JPS6146116B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6146116B2 JPS6146116B2 JP53045535A JP4553578A JPS6146116B2 JP S6146116 B2 JPS6146116 B2 JP S6146116B2 JP 53045535 A JP53045535 A JP 53045535A JP 4553578 A JP4553578 A JP 4553578A JP S6146116 B2 JPS6146116 B2 JP S6146116B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hrp
- peroxidase
- enzyme
- activity
- hydrogen donor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、螢光分析法によるペルオキシダーゼ
活性の新規な高感度測定方法に関する。 ペルオキシダーゼは過酸化物例えば過酸化水素
（H2O2）の共存下で種々の水素供与体の酸化反応
を触媒する酵素で既に植物及び動物組織由来の各
種のペルオキシダーゼ及び微生物産生のペルオキ
シダーゼ等が知られている。本発明に用いられる
ペルオキシダーゼとしてはこれら各種のペルオキ
シダーゼが対象となるが、その中でも殊に植物由
来のペルオキシダーゼが主要な対象であり、とり
わけ西洋わさび（Hovseradish）由来のペルオキ
シダーゼ（以下HRPと略す）が通常最も代表的
である。 植物ペルオキシダーゼの中でもHRPは最も古
くからその抽出分離及び精製化が進み、H2O2や
水素供与体の使用基質の直接定量を目的とした生
化学分析法や、糖類、アミノ酸、有機塩基、コレ
ステロール、ポリアミン等の測定対象物から
H2O2を生成する酸化酵素反応とペルオキシダー
ゼによる生成したH2O2の定量との組合せによつ
て測定対象物の微量測定を目指すなど臨床化学分
野において広く利用されている。したがつてペル
オキシダーゼ活性が高感度に測定出来ることによ
りペルオキシダーゼ自身の高感度な検出は勿論の
こと、この反応に関与する基質（H2O2または水
素供与体）の微量測定、更にはH2O2の微量測定
に基づく上記の目的測定対象物の超微量測定も可
能になつて臨床診断上の意義は極めて大である。
また一方、生体内各種微量成分の超微量測定手段
の一つとして近年急速に発展した来た酵素免疫測
定法においては抗原或いは抗体の標識用酵素とし
てペルオキシダーゼ例えばHRPを活用する事例
が非常に多い。この際、酵素免疫測定法において
はその測定システム上の原理からも明らかな如
く、標識酵素の活性が高感度に測定出来ればその
標識酵素量の微量測定が可能となり、その結果と
して測定対象物となる各種の抗原及び抗体の超微
量の定量化が達成される。このようにペルオキシ
ダーゼ活性の高感度な測定方法を確立すること
は、前述の如く、酸化酵素との組合せによる単な
る一生化学的分析手段のみならず、抗原抗体反応
との組合せによる酵素免疫化学的測定分野等への
広範囲な応用が可能となる。 HRPをはじめとする各種ペルオキシダーゼの
活性の測定方法としては従来は専ら可視部吸光法
が採用されて来たが、可視部吸光法一般に共通す
る性質としてその測定感度は相当に低い欠点があ
つた。一方先にギルバウルトらはホモバニリン酸
を基質とする新基な螢光分析法を報告した〔Guil
−bault，G.G.etal：Anal，Chem39（No.２）、271
（1967）、ibid，40（No.１）、190〜196（1968）、
ibid，40（No.８）、1256〜1263（1968）〕。 この螢光分析法は中性乃至弱アルカリ性の液性
下においてH2O2の共存によつて安定な非螢光性
基質のホモバニリン酸を高度螢光性物質に変換し
た後その物質の螢光強度を測定することによつて
ペルオキシダーゼ活性を求めるもので、従来の可
視部吸光法採用時に比較して全般的に測定感度は
高めるものの、ペルオキシダーゼを使用した前述
の多数の事例において未だ不充分な現状にあつ
た。こうした状況の中で本発明者は前記公知方法
の欠点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果、螢光
分析法によるペルオキシダーゼ活性の測定時にお
ける酵素反応を酸性下で行うことによつて従来法
に比較して高感度で且つ精度の高いペルオキシダ
ーゼ活性の新規な測定方法を先に完成させた（特
願昭52−66518）。今回これらの先願発明に加えて
２種類の基質の量的比率を改善することによつ
て、すなわち、水素供与体と過酸化物のモル比が
１対0.02〜１となる基質を含む反応液中で酵素反
応を行わしめることによつてペルオキシダーゼ活
性がさらに感度、精度、再現性共に極めて高く測
定出来、且つ著しく安定した結果を与えることを
見出して本発明を完成させるにいたつた。 本発明における酵素反応は酸性下で行われる
が、この場合のPHは７以下であればよく、最高の
測定成積を期待するためには酸性下の特定のPH領
域を選定するのが好しく、通常は特定PH領域設定
用緩衝液の調製に用いられた酸の種類との関係か
らPH3.5〜5.0を採用する。この際緩衝液調製時の
素材となる酸及びアルカリの種類、或いはその相
互組合せの如何に関係なく本発明は適用出来る。 本発明において使用する水素供与体と過酸化物
のモル比は１対0.02〜１であるが、この範囲内で
もとりわけ0.04〜0.5程度が好ましい。 また、酵素反応液が水素供与体を飽和状態又は
それ近く含んでいるのが、一方、過酸化物を25〜
0.5μｇ含んでいるのがより高感度にペルオキシ
ダーゼ活性を測定できるので好ましい。 本発明で使用される水素供与体の種類としては
ホモバニリン酸、Ｐ−オキシフエニル酢酸、Ｐ−
クレゾール、チラミン等、一方過酸化物としては
H2O2、過酸化アルコール等この螢光分析法の分
野で使用されるものの中から適宜選択できるが、
通常はホモバニリン酸とH2O2が使用される。 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 実施例 １ HRP量とH2O2至適量の相関性 0.1M−クエン酸−Ma2B4O7緩衝液（PH4.0）50
μｌ、HRP（Type Vi，RZ：約2.75、活性：約
260Purpurogallin Units／mg、Sigma Chemical
co、米国より買入）の１×100〜１×10-3ユニツ
ト／mlの酵素液10μ、牛血清アルブミン12.5
mg／ml水溶液20μ、0.25ホモバニリン酸水溶液
50μ、下記量のH2O2量を含む水溶液50μと
からなる反応混合液を27.7℃下でゆつくり振盪し
乍ら40分間インキユベーシヨンした後1.25％−
KCN液50μを添加して反応を停止させ、さら
に0.1N−NaOH2.5を追添してから日立製分光螢
光温度204S型を用いて螢光強度を測定し（励起
波長320nm、螢光波長425nm）、表１の結果を得
た。この際HRP各使用量毎にH2O225μ区の示
す螢光強度を100とし、他区のそれを相対値で示
した。
活性の新規な高感度測定方法に関する。 ペルオキシダーゼは過酸化物例えば過酸化水素
（H2O2）の共存下で種々の水素供与体の酸化反応
を触媒する酵素で既に植物及び動物組織由来の各
種のペルオキシダーゼ及び微生物産生のペルオキ
シダーゼ等が知られている。本発明に用いられる
ペルオキシダーゼとしてはこれら各種のペルオキ
シダーゼが対象となるが、その中でも殊に植物由
来のペルオキシダーゼが主要な対象であり、とり
わけ西洋わさび（Hovseradish）由来のペルオキ
シダーゼ（以下HRPと略す）が通常最も代表的
である。 植物ペルオキシダーゼの中でもHRPは最も古
くからその抽出分離及び精製化が進み、H2O2や
水素供与体の使用基質の直接定量を目的とした生
化学分析法や、糖類、アミノ酸、有機塩基、コレ
ステロール、ポリアミン等の測定対象物から
H2O2を生成する酸化酵素反応とペルオキシダー
ゼによる生成したH2O2の定量との組合せによつ
て測定対象物の微量測定を目指すなど臨床化学分
野において広く利用されている。したがつてペル
オキシダーゼ活性が高感度に測定出来ることによ
りペルオキシダーゼ自身の高感度な検出は勿論の
こと、この反応に関与する基質（H2O2または水
素供与体）の微量測定、更にはH2O2の微量測定
に基づく上記の目的測定対象物の超微量測定も可
能になつて臨床診断上の意義は極めて大である。
また一方、生体内各種微量成分の超微量測定手段
の一つとして近年急速に発展した来た酵素免疫測
定法においては抗原或いは抗体の標識用酵素とし
てペルオキシダーゼ例えばHRPを活用する事例
が非常に多い。この際、酵素免疫測定法において
はその測定システム上の原理からも明らかな如
く、標識酵素の活性が高感度に測定出来ればその
標識酵素量の微量測定が可能となり、その結果と
して測定対象物となる各種の抗原及び抗体の超微
量の定量化が達成される。このようにペルオキシ
ダーゼ活性の高感度な測定方法を確立すること
は、前述の如く、酸化酵素との組合せによる単な
る一生化学的分析手段のみならず、抗原抗体反応
との組合せによる酵素免疫化学的測定分野等への
広範囲な応用が可能となる。 HRPをはじめとする各種ペルオキシダーゼの
活性の測定方法としては従来は専ら可視部吸光法
が採用されて来たが、可視部吸光法一般に共通す
る性質としてその測定感度は相当に低い欠点があ
つた。一方先にギルバウルトらはホモバニリン酸
を基質とする新基な螢光分析法を報告した〔Guil
−bault，G.G.etal：Anal，Chem39（No.２）、271
（1967）、ibid，40（No.１）、190〜196（1968）、
ibid，40（No.８）、1256〜1263（1968）〕。 この螢光分析法は中性乃至弱アルカリ性の液性
下においてH2O2の共存によつて安定な非螢光性
基質のホモバニリン酸を高度螢光性物質に変換し
た後その物質の螢光強度を測定することによつて
ペルオキシダーゼ活性を求めるもので、従来の可
視部吸光法採用時に比較して全般的に測定感度は
高めるものの、ペルオキシダーゼを使用した前述
の多数の事例において未だ不充分な現状にあつ
た。こうした状況の中で本発明者は前記公知方法
の欠点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果、螢光
分析法によるペルオキシダーゼ活性の測定時にお
ける酵素反応を酸性下で行うことによつて従来法
に比較して高感度で且つ精度の高いペルオキシダ
ーゼ活性の新規な測定方法を先に完成させた（特
願昭52−66518）。今回これらの先願発明に加えて
２種類の基質の量的比率を改善することによつ
て、すなわち、水素供与体と過酸化物のモル比が
１対0.02〜１となる基質を含む反応液中で酵素反
応を行わしめることによつてペルオキシダーゼ活
性がさらに感度、精度、再現性共に極めて高く測
定出来、且つ著しく安定した結果を与えることを
見出して本発明を完成させるにいたつた。 本発明における酵素反応は酸性下で行われる
が、この場合のPHは７以下であればよく、最高の
測定成積を期待するためには酸性下の特定のPH領
域を選定するのが好しく、通常は特定PH領域設定
用緩衝液の調製に用いられた酸の種類との関係か
らPH3.5〜5.0を採用する。この際緩衝液調製時の
素材となる酸及びアルカリの種類、或いはその相
互組合せの如何に関係なく本発明は適用出来る。 本発明において使用する水素供与体と過酸化物
のモル比は１対0.02〜１であるが、この範囲内で
もとりわけ0.04〜0.5程度が好ましい。 また、酵素反応液が水素供与体を飽和状態又は
それ近く含んでいるのが、一方、過酸化物を25〜
0.5μｇ含んでいるのがより高感度にペルオキシ
ダーゼ活性を測定できるので好ましい。 本発明で使用される水素供与体の種類としては
ホモバニリン酸、Ｐ−オキシフエニル酢酸、Ｐ−
クレゾール、チラミン等、一方過酸化物としては
H2O2、過酸化アルコール等この螢光分析法の分
野で使用されるものの中から適宜選択できるが、
通常はホモバニリン酸とH2O2が使用される。 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 実施例 １ HRP量とH2O2至適量の相関性 0.1M−クエン酸−Ma2B4O7緩衝液（PH4.0）50
μｌ、HRP（Type Vi，RZ：約2.75、活性：約
260Purpurogallin Units／mg、Sigma Chemical
co、米国より買入）の１×100〜１×10-3ユニツ
ト／mlの酵素液10μ、牛血清アルブミン12.5
mg／ml水溶液20μ、0.25ホモバニリン酸水溶液
50μ、下記量のH2O2量を含む水溶液50μと
からなる反応混合液を27.7℃下でゆつくり振盪し
乍ら40分間インキユベーシヨンした後1.25％−
KCN液50μを添加して反応を停止させ、さら
に0.1N−NaOH2.5を追添してから日立製分光螢
光温度204S型を用いて螢光強度を測定し（励起
波長320nm、螢光波長425nm）、表１の結果を得
た。この際HRP各使用量毎にH2O225μ区の示
す螢光強度を100とし、他区のそれを相対値で示
した。
【表】
実施例 ２
化学修飾したHRP標品とH2O2至適量の相関性
HRP（Basic Isoenzyme Grade １−ｃ，
RZ：3.4、活性：360 Purpurogallin Units／mg.
東洋紡積K.Kより買入）２×-3ユニツトの10μ
、このHRP標品にP.K.NaKaneらの化学修飾法
〔P.K.NaKane，A.Kawaoi：J.Histochem，
Cytochem， 22.1084〜1091（1974）、瓦井康之
P.K.Nakane；蛋白質核酸酵素20（No.11）、1007〜
1013（1975）〕を応用して調製したDNP化HRPの
アルデヒド型標品10μ（HRP活性として約1.5
×10-3ユニツトを含む）、さらにこのアルデヒド
型にペプチドホルモンの１種のTSHを作用せし
めて調製したHRP.TSH複合体10μ（HRP活性
として約2.1×10-3ユニツトを含む）について実
施例１と同様な操作を施し表２の結果を得た。
RZ：3.4、活性：360 Purpurogallin Units／mg.
東洋紡積K.Kより買入）２×-3ユニツトの10μ
、このHRP標品にP.K.NaKaneらの化学修飾法
〔P.K.NaKane，A.Kawaoi：J.Histochem，
Cytochem， 22.1084〜1091（1974）、瓦井康之
P.K.Nakane；蛋白質核酸酵素20（No.11）、1007〜
1013（1975）〕を応用して調製したDNP化HRPの
アルデヒド型標品10μ（HRP活性として約1.5
×10-3ユニツトを含む）、さらにこのアルデヒド
型にペプチドホルモンの１種のTSHを作用せし
めて調製したHRP.TSH複合体10μ（HRP活性
として約2.1×10-3ユニツトを含む）について実
施例１と同様な操作を施し表２の結果を得た。
【表】
実施例 ３
水素供与体量とHRP活性
水素供与体の代表としてホモバニリン酸を選
び、その水溶液50μ（下記量を含む）に他方の
基質であるH2O2量を２レベルで組合せた他は実
施例１と同様な操作をし表３の結果を得た。
び、その水溶液50μ（下記量を含む）に他方の
基質であるH2O2量を２レベルで組合せた他は実
施例１と同様な操作をし表３の結果を得た。
【表】
実施例 ４
水素供与体及びH2O2の相互至適量の組合せ
実施例２で用いたDNP化HRPのアルデヒド型
標品10μ（但しHRP活性として２×10-4ユニツ
トを含む）、及びHRP.TSH複合体10μ（HRP
活性として３×10-4ユニツトを含む）をペルオキ
シダーゼ酵素源とし、これに水素供与体のホモバ
ニリン酸量及び過酸化物のH2O2量を適宜組合せ
た以外は実施例１と同様な操作を施し、表４の結
果を得た。
標品10μ（但しHRP活性として２×10-4ユニツ
トを含む）、及びHRP.TSH複合体10μ（HRP
活性として３×10-4ユニツトを含む）をペルオキ
シダーゼ酵素源とし、これに水素供与体のホモバ
ニリン酸量及び過酸化物のH2O2量を適宜組合せ
た以外は実施例１と同様な操作を施し、表４の結
果を得た。
【表】
実施例 ５
各種水素供与体に対するH2O2至適量
0.1M−クエン酸−NaoH緩衝液（PH4.0）50μ
及びHRP10μ（５×10-4ユニツトを含む）に次
表に示した各種水素供与体の一種の13.72mM液
（実施例１に示したホモバニリン酸の0.25％液に
相当する濃度）50μ、及び２レベルのH2O2量
を組合せた他は実施例１と同様な操作を施し、表
５の結果（HRP活性比）を得た。尚この際、酵
素作用によつて生成する螢光性物質は用いた水素
供与体の種類毎に異るため、各水素供与体の種別
毎に最大値を与える励起波長（λex）及び螢光
波長（λem）を事前に求めてから螢光強度を測
定した。
及びHRP10μ（５×10-4ユニツトを含む）に次
表に示した各種水素供与体の一種の13.72mM液
（実施例１に示したホモバニリン酸の0.25％液に
相当する濃度）50μ、及び２レベルのH2O2量
を組合せた他は実施例１と同様な操作を施し、表
５の結果（HRP活性比）を得た。尚この際、酵
素作用によつて生成する螢光性物質は用いた水素
供与体の種類毎に異るため、各水素供与体の種別
毎に最大値を与える励起波長（λex）及び螢光
波長（λem）を事前に求めてから螢光強度を測
定した。
【表】
以上、表１〜５の結果から明らかな如く、ペル
オキシダーゼ活性測定時における２種類の基質の
量的比率及び使用濃度の改善効果はその酵素作用
が酸性PH域下で行わしめた場合において顕著に認
められ、酵素作用に際して至適なPHを維持し得る
緩衝能を有するものであれば緩衝液の調製に用い
られた酸類及びアルカリ類の種類如何とは本質的
に関係なく発揮される。この際における２種類の
基質としてはホモバニリン酸及びｐ−オキシフエ
ニル酢酸、ｐ−クレゾール等の如きオキシ芳香族
化合物、チラミンの如き芳香族アミン類等種々の
水素供与体とH2O2をはじめとする種々の過酸化
物が役立ち、螢光分析法の分野で使用可能とされ
ている基質ならばその種類を、また水素供与体と
過酸化物との組合せの如何を問わない。実際的な
具体例としては、一般に、水素供与体の方は飽和
状態に近い濃度に保ち乍ら、他方のH2O2量は概
ね各試験管中に0.5〜2.5μｇ程度存在せしめ、水
素供与体と過酸化物のモル比が１対0.04〜0.05に
なるような反応液中で酵素反応を行わしめると最
高の測定結果が期待出来る。このような本発明の
構成要因をなす２種類の基質についての量的比率
及び使用濃度の改善につるペルオキシダーゼ活性
測定の高感度化の現象は酵素の給源及びその精製
度を反映するRZ値、補欠分子族ヘム蛋白云々の
如何を問わず各種のペルオキシダーゼ及びその各
アイソザイムに、またnativeなペルオキシダーゼ
そのものの他に人口的に化学修飾された標品更に
は各種の抗原や抗体に標識されたペルオキシダー
ゼ、固定化されたペルオキシダーゼについても同
様に認められる。殊に、nativeなペルオキシダー
ゼであつてもその使用量が極めて少い場合やまた
化学修飾されたり他に標識化されたり、更には不
溶性担体に固定化された場合においては本発明適
用の効果が一層大である。他方、通常の螢光分析
法における他の測定操作上の工夫例えば螢光強度
の測定に際しての使用セルのミクロ化等と本発明
とを適宜組合せれば、さらに極めて少量の試料に
ついてもペルオキシダーゼ活性が測定可能とな
る。 したがつて先願に加えて本発明を実施すること
により、通常の検査室等に設置されている普通型
の螢光分析計を用いるだけでペルオキシダーゼ活
性、加えて各種生体微量成分等がより簡便な操作
で且つ短時間以内に精度、感度、再現性及び安定
性共によりよく測定出来て本発明の臨床上等にお
ける意義は極めて大である。
オキシダーゼ活性測定時における２種類の基質の
量的比率及び使用濃度の改善効果はその酵素作用
が酸性PH域下で行わしめた場合において顕著に認
められ、酵素作用に際して至適なPHを維持し得る
緩衝能を有するものであれば緩衝液の調製に用い
られた酸類及びアルカリ類の種類如何とは本質的
に関係なく発揮される。この際における２種類の
基質としてはホモバニリン酸及びｐ−オキシフエ
ニル酢酸、ｐ−クレゾール等の如きオキシ芳香族
化合物、チラミンの如き芳香族アミン類等種々の
水素供与体とH2O2をはじめとする種々の過酸化
物が役立ち、螢光分析法の分野で使用可能とされ
ている基質ならばその種類を、また水素供与体と
過酸化物との組合せの如何を問わない。実際的な
具体例としては、一般に、水素供与体の方は飽和
状態に近い濃度に保ち乍ら、他方のH2O2量は概
ね各試験管中に0.5〜2.5μｇ程度存在せしめ、水
素供与体と過酸化物のモル比が１対0.04〜0.05に
なるような反応液中で酵素反応を行わしめると最
高の測定結果が期待出来る。このような本発明の
構成要因をなす２種類の基質についての量的比率
及び使用濃度の改善につるペルオキシダーゼ活性
測定の高感度化の現象は酵素の給源及びその精製
度を反映するRZ値、補欠分子族ヘム蛋白云々の
如何を問わず各種のペルオキシダーゼ及びその各
アイソザイムに、またnativeなペルオキシダーゼ
そのものの他に人口的に化学修飾された標品更に
は各種の抗原や抗体に標識されたペルオキシダー
ゼ、固定化されたペルオキシダーゼについても同
様に認められる。殊に、nativeなペルオキシダー
ゼであつてもその使用量が極めて少い場合やまた
化学修飾されたり他に標識化されたり、更には不
溶性担体に固定化された場合においては本発明適
用の効果が一層大である。他方、通常の螢光分析
法における他の測定操作上の工夫例えば螢光強度
の測定に際しての使用セルのミクロ化等と本発明
とを適宜組合せれば、さらに極めて少量の試料に
ついてもペルオキシダーゼ活性が測定可能とな
る。 したがつて先願に加えて本発明を実施すること
により、通常の検査室等に設置されている普通型
の螢光分析計を用いるだけでペルオキシダーゼ活
性、加えて各種生体微量成分等がより簡便な操作
で且つ短時間以内に精度、感度、再現性及び安定
性共によりよく測定出来て本発明の臨床上等にお
ける意義は極めて大である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 螢光分析法によるペルオキシダーゼ活性の測
定に際して、酸性下かつ、水素供与体と過酸化物
のモル比が１対0.02〜１となる基質を含む反応液
中で酵素反応を行わしめることを特徴とするペル
オキシダーゼ活性の測定方法。 ２ 反応液が水素供与体を飽和状態又はそれ近く
含んでいる溶液である特許請求範囲第１項記載の
方法。 ３ 反応液が過酸化物を25〜0.5μｇ含んでいる
溶液である特許請求範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4553578A JPS54137397A (en) | 1978-04-18 | 1978-04-18 | Method of measuring activity of peroxidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4553578A JPS54137397A (en) | 1978-04-18 | 1978-04-18 | Method of measuring activity of peroxidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54137397A JPS54137397A (en) | 1979-10-25 |
| JPS6146116B2 true JPS6146116B2 (ja) | 1986-10-13 |
Family
ID=12722076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4553578A Granted JPS54137397A (en) | 1978-04-18 | 1978-04-18 | Method of measuring activity of peroxidase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS54137397A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60200167A (ja) * | 1984-03-24 | 1985-10-09 | Toyobo Co Ltd | 化学発光法による過酸化水素の定量法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5852640A (ja) * | 1981-09-22 | 1983-03-28 | Toppan Printing Co Ltd | 印刷用版下の作製方法 |
-
1978
- 1978-04-18 JP JP4553578A patent/JPS54137397A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS54137397A (en) | 1979-10-25 |
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