JPH0429358B2 - - Google Patents
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- JPH0429358B2 JPH0429358B2 JP59166980A JP16698084A JPH0429358B2 JP H0429358 B2 JPH0429358 B2 JP H0429358B2 JP 59166980 A JP59166980 A JP 59166980A JP 16698084 A JP16698084 A JP 16698084A JP H0429358 B2 JPH0429358 B2 JP H0429358B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す
物質の探索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の
確立にあるといえる。従来、癌に関して種々の薬
剤、治療法、試薬が開発されているが、これらは
いずれも癌細胞ばかりでなく、正常組織、正常細
胞にも影響を与え、如何に有効な薬剤とはいえ、
その副作用のために使用が著しく制限されている
のが現状である。 免疫反応（抗原―抗体反応）は、非常に特異性
が高いものであるが、従来のポリクローナル抗体
ではいかに吸収操作を繰り返しても、例えばリン
パ球間のサブセツトのような、非常にマイナーな
抗原決定基によつて区別されるものを認識するこ
とは困難であつた。Milsteinらによつて開発され
たモノクローナル抗体〔Ko¨hler，G.and
Milstein，C.：Nature，256，495（1975）〕は、
この壁を打ち破るものであり、癌細胞上の癌特異
抗原、あるいは癌関連抗原を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を得ることにより、正常組織へ
のダメージを与えずに癌細胞のみを特異的に排除
できるものと期待される。また、モノクローナル
抗体を用いた診断薬あるいは検査試薬は、正常血
清成分に対する交差反応がなく、感度良く、癌関
連抗原、癌特異抗原を検出できるものと思われ
る。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応
するモノクローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定癌に対する抗原検出用
試薬を提供するものである。 〔本発明の構成〕 本発明は、膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌関連抗原
に対して特異的に反応するモノクローナル抗体よ
りなるものである。 また、本発明は、上記モノクローナル抗体を凝
集素とする膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌から選ばれ
る少なくとも一種の検出用試薬よりなるものであ
る。 本発明のモノクローナル抗体は、以下の特性を
有するモノクローナル抗体である。 (i) 免疫原：結腸癌細胞（COLO―201） (ii) 癌細胞との反応性：食道癌（TE―３）、結腸
癌（COLO―201）、胃癌（KATO―）各細
胞に対して陽性であり、膀胱癌、乳癌細胞には
陰性である。 なお、COLO―201についてはキヤンサー・リ
サーチ（Cancer Res.），37，1345（1978）に、
TE―１、TE―２についてはガン（Gann），70，
575（1979）に、NRC―12については日泌尿会誌、
69，1535（1978）に、また、MKN―45について
はアクタ・メデイカル・バイオロジー（Acta
Med.Biol.），27，49（1979）に開示されている。 本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞
融合によつて製造される。すなわち、抗体産生細
胞と骨髄腫細胞との間に、融合ハイブリツドを形
成させ、該ハイブリツドをクローン化し、上記癌
細胞（即ち、上記特性を有する特定抗原）に対し
特異性を示す抗体を産生するクローンを選択する
ことによつて製造される。この操作は、免疫用細
胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。 抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られ
る抗原によつて免疫させた動物からの脾細胞、リ
ンパ節細胞、Ｂ―リンパ球である。株化癌細胞と
しては、結腸癌、膵臓癌、大腸癌等の株化癌細胞
などが例示される。 免疫させる動物としては、マウス、ラツト、
馬、ヤギ、ウサギなどが例示される。 抗体産生細胞は、例えば次のようにして製造さ
れる。即ち、例えば株化癌細胞を超音波処理等で
破壊し、遠心分離（例、10000〜20000G、10〜60
分）を行つて細胞抽出液を得、この上清を分子量
10万〜200万の物質の分離が可能なゲル濾過担体
（例、セフアデツクス、セフアクリル、セフアロ
ース、バイオゲル等）を使用して分子篩し、高分
子画分と低分子画分とに分離する。かくして得ら
れた分子量が約70万〜150万の高分子画分は、例
えばFreund Complete adjuvantと混和後、動物
の免疫用として使用する。免疫は、動物の皮下あ
るいは筋肉内に週２〜３回注射すること、あるい
は週１〜２回、３〜７週間投与することによつて
行われる。投与量として、例えばマウスの場合、
１匹当たり１〜1000μg、好ましくは10〜100μgが
用いられる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動
物から抗体産生細胞を分取する。 骨髄腫細胞としては、マウス、ラツト、ヒト等
由来のものが使用される。例えばマウス由来ミエ
ローマP3X68―Ag8・U1〔マイクロバイオロジカ
ル・イムノロジー（Microbiol.Immunol.），81，
１（1978）参照〕などが挙げられる。抗体産生細
胞と骨髄細胞とは同種動物由来のものであること
が好ましい。 細胞融合は、例えばG.Ko¨hler〔Nature 256，
495（1975）〕に記載の方法又はこれに準ずる方法
によつて行われる。この際、45％ポリエチレング
リコール（平均分子量4000）を用いて30〜40℃の
温度下、約１〜３分間程度反応させることによつ
て行われる。 細胞融合によつて得られた細胞はクローニング
に付される。すなわち、当該細胞を、例えばマイ
クロプレート中で培養する。この培地としては
PRMI―1640培地あるいはＤ―MEM培地等を用
いることができる。また、好ましくは、これらの
培地においてヒポキサンチン１×10-4M、アミノ
プテリン４×10-7M、チミジン1.6×10-5Mおよ
びウシ胎児血清あるいは馬血清20％（ｗ／ｖ）を
含有させたものが用いられる。そして、増殖の見
られたウエルの培養上清中の抗体価を、例えば酵
素抗体法などによつて測定し、さらに例えば限界
希釈法によつてクローニングを行つてクローンを
得る。このクローンは、例えばあらかじめプリス
タン投与したBALB／Ｃ腹腔内へ移植し、10〜
14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水
を採取する。 なお、抗体価を測定するための酵素抗体法は、
例えば次のようにして実施される。すなわち、抗
原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗原）
をコートしたマイクロプレートに、検体を加え、
37℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ
標識抗マウス免疫グロブリン（IgG＋IgA＋IgM）
ウサギ抗体を加え、さらに37℃で１時間反応させ
る。未反応の標識抗体を洗浄後、0.006％（ｖ／
ｖ）の過酸化水素を含む0.8mg／mlのＯ―フエニ
レンジアミン液を加え、室温にて30分間反応させ
た後、2M硫酸を加えて反応を停止させ、490nm
の吸光度を測定する。 本発明の試薬は、前記した本発明のモノクロー
ナル抗体を凝集素とし、抗原―抗体反応によつて
膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌関連抗原を検出しうる
ものであればいかなる態様でもよく、例えば抗体
感作血球の態様にある試薬（即ち、RPHA試
薬）、抗体感作ラテツクスの態様にある試薬（即
ち、ラテツクス凝集反応試薬）、放射活性物質で
標識する態様にある試薬（即ち、RIA試薬）、酵
素で標識する態様にある試薬（即ち、EIA試薬）
などが挙げられるが、このうち、RPHA試薬が
好適なものとして例示される。 RPHA試薬調製用に用いられる赤血球として
は、従来赤血球凝集反応用に用いられているもの
が使用でき、特に動物を選ぶ必要はないが、安定
でしかも感度の高い試薬を得るためには、ヒツ
ジ、ニワトリ、ヒトのＯ型赤血球等が望ましい。
赤血球は、通常生理食塩水で十分洗浄した後、グ
ルタールアルデヒド、ホルマリン等で処理して安
定化される。補助的にタンニン酸を用いることも
できる。赤血球は５〜15μm程度のものが好まし
い。 かかる赤血球の抗原または抗体による感作は公
知の方法、例えば〔医学のあゆみ、78，759
（1970）〕に記載の方法等によつて実施することが
できる。 それには、赤血球と抗体とを緩衝液（例えば、
塩化ナトリウム加等張リン酸緩衝液、PH7.2など）
中で感作させるのがよく、一般には赤血球浮遊液
と抗体含有液を混合することにより行う。 本操作は、PH6.8〜8.5、温度20〜60℃で行うの
がよい。感作赤血球は凍結乾燥して、例えばバイ
アル中に、好ましくは0.1％ナトリウムアジドな
どの如き保存剤を添加して、封入しておくことが
好ましい。 当該試薬は、緩衝液、例えば塩化ナトリウム加
等張リン酸緩衝液、PH7.2程度にて0.5％濃度とな
るように再溶解して測定に用いられる。 〔作用・効果〕 本発明のモノクローナル抗体は、膵臓癌、大腸
癌及び肝臓癌関連抗原と特異的に反応するもので
あるから、これら癌に対する診断用試薬として有
用であり、かつかかる試薬はモノクローナル抗体
を使用するものであることから、非常に高感度で
ある。 実施例 免疫用癌関連抗原の調製： 株化結腸癌細胞（COLO―201株）を107細胞／
mlとなるようにDulbecco液〔PBS（−）〕に懸濁
した後、その懸濁液の５mlを超音波発振器（20k
Hz、200ワツト）で、氷冷下、１分間超音波処理
して細胞を破壊し、遠心分離（15000G、30分）
を行い細胞抽出液を得た。この上清をセフアロー
ス4Bのカラムを用い、ゲル濾過し、高分子画分
と低分子画分とに分離した。 分子量が約70万〜150万の高分子画分を、限外
濾過法にて濃縮後、Freund Complete Adjnvant
と等量ずつ混和して、マウスへ週１回、蛋白質量
として50μg／回を５週間免疫した。 最終免疫より４日後にマウス膵臓を取り出し、
以下の細胞融合に用いた。 細胞融合およびクローニング： 上記のマウス脾細胞と、マウスミエローマ
P3U1〔Curr.Top.Microbiol.Immunol.，81，１
（1970）〕を４：１の割合で混合し、Ko¨hlenらの
方法〔Immunological Method（Acadenic
Press），New York，391，（1979）〕を一部改変
して、45％ポリエチレングリコール（平均分子量
4000）を用いて、室温で２分間反応させることに
より細胞融合を行つた。 37℃、５％CO2気流下で、ヒポキサンチン１×
10-4M、アミノプテリン４×10-7M、チミジン
1.6×10-5Mおよび馬血清10％を含むＤ―MEM培
地中に、本細胞が105細胞数／wellとなるように
96ウエルマイクロプレートに播き、２〜３日毎に
半量ずつ培地交換を繰り返し、10〜14日後に増殖
の見られたウエルの培養上清中の抗体価を酵素抗
体法により測定し、更に限界希釈法によりクロー
ニングを行つた。得られた２株のクローンン（そ
れぞれKMO1およびKMO2と名付ける）は、予
めプリスタン0.5ml投与したBALB／Ｃの腹腔内
へそれぞれ移植し、10〜14日後にモノクローナル
抗体を高濃度に（すなわち、マウスIgGとして５
〜10mg／ml）含む腹水を採取した。 酵素抗体法： 抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗
原）をコートしたマイクロプレートに検体を加
え、37℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダ
ーゼ標識抗マウス免疫グロブリン（IgG＋IgA＋
IgM）ウサギ抗体（ザイメツト社製）を加え、更
に37℃で１時間反応させた。未反応の標識抗体を
洗浄後、0.006％（ｖ／ｖ）の過酸化水素を含む
0.8mg／mlＯ―フエニレンジアミン液を加え、室
温にて30分間反応させた後、2M硫酸を加えて反
応を停止させ、490nmの吸光度を測定した。 抗体感作血球（RPHA試薬）の調製： モノクローナル抗体（KMO1及びKMO2）を
含むマウス腹水から、硫安分画法（45％飽和）に
てIgGを精製した。この精製抗体をそれぞれ今井
らの方法〔医学のあゆみ、78、759（1971）〕に準
じてヒンジ赤血球に感作する。すなわち、生理食
塩液で十分洗浄した羊赤血球5v／ｖ％液に0.1〜
0.5％になるようにグルタールアルデヒドを加え、
室温１夜放置した後、食塩加等張リン酸緩衝液で
洗浄し、羊固定血球を得る。羊固定血球（５％
液）に等量のタンニン酸液（１〜30mg／100ml生
理食塩液）を加え、37℃、15分間インキユベート
した後、食塩加等張リン酸緩衝液で洗浄し、タン
ニン酸処理羊固定血球を得る。タンニン酸処理羊
固定血球（５％液）に精製抗体液（0.01〜0.1
mg／ml）を加えて37℃、１時間インキユベート
し、抗体を感作する。インキユベート終了後、食
塩加等張リン酸緩衝液で感作血球を洗浄し、未感
作の抗体を十分洗浄除去する。その後、少量ずつ
分注し、凍結乾燥した。この感作血球を
Antihebscell TM （(株)ミドリ十字）に添付のリン
酸緩衝液を用いて0.5％濃度になるように再溶解
し、測定に供した。この再溶解した感作血球は４
℃で保存する限り約２週間は安定であつた。 実験例 １ 各種癌患者より得られた癌組織およびその周辺
の正常細胞の凍結切片を用い、本発明モノクロー
ナル抗体KMO1及びKMO2の反応性を、ペルオ
キシダーゼ標識抗体を用いたAvrameasらの方法
〔Biochimie，54，837（1972）〕準じた酵素抗体法
にて測定した。 KMO1及びKMO2のモノクローナル抗体は、
いずれも直腸正常部組織とは反応しなかつた。し
かし、膵正常部導管、肝癌組織、膵癌組織および
直腸癌組織とは両抗体とも反応した。 実験例 ２ KMO1及びKMO2のモノクローナル抗体を感
作して得たRPHA試薬２種（KMO1試薬及び
KMO2試薬）の特異性をみるため、株化癌細胞
の培養上清との反応性を検討し、その結果を第１
表に示した、なお、当該株化細胞については、
PC―１は人癌細胞の培養（朝倉書店），131
（1975）に、PC―９はブリテイツシユ・ジヤーナ
ル・オブ・キヤンサー（Brit.j.Cancer），39，15
（1978）に、PC―10は癌と化学療法、５，89
（1978）に、Ｇ―415は癌学会総会記事、８回、
141（1979）に、HEp―２はキヤンサー・リサー
チ（Cancer Res.），15，598（1955）に、KBはプ
ロセデユア・エクスペリメンタル・バイオロジカ
ル・メデシン（Proc.Exp.Biol.Med.），89，362
（1955）に、NBT―２は日泌尿会誌、70，351
（1979）に、Ｊ―111はブラツド（Blood），10，
1010（1955）に、HL―60はネーチヤー
（Nature），270，347（1977）に、COLO―320DM
はキヤンサー・リサーチ（Cancer Res.），39，
4914（1979）に、MKN―28は癌と化学療法、５，
89（1978）に、KATO―は、癌学会総会記事、
35回、102（1976）にその開示がある。両RPHA
試薬はCOLO―201の培養上清と最も強く反応し、
TE―３やKATO―の培養上清とは中程度に、
その他TE―１、TE―２、NRC―12および
MKN―45の培養上清とも弱く反応することが判
つた。また、両RPHA試薬の反応性に殆ど差は
みられなかつた。 実験例 ３ 各種癌患者血清につき、本発明試薬によつて測
定した結果を第２表に示す。尚、対照として既存
のCA19―９（ミドリ十字社製）およびCEA（ミド
リ十字社製）を使用して測定した結果も第２表に
示した。 【表】 【表】
物質の探索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の
確立にあるといえる。従来、癌に関して種々の薬
剤、治療法、試薬が開発されているが、これらは
いずれも癌細胞ばかりでなく、正常組織、正常細
胞にも影響を与え、如何に有効な薬剤とはいえ、
その副作用のために使用が著しく制限されている
のが現状である。 免疫反応（抗原―抗体反応）は、非常に特異性
が高いものであるが、従来のポリクローナル抗体
ではいかに吸収操作を繰り返しても、例えばリン
パ球間のサブセツトのような、非常にマイナーな
抗原決定基によつて区別されるものを認識するこ
とは困難であつた。Milsteinらによつて開発され
たモノクローナル抗体〔Ko¨hler，G.and
Milstein，C.：Nature，256，495（1975）〕は、
この壁を打ち破るものであり、癌細胞上の癌特異
抗原、あるいは癌関連抗原を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を得ることにより、正常組織へ
のダメージを与えずに癌細胞のみを特異的に排除
できるものと期待される。また、モノクローナル
抗体を用いた診断薬あるいは検査試薬は、正常血
清成分に対する交差反応がなく、感度良く、癌関
連抗原、癌特異抗原を検出できるものと思われ
る。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応
するモノクローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定癌に対する抗原検出用
試薬を提供するものである。 〔本発明の構成〕 本発明は、膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌関連抗原
に対して特異的に反応するモノクローナル抗体よ
りなるものである。 また、本発明は、上記モノクローナル抗体を凝
集素とする膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌から選ばれ
る少なくとも一種の検出用試薬よりなるものであ
る。 本発明のモノクローナル抗体は、以下の特性を
有するモノクローナル抗体である。 (i) 免疫原：結腸癌細胞（COLO―201） (ii) 癌細胞との反応性：食道癌（TE―３）、結腸
癌（COLO―201）、胃癌（KATO―）各細
胞に対して陽性であり、膀胱癌、乳癌細胞には
陰性である。 なお、COLO―201についてはキヤンサー・リ
サーチ（Cancer Res.），37，1345（1978）に、
TE―１、TE―２についてはガン（Gann），70，
575（1979）に、NRC―12については日泌尿会誌、
69，1535（1978）に、また、MKN―45について
はアクタ・メデイカル・バイオロジー（Acta
Med.Biol.），27，49（1979）に開示されている。 本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞
融合によつて製造される。すなわち、抗体産生細
胞と骨髄腫細胞との間に、融合ハイブリツドを形
成させ、該ハイブリツドをクローン化し、上記癌
細胞（即ち、上記特性を有する特定抗原）に対し
特異性を示す抗体を産生するクローンを選択する
ことによつて製造される。この操作は、免疫用細
胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。 抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られ
る抗原によつて免疫させた動物からの脾細胞、リ
ンパ節細胞、Ｂ―リンパ球である。株化癌細胞と
しては、結腸癌、膵臓癌、大腸癌等の株化癌細胞
などが例示される。 免疫させる動物としては、マウス、ラツト、
馬、ヤギ、ウサギなどが例示される。 抗体産生細胞は、例えば次のようにして製造さ
れる。即ち、例えば株化癌細胞を超音波処理等で
破壊し、遠心分離（例、10000〜20000G、10〜60
分）を行つて細胞抽出液を得、この上清を分子量
10万〜200万の物質の分離が可能なゲル濾過担体
（例、セフアデツクス、セフアクリル、セフアロ
ース、バイオゲル等）を使用して分子篩し、高分
子画分と低分子画分とに分離する。かくして得ら
れた分子量が約70万〜150万の高分子画分は、例
えばFreund Complete adjuvantと混和後、動物
の免疫用として使用する。免疫は、動物の皮下あ
るいは筋肉内に週２〜３回注射すること、あるい
は週１〜２回、３〜７週間投与することによつて
行われる。投与量として、例えばマウスの場合、
１匹当たり１〜1000μg、好ましくは10〜100μgが
用いられる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動
物から抗体産生細胞を分取する。 骨髄腫細胞としては、マウス、ラツト、ヒト等
由来のものが使用される。例えばマウス由来ミエ
ローマP3X68―Ag8・U1〔マイクロバイオロジカ
ル・イムノロジー（Microbiol.Immunol.），81，
１（1978）参照〕などが挙げられる。抗体産生細
胞と骨髄細胞とは同種動物由来のものであること
が好ましい。 細胞融合は、例えばG.Ko¨hler〔Nature 256，
495（1975）〕に記載の方法又はこれに準ずる方法
によつて行われる。この際、45％ポリエチレング
リコール（平均分子量4000）を用いて30〜40℃の
温度下、約１〜３分間程度反応させることによつ
て行われる。 細胞融合によつて得られた細胞はクローニング
に付される。すなわち、当該細胞を、例えばマイ
クロプレート中で培養する。この培地としては
PRMI―1640培地あるいはＤ―MEM培地等を用
いることができる。また、好ましくは、これらの
培地においてヒポキサンチン１×10-4M、アミノ
プテリン４×10-7M、チミジン1.6×10-5Mおよ
びウシ胎児血清あるいは馬血清20％（ｗ／ｖ）を
含有させたものが用いられる。そして、増殖の見
られたウエルの培養上清中の抗体価を、例えば酵
素抗体法などによつて測定し、さらに例えば限界
希釈法によつてクローニングを行つてクローンを
得る。このクローンは、例えばあらかじめプリス
タン投与したBALB／Ｃ腹腔内へ移植し、10〜
14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水
を採取する。 なお、抗体価を測定するための酵素抗体法は、
例えば次のようにして実施される。すなわち、抗
原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗原）
をコートしたマイクロプレートに、検体を加え、
37℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ
標識抗マウス免疫グロブリン（IgG＋IgA＋IgM）
ウサギ抗体を加え、さらに37℃で１時間反応させ
る。未反応の標識抗体を洗浄後、0.006％（ｖ／
ｖ）の過酸化水素を含む0.8mg／mlのＯ―フエニ
レンジアミン液を加え、室温にて30分間反応させ
た後、2M硫酸を加えて反応を停止させ、490nm
の吸光度を測定する。 本発明の試薬は、前記した本発明のモノクロー
ナル抗体を凝集素とし、抗原―抗体反応によつて
膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌関連抗原を検出しうる
ものであればいかなる態様でもよく、例えば抗体
感作血球の態様にある試薬（即ち、RPHA試
薬）、抗体感作ラテツクスの態様にある試薬（即
ち、ラテツクス凝集反応試薬）、放射活性物質で
標識する態様にある試薬（即ち、RIA試薬）、酵
素で標識する態様にある試薬（即ち、EIA試薬）
などが挙げられるが、このうち、RPHA試薬が
好適なものとして例示される。 RPHA試薬調製用に用いられる赤血球として
は、従来赤血球凝集反応用に用いられているもの
が使用でき、特に動物を選ぶ必要はないが、安定
でしかも感度の高い試薬を得るためには、ヒツ
ジ、ニワトリ、ヒトのＯ型赤血球等が望ましい。
赤血球は、通常生理食塩水で十分洗浄した後、グ
ルタールアルデヒド、ホルマリン等で処理して安
定化される。補助的にタンニン酸を用いることも
できる。赤血球は５〜15μm程度のものが好まし
い。 かかる赤血球の抗原または抗体による感作は公
知の方法、例えば〔医学のあゆみ、78，759
（1970）〕に記載の方法等によつて実施することが
できる。 それには、赤血球と抗体とを緩衝液（例えば、
塩化ナトリウム加等張リン酸緩衝液、PH7.2など）
中で感作させるのがよく、一般には赤血球浮遊液
と抗体含有液を混合することにより行う。 本操作は、PH6.8〜8.5、温度20〜60℃で行うの
がよい。感作赤血球は凍結乾燥して、例えばバイ
アル中に、好ましくは0.1％ナトリウムアジドな
どの如き保存剤を添加して、封入しておくことが
好ましい。 当該試薬は、緩衝液、例えば塩化ナトリウム加
等張リン酸緩衝液、PH7.2程度にて0.5％濃度とな
るように再溶解して測定に用いられる。 〔作用・効果〕 本発明のモノクローナル抗体は、膵臓癌、大腸
癌及び肝臓癌関連抗原と特異的に反応するもので
あるから、これら癌に対する診断用試薬として有
用であり、かつかかる試薬はモノクローナル抗体
を使用するものであることから、非常に高感度で
ある。 実施例 免疫用癌関連抗原の調製： 株化結腸癌細胞（COLO―201株）を107細胞／
mlとなるようにDulbecco液〔PBS（−）〕に懸濁
した後、その懸濁液の５mlを超音波発振器（20k
Hz、200ワツト）で、氷冷下、１分間超音波処理
して細胞を破壊し、遠心分離（15000G、30分）
を行い細胞抽出液を得た。この上清をセフアロー
ス4Bのカラムを用い、ゲル濾過し、高分子画分
と低分子画分とに分離した。 分子量が約70万〜150万の高分子画分を、限外
濾過法にて濃縮後、Freund Complete Adjnvant
と等量ずつ混和して、マウスへ週１回、蛋白質量
として50μg／回を５週間免疫した。 最終免疫より４日後にマウス膵臓を取り出し、
以下の細胞融合に用いた。 細胞融合およびクローニング： 上記のマウス脾細胞と、マウスミエローマ
P3U1〔Curr.Top.Microbiol.Immunol.，81，１
（1970）〕を４：１の割合で混合し、Ko¨hlenらの
方法〔Immunological Method（Acadenic
Press），New York，391，（1979）〕を一部改変
して、45％ポリエチレングリコール（平均分子量
4000）を用いて、室温で２分間反応させることに
より細胞融合を行つた。 37℃、５％CO2気流下で、ヒポキサンチン１×
10-4M、アミノプテリン４×10-7M、チミジン
1.6×10-5Mおよび馬血清10％を含むＤ―MEM培
地中に、本細胞が105細胞数／wellとなるように
96ウエルマイクロプレートに播き、２〜３日毎に
半量ずつ培地交換を繰り返し、10〜14日後に増殖
の見られたウエルの培養上清中の抗体価を酵素抗
体法により測定し、更に限界希釈法によりクロー
ニングを行つた。得られた２株のクローンン（そ
れぞれKMO1およびKMO2と名付ける）は、予
めプリスタン0.5ml投与したBALB／Ｃの腹腔内
へそれぞれ移植し、10〜14日後にモノクローナル
抗体を高濃度に（すなわち、マウスIgGとして５
〜10mg／ml）含む腹水を採取した。 酵素抗体法： 抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗
原）をコートしたマイクロプレートに検体を加
え、37℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダ
ーゼ標識抗マウス免疫グロブリン（IgG＋IgA＋
IgM）ウサギ抗体（ザイメツト社製）を加え、更
に37℃で１時間反応させた。未反応の標識抗体を
洗浄後、0.006％（ｖ／ｖ）の過酸化水素を含む
0.8mg／mlＯ―フエニレンジアミン液を加え、室
温にて30分間反応させた後、2M硫酸を加えて反
応を停止させ、490nmの吸光度を測定した。 抗体感作血球（RPHA試薬）の調製： モノクローナル抗体（KMO1及びKMO2）を
含むマウス腹水から、硫安分画法（45％飽和）に
てIgGを精製した。この精製抗体をそれぞれ今井
らの方法〔医学のあゆみ、78、759（1971）〕に準
じてヒンジ赤血球に感作する。すなわち、生理食
塩液で十分洗浄した羊赤血球5v／ｖ％液に0.1〜
0.5％になるようにグルタールアルデヒドを加え、
室温１夜放置した後、食塩加等張リン酸緩衝液で
洗浄し、羊固定血球を得る。羊固定血球（５％
液）に等量のタンニン酸液（１〜30mg／100ml生
理食塩液）を加え、37℃、15分間インキユベート
した後、食塩加等張リン酸緩衝液で洗浄し、タン
ニン酸処理羊固定血球を得る。タンニン酸処理羊
固定血球（５％液）に精製抗体液（0.01〜0.1
mg／ml）を加えて37℃、１時間インキユベート
し、抗体を感作する。インキユベート終了後、食
塩加等張リン酸緩衝液で感作血球を洗浄し、未感
作の抗体を十分洗浄除去する。その後、少量ずつ
分注し、凍結乾燥した。この感作血球を
Antihebscell TM （(株)ミドリ十字）に添付のリン
酸緩衝液を用いて0.5％濃度になるように再溶解
し、測定に供した。この再溶解した感作血球は４
℃で保存する限り約２週間は安定であつた。 実験例 １ 各種癌患者より得られた癌組織およびその周辺
の正常細胞の凍結切片を用い、本発明モノクロー
ナル抗体KMO1及びKMO2の反応性を、ペルオ
キシダーゼ標識抗体を用いたAvrameasらの方法
〔Biochimie，54，837（1972）〕準じた酵素抗体法
にて測定した。 KMO1及びKMO2のモノクローナル抗体は、
いずれも直腸正常部組織とは反応しなかつた。し
かし、膵正常部導管、肝癌組織、膵癌組織および
直腸癌組織とは両抗体とも反応した。 実験例 ２ KMO1及びKMO2のモノクローナル抗体を感
作して得たRPHA試薬２種（KMO1試薬及び
KMO2試薬）の特異性をみるため、株化癌細胞
の培養上清との反応性を検討し、その結果を第１
表に示した、なお、当該株化細胞については、
PC―１は人癌細胞の培養（朝倉書店），131
（1975）に、PC―９はブリテイツシユ・ジヤーナ
ル・オブ・キヤンサー（Brit.j.Cancer），39，15
（1978）に、PC―10は癌と化学療法、５，89
（1978）に、Ｇ―415は癌学会総会記事、８回、
141（1979）に、HEp―２はキヤンサー・リサー
チ（Cancer Res.），15，598（1955）に、KBはプ
ロセデユア・エクスペリメンタル・バイオロジカ
ル・メデシン（Proc.Exp.Biol.Med.），89，362
（1955）に、NBT―２は日泌尿会誌、70，351
（1979）に、Ｊ―111はブラツド（Blood），10，
1010（1955）に、HL―60はネーチヤー
（Nature），270，347（1977）に、COLO―320DM
はキヤンサー・リサーチ（Cancer Res.），39，
4914（1979）に、MKN―28は癌と化学療法、５，
89（1978）に、KATO―は、癌学会総会記事、
35回、102（1976）にその開示がある。両RPHA
試薬はCOLO―201の培養上清と最も強く反応し、
TE―３やKATO―の培養上清とは中程度に、
その他TE―１、TE―２、NRC―12および
MKN―45の培養上清とも弱く反応することが判
つた。また、両RPHA試薬の反応性に殆ど差は
みられなかつた。 実験例 ３ 各種癌患者血清につき、本発明試薬によつて測
定した結果を第２表に示す。尚、対照として既存
のCA19―９（ミドリ十字社製）およびCEA（ミド
リ十字社製）を使用して測定した結果も第２表に
示した。 【表】 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 以下の特性を有するモノクローナル抗体。 (i) 免疫原：結腸癌細胞（COLO―201） (ii) 癌細胞との反応性：食道癌（TE―３）、結腸
癌（COLO―201）、胃癌（KATO―）各細
胞に対して陽性であり、膀胱癌、乳癌細胞には
陰性である。 ２ 以下の特性を有するモノクローナル抗体を凝
集素とする膵臓癌、大腸癌および肝臓癌から選ば
れる少なくとも一つの検出用試薬。 (i) 免疫原：結腸癌細胞（COLO―201） (ii) 癌細胞との反応性：食道癌（TE―３）、結腸
癌（COLO―201）、胃癌（KATO―）各細
胞に対して陽性であり、膀胱癌、乳癌細胞には
陰性である。
Priority Applications (7)
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|---|---|---|---|
| JP59166980A JPS6144900A (ja) | 1984-08-08 | 1984-08-08 | モノクロ−ナル抗体及び癌抗原検出用試薬 |
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