JPS61501048A - サイトケラチン腫瘍マ−カ−及びそれらの検出のためのアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、１９８４年１月６日に出願された出願番号５６８，８６２の一部継 続である。

腫瘍マーカーの同定を介して癌を検出しそして診断するための能力は、広範な興 味ある領域である。

腫瘍マーカーは、物質、典型的にはタンノやり質、糖タンパク質、多糖、及び同 様のものであり、これらは膿瘍細胞によって生成されそしてそれらに特徴的であ る。しばしば、腫瘍マーカーは、正常細胞及び腫瘍細胞によって生成される。し かしながら、腫瘍細胞においては、その生産量は幾分異常である。たとえば、腫 瘍マーカーの生産量は、癌細胞においてひじょうに増加することができる。一方 、正常細胞内又は表面上に通常存在するタン・やり質及び他の物質は、その細胞 が悪性になる時、循環内に放出又は与えられるかも知れない。従って血清中にお けるそのような分泌される物質の検出が、悪性の症候であることができる。

癌診断において遭遇するもう一つの問題は、第１次及び転移性腫瘍の両者の細胞 起源を同定することに関する。、両タイプの種瘍に関して・二、異なる細胞起源 の腫瘍、たとえば上皮起源の１瘍（癌）、非上皮の結合組織に由来する腫瘍（肉 腫）、及びリンパ種瘍（リン・ン遭）の間で形態的に区別することは時々困難で ある。さらに、乳房上皮癌に関して（は、管上皮組織、分泌上皮組織、及び筋上 皮組織に由来する噂瘍間で区別することは、しばしば困難である。

従がって、これまでに認識されていない腫瘍マーカー、特に、循環中に分泌され そして血清検定によって同定することができる腫瘍マーカーを同定することが望 ましい。また、特定の腫瘍の細胞起源の決定を可能にする方法及び組成物を開発 することが望エストラノオール刺激に応じである乳房細胞系によって放出される ５２．０００ダルトンのタンパク質が同定されている。Ｗｅｓｔｌｅｙ及びＲｏ ｃｈｅｆ　ｏｒｔ　、セル（Ｃｅｌｌ）（１９８０）２０：３５３〜３３６２． 及びＶｅｉｔｈなど。キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） （１９８３）４３：］８６１〜１８６８を参照のこと。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞 系に対して生じるモノクローナル抗体は、２４キロダルトンのサイドシルタンパ ク質を同定スることが示されている。Ｃ１ｏｃｃａなど。キャンサーリサーチ（ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（１９８２）　４２　：　４２５６〜４２５ ８゜組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）と称されるタン・ぐり質は、上皮細胞の＠ 胞質中間＠雄に関係している。ＴＰＡ　ｆ’！　、血清中において及び細胞表面 マーカーとして両方ともの腫瘍マーカーであると報告されている。Ａｌｔｍａｎ ｎｓｂｅｒｇｅｒなど。Ｖｉｒｃｈｏｗｓ　Ａｒｃｈ、　（セル／ｌンロノイ（ Ｃｅｌｌ　ｐａｔｈｏｔｏｇｙ））　（１９８１）　３７　：　２７７〜２８４ （この場合、乳癌細胞がプリケラチンに対する抗体と反応し）　：　Ｗａｇｎｅ ｒなど。オーストラリアン　アンド　ニューシーラント　シャーナル　オグサー ジェリイ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆＳｕｒｇｅｒｙ）（１９８２）５２：４１〜４３　（この場合、Ｔ ＰＡの高められた血清レベルが胃及び腸癌に苦しむいくらかの患者に検出され） 　：　Ｍｒｏｓｓ　など。Ｋ１１ｎ。

Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ　（１９８３）　６１　：　４６１〜４６８　（この場合 、ＴＰＡの高められた血清レベルが乳癌に苦しむいくらかの患者に見つけられ） そしてＬｕｎｉｎｇ及びＮｉ１ｓｏｎ　ａアクタ　ケミ力　スカンジナビ力（Ａ ｃｔａ　ＣｈｅｍｉｃａＳｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ）　（１９８３）　３７　： 　７３１〜７５３　（この場合、表皮ケラチンを含む、ＴＰＡ及びある線維性タ ンパク質問の一部相同の配列が報告された）を参照のこと。スウェーデンのプロ マにちるＳａｎｇｔｅｃ　Ｍｅｄｉｃａｌは、商標ＰｒｏｌｉＨｇｒｅｎ■ＲＩ Ａキ、トのもとて血清及び血漿中のＴＰＡの検出のだめのキットを販売している 。

Ｍａｒｔ　ｒｅｓｓｅなど。ジャーナル　オプ　ステロイド　パイオケミストリ イ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１ ９８１）１５：３７５〜３８１は、ＭＣＦ〜７細胞の培養培地での約５０　ｋｄ の低転換速度のタン・ぐり質の存在を報告している。ケラチンの血清学的検出が 、癌患者に２いて報告されて″いる。Ｍａｄｒｉなど。ラボラトリイ　イ／ベス ティグーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉ　ｎｖｅｓ−ｔｉｇａｔｉｏｎ）（ １９８３）４８　：　９８〜１０７゜発明の要約 この発明は、第１次及び転移性上皮腫瘍、特に上皮乳房＠ｓｔ−検出しそしてモ ニターするために有用な方法及び組成物を提供する。この方法は、膿瘍性、上皮 細胞によって循環中に放される細胞外サイト勿うチンの検出に基づく。この細胞 外サイトケラチンは、約４０〜４６キロダルトンの分子量を有しそして膿瘍性上 皮細胞Ｏ＆Ｂ胞表語表面上出される約４２〜４８　ｋｄのタン・ぐり質に関係し ている。細、抱外サイトクラチン及び細胞表面タン・ぐり質の両者は、今度は、 細胞内サイトケラチンに関係しているが、しかし細胞外サイトケラチンは、プロ 、りされているＮ−末端を有しそして水性溶液て溶解する点において、細胞内サ イトキンン及び細胞表面サイトケラチンの両者と異なる。細胞外サイトキンンの 検出は、／・イブリドーマ細胞系、ｔＪｃＤ／ＡＢ　６．１１、ＵＣＤ／ＡＢ　 １０．１１に由来するモノクローナル抗体又は類似の特異性を有する他の抗体と の反応によって便利に達成することができる。

この発明の組成物は、また種々の上皮膿瘍の細胞起源を同定するために有用であ る。上皮サイトケラチン、特にＵＣＤ／ＰＲ１０，１１と反応できるモノクロー ナル抗体は、非上皮腫瘍、たとえば肉腫及びリン・ぐ腫と上皮腫瘍（癌）を区別 するのに利用することができる。その上、抗体のグループ又は・２ネルを管上皮 、分泌上皮、及び筋上皮起源の第１次及び転移性乳房腫瘍の閘の区別をするため に利用することかで方法及び組成物は、上皮層温、特に乳房上皮腫瘍の検出、同 定、及びモニターリングのために提供される。正常及び種瘍性上皮細胞の両者は 、細胞表面上の約４２〜４８キロダルトン（ｋｄ）のタフバク質（これは、細胞 内サイトケラチンに免疫学的よ及び組成的に関係している）によって特徴づけら れることが見つけられた。また、サイトケラチン関連タンパク質の低分子形（約 ４０〜４６ｋｄ）が正常及び腫瘍性細胞の両者によって放出されるがしかし＠偏 性細胞からの放出速度は相当に高いということが見出さられた。従って血清中の そのような細胞外サイトケラチンの存在について検定することによって、患者集 団を、上皮新生物についてスクリーンすることができる。この検定は特に上皮新 生物のために治療を受けている患者の経過をモニターするためて適切である。

中間線維は、多くの細胞型における細１抱体質の主成分である。乳腺のような組 織の上皮細胞は、ケラチンから成る可溶性中間線維を含む。サイトケラチンと称 するこれらのタン・セフ質は、正常及び腫瘍性乳房細胞の両者中に見つけられそ してタイプ１から１９　（Ｍａｉｌなど。セル（Ｃｅｌｌ）（１９８２）３１　 ：　１１　）と称する少なくとも１９の異なるタン／Ｊり質のグループを含んで 成る。これまで、そのようなサイトケラチンは、細胞内サイトケラチンタンパク 質であると信じられていた。しかしながら後の実験部分に報告されている研究は 、そのような細胞内サイトケラチンに免疫学的に及び組成的に関連しているタン ・ぐり質を、細胞表面上でも見出すことができ、そして細胞から分泌され得ると いうことを証明している。

この発明によって同定された細胞表面サイトケラチン及び細胞外サイトケラチン は、構造的に及び免疫学的に既知の細胞内サイトケラチンに関連しているがしか し同一ではない。構造的に関連があるということは細胞外／細胞表面のサイトケ ラチン及び細胞内サイトケラチンの間で少なくとも６０チの相同性普通７５チ又 はそれより大きな相同性が存在するということを意味する。免疫学的に関連があ るということは、丈イトケラチン内で共通な少なくとも１つのエビドーグ部位、 普通多数のエピトープ部位しかし、すべてのエピトープ部位よりも少ない部位が 存在するであろうことを意味する。乳房上皮細胞の典型的な場合においては、タ イ７’８．１８及び１９の細胞内サイトケラチンと免疫学的に交叉反応をする少 なくとも３つのエピトープが細胞表面サイトケラチン上に存在するということが 見出される。乳房上皮上皮細胞から放出される細胞外サイトケラチンは、タイプ ８及びタイ７’１８の細胞内サイトケラチンと最っとも強く交叉反応し、そして 水性溶液中で可溶性である。細、胴外サイトケラチンは、ブロックされているＮ −末端を有するということも、さらに見出される。

生物学的液体、たとえば血清中での細胞外サイトケラチンの検出は、上皮癌の状 態シて関係があり得る。

腫瘍性上皮細胞は、正常な上皮細胞と比較して増大された速度でナイトケラチン を放出し、そして血清中のサイトケラチンレベルで疾患状態と関係することをで きることが観察される。たとえば、膿瘍が外科的に取り除かれ又は他の形の治療 によってその後退が誘発された後、血清中のサイトケラチンレベルが、減少する ことが予想され得る。従って患者の血清レベルをモニターすることによって増大 した腫瘍負荷（第１次又は転移性いづれか）の特徴である細胞外サイトケラチン の増加レベルを検出することができる。

この発明は、また膿瘍細胞の細胞起源を決定するために腫瘍細胞をスクリーニン グするのに有用である。腫瘍細胞におけるサイトケラチンの存在は、その細胞の 上皮起源のを診断するものである。従って、細胞サイトケラチンに対して特異な 抗体との反応によって非上皮腫瘍と上皮腫瘍を区別することができる。さらに、 サイトケラチンと反応することができる抗体は、管上皮、分泌上皮及び筋上皮の 乳房細胞間を識別することができるということが見出された。

従って、乳房上皮細胞のおのおのの型と反応するが、しかし乳房上皮細胞の他の ２つの型とは実質的に反応性が低い抗体のグループ又はパネルを使用することに よって、乳房腫瘍の細胞起源を、組織化学的染色技法により便利に決定すること ができる。通常の技法によシ抗体との反応性を基礎にして、陽性及び陰性のサン グルを評価することが可能であろうことが、１実質的に反応性が低い”というこ とによって意味される。腫瘍の細胞起源の知識は、治療の適切な態様を選択する 場合に有用である。

細胞サイトケラチン及び細胞外サイトケラチンの存在は、タンパク質と反応する 抗体を用いる通常のイムノアッセイ又は組織化学的染色技法を免疫学的に使用し て便利に決定することができる。免疫原として、細胞サイトケラチンもしくは細 胞外サイトケラチン、又はそれらの抗原性７ラグメントのいづれかを通常に使用 して（下に記載されているように）そのような抗体を生産することができる。乳 房腫瘍細胞系からの完全な又は溶解した細、泡を、免疫原として便利に使用する ことができる。一方、サイトケラチンに特異な抗体を利用して、血清、第１次腫 瘍細胞、又は腫瘍細胞系からサイトケラチンを単離し、免疫原として使用するた めの精製されたる抗原を得ることができる。

通常の技法に従って広範囲の種類のを推動物中に所望の免疫原を注入することに よって抗体を得ることができる。適当なを椎動物は、マウス、ラット、羊及びヤ ギ、を含み、特にマウスが適切である。普通、改良された力価及び特異性を有す る、逐次的な放血によシ定期的に動物から採血する。抗原は、筋肉内に、腹腔内 に、皮下に又はこれらと同様にして注入することができる。普通、完全又は不完 全７０インドアジユバントのような賦形剤が使用される。

所望によシモノクローナル抗体を製造することができるＯ モノクローナル抗体を得るために、免疫されたるを推動物からの膵臓細胞が不滅 にされる。不滅化の方法は臨界ではない。現在、景つとも通常な方法は、骨髄１ 融合パートナ−による融合である。他の技法は、ＥＢＶ形質転換、裸のＤＮＡ　 、たとえば、腫瘍遺伝子、レトロビールス、等による形質転換、又は細胞系の安 定維持及びモノクローナル抗体の生成をもたらすいづれか他の方法を含む。ヒト モノクローナル抗体（ｄ、適切なヒト融合・母−トナー、たとえばｗｒ−Ｌ２と 膵臓細胞の融合によって得ることができる（ヨーロツノぐ出願番号８２．３０１ １０３．６に記載され、これと関連する部分を、引用によυこの明細書に組み入 れる）。マウスＸマウスモノクローナル抗体を生成するための詳しい技法は、Ｏ ｉ及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇの″細胞免疫学における選択法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　、”　Ｍ ｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ　（出版））Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏ、 、サンフランシスコ（１９８０）ページ３５１〜３７２によって教示されている 。この発明の抗体は、いづれかの免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＧ１　、 　ＩｇＧ２ａ　、及びＩｇＧ２ｂ　′ｔ″含むＩｇＧ　。

ＩｇＡ　、　ＩｇＤ　、　ＩｇＥ　、並びにＩｇＭ、普通ＩｇＧ又はＩｇＭであ ることができる。

特に有用なモノクローナル抗体がこの発明において使用のために製造されている 。抗体ＵＣＤ／Ａ８６．１１は、上皮サイトケラチンの細胞内、細胞表面、及び 細胞外形と、特に分泌上皮細胞に特徴的であるタイプ１８サイトケラチンと反応 的である。抗体ＵＣＤ／ｌ’Ｒ１０，１１は、サイトケラチンの細胞内及び細胞 外形と、特に管上皮細胞に特徴的であるタイｆ８サイトケラチンと反応的である 。ＵＣＤ／ＰＲ７，０１は、筋上皮細胞に特徴的である抗原の細胞内及び細胞外 形と反応的である。これらの３つの抗体は、特に、それらが管起源、分泌起源、 又は筋上皮起源であるかどうかを決定するために膿瘍性上皮細胞をスクリーニン グするのに適切である。

抗体ＵＣＤ／ＰＲ１０，１１は、また、それらが上皮起源のものであるかどうか を決定するために膿瘍細胞をスクリーニングするのに特に適切である。ＵＣＤ／ ＰＲ１０，１１抗体は、上皮細胞のために高い親和性を有しそしてひじょうに低 いバックグラウンドレベルを伴って高度に特異的な染色を提供することが見出さ れる。

いったん適切な特異性を有する抗体が製造されたなら、広範囲の種類の免疫学的 検定法が利用可能である。多くのコンビティティブ及び非コンビティティグタン パク質結合検定は、科学及び特許文献に記載され、そしてそのような検定のひじ ょうに多くが商業的に使用可能である。血清抗原を検出するために適切である典 型的なイムノアッセイは、アメリカ合衆国特許番号、３．７９１．９３２；３． ８１７．８３７；３．８３９．１５３：３．８５０．７５２：３．８５０，５７ ８　；３．８５３，９８７；３．８６７，５１７：３，８７９，２６２　：３． ９０１．６５４；３，９３５，０７４：３．９８４，５３３　：３．９９６，３ ４５；４，０３４，０７４：及び４．０９８，８７６に記載されている方法を含 む。

イムノア、セイを実施するより前に、ある種の方法により生物学的サンプルをあ らかじめ処理することが普通必要でちろう。サンプルの調製法は、生物学的サン プル源に依存して異なるであろう。固形膿瘍及び他の組織サンプルは、細胞を溶 解することによって調製されるであろう。血清サンプルは、典型的に、良く知ら れている方法に従って、全血液を凝固しそして上清液を単離することによって調 製されるであろう。他の生物学的液体、たとえば精液、痰、及び尿は、また細胞 外サイトケラチンの存在について検定することができる。

通常の免疫組織化学的染色技法も、また組織サンプル中のサイトケラチンを検出 するために用いることができる。たと先ば、組織サンプルを、ホルマリン、Ｂ− ５又は他の標準組織学的保存集中に固定し、脱水しそしてどの病院の病理実験室 においても日常の仕事であるようなパラフィン中に封入することができる。切片 を・ぐラフインから切り離しそしてガラススライド上に置くことができる。次に 細、抱抗原が、検出されそしてラベルされている抗体及びラベルされている第２ 抗体に暴露することによっておのおの位置決定され得る。一方、細胞学的調製法 を用いることができる。たとえば、組織サンプルからの細胞は、典型的には、生 理学的−で緩衝液中、ホルマリンに暴露し、次にアセトン中に懸濁しそして遠心 分離によシゼラチンー被覆のスライド上にペレット化することによって、スライ ド上に固定することができる。次にラベルされている抗体に暴露するか、又はラ ベルされていない抗体及びラベルされている第２抗体に暴露するかいづれかによ って、細胞表面受容体を位置決定することができる。サンプル中の細、＠表面タ ン・ぐり質の量は、結合しているラベルの量に直接的に比例する。

放射性同位体のラベルを使用するホールボディイメージング技法は、上皮膿瘍、 特に転移した乳癌の位置を見つけるために利用され得る。この発明の抗体、又は それらの７ラグメントは、適切な放射性同位体、典型的にはテクネチウム−９９ 、Ｉ、Ｉ。

もしくは１３１１、又はそれらの組合せに結合され、そして非経腸的に投与され た。ラベルの生体分布状態は、シンテグラフィによってモニターされ、そしてラ ベルの蓄積を、エストロゲン感受性の膿瘍性乳房上皮細胞の存在に関係すること ができる。ホールビディイメーノング技法は、アメリカ特許第４．０３６゜９４ ５及び４，３１１，６８８に記載され、この開示を引用によりこの明細書中に組 み入れる。

次の実験は、制限的でなく、例示的に提供されて次の略語が用いられる： ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン ＤＣＣ−デキストラン被覆木炭 ＥＲ−ニストロノン受容体 ＨＭＦＧＭ−ヒト乳脂肪乳球膜 ＩＥＦ−等電点電気泳動 ＭＣＡ−モノクローナル抗体 ＰＢＳ　−１）ン酸緩衝代食塩溶液（０，０１Ｍのリン酸ナトリウム、　Ｐ！（ ７，３、０，１５Ｍの塩化ナトリウムを含む）ＲＩＡ−ラノオイムノアッセイ ５ＤＳ−ＰＡＧＥ−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 １、ＭＣＦ−７細胞。ＭＣＦ−７ヒト乳房膿瘍細胞系を用いて、抗体生産のため に免疫化及びスクリーンの両方を行なった。これは、転移性乳癌を有する患者の 胸漠の呑出液に由来する十分に特徴づけられている細胞系でちる〔ソウルなど。

シャーナル　オブ　ナショナル　キャンサー　リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ 　ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）（１９７３）５１：１４０ ９〜１４１６）。エストロゲン及びプロニステロノン受容体の両者を含んでいる ということが示されている。

２、ＨＢＬ−１００゜ＨＢＬ−１００は、授乳中の乳房乳汁サンプルから開発さ れた非腫瘍性ヒト乳房上皮細胞系である〔ボラノウスキイなどイン　ビトロ（Ｉ ｎ　Ｖｉｔｒｏ）（１９７６）１２：３２８〜３３６〕。それはニストロノン受 容体を含まない。

３、　１８６−ＮＷＴ　０１８６−ＮＷＴは、転移性乳癌を有する患者からの腹 水から開発されたヒト上皮細胞系である。それはいかなる乳房細胞マーカも示さ ずそしてそれはＥＲ陰性である。

４、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ　８．６５３゜これは、ＭＣＡ生産のためにハイブリドマ融 合パートナ−として用いられるマウス骨髄腫細胞系である。それは、免疫グロブ リン又はいかなる免疫グロブリン　サグユニットも生産シナイ〔ケアーニイなど 。ジャーナル　オグ　イムノロシイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ）　（１９７９）　１２３　：１５４８〜１５５５）。

増殖培地 ハイブリドマ細胞系は、ローズウェル　・ぐ−クメモリアル　インスティテユー ト　カルチャー　メディアム　１６４０　（Ｇｉｂｃｏラゴラトリイズ、グラン ド　アイランド、ニヨーヨーク）（加熱によシネ活性化されている１０％子牛血 清、ｌｒｒＬＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭＬ− グルタミン、及び２５μｐ　７ｍｌゲンタマイシンが補充されている）において 増殖された。ヒト乳房細胞系は、５チ子牛又は馬血清のいづれか、１μｙ／ｍｌ 　インシェリン、２　ｓ　μＰ／ｍｌゲンタマイシン及び１００　ｎＭ　１７β −エスト２ノオール（シグマ　ケミカル　カンパニイ。

セントルイス、ミズウリイ）を含むダルベツコ改変のイーグル最小必須培地中に 維持された。

５　細胞系ＡＥＩは、Ｔｓｅｎｇ　など。セ＃　（Ｃｅｌｌ）（１９８２）３０ ：３６１〜３７２によって記載されているハイブリドマ細胞系であり、これは、 サイトケラチンによる免疫化によって製造された。この細胞系によって生産され る抗体は、すべての酸性サイトケラチンに対してそして特にＭＣＦ−７タイグ１ ９に対して特異的である。

６、細、抱系βＨ１ｌは、Ｇｏｗｎ及びＶｏｇｅｌ。ソヤーナルオプ　セル　バ イオロノ４　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８２ ）９５：４１４〜４２４により記載されているハイブリドマ細胞系であり、これ はサイトケラチンによる免疫化によって製造された。この細胞系によって生産さ れる抗体は、ＭＣＦ−７細胞におけるサイトケラチンタイ７’８．１８及び１９ に対して特異的正常な及び腫瘍性ヒト乳房組織のパラフィンブロックは、カリフ ォールニア、サクラメントのカリフォールニア大学医学センターの医学部病理学 科から破損された）ＩＭＦＧＭは、クロロホルム及びエーテルによりヒト乳汁の クリーム画分を抽出することによって製造された〔Ｃｅｒｉａｎｉなど。プロス イーディングオプ　デ　ナショナル　ア力デミイ　オプ　サイエンス　アメリカ 合衆国（Ｐｒｏｃｅｅｄｈｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅ ｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｕ、Ｓ、Ａ）　（１９７７）　７４：　５８２〜 ５８６）。

モノクローナル抗体製造 標準的ポリエチレングリコール融合、すなわちＯｌ及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　 、細胞免疫学における選択された方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（１９８０）、Ｍｉｓｈｅｌｌ 及びＳｈｉｉｇｉ出版、Ｗ　、　ＨｌＦｒｅｅｍａｎ及びカン／Ｊ二イ、サンフ ランシスコ、カリフォールニア、ページ３５１〜３７２によって記載されている ようなヒボキサ／チンーアミノプテリンーチミヂン選択方法によって行なわれる 。抗体生業性クローン：・マ、Ｔｓｕ及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　６　前記（１ ，９８０）−！−ノ３７３〜３９７によって記載されているように固相ＲＩＡ及 びオートラジオグラフィによって、放射性ヨード化されているウサギ抗−マウス ＩｇＧにより同定された。

生きている無傷のＭｃＦ−７Ｍ、抱（２ＸＩＯ細胞）によりＢＡＬＢ／ｃマウス を週１度、４週間にわたって腹腔内高１窒免疫した６３週間後、融合の前の３日 間、２×１０６細胞によ９４度腹腔内にそのマウスを免疫した。

次に、マウス牌、臓細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３マウス骨髄、１細胞と共に バイブリド形成した。

第１及び第２レベルのスクリーニングのために完全に生きているＭＣＦ−７及び ＨＢＬ−１００細１＠も、また固相ＲＩＡに２いて用いた〔ブラウンなど。ゾヤ ーナルオブ　イムノロジカル　メソド（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ− １ｏｇｉｃａ１Ｍｅｔｈｏｄｓ）（１９７９）３１　：　２０１〜２０９　）　 、生きている細胞を用いて、固定人工物についての選択を避けた。ＭＣＦ−７を 陽性スクリーンとして、ＥＲ陽極細胞上の抗原に対する抗体を同定した。ＨＢＬ −１００を陰性スクリーンとして用いて、ＥＲ陰極抗体を同定した。また正常な ヒト乳汁から単離されるＨＭＦＧＭを用いて、標準固相ＲＩＡにより正常な乳房 上皮の表面酸（１９８０））。

最終ヌクリーニン判定基準は、抗原の検出のだめのイムノパーオキ／ダーゼ技法 を用いて、・七°ラフインスライド中の抗原の分布状態を直接的に映ｆ象化する ことに基づいた。

第２世代のモノクローナル抗体を上記のようにして生産したが、しかしＭＣＦ− ７組織培養培地（融合系列１０抗体）又は１８６−ＮＷＴからの膜抽出物（融合 系列７抗体）のいづれかから単離される抗原により、マウスを免疫化した。下に 記載しているようにして、ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１抗体により調製されたイムノ アフイニティ　カラムを用いてその抗原を単離した。第２世代の抗体についての スクリーニング方法は、次の通９であった。第２世代の抗体の選択は、固相ＲＩ Ａ、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｓ及びイムノパーオキシダーゼにおける反応性に 基づいた。

免疫拡散法 Ｏｕｃｈｔａｒｌｏｎｇ及び）ゴ１ｌｓｓｏｎ、ハンドｆ７り　オプ　イクスペ リメンタル　イムノロノイ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔ ａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　（１９７３）、Ｗｅ　ｉ　ｒ出版、ブラックウ ェル、ロンドン、（チャゲタ−１９）の二重拡散法を用いて、ＭＣＡをアイソタ イプ分けした。おのおののクローンからの、上清液及びＰＢＳ　（０，９％塩化 ナトリウム、］、　ＯｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，５）中１：１００に希釈 した腹水をおのおのの免疫グロブリンクラス：　ＩｇＭ　、　ＩｇＣ；１　、　 ＩｇＧ２ａ　、　ＩｇＣ３、及びＩｇＡに対して特異な抗血清に対して反応せし めた。クラスに特異的抗血清は、インディアナのエルクハートのマドリグシン処 理によって、７５α２の組織培養フラスコから細胞を収得し、１つのウェルにつ きｓｏ、ｏｏ。

細胞で９６ウ工ル組織培養プレートを平板培養し、そして１８〜２４時間培養し た。すべての培養は、５％ＣＯ２中、３７℃でちった。増殖培地を、吸引除去し 、０．０８％ナトリウムアジドを含む増殖培地１５０μｌを添加しそして細胞を 、３０分間インキュベートした。５チ子牛血清及び０．０８％ナトリウムアジド を含むハンクス液（洗浄緩衝液）によシ細胞をすすいだ。次に、洗浄緩衝液を添 加しそして細胞を、３０分蘭インキュベートした。この細胞を、再び洗浄緩衝液 によりすすぎ、そしてノ・イプリドマ培養からの組織培養液又は希釈された腹水 ５０μｌを添加しそして１時間インキュベートした。次にその細胞を、洗浄緩衝 液により２度すすぎ、そして　ニーウサギ抗−マウスＩｇＧ５０μ１（２Ｘ１０ ’ｃｐｍ）を添加しそして１時間インキ−ベートした。その細胞を、洗浄緩衝液 によ′り２度洗浄しそして陽性ウェルを、オートラジオグラフィーによって可視 化した。

タンパク質分析 Ｌａｅｍｍｌｉ、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７０）２２７：６８０〜６ ８５によって記載されている通りに、１０％分解グルを含む４％アクリルアミド 積み重ねグル（両者は、０．２チＳＤＳを含む）を用いて、ドデシル硫酸ナトリ ウム−ポリアクリルアミドスラブグル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）　によ）タ ン・ぐり質を分析した。５０μｌのサンプル緩衝液（６３ｍＭ　ＴＲｌ５．　ｐ Ｈ６，８、１０％グリセロール、５％　２−メルカ７’）エタノール、２．３％ ＳＤＳ　）中に、サンプルを加え、そして２０ｍＡの一定電流により４時間電気 泳動せしめた。既知の標準タンノ９り質の分子量と比較してそれらの移動度によ ってタンノ９り質の分子量を見積った。

σＦａｒｒｅ１１．ジャーナル　オプ　パイオロジカルケ　ミ　ス　ト　リ　イ 　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１ ９７５）２５０　：４００７〜４ｏ２１　によって記載されている通りに２次元 電気泳動を実施したが、しかし第２次元における５ＤＳ−ＰＡＧＥ　は、上に記 載されている通りであった。イムノアフイニティ精製した組織培養液４０μｌ（ 蒸発乾燥せしめ、そして溶菌緩衝液に再溶解されている）又は４０μｌの溶菌緩 衝液に溶解された細胞タンパク質、（溶菌緩衝液２　ｍｌ中に溶解されている１ コンフルエント１００朋Ｊトリデイツシユ）のいづれかを、分析した。

タンパク質濃度を、色素結合分析（Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリイズ、す、チモン ド、カリフォールニア）を用抗体によって同定される抗原を特徴づけるために、 Ｔｏｗｂｉｎ、など。グロヌイーｆイング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミイ 　オプ　サイエンス　アメリカ会衆Ｂｉｌ　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏ（ｔｈ ｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃ＆ｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅＵ、Ｓ、Ａ）（ １９７９）７６　：　４３５０〜４３５４によって記載されているようなりニス ターン法の変法を用い、この場合タンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥグルからニト ロセルロースフィルターに移されそしてＭＣＡによって同定サレる。ニトロセル ロースフィルターに移した後、過剰のタンパク質結合性部位を、３％ＢＳＡを含 むＰＢＳ中にそのフィルターを浸すことによってブロックした。１％ＢＳＡ及び １〜２ＸＩＱｃｐｍ　のヨード化された抗体を含むＰＢＳ　３０　ｍｌ中にその シートを１時間、インキ−ベートすることによって、抗原の位置を決定した。次 にそのフィルターをすすぎ、乾燥せしめそしてオートラノオグラフ化せしめた。

１００ｐ７はどの少量のタンパク質を、この方法により検出することができる。

ラベルされていｂタンパク質の分析 ステロイドホルモンを除くためにＤＣＣによシ処理された５条子牛血清中に１０ 日間細胞を増殖せしめた。試験の前２日間、細胞を、トリプトシ処理しそして１ ００朋ペトリデイツシユにつき４×１０６細胞で平板培養した。２４時間後、エ ストラノオールを・この培地に添加し、０，１，１０．及びｌ　ＯＯｎＭのエヌ トラノオール濃度を得た。この培地を、２４時間ｆｆ１５［した。ホルモン処理 の４８時間後、細胞をハンクス液により２度洗浄した。正常なメチオニン濃度の １０％のほかＫＳ−メチオニン２００μ＋：　ｉ、４ｎｌを含む、上記のように ホルモンが補充されている血清不含培地を添加した。細胞及び培地を、６〜１２ 時間の培養の後、収得した。

イムツノぐ−オキシダーゼ染色 用いられるイムツノＲ−オキシダーゼ染色法は、Ｈｏｒａｎ−Ｈａｎｄなど。キ ャンサー　リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）（１９８３）４３　：　 ７２８〜７３５　によって記載されているように、Ｈｓｕなど。ツヤ−ナル　オ プヒストケミストリイ　アンド　サイトケミストリイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　（１ ９８１）２９　：　５７７〜５８０のアビノン−ビオチンイムノパーオキシダー ゼ、技法の変法であった。

イムノアフィニティ　クロマトグラフィセフ　７　Ｑ　−７！、■４　Ｂ　（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ビスキャットウェイ、ニュ ージャノイ）を、Ｍａｒｃｈ　など。アナライティカル　パイオケミヌトリイ（ Ａｎａｌｙ−ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｓｒｙ）（１９７４）　６０　： 　１４９〜１５２によって記載されているように臭化シアンによシ活性化した。

４℃で一晩、４０％硫酸アンモニウム中での沈殿によって腹水から抗体を精製し た。この沈殿物を溶解しそして０．２Ｍリン酸ナトリウム、ＰＨ７，３に対して 透析した。活性化されたセファロース■（濾過され、コンノクトケーキにされた ）の１容積を抗体溶液（２■タンパク質／ｍｌ）の１．５容積に添加した。抗体 を、４℃で１６時間、穏か知混合することによりカップリングせしめた。セファ ローズ■を、再び濾過し、コン・ぐクトケーキにし、３容積の水によ）洗浄しそ してｐＨ９の１Ｍエタノールアミンの１．５容積に添加することによｐ未反応部 位をブロックした。この反応は、２７℃で２時間であった。次に、順にリン酸緩 １ｉ（０，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，３，１，０Ｍ塩化ナトリウム）、０ ．１Ｍ酢酸、及び再びホヌフェート緩衝液のおのおのにつき１０容積によシ順次 セファロース■を洗浄した。０．１％ナトリウムアットを含むリン酸緩衝液中に ４℃でこの樹脂を貯蔵した。

アフィニティー樹脂を０２〜１．０　ｍｌ　ノカラ１−　中に注ぎ、５カラム容 積の６ＭグウアニノンーＨＣ４ＰＨ１，５によりストリッピングし、そして使用 の前に、少なくとも１０容積のＰＢＳによシすすいだ。組織培養液を集めそして ２　ｍＭ　ＥＤＴＡ及びフェニルーメチルースルフォニルフルオリドを添加し、 タン／？り質分解を抑制した。２０分間、５０００　Ｘｇで遠心分離により、次 にグラスウール及び０．２２ミクロンのフィルターを通しての濾過によって破片 を取り除いた。サンプルを、４℃で２０〜３０　ｒｌｌ／時　でアフィニティー カラムを通す前に、セファロース■４Ｂの１　ｍｔ！カラムを通した。非特異的 に結合したメン・ンク質を、ＰＢＳ、中０．５Ｍ尿素１０〜２Ｑｒｎｌにより溶 出した。４カラムｌｆｉの６ＭグウアニノンーＨＣノＰＨ１，５のによシ抗原を 溶出しこの溶出物を中和し、そして透析した。

抗体のヨード化 クロラミンＴ法〔ＭｃＣｏｎａｈｅｇなど。メソッド　オプエンザイモロノイ（ Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（１９８０）７０：２１０〜２ １３〕により抗体を約２μＣ１／μりの比活性にヨード化した。１％ＢＳＡを含 むＰＢＳ中、セファロース■ｃ　−２５（１０Ｘ３Ｑｃｍ　のカラム）上で分離 し、そして使用するまで一７０℃で貯蔵した。

結果 生細胞ＲＩＡにおけるオートラジオグラフィー結合・やターンはＭＣＡの最初の 選択の基礎でちった。最初の融合からの２８８ウエルのうち８７が、ＭＣＦ−細 胞系て対する抗体を生成するハイブリドコロニイを含んだ。これらのコロニイの ２２を、拡大しそしてさらシて特徴付けるために選んだ。９コロニイを限界希釈 によってクローン化した。これらから、ＵＣＤ／ＡＢ６゜０１及びＵＣＤ／ＡＢ 　６．１１と命名された２つの抗体を、さらに特徴付けるために選択した。

ＭＣＦ−７に対するＵＣＤ／ＡＢ　６．１１の特異性を、ウェス。

ターン法によって証明した。ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１は、ＭＣＦ−７抽出物中の ２つの５ＤＳ−ＰＡＧＥバンドに結合したが、しかしＨＢＬ−１００、ＮＷＴ− １８６ＨＷＴ抽出物又はＨＭＦＧＭにはなんら結合性をも示さなかった。比較す ると、ＵＣＤ／ＡＥ　６．１３　と命名されたもう一つのクローンは、ＨＭＦＧ Ｍを除く３つのすべての細胞系に結合性を示した。

アビソンービオチン　イムノパーオキシダーゼ技法を用いてのパラフィン切片に おける細胞抗原の検出を実施例し、ＭＣＡがヒト乳房抗原に結合しそしてＭＣＦ −７の組織培養人工物とは結合しないということを確かめた。

正常の、形成異常の及び悪性の乳房組織において、ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１　に よって同定される抗原の分布状態を、ホルマリン及びＢ−５で固定された組織を 用いて決定した。Ｂ−５固定化は、いっそうすぐれた細胞学的な詳細を提供した 。

アビジン−ビオチン　イムツノＪ？−オキシグーゼ染色を用いて、ＵＣＤ／ＡＢ 　６．１１は、正常な筋上皮、支質、又は管腔分泌生成物とではなく、正常な前 泌乳性上皮細胞に結合することが見出された。ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１によって 検出される抗原は、まず第１に核上顆粒に位置決定されたこの抗原は、乳味間に 斑点状分布を有し、その結果陽性的に染色する乳味が、しばしば陰性的に染色す る乳味に隣接しているのを見出された。多くの場合、個々の乳味内の隣接する細 胞は、選択的に陽性及び陰性であった。

イムノパーオキシダーゼにより染色された乳癌細１抱のノンラフイン切片９０％ （１ｓ／２０）は、ＵＣＤ／ＡＢ６．１１のためには陽性であった。特定の組織 切片における悪性細胞のほとんどは染色した。顆粒及び表面染色も観察されたけ れども、この染色・２ターは、一般的に拡散的であシ且つ細胞質的であった。染 色は、隣接する正常細胞においてよシも腫瘍細胞においてひじょうに濃かった。

染色は、また第１次乳房腫瘍癌においてよりも転移性腫瘍細胞においてよシ濃か った。これらの結果は、転移性乳癌細胞において、抗原の生成が増大していると いうことを示す。

いくらかの、しかしすべてではない乳房形成異常（線維嚢胞疾患）がＵＣＤ／Ａ ８６．１１により染色された。

ＭＣＦ−７組織培養培地からの６．１１抗体によるイムノクロマトグラフィによ って単離された抗原による免疫化から得られる第２世代のモノクローナル抗体を 、シリーズ１０と命名した。さらに特徴付けそして試験するために選択された特 定の抗体は、ＵＣＤ／ＰＲ１０，０２、ＵＣＤ／ＰＲ１０，１１、及びＵＣＤ／ ＰＲ１０，１２であった。ＵＣＤ／ＰＲは、タイ７’１８サイトケラチンと反応 するが、しかしＵＣＤ／ＡＢ　６．１１　（６，１１抗原）に。

よって認識される抗原へのＵＣＤ／ＡＢ　６．１１又はＵＣＤ／ＰＲ１０，１１ の結合を抑制しないネズミＩｇＭである。

ＵＣＤ／ＰＲＩ　０．１１は、６．１１抗原及びタイプ８サイトケラチン並びに より低い程度では、タイプ８サイトケラチンと反応するネズミＩｇＧである。Ｕ ＣＤ／ＰＲ１０，１２は、６．１１抗原と反応するネズミＩｇＭである。

１８６−ＮＷＴ細胞からの６．１１抗体によるイムノクロマトグラフィによって 単離された抗原による免疫化から得られる第２世代のモノクローナル抗体を、シ リーズ７と命名する。ＵＣＤ／ＰＲ７，０１と命名された１つの特定の抗体は、 筋上皮細胞に対して特異的であるということが見出された。

２、細胞表面抗原 免疫沈殿法及びこれに続くラクト・２−オキシダーゼによる生細、抱の細胞表面 タン・ぞり質のヨード化を用いて、ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１によって同定される 抗原の細胞表面位置をさらに特徴づけた。このｒ−夕は、細、泡がエストラノオ ールにより又はエストラノンによらないで増殖される時、抗原が細胞表面上に位 置するということを示した。

細、抱内ケラチンー関連タン・ぐり質の３つの型（タイ７’８．１８及び１９に 関する）が、ＭＣＦ−７乳癌細胞系中に同定された。これらのタン・ぐり質は、 約５２゜４６、及び４６ｋｄの分子量及びそれぞれ６．１〜６．Ｏ１５，８〜５ ．３、及び５．２〜５．０の範囲内に等電点を有することが推定された。観察さ れる多重等電点形は、多種のケラチンの種々のリン酸化に少なくとも部分的て基 くと信じられている。抗−ケラチンモノクローナル抗体を用いるイムノプロット は、おのおののタンノマク質型に対するおのおのの抗体の異なる結合・ぐターン をもたらす。たとえば、３５βＨ１ｌ抗体は、すべての３つのＭＣＦ−７細胞ケ ラチン−関係のタンノクク質を認識し、一方ＡＥＩ、ＵＣＤ／ＡＢ　６．０１、 ＵＣＤ／ＡＢ６．１１及びＵＣＤ／ＰＲ１０，１１のおのおのは、種々のりン・ ンク質型を区別した。第１表を参照のこと。

３５βＨ１１＋＋＋＋　＋＋＋＋　＋＋＋＋ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１　±　＋＋ ＋＋０ＵＣＤ／ＡＢ６．０１　＋＋＋＋　士　士ＵＣＤ／ＰＲ１０，１１＋＋＋ ＋　土　０ＵＣＤ／ＰＲ１０，０２＋　＋＋＋＋　Ｑ＊２次元ウェつターン法に おける反応性に基礎を置く（上を参照のこと）。

モノクローナル抗体ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１及びＵＣＤ／ＰＲＩ　Ｏ，１１によ って認識されるエビドーグの組織分布を決定し、そして免疫診断におけるこれら の抗体の実用性を評価するために、多数のホルマリン又はＢ５−固定の・マラフ ィン組織切片を、アビノン−ビオチン　イムノ・ぐ−オキシダーゼ法によってス クリーニングした。

結果は、下の第２表に示されている。組織学的に正常な組織において、両抗体は 、乳腺、肝臓及び唾液腺、胃及び腸粘膜、及び腎、臓の遠位尿、細管を含む単純 上皮を染色した。両抗体は、神経及び血液要素との反応には機能しないが、しか しＵＣＤ／ＡＢ６．］、１　（ＬかしＵＣＤ／ＰＲ１０，１，１ではない）は、 しはしば平滑筋の成分と弱く反応した。

活性度 （陽性／合計） 染色された組織　６．１１　１０．１１　試験された合計サンプル休　止　３／ ３　３／３　３ 前泌乳性　２／２　２／２　２ Ｂ。異　常 良性 線維腺腫　５／６　６／６　６ 線維嚢胞　３１５　４１５　５ アデクリン化生　２／３　３／３　３ 形成異常　１／１　１／１　１ 悪性 腺　癌　５／７　５／７　７ 乳癌転移　０／４　３／４　４ 合　計　３１ 第２表（続き） 活性度 （陽性／合計） ■、非乳房 主細胞　３／３　０／３ 壁細胞　３／３　３／３ 内腔上皮　３／３　３／３ 空腸　１／１１／１　１ 結腸　２／３３／３　３ 筋　肉　５ 骨格の　Ｏ／４　０／４ ８属の　Ｏ／１　０／１ 気管（胎児の）１／１１／１　１ 気管支（胎児の）１／１１／１　１ 肺　（胎児の）　１／１１／１　１ リンノや節　０／３　０／３　３ 牌臓（胎児の）　Ｏ／１　０／１ 副腎　０／３　０／３　３ 腎臓　３ 近位尿細管　４／４　４／４ 遠位尿細管　４／４　４／４ 糸球体　０／４０／４ ファロビン管 粘膜の　２／３　３／３ 中皮の　１７３　３／３ 卵巣（胎児の） 初期の　Ｏ／１　１／１　１ 支質　１／１０／１ 第２表（続き） 活性度 （陽性／合計） 染色された組織　６．１１　１０．１１　試験された合計サンプル肝臓　３ 柔組織　１／３　３／３ 胆管　０／３　３／３ 膵臓　２ 膵島　０／２　０／２ 膵腺房　２／２　０／２ 膵管　２／２　２／２ 唾液線　１／２　２／２　２ 甲状線（胎児の）　Ｏ／１　０／１　１汗線　４ 分泌の　４／４　４／４ 排出の　４／４　０／４ 結瘍癌　０／２　１／２　２ 鱗状細胞癌　１／１　０／１　１ 神経節の 神経芽腫　０／１　０／１　１ 精上皮１！　Ｏ／１　０／１　１ 甲状腺癌　０／１　１／１　１ 良性前立腺過形成　０／１　１／１　１黒色陳　０／１　０／１　１ ５、主紙、抱土のエビトーゾ分布状態 生きている、無傷のＭＣＦ−７細胞に間接的イミノフル吋しセンスを実施するこ とによって細胞表面エピトープに結合する細胞表面を可視化した。ＵＣＤ／Ａ　 Ｂ６．０１及びＵＣＤ／ＡＢ　６．１１が、細、抱と細、抱の接解の濃縮領域に 伴って、全納、＠表面に分散された天文状の抗原を同定した。細胞表面エピトー プは軽いトリグシン処理によって容易に取り除かれ、・母ッチ形成又はキャップ 形成の形跡を示さず、そして細胞が血清−含有又は血清−不含培地のいづれかで 増殖する場合、存在した。しかしながら、ＵＣＤ／ＰＲ１０，１１，３５βＨ１ ｌ及びＡＥＩによりて認識されたエピトープは、類似の間接的イムノフルオレセ ンス実験では検出され得なかった。

６、分泌された６、１１抗原の特徴付はケラチンに関係する抗原は、また膿瘍性 乳房組織培養培地において可溶性タン・ぐり質として見出され得る。ＭＣＦ−７ 、Ｔ４７Ｄ　％及び５Ｋ−ＥＲ３ヒト乳房細胞系からの培養液は、それぞれケラ チンのような免疫活性を含んでいることが見出されている。試験された５つのモ ノクローナル抗体のうち４つが、ＭＣＦ−７培譬上滑液からの抗原に結合しく第 ３表）、そしてこの抗原は４０〜４６キロダルトンの分子量範囲及び５．０〜５ ，２の等電点を有する。追加実験は、ＭＣＦ−７組織培養抗原が３．６３の沈降 係数及び１．２５９／ｃｒｒｉ’の浮力密度を持つということを示した。

ＵＣＤ／ＡＢ　６．０１　− ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１　＋ ＵＣＤ／ＰＲ１０，１１＋ 従って、このＭＣＦ−７細胞外抗原は、細胞内サイトケラチンに関係しているよ うである。まず、非乳房ケラチン（たとえば３５βＨ１ｌ　及びＡＥＩ　）　Ｋ 対して生じた抗体は、その抗原を認識する。第２に、ハイプリドーマが免疫アフ ィニティにより精製されたＭＣＦ−７組織液抗原にょ９免疫化されたマウスから 生産される場合、この得られる抗体（たとえば、ＵＣＤ／ＰＲ１０，１１）は、 非乳房ケラチンと広く反応する。

第３に、精製されたＭＣＦ−７抗原のアミノ酸組成物は、他Ｏケラチンに見つけ られるアミノ酸組成物、特にグリシン及びグルタミン酸−グルタミン残基がタン パク質の総アミン、酸の２５％〜３０％を含んで成るということに密接に近い。

第４表を参照のこと。

第４　表” タイプ１８ケラチン　タイプ８ケラチン　ＭＣＦ−７抗原６．１１アミノ酸　（ ４６ｋｄ）　（５２ｋｄ）　（４０〜４６ｋｄ）Ａｓｐ（＋Ａｓｎ）　９．　ｓ ｓ％　８．１９％　１０．３％Ｔｈｒ　４．２４　４．００　５−４７Ｓｅｒ　 ８．９６　１０．３９　１０．９４Ｇｌｕ（＋Ｇ１ｎ）　１３．９５　−１２． １４　１４．７Ｇｌｙ　１６．１３　１６．０２　１１．７６Ａｌａ　６．３８ 　５．８２　８．８ Ｖａｌ　５．８２　６，４９　６．０５Ｉ　１　ｅ　４．６８　６．００　４． ３９Ｌｅｕ　７．５２　８．９４　９．３７Ｔｙｒ　３．３６　３．５４　２． ６６Ｐｈｅ　２．７５　２．７４　２．６７Ｈｉ　ｓ　１．８８　１．８７　１ ．６７Ｌｙｓ　３．６０　５，３１　６．４３Ａｒｇ　４．７２　４．３９　５ ．３２Ｐｒｏ　３．９４　−　３．４５ Ｍｅｔ　Ｏ，１７４，１８１，２ Ｔｒｐ　ＮＤ”　Ｎｌ）＊＊　Ｎｌ）”Ｃｙｓ　ＮＤ峠　ＮＤ”　＊　ＮＤ峠 車　すべての値は、測定における誤差に従っている。

林　測定されなかった。

７、細胞外サイトケラチンのだめの血清検定ＵＣＤ／ＡＢ　６−１１　をラジオ イムノアッセイに使用し、正常な血清及び乳癌に罹患しているｐ者からの血清の 両者中細胞外サイトケラチンの存在を検定した。

この検定は、マイルなど。（１９７３）Ｃ医学におけるラジオイムノアッセイ及 びそれに関する方法（”Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　ａｎｄ　Ｒｅ１ ａｔｅｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｔｎｅ”）、インターナシ ョナル　アトミック　エナージイ　エノエンスイ、、ビエナ、オース）　ＩＪ　 ｔ　、−＜−ノ１４９〜１６４．第１巻〕によって記載されている２一部位イム ノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）の変法であった。精製されたモノクロ ーナル抗体ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１を、プラスチック　マイクロタイター　グレ ートウェル上に吸着せしめた。吸着の後、サンプル血清を、おのおののウェル中 に置いた。細胞外サイトケラチンが、血清サンプル中に存在する場合、固相に結 合したＵＣＤ／ＡＢ　６．１１　は、サイトケラチンを捕捉するためて反応した 。次に１サイトケラチン上の異なるエピトープのために特異な過剰に精製したウ サギＩｇＧ抗体を、ミイクロタイターウエル〔ここで、結合しているサイトケラ チン（もしあるなら）と反応する〕に導入した。次に１２５工によりラジオラベ ルしたタン・ぐり質の過剰り量を、ウェル〔ここで、ウサギＩｇＧと反応する〕 に導入した。未結合のラベルされたタン・ぐり質Ａを除くために洗浄した後、お のおののウェルＤ放射能の量を決定した。従って、細、胴外サイトケラチンの量 は、結合している放射能の量に直接的に比例した。サイトケラチンの絶対量を、 あらかじめ用意した標準１ｌＩｌｌ］＠から決定した。

正常な血清を、細胞外サイトケラチンの存在について検定する場合、得られた値 は、１４０〜３２６０ＣＰＭに対応して０．０２μ９７ｆｎｌ〜０８２μｙ／ｍ ｌに分布した。

乳癌患者についてのこの値は、３４０〜１０．８００ＣＰＭに対応して０．０５ μｙ／ｍｌ　−３３，４ｔｎ／ｍｌであった。任意のカット−オフとして１００ ０　ＣＰＭを選択する場合、１４の正常な血清サンプルのうち２（１４％）つが 、陽性であった。乳癌患者については、８３のサンプルのうち３０（３６％）が 陽性であった。従って、血清中の細胞外サイトケラチンの存在は、上皮膿瘍、た とえば乳癌に罹患している患者中には有意に高められる。

この発明に従えば、正確且つ敏感な検定が、生物学的サンプルにおける特定の４ ２〜４８ｋｄの細胞タンノクク質及び関連する４０〜４６　ｋｄの血清タンノｆ り質の存在を検出するために提供される。この方法は特に、エストロゲン療法に 敏感であるこれらの乳房Ｍ［を同定することのために有用である。この方法は、 また、乳房から転移したエストロゲン−感受性の乳房１慄瘍を同定することのた めに、そしてそのような膿瘍についての患者の血清をスクリーニングすることの ために有用である。

前述の発明は、明確に理解するためて、ヅ」示的及び倒曲な方法によって、いく らか詳細に記載しているけれども、ある変更及び修飾を、付属の請求の範囲内で 実施することができる。

この発明は、デノや一トメント　オブ　ヘルス　アａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒ ｖｉｃｅｓ）によって与えられた許可番号、釜ＩＣＰ　０１００８下で、政府支 援により行なわれた。政府は、この発明に確かな権利を持つ。

ハイブリドマ細胞系ＵＣＤ／ＡＢ　６．１１　は、１９８３年１２月８日にアメ リカン　タイプ　カルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されそして受入番号ＨＢ　８４５８ を付与された。ハイブリドマ細胞系ＵＣＤ／ＡＢ　６．０１及びＵＣＤ／ＰＲ１ ０，１１は、１９８５年１月３日にアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクシ ョンに寄託されそして受入番号ＨＢ８６９３及びＨＥ８６９４をそれぞれ付与さ れた。

国際論を報告 ｍ＋ａｎ＋ａ、５ｎａｌ　Ａ＊ｅｌｉｃａｌ＊ｎ　Ｎ。ｐｃｒ７ａｓａ５１０ｏ ｏｔ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の腫瘍性上皮細胞の同定法であって、前記患者の血清サンプル中の細胞 外サイトケラチンを検出し、前記細胞外サイトケラチンが細胞内サイトケラテン に構造的に及び免疫学的に関係しそしてブロックされたＮ−末端によって特徴づ けられていることを含んで成る方法。 ２．前記細胞外サイトケラチンが、ＵＣＤ／ＡＢ６．１１又はＵＣＤ／ＰＲ１０ ．１１抗体との反応性によってさらに特徴づけられている請求の範囲第１項に記 載の方法。 ３．前記細胞外タンパク質が、乳房上皮細胞からのサイトケラチンに関係しそし て４０〜４６ｋｄの範囲に分子量を有する請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．前記細胞外サイトケラチンがタイプ８及びタイプ１８の細胞内サイトケラテ ンに免疫学的に関係している請求の範囲第１項に記載の方法。 ５．ヒトの生物学的サンプル中において腫瘍性上皮細胞を検出する方法であって 、ＵＣＤ／ＡＢ６．１１又はＵＣＤ／ＰＲ１０．１１抗体のいづれかによって認 識されるエピトープ部位に対して特異な抗体をサンプルと一緒にし、そして特異 的複合体の形成を決定することを含んで成る方法。 ６．前記サンプルが血清である請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．前記サンプルが組織サンプルである請求の範囲第５項に記載の方法。 ８．腫瘍性細胞の起源を決定するためにそのような細胞をスクリーニングする方 法であって；グループ内の個々の抗体が管上皮細胞、分泌上皮細胞、筋上皮細胞 、又はそれらの組み合せと選択的に反応することができる抗体のグループに腫瘍 性上皮細胞のサンプルを暴露し； 抗体のどれが腫瘍性上皮細胞と反応するかを決定し；そして 抗体の反応性のパターンを基礎に、腫瘍性上皮細胞の起源を決定することを含ん で成る方法。 ９．前記抗体のグループが管上皮細胞とは反応するが、しかし分泌上皮細胞及び 筋上皮細胞とは実質的に低反応性である第１抗体、分泌上皮細胞とは反応するが 、しかし管上皮細胞及び筋上皮細胞とは実質的に低反応性である第２抗体、及び 筋上皮細胞とは反応するがしかし管上皮細胞及び分泌上皮細胞とは実質的に低反 応性である第３抗体を含んで成る請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．前記上皮細胞が乳房上皮細胞である請求の範囲第８項に記載の方法。 １１．管上皮細胞と反応する抗体がＵＣＤ／ＰＲ１０．１１である請求の範囲第 ９項に記載の方法。 形成を決定することを含んで成る方法。 ２７．腫瘍性上皮細胞によって分泌されそして抗体ＵＣＤ／ＡＢ６．１１又はＵ ＣＤ／ＰＲ１０．１１と反応する細胞外可溶性サイトケラチンであって、実質的 に他の血清成分不含のサイトケラチン。 ２８．４０〜４６ｋｄの範囲に分子量を持つ請求の範囲第２７項に記載の細胞外 可溶性サイトケラチン。 ２９．ブロックされているＮ−末端を持つ請求の範囲第２８項に記載の細胞外可 溶性サイトケラチン。 ３０．腫瘍性乳房上皮細胞によって分泌される細胞外可溶性サイトケラチンであ って、ブロックされているＮ−末端、４０〜４６ｋｄの範囲の分子量を有し、そ して実質的に他の血清タンパク質不含のサイトケラチン。