培養液（５１００ｍｊ、０．４７ＰＵ〜）
を、次の条件のもと更に９７時間ドライアイス上に集控
た： 希釈速度　　　０．０４９±０．００８　ｈｒ−’０Ｄ
４５８１０．６±１．１ 細胞密度　　　　２．９±１．５ｆｆ／１枝切）＃索活
性　　０．５±０．１　ＰＵ、Ａ／細胞を遠心分離によ
シ除去する。上澄み液をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　
）　ＧＦＡガラスフィルター（ｌｌｃｒｎ）で濾過し、
次いでＨＩＰ　１０膜を有するアミコン（Ａｍ１ｅｏｎ
　）　ＤＣ２ホローファイバーモジュールで２００１Ｌ
ＩＶＣ＠縮した。濁りをＧＦＡフィルターで除去し、そ
してＰ液を更に２０２−ＤＤＳ６００　Ｎｍ　（ＤＤＳ
　、コペンハーグン、デンマーク）を用い、アミコンモ
ジ島−ルで濃縮し、６５　ＰＵ７４ｔｌの活性を有する
最終濃縮物（３０１１ｊ）ｆｆｉ得た。この濃縮物を急
速冷凍して保存した。

例２ 菌株ＮＣＩＢ　１１７７７からの波切）製品の製造全容
積５５０１のステンレス鋼ファーメンタ−内で発酵を行
なった。作業容量３４０〜４３５ノを用いた。

以下余白 培地組成　　　　　　　　　　　　培地Ａ　培地Ｂ酵母
抽出液ペース）（８０％乾物）　　　　−３２大豆ミー
ル　　　　　　　　　　　　　　２５ノ　　−コー７ス
ｆ４−デｌＪカー（５０１乾物）５ｐ１５）ＫＨ２ＰＯ
４１，８Ｐ　　　１．０Ｐ （ＮＨ４）２Ｓｏ４　　　　　　　　　　　　　　　　
１．Ｏ？　　１．３ｉＣａＣ１２’２Ｈ２０−０，２５
Ｐ ＭｇＢＯ４・７Ｈ２０−０，２５Ｐ プにＣニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）Ｌ６１　　　　　　
　　　　Ｑ、１ＩＲＩ　　０．１１１１水道水で　　　
　　　　　　　　　　　　　１ノ　　１！培地のＰ）（
を水酸化ナトリウム溶液で５．４〜５．６に調節した。

澱粉をターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）Ｌ−ω（乾燥澱
粉１ｋ）当たり２−）で６０分間９０℃で液化した。く
えん酸（乾燥澱粉ｌ　ｋｇ洛たシ１１を添加して液化を
終了させ次いで沸点まで加熱した。

フェルンパッハ（Ｆｅｒｎｂａｅｈ　）　培養フラスコ
中で例１に使用した同じ栄養塞天基質上で２日間生育し
た菌株ＮＣＩＢ　１１７７７の培養物を、培地Ａの田ｌ
を接種するため使用した。発酵を３５℃で実施したが、
その際攪拌機の速度はｌ　Ｏ７ｒｐｍで、通気速度は０
．５パールの圧力で毎分３０橡準リツトルにした。

この接種培養物が１０８時間のエイジに達し次ら、培地
Ａ３４０１を含有する、５５０１の７アーメンターを接
種するため該接種培養物を用いた。

５５０１の７アーメンター内の温度を２９〜３１℃に維
持した。攪拌速度を１２　Ｏｒｐｍに設定した◎空気流
を、０．５パールの圧力で毎分１５０標準リツトルに調
節した。４４時間から１９４時間まで、培地Ａが毎時１
４〜１９１の速度でファーメンタ−に供給された。！ロ
スの容積が４３５１ＶＣ達したら、培養液を自動的に除
去し友。

接種１９４時間から実験の終了の５２５時間まで、培地
Ｂｌ毎時１１〜１９Ａ！の速度でファーメンタ−に供給
した。容積物を上述のように４３５！に保持した。

接種後約３８時間に激しい生長をＣＯ□の発生および顕
微鏡によシ観察した。プルラナーぜ活性は生成６９時間
に１ｄ当た！り　０．２　Ｐ　Ｈに達しそして培地を交
換するまでこのレベルにありた。接種後２１９時間に、
ゾルラナーゼ活性はｌｙｄ当たシ１、４　Ｐ　Ｕ以上に
達した。活性は、接種後２９時間に実験中の最大の１１
ｉｌ当たｊ５３．２ＰＵに達した。

培養物のＰＨは５．４〜５．８の範囲で変化した。２２
５時間から３１２時間まで、培養液を集めそして水中で
冷却した。

発酵液（１１当たり１．７３ＰＵの活性度を有する）１
４５０１を、塩化カルシウムの１５ｋＪｌ−、フィルト
ロックス（Ｆｌｌｔｒｏｘ　）　ＸＬＯＩのｌｋｐおよ
びナル：ｙ　（Ｎａ１ｅｏ　）　６７３の０．２５　ｉ
ｐを用いて−６，０で凝集させた。

スラッジを遠心分離で除去し、次いで最後のかすみ状の
ものを、濾過助剤として珪藻土を用いサデラ（５ｕｐｒ
＊　）　１００Ｆ’遇板で濾過した。

酢酸を用いｐｗＬをｐＨ４，８に調整し、次いでＧＲ６
０ｊ！Ｉを備えたＤＤＳ　３５モジエーレを用いて濃縮
した。奄終濃縮物（１５ｋｙ）Ｆｉ乾物１０．６優を含
有していた。

珪藻土を用いて更に加圧濾過し、１？当た）９５ＰＵの
活性度を有する酵素濃縮物（１２，８ｋｙ。

乾物９．８優を含有）を得た。

シ ＮＣＩＢ　１１７７７菌株から枝切り酵素製品の婁造田
発材料は、上記例２で集められた冷却発酵液（３））で
あった。全ての連続工程Ｆｉ４℃〜８℃の温度範囲で行
なわれた。

次いで、液体を、ベックマンＪ６遠心機内で３００　Ｏ
ｒｐｍで遠心分離した。ＨＩＰＩＯＪｌｉを備えたアミ
コンホローファイバー濃縮器、型ＤＣ４（アミコツ社、
マサクチー−セット州、米国）を用いて、上澄み液ｆ２
０００１１１に濃縮した。

次いでＤＣ４の設定を、透析に変え次いで誘導率を２ｍ
Ｓｉに低下させセしてｐ）ｌ’ｒ酢酸で３，８に調整し
た。

次いで得られた酵素溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液（０
，０２Ｍ％ｐＨ３，８）で平衡化したＣＭ−セファＯ−
スＣＬ−６Ｂ　（Ｐｈｓ＋ｒｍａｅｉｉ、Ｓｗｅｄｅｎ
）カラムに供給し、これＫより大部分の酵素が吸収され
た。

Ｎａ２ＨＰＯ２緩衝液（０，０２Ｍ）と線状に混合した
同じ緩衝液で溶離を実施して、３．８〜７．２の一勾配
を得た。プルラナーゼ活性について、フラクシ曹ンを分
析し九。活性なフラクシ璽ンをプールし、次いでＰＩＯ
ホローファイバー濃縮器で３５０ＨＩＫ濃縮した。

濃縮物を同量の９６優の冷（４０℃）エタノールと混合
した。沈澱物を、ベックマンＪ６遠心器内で３０００　
ｒｐｍで遠心分離した。沈澱物を水（１５０ｍＪ）中に
溶解した。

ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｅｉｍ　）　（スウェーデ
ン）から購入されたクロマトフオーカシイング用キット
を、最後の精製工程に対し用いた。１５０−のＰＢＥ　
９４を２５Ｘ４０（１ｍカラムに２５フアルマシア中に
充填し次いで流速１５０１１／／ｈ　　で２５１イミダ
ゾール緩衝液（−７，４）で平衡化し友。

次いでｌ：８に希釈した？リパッファー７４を適用しく
　１５０１ｊ）、続いて試料（可溶化されるエタノール
沈澱物を適用した。次いで２０００１ＪのＩリパッファ
７４（１：８に希釈）を適用し勾配法を開始した。

１７０−の全量中、酵素をｐ）１５．４付近で溶出し、
次いでＤ　Ｄ　８５００膜を有するアミコン型２０２濃
縮セルで２０ｄＫ濃縮した。

１−当たりタンノ譬り１０〜を含有する、得られた溶液
は１ＩＩＬｌ当たシ１５００　ＰＵのプルラナーゼ活性
を有しており、従ってタンノｆりｌノ当たシ１５０．０
００の特異活性を有した。

例４ Ｄ　Ｉ　７．０を有する、噴霧乾燥したマルトデキスト
リンのパッチを調製した。

このマルトデキストリンの適当量を脱イオン水に再溶解
させ、約３０チＤ、Ｓ、にすることによ多糖化用基質を
！ＩｌＩ製した。次にこの基質の少量を６０℃に加熱し
％−を４．８．４．５又は４．０に調節した。０．１１
３　ＡＧ単位／ｆＤｓに相当する、同用量のゲルコアき
ラーゼについてこのシリーズの平行した糖化実ｋＡを行
なった。第一のシリーズでは、ＩＰル’ｆ　Ｄ　Ｓに対
応する、ＮＣＩＢ　１１６４７からの枝切り酵素の量を
添加した。第二のシリーズではＩ　ＰＵ／Ｐ　ＤＳに対
応する、ＮＣＩＢ　１１７７７からの枝切り酵素の量を
添加した。試料混合物を一定時間間隔で採取し、各試料
中のデキストロース含有率（２））をＨＰＬＣによって
測定した。下記の結果が得られた。

以下余白 ＮＣＩＢ　１１６４７からの枝切り酵素ＮＣＩＢ　１１
７７７からの波切）Ｗｌ累これらの結果は、次の事実を
示している。すなわち、−約４．４で糖化を開始した場
合、ＮＣｌＢ１１６４７およびＮＣＩＢ　１１７７７か
らの波切シ酵素については、類似の結果を得ることがで
きる。−約４．０以下では、　ＮＣＩＢ　１１６４７か
らの波切）酵素とは異ってＮＣＩＢ　１１７７７からの
波切シ酵素はその活性を保持している。

例５ 例４で記載した少量の基質を、ｐ）１４．５　Ｋ調整し
次いで６０℃に加熱した＠０．１１３ＡＧ単位／ＰＤ８
に相轟する量およびＮＣＩＢ　Ｈ６３９から得られた枝
切り酵素の変化量を添加した。反応混合物を採取し、例
４におけると同様に分析し友。

以下余白 これらの結果は次の事実を示している。　３０ｑ６Ｄ、
Ｓ、マルトデキストリンを６０℃でかつ−４〜４．５で
糖化することにより、９７の過剰ＤＸが、グルコアミラ
ーゼの１７ＤＢ当たシ０．１１３ＡＧおよび本発明の波
切シ酵素１ｐＤ８当たｐ少なくともＩＰＵからなる酵素
系について達成できる。

【図面の簡単な説明】

図は、種々の−および温度における本発明の酵素のゾル
ラナーゼ活性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、全ての実施上の目的に対し、適当な栄養培地中で￥
   バチルス￥・￥アシドプルリティクス￥（Ｂａｃｉｌｌ
   ｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｕｓ）ＮＣＩＢ　
   １１６３９、又はその枝切り酵素産生突然変異株と同一
   でありかつそれを含有する菌株の培養並びに培養物を含
   む培地から枝切り酵素を回収することによって得られる
   新規枝切り酵素の有効量並びにグルコアミラーゼ及びベ
   ータアミラーゼから成る群から選択した糖化酵素を含む
   酵素系の存在で澱粉または澱粉加水分解生成物の糖化を
   行なうことを特徴とする、デキストロース及び／または
   マルトースを含むシロップに澱粉を変える方法。 ２、更に、乾物重量で少なくとも３０％の澱粉加水分解
   生成物を糖化する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、糖化を４．０〜４．５のｐＨ範囲で少なくとも６０
   ℃の温度で行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、グルコアミラーゼ及びベータアミラーゼの用量が乾
   物１ｇ当りそれぞれ０．０５〜０．５ＡＧ単位及び０．
   ００５〜０．３ベータアミラーゼ単位の範囲にある特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ５、枝切り酵素の用量が乾物１ｇ当り０．００５〜５プ
   ルラナーゼ単位の範囲にある特許請求の範囲第４項記載
   の方法。