JPS614962A - 薬物誘発性血小板減少症の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、薬物誘発性血小板減少症の固相免疫測定法に
関する。より詳細には本発明は薬物誘発性血小板減少症
の検出に適合した酵素連結免疫特異測定（ＥＬＩＳＡＪ
に関する。

個人によってはある種の薬物が血小板減少症を招く免役
反応をひき起こすことがある。血小板減少症と特定の薬
物との間の因果関係を臨床歴から推定することはできな
い。これは、患者が多重的に薬物を服用していたり、あ
るいはまた血小板減少症によシ複雑化することの知られ
る関連障害が存在したりする力・らである。患者に疑い
のある薬物を再投与することにより原因物質を同定する
ことは可能である。しかしながら、このとり組み方には
潜在的なリスクがあるため、倫理的に容認し難いものと
なる可能性がある。従って副作用を起こす薬物依存性抗
体を検出する測定技術からの取υ組みが好ましい診断の
やり方である。

薬物依存性抗体の検出には放射免役測冗技術がオリ用さ
れている。例えばフエイグ、ダグラス（Ｆａｉｇ、　Ｄ
ｏｕｇＬａ日）およびカルパトキン、シモン（Ｋａｒｐ
ａｔｋｉｎ、　８１ｍｏｎ）　ｒ結合抗血小板ＩｇＧ、
血清自己−、アローおよび薬物−依存性抗体の検出のた
めの簡易同相放射免疫測定に関する累積経験（Ａ　Ｃｕ
ｍｕｌａｔｉｖｅ　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　
ａ　ＳｉｍｐｌｉｆｉｅｄＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｒ
ａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｄ
ｅｔｅｃ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｏｕｎｄ　Ａｎｔｉｐｌ
ａｔｅｌｅｔ　ＩｇＧ、　Ｓｅｒｕｍ　Ａｕｔｏ−。

Ａ１１ｏ　−ａｎｄ　Ｄｒｕｇ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　）　Ｊ、Ｊ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ
、　Ｈｅｍ、、　６０．（４，／：　８０７〜８１５（
１９８２）参照。

ここに開示されている技術は微量滴定板のウェル内に血
小板検体を沈殿させることを含んでいる。その血小板は
洗浄され、そして抗ヒトエｇＧ（家兎）が各々の血小板
で被覆された微量滴定ウェルに添加される。室温で１時
間インキュベーションの後、それらウェルは洗浄され、
１２５ニ一ブドウ球函プロティンＡで処理されそして再
度室温で１時間インキュベートされる。それらつエルを
洗浄した後、各ウェルの放射能が測定されそしてコント
ロールと対比される。この技術は効果的ではあるがそれ
には放射性物質の使用が必要であり害が伴う。

血小板抗体の検出に利用されるもう一つの技術は免役酵
素測定である。精製家兎抗ヒトエｇＧ抗体を、ｍ−マレ
イミドベンゾイル−ヒドロキシスクシンイミドエステル
を２官能試薬としてまたＯ−ニトロフェニル−β−ガラ
クトピラノシドを標識抗グロブリンの酵素活性を評価す
るための基質として用いてβ−ガラクトシダーゼに接合
さぜる。Ｎ験は液相で行われ、また抗体は免疫螢光光学
密度または他の適当な測定手段により検出される。例え
ばボルジニ、ピー（Ｂｏｒｚｊｎｉ＋　ｐ、）ほか［血
小板抗体の検出および定量のための免役酵素測定：血小
板β−ガラクトジター七試験（ＰＧＴ）　（Ａｎ工ｍｍ
ｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉ　ｃＡｓｓａ７　ｆｏｒ　ｔｈ
ｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｑｕａｎｔｌｔａｔ
ｉｏｎｏｆ　Ｐ：Ｌａｔｅｌｅｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：　　Ｔｈｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　　β−Ｇａｌａｃ
ｔｏｓｉｄａｅｅ　　Ｔｅ５ｔ　　（ＰＧＴ）Ｊ　　、
Ｔ、　　工ｍｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈ、。

１４．３２３〜３３２（１９８１）参照。

血小板減少症ｇＧの検出には電気免疫測定技術が応用さ
れている。例えばクニツキ、トーマス・ジエイ（Ｋｕｎ
ｌｃｋｌ、　Ｔｈｏｍａｓ　Ｊ、）ほか［電気免疫測定
による血小板関連ＩｇＧの直接定量（ＤｉｒθｃｔＱｕ
ａｎｔｌｔａｔ１ｏｎ　ｏｆ　Ｐ］、ａｔｅｌｅｔ−Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｄ工ｇＧｂｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ）Ｊ　Ｂｌｏｏａ　６０　（１）　：
　５４〜５９（１９８２）参照。キニンおよびキニジン
誘発性血小板減少症のスタディには電、気泳動がオリ用
されている。例えばクリスチー、ダグラス°ジエイ（Ｃ
ｈｒｊｓｔｌｅ、　Ｄｏｕｇｌａｓ　、ｒ、）およびア
スター、リチャード・エイチ（Ａｓｔｅｒ、　Ｒ１（！
ｈａｒｄ　Ｈ，）　ｒキニン−およびキニジン−誘発性
血小板減少症における薬物−抗体−血小板相互作用（Ｄ
ｒｕｇ−Ａｎｔｉ　ｂｏｄｙ−Ｐｌａｔｅｌｅｔ　　工
ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　　ｉｎ　　Ｑｕｌｎｉｎｅ−ａ
ｎｄＱｕｌｎｌｄｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｔｈｒｏｍ
ｂｏｃｙｔ、ｏｐｅｎｌａ）Ｊ　Ｊ。

Ｃ１１ｎ、　　工ｎｖｅｓｔ、、　　７０（５）：　９
８９〜９９９　（１９Ｂ２）参照。

血小板抗体の検出には酵素連結免疫収着剤測定（ＥＬ工
ＳＡ）技術が応用されている。シラファー。

チャールズーエイ（Ｓｃｂｊｆｆｅｒ、　Ｃｈａｒｌｅ
ｓ　Ａ、）　　およびヤング、バージニア（Ｙｏｕｎ、
ｇ、　Ｖｌｒｇｌｎｌａ）　ｒ微景酵素連結免役収着剤
側冗（ＫＬ工ＳＡ）を用いた血小板抗体の検出（Ｄｅｔ
ｅｃｔ、ｉｏｎ　ｏｆ　ＰｌａｔｅｌｅｔＡｎｔｌｂｏ
ｄｊｅｅ　Ｕｓｌｎｇ　ａ　Ａｉｌｃｒｏ−Ｅｎｚｙｍ
ｅ−Ｌｉｎｋｅｄ工ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ、ｔ　　Ａ
ｓ５ａｙ　　（ＥＬ工ＳＡ）月　Ｂｌｏｏｄ　　６±（
２）、３１１〜３１７（１９８３，）参照。アルカリ性
ホスファターゼに接合された抗−ヒトエｇＧを用いる「
サンドインチ」法によ、り血小板関連ＩｇＧを検出する
ＥＬＩＳＡ試鋏には凍結乾燥血小板が用いられる。試験
結果は自動式マイクロＫＬ工ＳＡ読取機ヲ用いて、ｐ−
ニトロフェニルホスフエートヲ基質として定量される。

ヘッジ、ニー・エム　（Ｈｅｄｇｅ　、　Ｕ、Ｍ、　）
らは抗ヒトエｇＧ（ＡＩｇＧ）をポリスチレン上にコー
ティングし、そのＡＩｇＧに可溶化血小板関連工ｇＧ（
ＰＡ工ｇｃ））を結合し、次いでそのＰＡＩｇＧを酵素
接合体と基質のｐ−ニトロフェニルホスフエートヲ用い
ることにより測定することから々る血小板関連工ｇＧ検
出のためのＦｉＬ工ＳＡ試験を開示している。

ヘッジ、ニー・エム　（Ｈｅｄｇｅ、　Ｕ、λり、）ほ
か「血小板関連ＩｇＧ検出のための酵素連結免疫辿１定
（’Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ工ｍｍｕｎｏａｅｅａ
ｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｃｌｏｎｏｆ　Ｐｌａｔ
ｅｌｅｔ、　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｄ工ｇＧ）　Ｊ　Ｂｒ
１ｔ、　Ｊ、　Ｈｅｍａ、。

４８．５９〜４６（１９８１）参照。

米国特許第４，０１６，０４３号明細書はポリスチレン
微量滴定板に結合させた抗ヒトエｇＧをヒト血清または
血漿で処理する酵素免役測定（Ｅ工Ａ）を開示している
。処理された滴定板は６７℃で約２時間インキュベート
される。微量滴定板のウェルを空にしそして約１４の州
の緩衝液で洗浄する。

この技術はＢ型肝炎表層抗原の検出に使用でき、その場
合、抗体をポリスチレン板に結合した後それを血清また
は血漿で処理する。西洋ワサヒヘルオキシダーゼを添加
しそしてその物質をインキュベートして反応を完結させ
る。結果は比色読値として記録される。

米１１再発行特許第Ｒｅ３１，００６号明細書は同様の
ＥＩＡ技術を開示している。それは基質として酵素力タ
ラーセ、はルオキシダーセ、β−グルクロニダーゼ、グ
ルコース−オキシダーゼおよびガラクトース−オキシダ
ーゼを開示している。

米国特計第３，６５４．０９’０号明細書は抗原および
抗体を酵素で標識する方法を開示している。１例ハ、ヒ
ト絨毛性ゴナドトロピンと西洋ワサビペルオキシダーゼ
との接合体である。

本発明者らは篤（べきことに、免疫介在薬物誘発性血小
板減少症の判定にＥＬ工ＳＡ技術を通用できることを見
出した。本発明の測定方法は、ａ）血小板を薬物誘発性
血小板減少症の疑いのある患者に由来する血清または血
漿およびその血小板減少症の原因になる疑いのある薬物
と接触させ、 ｂ）そのように処理された血小板を約２１Ｃ〜約２４℃
の温度で約１５〜約２５分間インキュベートし、 Ｃ）その処理された血小板を前記薬物を含有する洗浄溶
液で洗浄しそしてそれら血小板をその洗浄溶液中で再懸
濁し、 ｄ）特異結合タンパクを結合した固体支持体を前記再懸
濁された血小板と接触させそしてそれら反応成分をイン
キュベートし、 θ）未結合血小板を傾瀉し、そして ｆ）結合血小板を （１）　　ｉ■小板を結合したＡｆＪ記固体支持体を酵
素接合体と接触させそしてそれら反応成分をインキュベ
ートし、 （２未結合反応成分を除去し、 （６）前記支持体プレートを基質と接触させそしてそれ
ら反応成分をインキュベートし、（４）　　前記酵素接
合体の作用を受けた基質光゛を測定する ことにより測定し、そして ｇ）基準値、および薬物不含コントロールを段階ａ）〜
ｆ）に付すことにより導がれた値のうちの少くとも一方
と比較する ことよりなる。

別の態様において、本発明者らは ａ）特異結合タンパクを結合した非水溶性固体支持体、 ｂ）酵素接合体、 Ｃ）基質、および ｄ）血小板 を含む薬物誘発性血小板減少症判定用キットを開発した
。

検体の０．Ｄ、を薬物を添加しないほかは同じ方法で調
製されたコントロールと比較することにより、疑いのあ
る薬物の免疫原作用を測定できる。好ましい酵素接合体
はアルカリ性ホスファターゼ−抗−工ｇＧでありまた好
ましい基質はｐ−ニトロフェニルホスフェ−トチアル。

本発明の詳細な説明 本発明は、診断目的の血小板抗体測定へのＥＬ工ＳＡ技
術の適用に関する。特に本発明は崩小板減少症の原因と
なる疑いのある物質の検出方法に関する。詳しくは、本
発明は薬物誘発性血小板減少症の検出方法そして特にキ
ニン−またはキニジン誘発性血小板減少症の検出方法に
関する。

本発明の実施にあたっては、凍結乾燥血小板を薬物誘発
性血小板減少症の疑いのある患者に由来する血清または
血漿と接触させる。前記血小板は血清または血漿中に存
在する可能性のある抗体に対する免疫吸着剤として用い
られる。

新鮮血小板を用いてもよいが、該血小板に既に結合して
いる抗体からのバックグラウンド読みを最小限に抑える
ために凍結乾燥した血小板を用いるのが好ましい。ヒト
血小板ｔの抗体ｆ′場度は通常約２０　ｎｇ／ｌ　０　
’血小板であるのに対し凍結乾燥血小板の抗体齢反は約
１〜５　ｎｇ／１０’血小板である。

本発明に使用するのに適した凍結乾燥血小板の調製方法
は当該技術分野においてよく知られている。例えば米国
特許＠４，２８７，０８７号明細書参服。新鮮血小板を
洗浄しそしてホルムアルデヒド、ゲルタールアルデヒド
または（パラ）ホルムアルデヒドで固定する。その固定
された血小板を凍結乾燥しそして乾燥状態で貯蔵する。

本発明の実施に用いるために精製水で再構成した場合の
血小板懸濁液は懸濁液１μｔあたり約４．５Ｘ１０５〜
５．５Ｘ１０５個の血小板を含有する。

本発明に用いうる薬物には一般的に薬物誘発性血小板減
少症に関連づけられるもの、例えば金、キニン、キニジ
ン、チロキシンおよびスルホンアミド誘４ｊ体などが含
まれる。キニンおよびキニジンが好ましい。患者血清ま
たは血漿には薬物の混合物が存在しうる。

本発明のＫＬ工ＳＡ試験を行うに際しては血小板減少症
の原因になる疑いのある薬物の溶液を調製する。過度の
希釈が扱求されないように、約７　ｍＭ〜約１０ｍＭの
濃度を有する薬＠原液が本発明の目的に適している。

本発明のＢｊＬＩＳＡ法を行うにおたｐ、使用物質の量
はそれ自体臨界的ではなく本発明の範囲内で変化させう
る。

好ましい態様では、約５ｏμｔ〜約１５０μｔの患者血
漿を１．５　ｍｌ微小遠沈管にピペットで注入する。そ
の管に約１５〜約４０μｔの薬物原液および約５０μＬ
〜約１５０μｔの再構成血小板を添加する。その管をゆ
るやかに渦動させそして約２１℃〜約２５℃で約１５〜
約２５分間インキュベートする。

このインキュベーション過程で患者血清が疑いのある薬
物に対する抗体を含む場合には薬物−抗体−血小板複合
体が形成されることになる。

インキュベーション後、その管を遠心分離しセして上清
液を血小板ベレットを動かさなりように注意しながら注
意深くピばットを使用して捨てる。

次にそのベレットを邑該薬物を含有する血小板洗浄緩衝
液を用いて洗浄する。この血小板洗浄緩衝液は約０．０
’２０Ｍ〜約０．０２８ＭＩＪン酸ナトリウム、約０．
００７Ｍ〜約０．０１０ＭジナトリウムＫＤＴＡ、約０
．１０Ｍ〜約０．２０Ｍ塩化ナトリウムおよび約０．７
５０〜約１２５％（ｗ／ｖ　）牛血清アルブミンを含む
。

薬物洗浄緩衝液の調製には、約２〜約６１の薬物原液を
約２０〜約３５−の血小板洗浄緩衝液に添加して薬物を
約１：１０に希釈する。各ベレット洗浄に約１００μｔ
の薬物洗浄緩衝液を用いる。洗浄されたベレットはプレ
ート洗浄緩衝液に再懸濁される。

プレート洗浄緩衝液の組成は臨界的ではない。

それは水と非イオン表面活性剤のみを含有するものであ
ってよい。しかしながら、本発明の実施に際しプレート
洗浄緩衝液は酵素接合体のキャリアーとして用いられる
ので、その酵素接合体の劣化を避けるためにその洗浄緩
衝液のｐＨを約５．６〜約８．６とするのが好ましい。

プレート洗浄緩衝液の声は約ＺＯ〜約７４とするのが好
ましい。

典型的なプレート洗浄緩衝液は約０．０１７５Ｍ〜約０
．０２２Ｍリン酸ナトリウム、約０．１２５Ｍ〜約０．
１７５Ｍ塩化ナトリウム、約０．０４％（ｖ／ｖ）〜約
０．０６％（ｖ／ｖ　）の非イオン表面活性剤および約
０．０１５％〜約０．０２２　’ｌａ　（ｖ／ｖ）のア
ジ化ナトリウム保存剤を含む。

本発明の薬物誘発性免疫測定を行うにあたり、抗体濃度
を正確に測定するために反応複合体の希釈を行う必要が
ある。そのレベルが高過ぎると光学密度値が本発明の実
施に用いられたＫＬＩ軽試験の実行者により利用される
特定の１！！Ｌ工ＳＡ読取機（リーダー）の限界を超え
てしまう可能性がある。この潜在的問題を避けるために
薬物−抗体処理された血小板を希釈しておく。

典型的には、本発明の実施に用いられる希釈は１：５〜
約１：１００にわたって変えうる。好ましい一態様にお
いては２種類の希釈、すなわち１：５および１：４ｏを
用いそして各希釈について試験を２回ずつ行う。

血小板関連薬物誘発性抗体を定量する第１段階はそれを
不活性不溶性担体に結合された特異結合タンパクと反応
させることである。本明細書において用いられる用語「
特異結合タンパク」は抗体、抗原またはハシテンと特異
的に反応するタンパク群の１種またはそれ以上のものを
意味する。有用なタンパクにはγ−グロブリン類、免疫
グロブリン類およびレクチン類が含まれる。

本発明の特異結合タンパクは好ましくはＩｇＧとして知
られる免疫グロブリンサブクラスに属する。

本発明の実施にあたシ、抗ヒトエｇＧが一般に特異結合
タンパクとして用いられる。

特異結合タンパクの調製および精製は当該技術分野にお
いて周知である。ＥＬＩＳＡ型診断試験の実行者は、例
えばヤギまたは家兎血清に由来する様々力抗ヒトエｇＧ
を容易に入手できる。

特異結合タンパクが支持される支持体は、七の特異結合
タンパクを吸着ないし結合しうる透明、不活性、非水溶
性の支持体である。かかる支持体用材料としては例えば
炭化水素重合体例えばポリスチレン、ポリエチレンおよ
びポリブチレンなどが挙げられる。その他の適当な有機
重合体としては例えば縮合物、例えばポリエステルおよ
びポリアミド；セルロースおよびセルロース誘導体；お
よびビニル系重合体例えばアクリレート、メタクリレー
ト、塩化ビニル単独重合体、ポリ塩化ビニール−アクリ
レート共重合体、ポリスチレンの共重合体などが挙げら
れる。

固体支持体表面の特に効果的な形態は試験管または微量
滴定板ウェルである。本発明の好ましい固体支持体表面
は微量滴定板である。何故ならば自動ＫＬ工ＳＡ読取シ
のために自動装置が容易にｆｌｕ用できるからである。

血小板関連抗体の定量的および／またけ定性的な量はそ
の固体支持体媒体を薬物／血清洗浄血小板で処理するこ
とにより測定される。本発明の免疫御１定を行うにあた
っては薬物−抗体−血小板懸濁液の各種希釈物を固体担
体媒体例えば抗ヒトエｇＧで被覆された微量滴定板と接
触させる。血小板懸濁液の使用量は臨界的ではないが、
約１．０Ｘｊ０６〜約１．５Ｘ１［１７個の血小板を処
理すべき微量滴定板のウェルに徐加するのが好ましい。

抗ヒ）ＩｇＧで被覆された本発明の実施に用いるのに適
した良質の微量滴定板は容易に入手可能であって、本発
明のＫＬ工ＳＡ試験のために新たに作製する必要はない
。特異結合タンパクとしては任意の抗ヒトエｇＧを利用
しうるが、典型的にはヤギまたは家兎由来抗−ＩｇＧが
用いられる。

血小板９濁液で処理された固体支持体媒体は約２１℃〜
約２４℃で約３Ｖ２〜４μ時間インキュベートされる。

そのインキュベーション時間の間に、関連ヒ）ＩｇＧを
有する血小板は特異結合タンパクに結合されることにな
る。残りの血小板は固体支持体プレートをすすぐ間に抗
い流、される。

結合血小板−関連抗体の定性的および／ｌたは定量的々
測定は処理された支持体プレートを標識物質と接触させ
ることによシ行われる。本発明の免疫測定に用いる標識
物質は任意の通常の標識であってよく、例えば放射性同
位元素、酵素または螢光測定用物質などであってもよい
。

標識化をどのように行うかにかかわらず、標識物質は検
出すべき抗体のトシ′−サーとして働く。

特に好ましい方法は、特異結合タンパクが酵素で標識さ
れている酵素接合体を使用する方法である。本明細書に
用いられる用語「酵素接合体」は１種またはそれ以上の
酵素分子に共有結合的に連結された完投学的成分を意味
する。このような連結は、直接縮合によるか、または当
業者に知られた方法により外部架橋分子を用いることに
よって達成することができる。すなわち、共有結合を用
いる酵素接合体の製造は、カルボジイミド、ジイソシア
ネート、ゲルタールアルデヒドおよびビスージアゾベノ
チジン々どの試薬により行うことができる。

接合体の一部をなす酵素の選択は特異結合活性などの性
）Ｂ（高転化率は試験システムの感度を増大させる）お
よび酵素の測定簡易度により決められる。最も簡単ガ酵
素測定は酵素が呈色反応成分が開力する転化を触媒する
ものである。

このような比色抑１冗は自動化することができる。

分光光度測定または螢光測定によυ迎１足しうる反応成
分の関与する転化を触媒する酵素を用いることもできる
。

本発明の実施に用いるのに適した酵素にはカタラー七、
ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、グルツースオキシダー
ゼおよびアルカリ性ホスファターゼが含まれる。アルカ
リ性ホスファターゼが好ましい酵素である。

酵素接合体の溶液を処理された支持体プレートと接触さ
せそしてインキュベートする。インキュベーション時間
の好ましい長さは酵素接合体の濃度および活性、および
インキュベーション温度に依存する。アルカリ性ホスフ
ァターゼ酵素接合体に対しては、好ましいインキュベー
ション時間は約２１℃〜約２４℃で約１０分〜約１００
分、好ましくは約１５〜約３５分である。インキュベー
ションの完了後その支持体プレートを洗浄して未結合酵
素接合体を除去する。

次いでその支持体プレートを基質で処理する。

本明細書に用いる用語「基質」は酵素の作用を受けて反
応生成物を生じる化合物を意味する。

アルカリ性ホスファターゼが酵素のときは好ましい基質
はｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｒｐＮｐｐ」）で
ある。ＰＮＰＰに対するアルカリ性ホスファターゼの作
用により生じる反応生成物は黄色体であるｐ−ニトロフ
ェノールである。アルカリ性ホスファターゼと共に用い
るのに適した他の基質には４−メチルウムベリフエリル
ホスフエート、α−ナフチルホスフェート、フラボン−
６−：）ホスフェートおよびチモールフタレインが含ま
れる。

本発明の実施に有用なその他の＃素−基質対には西洋ワ
ザビペルオキシダーセ１０−フェニレンジアミンおよび
ペルオキシド、β−ガラクトシｐ＝−−Ｍ１０−−トロ
フエニノ１−β−Ｄ−−Ｎラクトピラノシド、β−ガラ
クトシダーセ／ウムヘリフエリルーβ−Ｄ−ガラクトシ
ド、グルコースオキシダーゼ１０−ジアニンジンおよび
西洋ワサビペルオキシダーゼなどが含まれる。

基質で処理した後、その支持体プレートをインキュベー
トして基質反応生成物を生成させる。

酵累−基質対、および支持体プレートに接触させる基質
洗浄緩衝液中の基質濃度に依存する。

醇索−基質対がアルカリ性ホスファターゼ−ｐ−ニトロ
フェニルホスフェニドの場合、好ましいインキュベーシ
ョン時間は約−２１Ｃ〜約２４℃で約６０分〜約６０分
である。

好ましくは、基質緩衝液は約８％〜約１０％（ｖ／ｖ）
のジェタノールアミン、約０．４ｍＭ〜約０．６ｍＭの
塩化マグネシウムおよび約０．［’１１７５〜約［１，
０２２％（Ｗ／りのアジ化す）ＩＪウム（保存剤として
）の精製水溶液よりなる。

基質緩衝液中の基質濃度は約１■／−〜約６ｇｙ／ゴで
ある。本発明の実施により処理された微量滴定板の各ウ
ェルに対し、約８０μｔ〜約２００μｔの基質緩衝液を
添加するのが好捷しい。

基質反応生成物量、そして有色体が反応生成物の場合に
は生じる色の強度が、支持体プレートに結合した酵素接
合体の量の直接の関数となる。従って基質反応生成物の
測定は支持体プレートに結合した薬物−誘発性抗体の測
定となる。

基質反応生成物は微量滴定板のウェル内に形成された反
応生成物の光学密度を測定することにより＋１１１１１
　定石しる。ｐ−ニトロフェニルホスフェートの場合に
は、黄色反応生成物であるｐ−ニトロフェノールが支持
体プレートのウェル内に生じる。固体支持体が微量滴定
板のときは、生じる有色体の光学＠度は約４０５　ｎｍ
でＥＬ工ＳＡ読取９機を用いて測定される。

そのようにして得られた読みと対比するためのコントロ
ールをうるために、薬物を血小板洗浄緩衝液を含めない
ほかは前記手順全体を繰り返す。薬物含有システムの光
学密度の比較により薬物誘発性免疫反応の有無が判定さ
れる。薬物誘発性免疫反応がなければそれら２つの光学
密度の読みは実質的に同じとなろう。そうではなく薬物
誘発性免疫反応のある糸の光学密度はフントロールのそ
れよシも高くなる。

実際上、本発明は一般に処理された（すなわち薬物を含
有する）血小板から得られた値をコントロール血小板か
ら得られた値と比較しそしてその有意差をみることを含
む。一般的に、測定値の有意差が大きい程被験薬物が薬
物誘発性血小板減少症の原因と方っている確度が高いこ
とを見出した。

以上不発明を、患者検体を陰性コントロール、すなわち
有意音の疑いのある薬物を含まないものと比較するため
の測距手段として説明した。

しかしながら、基負量の副足は標準的方法によρ、例え
ば１ｇＧの分析により作られた標準曲線と比較すること
により、丑だ他の適当なコントロールまたは標準を用い
ることにより行うことができる。

本発明の要所は以下の実施例を参酌することにより容易
に理解されよう。

実施例を含むすべての開示においてパーセントはずべて
特に断りがなければＭ量に基づく。

実施例　Ｉ この実施例はキニン誘発性血小板減少症の検出への本発
明の有用性を実証するものである。

次の組成を有するプレート洗浄緩衝液（ｒＰＷＢＪ）を
調製した。

リン酸ナトリウム　　　　　０．０２Ｍ塩化ナトリウム
　　　　　　０．１５Ｍ表面活性剤（１）　　　　　　
　０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム　　　　０．
０２％（ｗ／ｖ　）精　製　水　　　　　　　　　Ｑ、
Ｓ、（十分量）（１）　　エトキシル化重合体（Ｔｗｅ
θｎ　２０）を表面活性法の組成を有する血小板洗浄緩
衝液を調製した。

リン酸ナトリウム　　　　　０．０２６Ｍ塩化ナトリウ
ム、　　　　　　０．１５Ｍ牛血清アルブミン　　　　
　　　１％（ｗ／ｖ）精製水　　　Ｑ、ｓ。

前記プレートａ浄緩衝液および血小板洗浄緩衝液は用時
調製丁べきであるが、予め調製しておくときは約２°〜
約８Ｃで貯Ｍこれうる。

次の組成を有する基η緩衝液を調製した。

ジェタノールアミン　　　　　　９７％（ｖ／ｖ）塩化
マグネシウム　　　　　０．５　ｍＭアジ化ナナトリウ
ム　　　　００２チ（Ｗ／Ｖ）精製水　　　　８ｍｌ。

ｐζトロフェニルホスフェ−）　　　　４０ｍＩＰ基質
緩衝液は井１時調衷するのが好ましいが凍結−融解を避
ければ一２０℃で１ケ月貯蔵されうる。室温では緩衝液
は調製後１時間以内に使用されねば々らない。

０型血から予め調製された凍結乾燥血小板を精製水を用
いて再構成する。血小板溶液中の血小板濃度は１μを中
に血小板約５Ｘ１０５個である。

キニン誘発性免疫血小板減少症に罹患していると思われ
る患者から血液検体を抜き取る。その血液を遠心分離し
そして血小板不含血漿を注意深くピペットで取りそして
使用時まで保存する。

薬物原液は１７．９■のキニン、　ＨＣｔ　、　２Ｈ２
０を５−９脱イオン水に溶解することにより調製する。

この溶液のキニン濃度は９ｍＭである。薬物洗浄緩衝液
は予め１：１０に希釈しである血小板洗浄緩衝液２８−
に４ｍｌの薬物原液を添加することにより調製逼れる。

１００μｔの血漿を２個のプラスチック製１．５−微小
遠沈管の各々にピはットで注ぐ。それら遠沈管ＫｒＡＪ
および「Ｂ」のラベルを施す。

２５μｔの９ｍＭ薬物原液を遠沈管Ａに添加した。

２５−の血小板洗浄緩衝液（薬物不含）を遠沈管Ｂに添
加した。混合後１００μｔの再構成された血小板を径管
に糸加した。それら遠沈管をゆるやかに渦動させ、そし
て約２３０で２０分間インキュベートした。１０分間の
間をおいて６管をゆるやかに混合した。両管を２００Ｘ
、９で１０分間遠心分離しそして上滑を血小板にレット
を動かさずに注意深くピペットを用いて捨てる。

約１００μｔの薬物洗浄緩衝液を管Ａに添加し、そして
約１００μｔの血小板洗浄緩衝液を管Ｂに添加した。血
小板をピペットで磨砕することによシ再懸濁した。それ
ら洗浄された血小板を遠心分離しそして同じ方法でさら
に２回洗浄した。

管ＡおよびＢの各々に０．５−のプレート洗浄緩衝液を
添加した。各試料を磨砕しそして渦動させた。検体（Ａ
）およびコントロールＣＢ＞’ｌ各各１：５および１：
４０に希釈する。１：５希釈には１００μＬの管Ａｉた
は管Ｂを４００μｔのプレート洗浄緩衝液に添加する。

１：４０希釈には５０μＬの管ＡまたはＢを１９５ｍの
プレート洗浄緩衝液に沿加する。

１００μｔの各希釈物を抗ヒト−１ｇＧをその表面に結
合した微量滴定板のウェル内にピペットで注入する。蒸
発防止のためにそのプレートをプラスチックフィルムで
覆いそして２３℃で４時間インキュベートした。その微
量滴定板から溶液を排液し、そのプレートをプレート洗
浄緩衝液で６回洗浄しそして排液した。プレート洗浄緩
衝液中のアルカリ性ホスファターゼ−抗ヒ）　−ＩｇＧ
接合体の溶液約１００μＬを谷試験ウェルに添加しそし
てそのプレートを約２３℃で６０分間インキュベートし
た。インキュベーション時間の終了時に溶液をプレート
から排液しそしてそのプレートなブレ・−ト洗浄緩衝液
で３回洗浄した。

緩衝液中の基質１００μＬを各試験ウェルに添加しそし
てそのプレートを２３℃で３０分間インキュベートした
。試験ウェルの各々の光学密度なＫＬ工ＳＡ読取機を用
いて測足した。コントロールの１：５希釈物の光学密度
（０、Ｄ、）は０２５７であったのに対し検体の光学密
度は０．６５５であった。それら２つの読みの間のＯ，
Ｄ、値の差に基づき患者の血小板減少症は薬物誘発性で
あると結論された。

商業的に入手しうる酵素接合体がロットごとに変動があ
ｐ既知強度の標準希釈物を調製する必要のあることは当
業者の解するところであろう。これは、まず１．０のＯ
，Ｄ、と相関する工ｇＧのナノグラム数を任意に選択す
ることにより行うことができる。そのナノグラム数のヒ
トＩｇＧ。

例えば１２８ｎｇを微量滴定板の約６〜約１０ウエルの
各々に添加する。約２１℃〜約２３℃で４時間インキュ
ベーションの後、そのプレートを洗浄しそして酵素接合
体の各種希釈、例えば１：２５．１：５０　、１ニア５
　、１：１００などの希釈物をウェルの各々に添加する
。

前述の試験手順を繰り返す。ｔｏの０．Ｄ、に相当する
希釈物が本発明の薬物免疫血小板減少症検定に用いるの
に選択される希釈である。酵素接合体の新しい試料を用
いる都度新しい希釈値を定める必要がある。

実施例　■ 薬物としてキニンに代えてキニジンを用いた＃なかは実
施例１を繰り返した。９ｍＭ薬物ＩｊＫ液を調製するた
めに、１８６■のキニジン、Ｈｃｔ、Ｈ２ｏを５−の脱
イオン水に添加、した。コントロールの１：５希釈物の
光学密度は０．２６２であり、そして検体の１：　ｓ４
釈物の光学密度はｔ２４６であった。この場合も、結果
は患者の血小板減少症が薬物誘発性であることを示して
ｈる。

本発明においては本発明の範囲から逸脱することなく適
正なバリエーション、例えば当業者が想到するようなバ
リエーションを行うことができる。このようなバリエー
ションは本発明の範囲を逸脱するものとして考えられる
べきではなくすべてかかる改変は特許請求の範囲に包含
されるべきものである。

外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ａ）血小板を薬物誘発性血小板減少症の疑いのある
   患者に由来する血清または血漿および血小板減少症の原
   因になる疑いのある薬物と接触させ、 ｂ）そのように処理された血小板を約２１℃〜約２４℃
   の温度で約１５〜約２５分間インキュベートし、 ｃ）その処理された血小板を前記薬物を含有する洗浄溶
   液で洗浄しそしてそれら血小板をその洗浄溶液中に再懸
   濁させ、 ｄ）特異結合タンパクを結合した固体支持体を前記再懸
   濁された血小板と接触させそして反応成分をインキュベ
   ートし、 ｅ）未結合血小板を傾瀉し、そして ｆ）結合血小板を （１）血小板を結合した前記固体支持体を酵素接合体と
   接触させそしてそれら反応成分 をインキュベートし、 （２）未結合反応成分を除去し、 （３）前記支持体プレートを基質と接触させそしてそれ
   ら反応成分をインキュベートし、（４）前記酵素接合体
   で作用を受けた基質量を測定する ことにより測定し、そして ｇ）基準値および薬物不含コントロールを段階ａ）〜ｆ
   ）に付すことにより導かれた値のうちの少くとも一方と
   比較する ことよりなる薬物誘発性血小板減少症の検出方法。 ２）酵素接合体がアルカリ性ホスファターゼ抗ヒト−Ｉ
   ｇＧ接合体であり、固体支持体が微量滴定板でありそし
   て特異結合タンパクが抗ヒト−ＩｇＧである特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３）薬物がキニンである特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ４）薬物がキニジンである特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ５）基質がｐ−ニトロフェニルホスフェートである特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ６）血小板が再構成された凍結乾燥ヒト血小板である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ７）固体支持体が微量滴定板でありそして特異結合タン
   パクが抗ヒト−ＩｇＧである特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ８）血小板−薬物−血清または血漿の混合物を約２１℃
   〜約２４℃で約１５分間〜約２５分間インキュベートす
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９）血小板を固体支持体と接触させつつ約２１℃〜約２
   ４℃で約３１／２〜約４１／２時間インキュベートする
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０）血小板処理固体支持体を酵素接合体と接触させそ
   して約２１℃〜約２４℃で約１５分間〜約３５分間イン
   キュベートする特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１）基質を支持体プレート／酵素接合体と接触させそ
   して約２１℃〜約２４℃の温度で約３０分間〜約６０分
   間インキュベートする特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 １２）ａ）特異結合タンパクを結合した水不溶性固体支
   持体、 ｂ）酵素接合体、 ｃ）基質、および ｄ）血小板 を含む薬物誘発性血小板抗体検定用免疫測定キット。 １３）特異結合タンパクが抗ヒト−ＩｇＧである特許請
   求の範囲第１２項記載の測定キット。 １４）酵素がアルカリ性ホスファターゼである特許請求
   の範囲第１２項記載の測定キット。 １５）基質がｐ−ニトロフェニルホスフェートである特
   許請求の範囲第１４項記載の測定キット。 １６）血小板が凍結乾燥ヒト血小板である特許請求の範
   囲第１２項記載の測定キット。 １７）血小板減少症の原因になる疑いのある少くとも１
   種の物質を付加的に含有する特許請求の範囲第１２項記
   載の測定キット。 １８）物質が金、キニン、キニジン、チロキシンおよび
   スルホンアミド誘導体よりなる群から選択される特許請
   求の範囲第１７項記載の測定キット。 １９）ａ）血小板を薬物誘発性血小板減少症の疑いのあ
   る患者に由来する血清または血漿およびその血小板減少
   症の原因になる疑いのある薬物と接触させることにより
   薬物含有試料を調製し； ｂ）血小板を当該薬物の非存在下に前記患者からの血清
   または血漿と接触させることによりコントロール試料を
   調製し； ｃ）段階ａ）およびｂ）の生成物を約２１℃〜約２４℃
   の温度で約１５分〜約２５分間別々にインキュベートし
   て薬物含有処理血小板およびコントロール血小板を生成
   させ、 ｄ）その薬物含有処理血小板をその薬物を含有する洗浄
   溶液で洗浄しそして血小板を再懸濁し； ｅ）前記コントロール血小板をその薬物を含有しない洗
   浄溶液で洗浄しそして血小板を再懸濁し； ｆ）段階ｄ）およびｅ）の生成物を、 ｇ）特異結合タンパクを結合した固体支持体を再懸濁さ
   れた血小板と接触させそしてそれら反応成分をインキュ
   ベートし； ｈ）未結合血小板を傾瀉し；そして ｉ）結合血小板を （１）血小板を結合した固体支持体を酵素接合体と接触
   させそしてそれら反応成分をイ ンキュベートし、； （２）未結合反応成分を除去し； （３）その支持体プレートを基質と接触させそしてそれ
   ら反応成分をインキュベートし；そして （４）酵素接合体で作用を受けた基質量を測定する ことよりなる測定に別々に付し、そして ｊ）得られた測定値を薬物含有血小板およびコントロー
   ル血小板を用いて比較する ことよりなる薬物誘発性血小板減少症の検出方法。 ２０）薬物がキニンおよびキニジンよりなる群から選択
   される特許請求の範囲第１９項記載の方法。