JPH0428356B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は殿粉の糖化方法に係り、特に殿粉をぶ
どう糖に加水分解するのに好適な糖の製造方法及
びその製造プラントに関する。 〔従来の技術〕 殿粉からぶどう糖や異性化糖等の甘味料を製造
するには、殿粉をまずα−アミラーゼによりデキ
ストリンに加水分解し、しかるのちグルコアミラ
ーゼで異性化している（化学便覧応用編改訂２
版）。 このように、α−アミラーゼとグルコアミラー
ゼは殿粉加工工業において中心的役割をもつ酵素
である。 通常の酸素は常温以下でしか安定でないが、糖
製造ライン内の雑菌繁殖や反応の高速化のため60
℃以上のより高い温度域で反応させることが望ま
れてきた。さらに、原料の殿粉スラリは酸性の不
純物を含むため、PH４〜５の酸性を呈する。この
ため、酸性下で耐熱性を有する酸素が望まれてき
た。 現用のα−アミラーゼは耐熱性を有するが、反
応の最適PHが中性域にあり、かつ安定域も中性で
ある他、数mMのカルシウムイオンの共存下では
じめて耐熱性を発揮できる。先に、我々は、耐熱
性，耐酸性を有し、カルシウム剤の添加を必要と
しない新型のα−アミラーゼを見い出している。
このα−アミラーゼを用いれば、液化工程で酸性
のままカルシウムイオン無添加で、高温で反応さ
せることができる。 一方、グルコアミラーゼは前述したように、液
化反応に引きつづきデキストリンをぶどう糖に加
水分解する際用いられる。現在公知のグルコアミ
ラーゼは酸性下では耐熱性を有するものは知られ
ていない。 このため、液化反応で、耐酸，耐熱性α−アミ
ラーゼを用い、酸性のまま高温で反応させても糖
化工程でいつたん中和して反応しなければならな
い。したがつて、中和工程が必要となるだけでな
く、かつ糖製品化の際に行うイオン交換樹脂によ
る脱塩工程に大きな負担となる。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、上述の従来技術の欠点を解決
し、でん粉を原料としてぶどう糖を製造するにあ
たり特に、PH４〜５の酸性条件下、60〜70℃の高
温下で作用可能なグルコアミラーゼを糖化酵素と
して用いることにより冷却及び中和工程が不用な
糖の製造方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、α−アミラーゼを用いて殿粉を液化
した後、グルコアミラーゼを用いて生成したデキ
ストリンを糖化する殿粉の糖化方法において、原
料殿粉を酸性で、かつ実質的に金属イオンの添加
なしに、70℃以上の温度で反応させて液化及び糖
化することにあり、具体的には上記のα−アミラ
ーゼとしては、作用最適PHが２〜5.5，PH4.5にお
ける80℃での活性半減期が80時間以上の耐酸性及
び耐熱性を有し、耐熱性発揮に10μM以下のカル
シウムイオンで活性を有する耐熱性α−アミラー
ゼを、またグルコアミラーゼとしては、作用最適
PHが４〜５，PH4.5における70℃での活性半減期
が３時間以上、65℃での活性半減期が120時間以
上の耐酸性及び耐熱性を有し、耐熱性発揮にカル
シウムイオンを必要としない耐熱性グルコアミラ
ーゼを用いることにある。かかるα−アミラーゼ
はクロスツリジウム属に属する微工研菌寄第7918
号の好熱性嫌気性細菌より産生することができ、
グルコアミラーゼはクロスツリジウム属に属する
微工研菌寄第8737号の好熱性嫌気性細菌より産生
することができる。 本発明者らは上記した従来の糖化方法の欠点を
改善するため、酸性下で高い耐熱性を有する新し
いグルコアミラーゼを得ることを目指し、酵素生
産用微生物の探索を行つた。 その結果、有機廃棄物の中温メタン発酵スラリ
中から分離した中等度好熱嫌気性細菌Ｇ−00003
が上記の条件を満たす新規な耐熱性グルコアミラ
ーゼを生成することを見い出した。そして、本菌
の培養液から本酵素を分離し、これを用いて殿粉
の糖化方法について鋭意検討した結果、本発明に
至つた。 本発明の第１の特徴は、本発明に係る新規耐熱
性グルコアミラーゼを用い、カルシウム剤無添加
で、かつ原料殿粉液を中和することなく酸性のま
ま糖化することである。 第２の特徴は、耐酸性，耐酸性，低カルシウム
要求性のα−アミラーゼを用いて液化した液化処
理液を、耐酸性，耐熱性を有するグルコアミラー
ゼで糖化することである。 したがつて、実質的に中和せずにかつ高速に糖
化できることとなり、糖化後の脱塩工程への負荷
が大巾に軽減されると共に、糖製造ラインの雑菌
繁殖も防止できる。 本発明の第３の特徴は、耐熱性，耐酸性，低カ
ルシウム要求性を有するα−アミラーゼと本発明
に係るグルコアミラーゼの同時存在下で殿粉を液
化，糖化することである。 本発明に使用できる、ぶどう糖の出発原料とな
る殿粉の種類は、特に限定されるものではなく、
例えば、馬鈴薯，甘しよ，とうもろこし，タピオ
キ，小麦などの公知の殿粉に十分適用できる。殿
粉の液化方法もα−アミラーゼを用いる酵素法で
も、化学的酸加水分解法であつてもよい。 本発明に係るα−アミラーゼの耐熱性保持を目
的とするカルシウム剤の添加は、仕込水に蒸溜水
を用い、かつ完全に脱カルシウム処理した試薬級
のアミロースを用いる場合を除外すれば必要な
い。したがつて、通常の水道水を用いれば、後に
行う陽イオン除去を目的とする脱塩工程は事実上
必要ない。液化に際してのPH調整は、本α−アミ
ラーゼの最適反応域及び安定域とほぼ一致してい
るため通常は必要ない。このため、酸性の殿粉ス
ラリーをPHの調整をせずに反応できる。 原料殿粉濃度は、原料の種類，品質，液化処理
液の用途によりことなるが、従来公知の10〜40％
の範囲内にある。 反応温度は、本α−アミラーゼの耐熱性から
100℃以下で用いられる。酵素の反応速度と耐熱
性を考慮すれば、70〜80℃で行うのが好ましい。
酵素の添加量は、反応槽内における原料殿粉の種
類及び滞留時間，反応温度，PH等により異なる
が、処理時間を0.5時間に固定した場合、80℃，
PH4.5にて馬鈴薯殿粉を限界デキストリンにまで
加水分解するには殿粉１Kgあたり約10⁵単位を必
要とする。ここで、α−アミラーゼ活性の単位は
Blue value法によるもので、酵素の特性の個所
で詳述する。 本発明に使用できる殿粉液化処理物すなわちデ
キストランは、酵素法による液化処理によつても
化学的な酸部分分解処理によるものでもよい。 糖化に際してのPHの調整は、液化処理の際、PH
４〜５の酸性で行われる限り、通常は必要ない。
液化処理液の濃度は、原料の種類，品質，用途に
よりことなるが、従来公知の10〜40％の範囲内に
ある。 反応温度は、本発明に係るグルコアミラーゼの
耐熱性から100℃以下で行われる。酵素の反応速
度と耐熱性を考慮すれば60〜80℃で行うのが好ま
しい。 カルシウムイオンの添加は本酵素の特性からし
て不要である。 酵素の添加量は、反応槽内における原料液化処
理液の質や濃度，滞留時間，反応温度，PH等によ
り異なるが、処理時間を70℃，PH4.5にて限界デ
キストリンを糖化率90％まで糖化するには、局方
馬鈴薯殿粉１Kgあたり、約120単位を必要とする。 ここで、グルコアミラーゼの活性単位の定義に
ついては、酵素の特性の個所で詳述する。 本α−アミラーゼと本グルコアミラーゼの同時
存在下で液化，糖化を行う場合には、温度，PH等
は両酵素で同一範囲内にあることから、両酵素の
特性を勘案して適宜選定した条件下で行う。 本発明に用いるα−アミラーゼを産生するクロ
スツリジウム属に属する細菌（Clostridium sp
RS−0001）は工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託している（受託番号；微工研菌寄第7918号
（FERM Ｐ−7918））である。まず、本菌の菌学
的性質の詳細を説明する。 Ａ 形態的性質 (1) 栄養細胞の形態 下記の殿粉・ペプトン培地の寒天平板上、嫌気
性範囲気中、60℃で２日間培養した場合、栄養細
胞は0.4〜0.8×２〜5μｍの大きさの直状の桿菌で
ある。３日間以上の培養では、上記の形状の栄養
細胞が単独に存在する他、連鎖するものも生ず
る。液体培養でも同様となる。 殿粉・ペプトン培地の組成 可溶性殿粉 1.5％ ペプトン 0.5％ 酵母エキス 0.5％ KH₂PO₄ 0.7％ Na₂HPO₄ 0.35％ MgSO₄・7H₂Ｏ 0.001％ 寒 天 2.0％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 水道水 PH6.4 (2) 胞子の有無 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養及び液体培
養で胞子の形成が認められる。 Ｂ 培養的特性 (1) コロニーの形態 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養でのコロニ
ーは、中心部がやや隆起した扁平な円形となり、
周縁部は全縁である。色素生成は見られず、表面
に光沢を有し乳白色不透明である。また、粘着性
を有する。 (2) 肉汁培地の寒天平板培養及び穿刺絶養生育し
て殿粉・ペプトン培地と同様のコロニーを生ず
る。 肉汁寒天培地組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食塩 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 寒 天 1.5％ 蒸留水 PH6.0 (3) 肉汁培地の穿刺培養 水素と炭酸ガスを含むガスの発生を伴つて生育
し、このため寒天培地が２〜３個所で分断され
る。 (4) 肉汁液体培養 嫌気的範囲気下でのみ生育し、培養液が自濁す
る。 肉汁培地の組成 肉エキス 1.0％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.0 (5) 肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。 肉汁・ゼラチン培地の組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ ゼラチン 15％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.0 (3) リトマスミルク培養 ガス発生を伴い、固く凝固し、酸の生成により
赤変する。 Ｃ 生理的性質 (1) 生育の温度範囲 40〜63℃で生育する。30℃では生育は認められ
ず、60℃付近で良好。 (2) 生育のPH範囲 PH５〜７。5.6付近が良好。 (3) 酸素に対する態度 偏性嫌気性 (4) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Laifson変法） 空気範囲気中では生育みられず陰性。流動パラ
フイン重層による嫌気性条件下では菌が生育し、
酸を生成して培養液が黄色となる。 培地組成 ペプトン 0.2％ グルコース 1.0％ 食 塩 0.5％ K₂HPO₄ 0.03％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ ブロムクレゾールパープル 0.002％ 寒 天 0.3％ 蒸留水 PH6.0 陰性。 (5) VPテスト 陰性。 (6) MRテスト 陽極，赤変化する。 (7) インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できない。 (8) 硫化水素の生成 陰性（Kligrerの培地使用において）。 (9) 殿粉の加水分解 陽性。可溶性殿粉だけでなく、馬鈴薯殿粉など
粒状殿粉も分解する。 (10) クエン酸の利用 陰性（Simmons培地使用において）。 (11) アンモニウム塩の利用 ペプトン水に生育しないため測定できない。 (12) 色素の菌体外生成 陰性。 (13) ウレアーゼ 陰性。 (14) オキシダーゼ活性 陰性。 (15) カタラーゼ活性 陰性。 (16) 糖の資化性 糖の資化性及びダラーム管を用いたガス発生有
無の観察結果を下表に示す。

【表】 (17) 無機塩培地への生育 生育認められず。 (18) 有機酸の生成 各種培地から生成する有機酸組成を第２表に示
す。

【表】

【表】 供試液体培地の組成 炭素源 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.4 これらの結果をHoldemanの嫌気性細菌分類マ
ニユアルに照合したところ、嫌気性であり、桿菌
であり且つ胞子を形成することからクロスツリジ
ウム属に属する細菌と同定されたが、生育温度範
囲と糖の資化性及びガスの生成状況を全て具備す
るものが公知のどの菌種にもなく、新種の細菌と
判定した。 次に、本発明なる耐熱性α−アミラーゼの酵素
的特性について記す。 尚、α−アミラーゼ活性の測定方法は次のよう
に行つた。 Blue value法（日本化学会編：実験化学講座
24巻、生物化学、p279、丸善書店、1969）に
よる糊精化力を測定した。本法は、殿粉の分子が
加水分解されるのに伴い、殿粉−より素complex
に基づく青色の発色量が、分子量の低下に比例し
て減少する原理を応用したものである。まず、２
mg／mlの殿粉溶液２ml及び0.1Mくえん酸緩衝液
（PH4.0）１mlを試験管に取り、60℃水浴中で５分
間振盪した。次いで、粗酸素液として培養濾液１
mlを加え、30分間反応させた。反応後、反応液
0.4mlを採取し、直ちに0.5M酢酸溶液２mlと混合
して酵素反応を停止させた。次のその１mlを10ml
の1/3000Ｎよう素溶液中に加え、680nmでの吸光
度を分光光度計を用いて測定した。一方、酵素液
を加えた直後の反応液を採取して同様に発色さ
せ、吸光度を測定した。なお、殿粉としては重合
度約2000のアミロースを用いた。 α−アミラーゼ活性は次式により算出した。 α−アミラーゼ活性（単位）＝0time反応液の吸光度−3
0分反応液の吸光度／0time反応液の吸光度×10 (1) 作用及び基質特異性 本酵素は、馬鈴しよ，とうもろこし，甘しよ等
の殿粉を加水分解する液体型α−アミラーゼであ
る。 (2) 至適PH 第１図に、従来公知の代表的なα−アミラーゼ
の作用PH曲線を示す。曲線４で示した小笠原等の
バチルス・ズブチリス（J.Biochem.67．65.1970
年）及び曲線６で示した斉藤等のバチルス・リチ
エニホルミス（特開昭48−35083号公報）を起源
とするα−アミラーゼは、PH４〜11に好適域を有
する（最適PHでの活性の80％を有するPH域とす
る）。従来公知の酸性α−アミラーゼのうち、最
も酸性側で活性の高い田中等によるバチルス・リ
チエニホルミス起源α−アミラーゼ（特開昭52−
151970号公報、曲線３）では、好適域が3.5〜6.3
にあり、PH２で全く活性を示さない。 これに対し、本発明なるα−アミラーゼ（曲
線１）ならびにα−アミラーゼ（曲線２）の60
℃における最適PH域は、いずれも４付近にあり、
かつ好適PHはそれぞれ２〜5.7，２〜6.3にあつ
て、従来の酸性α−アミラーゼにくらべ、さらに
酸性側でも高い活性を有する。すなわち、PH２で
は、従来の酸性α−アミラーゼが全く活性を示さ
ないのに対し、本発明のα−アミラーゼはそれぞ
れ95％，81％の高い活性を示す。 なお、酵素反応は次の反応系を用いた。 酵素液：0.6〜1.3μｍ／ml 基質：アミロース１mg／ml クエン酸緩衝液：0.025M 上述したように、本発明α−アミラーゼは従来
の酸性α−アミラーゼと作用PH域を異にすること
から、新しいα−アミラーゼであることは明らか
である。 (3) PH安定性 本発明で用いるα−アミラーゼ及びを、PH
２，４，６，７の各PH（0.025Mクエン酸緩衝液）
下で、60℃，30分間インキユベートした。反応液
を稀釈してPHを4.0に調整し、アミロースを基質
として残存活性を測定した。その結果両α−アミ
ラーゼは、上記のPH処理で完全に活性が保持され
ていた。したがつて、本α−アミラーゼは酸性域
でも安定性が高い特徴を有している。 (4) 至適温度 第２図に示す如く、本発明α−アミラーゼ
（曲線１１）及び（曲線１２）の至適PH4.0にお
ける至適温度は、いずれも80℃付近である。好適
温度（最適温度での活性の80％を有する温度域と
する）は65〜87％である。なお、反応にはくえん
酸緩衝液0.025Mを用いた。 (5) 熱安定性 本発明で用いるα−アミラーゼをPH6.0で
20μM塩化カルシウムの存在下に60〜97℃に加熱
処理し、残存活性を測定した。これをもとに各温
度における活性半減期を求め、その結果を第３図
に示す。80℃及び90℃における活性半減期（基質
無添加）はそれぞれ８時間，0.5時間であり、熱
安定性にすぐれている。α−アミラーゼについ
ても90℃における活性半減期は約0.5時間と、α
−アミラーゼと同等の耐熱性を有する。一方、
従来のα−アミラーゼの例とし、バチルス・リチ
エニホルミスに属するα−アミラーゼ生産菌、及
びバチルス・ズブチリスに属するα−アミラーゼ
生産菌の培養液から調製した部分精製α−アミラ
ーゼ標品を用い、カルシウム濃度20mMにおいて
半減期を実測した。その結果を第３図に付記す
る。反応は、くえん酸緩衝液を用いて、両α−ア
ミラーゼの最適PHである6.0で行つた。前者の80
℃における半減期は0.6時である。本発明で用い
るα−アミラーゼの耐熱性（曲線２１）は、従来
公知のサーマス属の耐熱性α−アミラーゼには及
ばないが、バチルス属のα−アミラーゼ（バチル
ス・リチエニホルシスSP.を起源とする耐熱性α
−アミラーゼ，曲線２２）とくらべて遜色ない。 (6) 液熱性に及ぼす金属塩の影響 本発明で用いるα−アミラーゼの耐熱性に及
ぼす金属塩の影響を第３表に示す。α−アミラー
ゼの水溶液に各種の金属塩を5mM濃度になる
様に添加し、加熱処理を行つて活性を測定した。
そして、加熱処理前に対する加熱処理後の活性、
すなわち残存活性を％で表示した。加熱処理及び
活性測定は以下の条件で行つた。 加熱処理条件 PH6.0 加熱温度：80％ 保持時間：30分

【表】 活性測定は、試料液を希釈後、以下の条件下で
行つた。なお、各金属塩を本添加濃度で添加して
も、活性測定に影響のないことを確認している。 活性測定条件 PH4.0（0.025Mくえん酸緩衝液） 活性測定温度：60℃ 第１表から明らかに、カルシウムイオンに保護
効果が認められるのに対し、ナトリウム，カケ
ル，コバルト，亜鉛及びマンガンの各イオンは耐
熱性を低下させる。また、本α−アミラーゼは
0.5μMのEDTAで耐熱性を失うことも確認してい
る。 本α−アミラーゼのカルシウム要求濃度は第４
図の曲線３１に示すように、100μM（4ppm）で
あり、水道水中のカルシウム濃度で十分安定化さ
れる。さらに本酵素は1μM以下のカルシウム濃
度においても65％の活性を保持している。また、
α−アミラーゼもα−アミラーゼと同等のカ
ルシウム要求性を有している。 これに対し、バチルス・リチエニホルミスに属
するα−アミラーゼ生産菌から部分精製したα−
アミラーゼは、第４図の曲線３２に示すように、
30mMのカルシウムイオンを必要とする。なお、
加熱処理は両酵素ともPH６，80℃で30分間加熱
し、活性測定は各々の最適にて60℃で行つた。 一方、バチルス・ズブチリスの耐熱性α−アミ
ラーゼでは、カルシウム必要濃度は３〜10mMで
ある（特開昭51−44690号公報、特開昭58−34117
号公報）。 したがつて、本発明α−アミラーゼは、従来公
知の耐熱性α−アミラーゼに比べ著しくカルシウ
ム要求性が低い。 (7) 精製方法 実施例において詳述するので、ここでは簡単な
説明にとどめる。 本発明で用いるα−アミラーゼ生産菌を、殿
粉，ペプトン及び酵母エキスを含有する液体培地
に接種し、嫌気条件下で60℃に１〜３日間培養す
る。培養液を遠心分離等により菌体及びそれ以外
の不溶物資を除したいわゆる培養濾液を得る。次
いで、培養濾液を、モレキユラシーブ膜濾過，イ
オン交換クロマト，ゲル濾過クロマト，塩析等の
公知の方法を適宜利用して、本発明α−アミラー
ゼを濃縮するとともにそれ以外の不純物を除く。 (8) 分子量 本発明α−アミラーゼの分子量は未確認である
が、モレキユラシーブ膜濾過における挙動から、
分子量は20000以上と推定される。 以上述べたことから明らかなように本発明で用
いる耐熱性α−アミラーゼは、特に作用PH並びに
カルシウム要求性において、従来の嫌気性細菌の
生産する耐熱性酵素と著しく異なる。 次に、本発明で用いるグルコアミラーゼを産生
するClostridium spG−0005は工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託している（受託番号：；微
工研菌寄第8737号（FERM Ｐ−8737））。まず、
本菌の菌学的性質の詳細を説明する。なお、以下
の記載において％は特に指示しない限り重量％で
ある。 Ａ 形態的性質 (1) 栄養細胞の形態 下記のデキストリン・ペプトン培地の寒天平板
上、嫌気性範囲気中、60℃で２日間培養した場
合、栄養細胞は0.3〜0.5×２〜4μmの大きさの直
状の桿菌である。上記の栄養細胞が単独あるいは
連鎖して存在する。液体培養においても同様とな
る。 デキストリン・ペプトン培地の組成 デキストリン 1.5％ ペプトン 0.5％ 酵母エキス 0.5％ KH₂PO₄ 0.7％ Na₂HPO₄ 0.2％ MgSO₄・7H₂Ｏ 0.001％ 寒 天 2.0％ オチグリコール酸ナトリウム 0.1％ 水道水 PH6.0 (2) 運動性の有無 運動性は認められない (3) 胞子の有無 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養において胞
子の形成が認められる。胞子は栄養細胞内端部に
形成され、直径0.5μｍ程度の球状をなしている。 (4) グラム染色性 陰性 Ｂ 培養的特性 (1) コロニーの形態 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養でのコロニ
ーは、中心部がやや隆起した扁平な円形となり、
周縁部は不規則である。色素は産生せず、乳白色
半透明である。 (2) 肉汁寒天平板培養 生育は認められない 肉汁寒天培地組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 寒 天 2.0％ 蒸留水 PH6.0 (3) 肉汁寒天斜面培養 生育は認められない (4) 肉汁寒天穿刺培養 穿刺線にそつてわずかに増殖していることが観
察される。色素の産生は認められない。 (5) 肉汁液体培養 生育は認められない 肉汁培地の組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.01％ 蒸留水 PH6.0 (6) 肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。ゼラチンの液化も認めら
れない。 肉汁・ゼラチン培地の組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ ゼラチン 15.0％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.0 (7) リトマスミルク培養 酸を生成して赤変し、固く凝固する。ガスの発
生が認められる。 Ｃ 生理的性質 (1) 生育の温度範囲 49〜64℃で生育する。46℃，69℃では生育は認
められない。57〜61℃付近で良好に生育する。 (2) 生育のPH範囲 PH4.8〜7.5で生育する。PH6.0付近で良好に生育
する。 (3) 酸素に対する態度 偏性嫌気性 (4) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Laifson法） 陰性。空気雰囲気中及び流動パラフイン重層に
よる嫌気性条件下共にガス生成を伴つて生育し、
酸の生成により黄色となる。空気雰囲気中での培
養においては、気相境界部より約１cm下より底部
にかけて生育した。 培地組成 ペプトン 0.2％ ぶどう糖 1.0％ 食 塩 0.5％ K₂HPO₄ 0.03％ ブロムクレゾールパープル 0.002％ 寒 天 0.3％ 蒸留水 PH6.0 (5) 硝酸塩の還元 陰性 (6) VPテスト 陰性 (7) MRテスト 陽性。赤変化する。 (8) インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できない。 (9) 硫化水素の生成 陰性（Kligrerの培地使用において）。 (10) 殿粉の加水分解 陽性。 (11) クエン酸の利用 陽性（Simmons培地使用において）。 (12) アンモニウム塩の利用 ペプトン水に生育せず、測定できない。 (13) 色素の菌体外生成 陰性。 (14) ウレアーゼ 陰性。 (15) オキシダーゼ 陰性。 (16) カタラーゼ活性 陰性。 (17) 糖の資化性 糖の資化性及びダーラム管を用いたガス発生有
無の観察結果を第１表に示す。表中、資化性及び
ガスの生成が認められた場合には＋，認められな
い場合には−の記号で示した。

【表】

【表】 糖資化性試験用液体培地組成 炭素源（糖） 1.0％ ペプトン 1.0％ NaCl 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.0 (18) 無機塩培地への生育 生育は認められない。 これらの結果をバージーの細菌分類マニユアル
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology 8th Edition）に照合したところ、
桿菌であり、嫌気性であり且つ硫化水素の生成が
陰性であることからクロスツリジウム属に属する
細菌と同定されたが、生育温度範囲と糖の資化性
とを全て具備するものが公知のどの菌種にもな
く、新種の細菌と判定した。 次に、本発明なる耐熱性グルコアミラーゼの酵
素的特性について記す。 なお、グルコアミラーゼ活性の測定は次のよう
に行つた。 グルコアミラーゼ活性測定の基質には可溶性殿
粉（和光純薬製、生化学用）を用いた。まず、５
％可溶性殿粉溶液0.5ml，PH4.5の0.1M酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液0.5ml，純水１ml，酵素溶液0.5
mlを混合し、60℃で30分間酵素反応を行わせた。
次いで、反応液中のぶどう糖量をグルコース分析
器（米国，イエロー・スプリングス・インスツル
メント・カンパニー（Yellow Springs
Instrument Company）社製、グルコースオキシ
ダーゼ法により測定する。）を用いて測定した。
グルコアミラーゼ活性の１単位は、上記測定条件
下で１分間に1μmolのぶどう母を生成する能力と
定義した。 (1) 調製方法 実施例において詳細に説明するので、ここでは
簡単な説明にとどまる。 本発明になるクロスツリジウム属細菌Ｇ−0005
菌を、デキストリン，ペプトン及び酵母エキスを
含有する液体培地に接種し、嫌気条件下、60℃に
て１〜３日間培養する。培養液を遠心分離等によ
り菌体及びそれ以外の不溶物質を除去したいわゆ
る培養濾液を得る。次いで、培養濾液を、モレキ
ユラーシーブ膜濾過、塩析イオン交換クロマト、
ゲル濾過クロマト等、公知の方法を適宜利用して
本発明のグルコアミラーゼを濃縮するとともに、
それ以外の不純物を除く。 なお、液体培養における液体培地の炭素源とし
ては、上記デキストリンに限るものではなく、可
溶性殿粉，馬鈴薯，殿粉，コーンスターチ，甘し
よでん粉廃糖みつ等を用いてもよい。また、その
他の栄養成分も上記に限定するものではなく、コ
ーンステイープリカー，各種アミノ酸，ビタミ
ン，各種塩等を単独もしくは混合して用いてもよ
い。 (2) 作用及び基質特異性 本酵素は、馬鈴薯，とうもろこし，甘しよ等の
殿粉、およびこれを加水分解して得た可溶性殿
粉，デキストリン，マルトース等をぶどう糖に加
水分解するグルコアミラーゼである。マルトース
基質の場合、ぶどう糖生成速度は可溶性殿粉基質
の約1/2である。 (3) 至適PH 本酵素の60℃における作用PH曲線を第１図に示
す。本酵素の60℃における最適PH域は４〜５にあ
り、かつ好適PHは（最適PHでの活性の80％を有す
るPH域とする）3.8〜5.7にある。なお、反応の際
のPH緩衝液としては、塩化カリウム−塩酸（PH
2.0），グリシン−塩酸（PH2.5〜3.5），Ｐ：P′−ジ
メチルグルタル酸−トリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン−２−アミノ−２−メチル−１：３−プ
ロパンジオール（以下「GTA」と略称）（PH3.5
〜９）の0.05M緩衝液を用いた。 (4) PH安定性 本発明のグルコアミラーゼをPH２，３，４，
4.5，５，６，７，９の各PH下（0.05酢酸−塩酸、
及び0.05M GTA緩衝液を使用）で70℃，30分間
インキユベートした。そののち、反応液を稀釈
し、PH4.5に調製したのち、可溶性殿粉を基質と
して残存活性を測定した。その結果を第２図に示
した。本発明のグルコアミラーゼはPH4.5〜5.0の
範囲で完全に活性が保持されていた。したがつ
て、本グルコアミラーゼは酸性領域ですぐれた安
定性を有する酵素であることがわかつた。 (5) 至適温度 本発明のグルコアミラーゼの活性をPH4.5の条
件下、40，50，60，65，70，75℃の温度にて測定
したところ、第３図に示す結果を得た。本結果よ
り、至適温度は70℃付近にある。好適温度（最適
温度での活性の80％を有する温度域とする）は53
〜73℃である。

【表】 (6) グルコアミラーゼ活性に及ぼす金属塩の影響 本発明のグルコアミラーゼの活性に及ぼす金属
塩の影響を表４に示す。グルコアミラーゼ活性の
測定において各種の金属塩を5mMになるように
添加した。そして、金属塩無添加に対する活性を
％で表示した。 なお、アンモニウム塩及びEDTA添加の場合
についても表４中に附記した。マグネシウムイオ
ン，カルシウムイオン，カリウムイオンがグルコ
アミラーゼの活性化作用を有することが認められ
る。ニツケルイオン，鉄イオンには阻害作用が認
められる。

【表】 活性測定条件 PH5.0（0.1Mクエン酸−第２クエン酸ナトリウ
ム緩衝液）活性測定温度：60℃ (7) 熱安定性 本発明のグリコアミラーゼを基質無添加下、PH
4.5にて、60〜80℃の加熱処理を行い、一定時間
毎（20，40秒，１，２，４，10，20，40分，１，
２，４，６，８，16時間，１，２，４，７，10，
15，20日）に処理液の一部を採取し、液中のグル
コアミラーゼ活性を60℃，PH4.5にて測定した。
これをもとに各温度における活性半減期を求め、
その結果を第４図に示した。70℃及び75℃におけ
る基質無添加下での活性半減期はそれぞれ、６時
間，１分間である。本グルコアミラーゼはこれま
で公知のグルコアミラーゼに較べ高度の耐熱性を
有している。一方、PH4.0，4.3，4.5，5.0，6.0の
各PHにおける基質無添加下、70℃での活性半減期
を求め、第３表に示した。この結果から、本グル
コアミラーゼは、クロスツリジウム・サーモアミ
ロリテイクム（Clostridium
thermoamylolyticum）、サーモマイセス・ラヌ
ギノスス（Thermomyces lanuginosus）、及び
タラロミセス・デユポンテイ（Talaromyces
duponti）により産生されるグルコアミラーゼよ
りも特に、PH４〜５の酸性領域においてすぐれた
耐熱性をもつことを示す。 (8) 耐熱性に及ぼす金属塩の影響 本発明のグルコアミラーゼの耐熱性に及ぼす金
属塩の影響を第５表に示す。グルコアミラーゼの
水溶液（0.05M 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液に
溶解、PH4.5）に各種の金属塩を5mM濃度になる
ように添加し、70℃，１時間の加熱処理を行つた
のち、PH4.5、60℃でクルコアミラーゼ活性を測
定した。そして、加熱処理前に対する加熱処理後
の活性、すなわち残存活性を％で表示した。 第５表から、ニツケルイオン，マンガンイオ
ン，マグネシウムイオンに保護効果のあることが
認められる。コバルトイオン，カルシウムイオン
については保護効果は認められない。亜鉛イオン
は耐熱性を著しく低下させる。

〔作用〕

ぶどう糖や異性化糖を製造するには、まず、原
料である殿粉をα−アミラーゼで液化し、その後
グルコアミラーゼで糖化するのであるが、液化の
際、原料の殿粉を20〜40％の高濃度に仕込むた
め、液のPHは酸性を呈する。このため、従来のα
−アミラーゼ及びグルコアミラーゼを用いる場合
には、作用PH域が中性域にあるため、アルカリで
中和しなければならない。これに対し本発明で用
いる耐熱耐酸性のα−アミラーゼ及びグルコアミ
ラーゼは、酸性域でも高活性を有することから、
液化での中和を行なうことなく酸性の状態のまま
（この場合PH調整も必らずしも必要とならない）
液化及び糖化を行なうことが可能であり、ひいて
は反応後の脱塩工程への負荷を大幅に軽減でき
る。 また、本発明で用いる新規なグルコアミラーゼ
は80℃以上の高温でも活性を有することから、80
℃の高温で液化した後、そのまま冷却しないで用
いることができる。 〔発明の実施例〕 以下、本発明の実施例を示し、さらに詳しく説
明する。 実施例 １ 可溶性殿粉1.5％，ポリペプトン0.5％，酵母エ
キス0.5％，リン酸第１オリウム0.7％，リン酸第
２ソーダ0.35％、硫酸マグネシウム・ク水和物
0.01％，チオグリコール酸ナトリウム0.1％及び
水道水を含む液体培地（PH6.5）15.75Kgを、内容
積５の培養槽５基に3.15Kgずつ分注し、120℃
で20分間殺菌する。これに同上培地で嫌気的に培
養した本発明者等により分離せるクロスツリジウ
ム属の菌体懸濁液350ｇを各槽毎に添加した。次
いで、ガス出口に水封トラツプを付し、発酵槽内
気相部をアルゴンガスで十分置換後、遮気条件下
で培養する。培養液のPHは6.0に自動調整し、温
度も60℃に自動調整する。22時間培養後、培養物
を合せ6000rpmで遠心分離し、菌体を除去する。
この上澄液は60単位／ｂの比活性を示した。 次に、上記上澄液14.6Kgを２℃に冷却したの
ち、コーンスターチ300ｇ及びセライト（和光純
薬製）300ｇを入れ、攪拌下、10分間接触させた。
次いで、減圧濾過により、コーンスターチ及びセ
ライトを回収し、更に２℃に冷却した純水３で
洗浄した。次いで、あらかじめ、65℃にあたため
た5mMの塩化カルシウムを含む0.05M トリス、
塩酸緩衝液（PH7.5）に上記コーンスターチ及び
セライトを分散させ、水浴上で65℃に５分間保持
したのち、減圧濾過により固液分離し、更に固形
物を１の上記緩衝液（65℃）で洗浄し、濾過液
及び洗浄液を合わせて４を得た。次に上記濾過
を２℃に冷却後、モレキユラーシーブ膜（分画分
子量：20000）で濾過して濃縮し、更に濾過によ
り不溶物を除いて濃縮液400mlを得た。この濃縮
液は1.5×10³単位／mlのα−アミラーゼ活性を示
した。 次に、上記濃縮液を、ジエチルアミノエチル化
架橋アガロースゲル（DEAEセフアロース・CL
−6B，フアルマツア社製）を用いたイオン交換
クロマト（カラムサイズ：φ50×210mm）により
精製した。まず、上記の濃縮液を、0.05Mトリス
塩酸緩衝液（PH7.5）で２回透析したのち、不溶
物を濾過し、同じ緩衝液で緩衝化したゲルカラム
にチヤージし、洗浄した。次いで、緩衝液中の塩
化ナトリウム濃度を直線勾配で上昇しつつ展開し
た。その結果、塩化ナトリウム濃度0.04Mと
0.08Mの位置にα−アミラーゼ活性を有する２つ
のピークが認められた。0.04Mの位置に溶出した
α−アミラーゼの活性量は吸着全活性の約30
％、0.08Mの位置に溶出したα−アミラーゼの
それは約60％であつた。両活性フラクシヨンを純
水中で透析後、凍結乾燥してα−アミラーゼ、
及びα−アミラーゼを得た。培養液の遠心上澄
基準の活性回収率は、それぞれ17％，32％であつ
た。 次にデキストリン1.5％，ポリペプトン0.5％，
酵母エキス0.5％，りん酸第１カリウム0.7％，り
ん酸第２ナトリウム0.2％，硫酸マグネシウム・
７水和物0.001％，チオグリコール酸ソーダ0.1％
及び水道水を含む液体培地（PH6.0）120Kgを内容
積20の培養槽10基に12Kgずつ分注し、120℃で
15分間殺菌した。それぞれの培養槽に本発明に係
るグルコアミラーゼ生産菌であるclostridium
SPG−0005（微工研菌寄第8737号）の菌体懸濁液
0.5Kgを添加した。次に、気相部分を窒素で置換
し、嫌気条件下、60℃，PH6.0で２日間培養した。
培養液を6000rpm，10分間遠心分離して菌体を除
去した。回収した上澄液をさらにガラス濾紙で濾
過し固形粒子フリーの培養濾液を得た。本液中に
は0.05単位／mlのグルコアミラーゼが含まれてい
る。 次に上記培養濾液115Kgをモレキユラシーブ膜
（ポアサイズ分子量20000）で加圧濾過し、さらに
洗滌して濃縮し12Kgの液を得た。本液を飽和度55
％で硫安塩析を行い、沈殿を遠心分離して回収し
た。これを0.005Mトリス−HC緩衝液（PH7.5）
に溶解し980ｇの液を得た。さらに本液を24時間
透析した。 次にDEAE−アガロースゲルを用いたイオン交
換クロマト（φ44×500mm）により精製し、グル
コアミラーゼ活性を有するフラクシヨン液360ml
を回収した。これをモレキユラシーブ膜で濾過し
濃縮して30単位／mlの酵素液160ｇを得た。さら
に、本液を凍結乾燥し架橋デキユトランゲルのカ
ラムでゲル濾過し、活性フラクシヨン40ｇを得た
（92単位／ml）。 次に、局法馬鈴薯殿粉10ｇと60℃温水90mlとの
混合物に前述の耐熱性α−アミラーゼ2000単位を
添加し80℃で３時間反応し、限界デキストンに転
換した。 次いで、上記の液化処理液に上述のグルコアミ
ラーゼ1000単位を添加し、PH4.5，70℃，３時間
反応して糖化した。 その結果、DE（Dextrose Equivalent Value DE＝直接還元糖（ぶどう糖として標示）／固形分×100 が95.8の糖化液を得た。 実施例 ２ 攪拌機を有する0.3容オートクレーブ内にと
うもろこし殿粉10ｇ、水道水90ｇ及び実施例１で
調製したα−アミラーゼ1000単位を添加し、攪拌
下、まず、オートクレーブ内気相部へゲージ圧２
Kg／cm²の水蒸気を排気弁開放下10秒間吹込み、次
いで、排気弁を閉め、コーンスターチスラリ内へ
蒸気を吹込み、内圧を1.1Kg／cm²に調節し１時間
保持した。次いで液化液をオートクレーブより取
出し、80℃まで冷却したあとα−アミラーゼ1000
単位を加え２時間反応させて液化液を調製した。 上記液化液に実施例１にて調製したグルコアミ
ラーゼ1000単位を加え、70℃で３時間反応した。 その結果、DEが93.2の糖化液を得た。なお糖
化後の反応液のPHは4.8であつた。 実施例 ３ 甘しよ殿粉10Kgについて、実施例１の手法によ
り液化及び糖化の反応を行つたところ、DE96.3
の糖化液が得られた。 実施例 ４ 局法法鈴薯殿粉10ｇに水道水90mlを加え70℃に
加温した。次いで、実施例１にて調製したα−ア
ミラーゼを2000単位及びグルコアミラーゼ1000単
位を加え、70℃５時間反応させた。反応終了後の
液PHは4.8であつた。反応液のDEは92.8であつた。 第９図は、本発明の糖製造方法を実施する製造
装置の１実施例を示す図である。本実施例では、
殿粉を原料として用いる。攪拌装置、PH調整機構
を有する殿粉スラリ調製槽１１に、水貯留槽１
８、殿粉貯留槽１９より、それぞれ水及び殿粉を
加えて攪拌し、殿粉スラリを調製する。ここで用
いる水としては、カルシウム塩を100μM程度含
むことが望ましい。通常、原料水として工業用
水，飲料用水道水等を用いれば特にカルシウム塩
添加を必要とすることはない。原料の殿粉は特に
限定されるものではなく、馬鈴薯殿粉，とうもろ
こし殿粉，甘しよ殿粉等を用いる。殿粉スラリの
濃度としては10〜40％にすることが望ましい。さ
らにあらかじめ、殿粉スラリを加熱糊化した場合
のPHを測定しておき、糊化後のPHが４〜５による
ようPH調整薬剤貯槽２２よりPH調整薬剤を加え、
調整しておくことが望ましい。しかしながら、通
常の場合、殿粉スラリを糊化するとその糊化液の
PHは４〜５を示すことが多く、薬剤添加を必要と
することは少ない。PH補正を終えた殿粉スラリに
α−アミラーゼ貯槽２１よりα−アミラーゼを加
え、十分に攪拌する。次いで、送液ポンプ３５に
より殿粉スラリをスラリ加熱器１５に移送する。
本スラリ加熱器では、殿粉スラリ中に直接蒸気が
注入され、瞬時に100〜105℃まで加熱され、直ち
に液化槽１６に移送される。液化槽１６では70〜
100℃に10〜60分間保持され、その間、殿粉の糊
化、及びα−アミラーゼによる液化が行われ、液
の粘度が急速に低下する。液化終了後、液化液は
送液ポンプ３８より、糖化槽１３に移送される。
糖化槽１３には攪拌装置、加温機構、PH測定装置
が設置されている。液化液にグルコアミラーゼ貯
槽２３よりグルコアミラーゼが供給され、攪拌
下、70〜80℃にて10〜50時間、酵素反応が行われ
る。すなわち、液化により生成したデキストリン
をグルコースに加水分解する。糖化終了後、糖化
液は送液ポンプ３６により糖化液貯槽１４に移送
し、後段の精製工程に移送するまでの間、貯蔵す
る。精製工程への移送の際には送液ポンプ３７に
より圧送する。 第１０図は、本発明になる糖製造方法を実施す
る製造装置の一実施例を示すフロー図である。本
実施例は、デキストリンを糖化原料としている例
である。原料のデキストリンはデキストリン貯槽
２０よりデキストリン液調整槽１２に供給され
る。さらに水貯留槽８より水を加えて、攪拌装置
３１により攪拌し、ロ形物濃度10〜80％のデキス
トリン溶液を調製する。次いで、デキストリン溶
液のPHを測定し、PH調整用薬剤貯槽２２よりPH調
整用薬剤を加えPH４〜５に調整する。次いで、グ
ルコアミラーゼ貯槽よりグルコアミラーゼをロ形
物当り１×10⁴〜５×10⁵単位加え、攪拌，混合す
る。そののち、送液ポンプ３５により糖化槽１３
に移送する。糖化槽１３は、攪拌装置３２、加温
装置及びPH測定装置を有している。デキストリン
溶液は糖化槽１３内にて70〜80℃に加温され、10
〜50時間保持される間にグルコアミラーゼにより
グルコアミラーゼに加水分解される。糖化終了
後、糖化液は送液ポンプ３６により糖化液貯槽１
４に移送し、貯蔵する。精製工程にあわせて、送
液ポンプ３７により供給する。 〔考案の効果〕 本発明によれば、原料の殿粉カラリーを中和せ
ず酸性のまま高温で反応できる。そのため、高速
で反応できかつ中和剤の添加やカルシウム塩の添
加が不要となり、製品糖液の脱塩工程への負荷が
大巾に軽減される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に用いるα−アミラーゼのPH特
性図、第２図は本α−アミラーゼの温度特性図、
第３図は本α−アミラーゼの耐熱性を示す特性
図、第４図は本α−アミラーゼのカルシウム添加
による耐熱性向上を示す特性図、第５図は、本発
明に用いるグルコアミラーゼのPH特性図、第６図
は本グルコアミラーゼのPH安定性を示す特性図、
第７図は本グルコアミラーゼの温度特性図、第８
図は本グルコアミラーゼの耐熱性を示す特性図で
ある。第９図は本発明の糖製造方法を実施する製
造装置の一実施例を示すフロー図、第１０図は他
の実施例を示すフロー図である。 １……本発明α−アミラーゼ、２……本発明
α−アミラーゼ、３……バチルス・ステアロサ
ーモフイラス起源α−アミラーゼ、４……バチル
ス・スブチリス起源α−フミラーゼ、５……バチ
ルス・リチエニホルミス起源α−アミラーゼ、６
……バチルス・リチエニホルミス起源α−アミラ
ーゼ、７……バチルス・リチエニホルミスspを起
源とする耐熱性α−アミラーゼ、８……バチル
ス・ズブチリスspを起源とするα−アミラーゼ、
１１……殿粉スラリ調製槽、１２……デキストリ
ン液調製糖、１３……糖化槽、１４……糖化液貯
槽、１５……スラリ加熱器、１６……液化槽、１
８……水貯留槽、１９……殿粉貯槽、２０……デ
キストリン貯槽、２１……αアミラーゼ貯槽、２
２……PH調整薬剤貯槽、３１，３２，３３，３４
……攪拌装置、３５，３６，３７，３８……送液
ポンプ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ α−アミラーゼを用いて殿粉を液化した後、
   グルコアミラーゼを用いて生成したデキストリン
   を糖化する殿粉の糖化方法において、原料殿粉を
   けん濁した液に前記α−アミラーゼとしてクロス
   ツリジウム属に属する微工研菌寄第7918号の好熱
   性嫌気性細菌より産生した耐熱性α−アミラーゼ
   を添加し、金属イオン無添加でかつ原料殿粉けん
   濁液のPHを調整することなく酸性のままで殿粉を
   液化し、生成したデキストリンをクロスツリジウ
   ム属に属する微工研菌寄第8737号の好熱性嫌気性
   細菌より産生した耐熱性グルコアミラーゼを用い
   てPHを調整することなく酸性のままで糖化するこ
   とを特徴とする糖の製造方法。