SU1606940A1 - Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл - Google Patents
Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл Download PDFInfo
- Publication number
- SU1606940A1 SU1606940A1 SU884467468A SU4467468A SU1606940A1 SU 1606940 A1 SU1606940 A1 SU 1606940A1 SU 884467468 A SU884467468 A SU 884467468A SU 4467468 A SU4467468 A SU 4467468A SU 1606940 A1 SU1606940 A1 SU 1606940A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- enzyme
- active molecules
- serine
- analysis
- sensitivity
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 title claims abstract description 7
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims abstract description 5
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 108010064983 Ovomucin Proteins 0.000 abstract description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 abstract 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 108700023668 bacilysin Proteins 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к аналитической химии ферментов и представл ет собой способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл. Цель изобретени - повышение чувствительности и специфичности анализа. Анализируемый фермент взаимодействует с иммобилизованным на твердой фазе овомукоидом из белка утиных иц или белковым ингибитором сериновых протеиназ из сем н кукурузы. Полученный комплекс обрабатывают антителами к этому ферменту,меченными другим ферментом с более высокой активностью. Детекцию осуществл ют по активности св завшейс метки. 2 ил.
Description
Изобретение относитс к аналитической химии ферментов, а именно к способам количественного определени каталитически активных молекул ферментов в биологических и биотехноло- гичаских препаратах.
Цель изобретени - повышение чувствительности и специфичности анализа .
Способ осуществл ют следующим образом ..
Пример 1. В лунки стандарт- ньк полистиролрвых микропланшетов дл иммуноферментного анализа внос т
по 100 мкл 0,1 И калий-фосфатного буфера , рН 6,3, содержащего овомукоид из белка иц утки в концентрации 0,1 мкг/мл. Планшет инкубируют при в течение 2 ч, затем удал ют из лунок раствор отсасыванием и внос т 100 мкл 1%г-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в том же буфере . После 30 мин инкубации при 37 С лунки 4-кратно промывают 0,05 К калий-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,1 У Nad и 0,05% твина-20 (буфер X), и внос т анализируемую пробу, содержащую сериновую протеинаS5
о а ;о
4
зу бацилл, разбавленную буфером X не енее, чем в 2 раза. Планшет инкубиуют 20 мин при 37°С, 4-кратно проывают буфером X и внос т по 100 мкл раствора конъюгата-поликлональньк кроличьих антител против сериновой протеиназы с пероксидазой в концентрации 1,2 мкг/мл по пероксидазе (Конъ- югат синтезирован из IgG, вьщеленных из сывороток с титром в ИФА 1:100000, и пероксидазы хрена с RZ- 3,0 перио- антным методом). Длительность инку- бации - 60 мин. Далее после четырех отмывок буфером X и одной - дистиллиованной водой в лунки внос т раствор 5-амин о салициловой кислоты (5,0 мМ) + НгОг (1,8 мМ), рН 6,0, и после 10 мин инкубации при комнатной ратуре определ ют оптическую плотность при 490 нм.
На фиг. 1 изображен типичный кали- бровочный график анализа. Чувствительность анализа - до 10 иг/мл. Средн ошибка в серии измерений - 4,6%.
П. р и м е р 2. Анализ провод т в соответствии с примером 1, но ад -- сорбцию ингибитора провод т при +4 в течение 16 ч. При этом чувствительность и точность определени не отичаютс от примера 1.
Пример 3. В лунки полистироловых микропланшетов внос т по 100 мкл 0,1 К калий-фосфатного бз/ фе- ра, рИ 7,0, содержащего ингибитор се- риновых протеиназ из сем н кукурузы, в концентрации 0,8 мкг/мл. Планшет инкубируют при в течение 16 ч. затем удал ют из лунок раствор отсасыванием и внос т 100 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в том же буфере. После 30 мин инкубации при лунки 4-кратно промывают буфером X (как в примере 1) и внос т анализируемую пробу, содержащую сериновую протеиназу бацилл, раз- равленную буфером X не менее чем в 2 раза. Кикропланшет инкубируют 10 мин при и провод т дальнейший анализ по методике, приведенной в примере 1, вплоть до отмывки от иш(унопе роксидазного конъюгата. После отмывки в лунки внос т по 100 мкл 3,7 мМ раствора орто-фенилендиамина в 30 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, с 1,8 мМ HjOj. Микропланшет вьщерживают 10 мин в темноте при комнатной температуре , а затем останавливают реак
5
0
5
0
5
0
5
0
5
цию, добавл ют по 50 мкл 0,5 К HjSO. Оптическую плотность измер ют при 490 нм.
На фиг. 2 изображен калибровочньй график анализа. Чувствительность анализа - 1 нг/мл. Средн ошибка определени - 3,4%.
Пример 4. В лунках микро- планшетов провод т иммобилизацию мукоида из белка иц утки и обработку .бычьим сывороточным альбумином в соот- ветствии с примером 1. После отмывки от альбумина буфером X микропланшет промьшают дистиллированной водой, высушивают и хран т при до 3 мес.
Далее анализ провод т в соответствии с примером 1, но концентраци г конъюгата составл ет 2,0 мкг/мл (по содержанию пероксидазы).
Чувствительность определени - 10 нг/мл, средн ошибка - 8-10%, рабочий диапазон калибровочного графика достоверно не отличаетс от примера 1.
Предлагаемьй способ по сравнению с известным позвол ет увеличить чувст-- вительность определени ферментов более чем в 100 ра, сократить врем анализа более чем в 4 раза, а также существенно повысить специфичность анализа и упростить способ его проведени , дл которого может использоватьс стандартное оборудование дл иммуноферментного анализа, имеющеес во многих исследовательских и клинических лаборатори х.
Формул а- изобретени
Способ количественного определени каталитически активных молекул сери- новых протеиназ -бацилл, предусматривающий проведение реакции анализируемого фермента с иммобилизованным на твердой фазе реагентом, специфически св зывающимс с активньпу центром фермента , и детекцию образовавшегос комплекса путем взаимодействи со специфическими антителами, меченными другим ферментом, с последующим определением активности св завшейс метки, отличающийс тем, что,.с целью Повьш1ени чувствительности и специфичности анализа, в качестве реагента , специфически св зывающегос с активным центром фермента, исполь« - зуют овомукоид из белка утиных иц или белковый ингибитор сериновых про- . теиназ из сем н кукурузы.
ОЛ
0.5
01
W
г.
Ю С.пкг
ОЛ
1.0
0
0.
Claims (1)
- Формула· изобретенияСпособ количественного определения каталитически активных молекул сериновых протеиназ -бацилл, предусматривающий проведение реакции анализируемого фермента с иммобилизованным на твердой фазе реагентом, специфически связывающимся с активным центром фермента, и детекцию образовавшегося комплекса путем взаимодействия со специфическими антителами, меченными другим ферментом, с последующим определением активности связавшейся метки, отличающийся тем, что,.с целью повышения чувствительности и специфичности анализа, в качестве реагента, специфически связывающегося с активным центром фермента, исполь*=зуют овомукоид из белка утиных яиц или белковый ингибитор сериновых про- . теиназ из семян кукурузы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884467468A SU1606940A1 (ru) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884467468A SU1606940A1 (ru) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1606940A1 true SU1606940A1 (ru) | 1990-11-15 |
Family
ID=21392698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU884467468A SU1606940A1 (ru) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1606940A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001096576A1 (en) * | 2000-05-09 | 2001-12-20 | Shanghai Biowindow Gene Development Inc. | A novel polypeptide, a human atp-dependent serine protein hydrolase 10 and the polynucleotide encoding the polypeptide |
-
1988
- 1988-07-28 SU SU884467468A patent/SU1606940A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Shirahata А., Christman К. L., Pegg А. Е. Quantitation of S-adeno- sylmethionine decarboxylase protein.1985,Biochemistry, v. 24, № 16, p. 4417-4423. Delpech B.Chanzy C., Davean M., Lebreton J. - P., Bentrand i P., Annie 0. Caracterisation d une hyaluro- nidase de type- lysosmal dans le mili- en de culture da deux lignees cellu- lares derivees d hepatomes huraains 1986,.Comptes rendus de l Academie das sciences, t. 302, serie Щ, № 16, p. 593-596. 2 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001096576A1 (en) * | 2000-05-09 | 2001-12-20 | Shanghai Biowindow Gene Development Inc. | A novel polypeptide, a human atp-dependent serine protein hydrolase 10 and the polynucleotide encoding the polypeptide |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4886761A (en) | Polysilicon binding assay support and methods | |
| US6429026B1 (en) | One-step all-in-one dry reagent immunoassay | |
| US5051356A (en) | Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use | |
| US4578361A (en) | Creatinine antibody | |
| US5506114A (en) | Methods and kits for detecting the presence or concentration of biological analytes | |
| US20070184504A1 (en) | Assay for anti-INGAP antibodies | |
| RU2232991C1 (ru) | Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
| JP4197393B2 (ja) | ＩｇＡ腎症の検査法 | |
| US6127136A (en) | Detection of dioxin-like compounds by detection of transformed Ah receptor/ARNT complex | |
| EP0514509B1 (en) | Composition and its preparation process using antigen conjugated to enzymatic activity for immunological diagnosis and chagas' disease immunological diagnosis kits, for individual and epidemiological application, based on that composition | |
| JPWO1999050663A6 (ja) | ＩｇＡ腎症の検査法 | |
| JPH03123498A (ja) | 線溶系測定法 | |
| RU2417375C2 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
| RU2380707C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
| CZ83393A3 (en) | Process of treating humors when determining neopterin and means for carrying out said process | |
| SU1606940A1 (ru) | Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл | |
| KR20010025027A (ko) | 면역측정시약 및 면역측정법 | |
| RU2232992C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
| RU2376605C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
| EP0943919B1 (en) | An assay surface that permits an analyte releasing step | |
| RU2251697C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека по классическому пути активации | |
| RU2506594C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
| RU1814075C (ru) | Способ определени трипсина в крови | |
| JPH08509064A (ja) | 化学的に架橋したタンパクの固相支持体上の固定化 | |
| US4778755A (en) | Immunoassay method |