JPS61501367A - 新規な細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規表ｉｌｌ胞培養方法 〔技術分野〕 本発明は１）成熟核細胞の表面培養方法及びそれにより得られる物質；２〉並び に皮膚の発疹を和らげ、冶Ｆ！する為の方法に関する。

成熟核細胞は表面培養方法によってのみ培養が可能であることは公知である。し たがって、浮遊液中に保持された成熟核細胞は同じ程度には生育しない。しかし ながら、成熟Ｐｃｆａ胞を適当な表面上に定着させれば接触による抑υ１が起こ るま〔発明の要旨］ 本発明は、例えば０．１５及び０．２５　ｍの適当な直径を有するプラスチック 、ガラス及びセラミックスのような不活性物質から成る、例えばデキストランも しくはその他の材料から成る適当なビーズを使用し、これを培養基中に浮遊させ 、攪拌下で浮遊状態に維持することから成る方法を利用するものである。適当な 方法（「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリングＪ　［（Ｂｉｏ −ｔｅｃｈｎｏｌｏｏｙ　ａｎｄ　Ｂｉ。

ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、　ＸχＩ、　４３３−４４２　（１９７９）ｉｊ照 １）を用いてこれらのビーズの表面上に細胞を培養することができる。本発明の 場合には、培養容積との関連で提供される表面積は特に大きい。培養基１００ｒ ｄｌ中の０．５ｇのデキストランは３０００　ｔｒｉの表面積を提供する。適当 なビーズの使用が好ましいが、例えばｌ１１１ｆ、チューブ状シート、及び粒子 のような容積に比べて表面積の大きいものであれば、どのような固体表面でも使 用ができる。

〔技術的背景〕

歴史的にみて、全ての組織培養システムでは成長の為に血清もしくはアルブミン のいずれかが必要であった。ホ乳類細胞の成長と分化の調部は、認克されるｅｌ ｌ！相互作用及び分化中の細胞によって生ずる溶性因子の両方によって仲介され る外部１ＩｉＩｌ　ｆｉの複雑なネットワークである。試験管内培養において通 常のホ乳類細胞の成長要件を再現しようとすることは、結果的に？［で、かつ困 難な努力であり、解決にはほど遠い。

変形成長要件及び特性をもって、連続的細胞ラインを試験管内で培養することは 現状まで進歩したが、それでもなお塩類、ホルモン、ビタミン、及びアミ、）酸 の混合物から成る合成培養基は酸素添加的（ｏｘｙｇｅｎ　ｉｃａ　Ｉ　ｌ　ｙ ）に由来した血清の補給を必要とする。この血清補給物は最適の細胞成長を達成 させるｂに必要であり、各種の公知及び未知の脂肪酸、ホルモン、合成イオン、 蛋白、炭水化物などを含んでいる。ホ乳類ｆａｌ胞はその全ての脂質、炭水化物 及び蛋白質が、各種のアミノ酸、多数のビタミン及びグルコースから構成されて いると考えられるでいるが、このことが正しいことを立証するのは極めて難しい 。またホ乳類の組織中での脂肪酸含有量は一般的には食餌及び脂肪酸の摂取通の 反映であり、この脂肪酸はほとんど変化を受けずに、りん脂質とトリグリセライ ドとして編入されるということは注目すべきである。脂肪酸は細胞の重要な構成 １位であり、普通の細胞の成長の為に長辺脂肪酸を供給する為に必須のものであ ること明白である。このことは組織培養中の細胞が、脂肪酸が供給されると烏級 長鎖脂肪酸を急速に消化することからも分る。

長鎖脂肪酸が供給されれば細胞は血清成分なしにも成長する。細胞懸垂（ａｄｈ ｅｓｉｏｎ）因子及びある種のホルモンがある種の細胞の成長に対して重要な役 割を持つとする報告もあるが、これが血清成分の主たる機能であるように見える 。

アルブミンが無い状態で細胞に長鎖脂肪酸を供給することに伴う問題点は、成長 に必要な濃度にお番プる脂肪酸は固体表面上に結合していなければ有毒であり得 るということである。

例えば、りん脂質媒体の使用は毒性問題を引起こす可能性が考えられる。培養中 の、細胞は供給された脂肪酸を、分子の短縮、延長又は不飽和化のいずれかによ り変性することができることは明白である。組織培養細胞の成長に適する固体表 面に局在している長鎖脂肪酸を提供することは可能である。このようにして供給 された脂肪酸は溶性脂肪酸の必要性をなくするので、血清分層の必要性をなくす るか、大幅に減少させる。ミクロキャリヤー培養を包含する組ｉ細胞培養に使用 する媒体（もしくは培養基）には多数の欠点がある。

これらの培養基は著しくコスト高であるばかりか、培養生長からの生成物が明確 ではなく、培養成長の品質を標準化することも困難でバッチ毎に変化する。その うえ汚染の危険性が高い、Ｒ終生酸物の調製は面倒で忍耐を必要とする。また胎 児ウシ血清の供給は世界的に減少している。例えば、モノクロナル抗体の調製に 用いるハイブリドーマ細胞の大規模培養では、胎児ウシ血清の使用は不可能にな った。今日ではアルブミンを必要としない培？！Ｉｓの研究が多くなされている 。

アルブミン−ｒ　Ｔｗｅｅｎｊ　（トウィーン、商品名）複合体の［Ｔｗｅｅｎ ｊ　（商品名）分層の［ｉは費用が掛かるのでワクチンの製造用の培養基に使用 されるだけである。。

〔発明の開示〕

本発明の培養基の利点を要約すれば次のようである。

■）　明確な培養基。

■）　成長の為に供給される脂肪酸に関して操作されることができる培養基。

１［［）　Ｉ造コストの著しい低減。

■）　細胞脂質の諸成分は血清脂質とは異なるので、天然脂質の供給が可能。

極性脂質や脂肪酸並びに表面上での組織培養成長に関する下記の情報は、文献か ら得たものである。血清成分の機能は脂肪Ｍ（持続注入）によって代替できる（ 　Ｌｙｎｃｈ及びｌｉｆｆｍ−ａｎ１９８１　：　Ｌｙｎｃｈ　１９８０）　、 、血清アルブミンは脂肪酸の抗体として必ず必要であり、このものは他の刺激的 成長効果をなんら持たないことが分っている（　Ｌｙｎｃｈ及びＬｉｆｆｍａｎ 　：　１９８１）。

ＢＳＡに結合した不飽和脂肪酸はｍ胞の成長を速め、培養した細胞の膜流動性を 向上させる（　Ｙａｌｌａｎｅほか、１９８１　）。

脂肪酸持続注入によって、アルブミン脂肪酸複合体と同様な成長速度が得られる 。

細胞中の全脂肪酸の約７０％はバルミチン酸、ステアリン酸及びオレイン酸が占 める。ＩＩｌ胞の脂肪酸組成は、彼等がその中で成長する胎児ウシ血清の脂肪酸 組成を反映している。

しかしながら、細胞は脂肪酸を不飽和化、延長及び短縮することができる（　Ｗ ｅｉｎｓｔｃｉｎら、１９６９）。

Ｂａｉ　ｌｅｙ　（１９６４）らによれば、培養ホ乳類細胞の場合、成長に必要 な彼等の大半の脂質は培養基の脂質に依存し、またＢａ１１ｅｙ　（１９６７） は脂質合成は血清脂質の存在下では９５％以下に抑制されると報告している。

りん脂質はＩｌＩ胞の栄養源として有用でありうる（　Ｐａｇａｎｏら、１９７ ４）。ヒト全数結合織形成細胞（例えばインクフエロン製造用に用いられる）は 血清が存在しない場合には成長速度がより遅くなるので、これらのａｍは本発明 の目的に適しているように見える。おそらくこの成長速度の減速は、外因性脂肪 酸が存在しないことに原因があるらしい。表面の真負電荷状態が細胞培養成長に 好適であることが分っている（　Ｄａｖｉｅｓ１９８１）。脂肪酸を被覆した表 面は一種の真負電荷状態にある。

本発明は、表面培養方法、特にｍ胞培養によって生産できるインクフエＯン、ウ ィルス、酵素、抗体の生産や組替えＤＮＡ生産の際に、胎児ウシ血清及び／又は アルブミン／脂肪酸が存在しないか、又はこれらが極めて少量の培！！基中で表 面培養する方法で細胞培養すれば前記のような欠点が克服できる可能性があると いう発見にもとすくものである。

本発明の一つの特徴によれば、成熟核細胞の表面培養方法であって、該細胞を胎 児ウシ血清が存在しない培養基中での固体担体上で該細胞を培養する方法が提供 される。本発明では水溶液中での溶解性が極めて小さい表面活性分子を固体表面 に被覆することが基本になっている。この表面活性分子は親油力によって固体表 面に定着し、この膜はぎっしりと充填された単分子膜を形成している。この分子 と固体表面との間には結合は無く、したがって該方法は表面活性分子の固定化方 法と見なすことができる。

本発明の方法を利用すると、主な炭素源及びエネルギー源として働く表面活性分 子で被覆された固体担体上、又は担体の存在下で成長細胞を培芸することができ る。水性培養基は普通のものでよく、胎児ウシ血清、又はアルブミン−複合体は 含まれないか、又は極めて少量でよい。

この方法の有利性は多数ある。このシステムは生産コストが低く、Ｘｌｌ製及び 操作が容易である。

本発明は培養細胞に対する栄養補給方法としては全く新しい概念のものであり、 また本発明の方法は無蛋白ワクチンの製造に使用することができ、またこの発明 ではｌ１ｌｌｌ培養成長に対していかなる表面活性ｖＡ質でも、又はいかなる固 体表面でも使用ができる。用いる希釈剤はいかなる水性媒体でも有＾溶剤でも使 用ができる。洗浄方法は希釈、クロマトグラフィー、ろ過、遠心法及び再浮遊法 などが使用できる。本発明の提案による方法は、溶剤に可溶性な表面活性分子を 造り、次いでこの混合物を固体表面上にさらし、さらに未定着の表面活性分子を 単に洗い去る工程を包含するだけである。

表面活性分子の例としては、りん脂質、トリグリセライド、全ての脂肪酸、全て の蛋白、炭化水系、及びステロルが挙げられる。溶剤には、全ての水性媒体、有 磯溶剤、例えばクロロホルム、アセトン、又は炭化水素が包含される。

周体表面の例としては、ビーズ、繊維、チューブ状シート及び粒子が挙げられる 。

洗浄工程は単に、被覆した表面を多伍の溶剤（通常は水）にざらして未定着の表 面活性分子を除くだけである。

次に本発明をさらに詳しく説明する為に実施例を述べる。

（実　施　例） 浮遊液中の１００ｄの［オクチル−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｊビーズをベレット化 （例えば、２分間３００ｇで遠心分離）し、再びアセトン１００ｄ中に浮遊させ た（繰返し）。この浮遊液を再びベレット化し、更に　１００ｄのクロロホルム 中に再浮遊させたく繰返し）。１Ｒｇのステアリン酸を１０ｄのクロロホルム中 に溶解し、加えて、１０分間、攪拌した。溶剤を蒸発して乾燥させ、アセトン１ ００ｍを加え、攪拌し、蒸発させて乾燥させた（繰返し）。このビーズを１００ ０ｄの蒸留水中に浮遊させ、沈降させ、減圧吸引により注意深く表面に浮いてい る部分を除いて水の表面に蓄積した脂肪酸をとり除いた（８回繰返し）。

最終洗浄後、ビーズを沈澱させ、大半の水を除いた。この浮遊液を１５ｐｓｉ　 （６，８／ｒｇ／α）の加圧下で１５分間、オートクレーブ中で処理して冷却し た。このビーズを、培養に使用する無菌培養基１２０ｍの中で２回洗浄した。こ のビーズを更に培養用の培養基中に浮遊させた。このビーズを単独で、又は他の ビーズと併用して細胞の培養用の担体として用いた。

細　胞 ３Ｔ３及びｖｅｒ。

この細胞を“母（ｍｏｔｈｅｒ）″′フラスコで０．２５％のトリプシンを用い て３７℃で５〜１０分間、抗トリプシン性を破壊した。

１０％ＦＣ３を含む媒体中ｒ１０００ｘｇで５分間、遠心分！！＠、３回洗浄し 無血清ＤＭＥ中に浮遊させた。摂取：Ｐ３培養皿当り５×１０セル。

培養基 基礎培養基、ＤＭＥ／Ｆｉｇ（８０：２０．Ｖ／Ｖ）を２ＴｒＬＭグルタミン、 １％非必須アミノ酸で補充した。

比較（ｃｏｎｔｒｏｌ）培＠Ｍ：　ｉｏ％ＦＣ３基礎培養基。

ＴＴＡＦ：１μ９インシユリン、２５μ９トランスフエリン、１ηアルブミン、 ２μグフイブロネクチンを含む基礎培養基＜ｄ培養基当りに添加） （ＦＩＴ１１μリフイブロネクチン、１μゲインシユリン、２５μ９トランスフ エリンを含む基礎培！Ｉ　（ｄ培養基当り添加） ビ　−　ズ：「オクチル−Ｃｙｔｏｄｅｘ　１　Ｊビーズを上記に従って脂肪酸 で被覆したが、最後のすすぎは蒸留水の代わりに０．９％Ｎａ　Ｃｊを用いた。

培養及び評価 ６０ａｍの細菌学用２３皿（Ｎｕｎｃ）中で０．５ｄの細胞浮遊液を用いて実験 を行なった。

培養（インキュベーション）は５％ＣＯ２を含む湿った雰囲気下で３７℃にて一 昼夜行なった。翌朝、２威の新しい培養基を加えた。７２時間後、この「ｃｙｔ ｏｄｅｘ　Ｊ浮遊液を取り出し、ビーズを沈降させた後、上澄み液をサイホンで 除き、５００μ】のクリスタルバイオレット（Ｈｃｒｃｋ　１４０８）・クエン ！Ｓｌｌ溶液を添加した。３７℃、５％Ｃｏ２の条件で６０分培養後、細胞核を Ｂｕｒｇｈｅｒ−計算室で計算した。

結果及び評論 脂肪酸被覆ビーズは媒体へのＦＣ８添加には代替できないことが分った。しかし ながら、明確な培養基を使用すると被覆ビーズでは著しい増加が観察された。（ 第１及び２表参照）、一つの例ではｉ胞の収率は比較培養基（ｃｏｎｔｒｏｌ） の８９％であった。

脂肪酸がビーズに結合している場合には、この脂肪酸についてなんらの毒性問題 もみられなかった。脂肪酸を被覆した間のオートクレーブ処理に耐えられた。

付着細胞は被覆されたビーズ、すなわち表面活性物質の諸特性と出会うのであっ てビーズ自体の真の表面と出会うのではない。

付着細胞による脂肪酸の詰込み（ｇｏｒａｉｎａ）が初期には観察された。この ために、細胞は集り、あまり広がらなかった。

もしこの問題が起きたときには、被覆していないビーズを被覆ビーズと混合して やって、ｍ覆ビーズから余分な脂肪酸を吸収してやることにより克服できる。こ のメカニズムは遊離脂肪酸の解毒作用としても働く。

脂肪酸上に付着した細胞は余分に誓えられた脂肪酸を利用するのがＩｌ！察され る。したがって被覆ど一ズｑ調製に際しては、よりよい洗浄方法を採用するべき である。

他の一組の実験を細菌レプトスピラ菌株ＨＡＲＤＪＯを使用して行なったが、上 記の結果と類似の結果が得られた（第３表参照）。レプトスピラ菌株は組織培養 細胞が行なうのと同じ代謝経路で脂肪酸を利用する。またこのレプトスピラ菌株 は生長の為に長鎖脂肪酸類を必要とする。通常、脂肪酸類は遊離の有毒な脂肪酸 を束縛するためのアルブミン分＠（１％）とともに「Ｔｗｅｅｎ８０」として供 給する。１０％「Ｔｗｅｅｎ　８０　Ｊアルブミンを無炭素培Ｍ基中で脂肪酸被 覆ビーズと共に使用すると、生長４日後に、真性強さくｆｕｌｌｓ’ｔｒ−ｅｎ ｇｔｈ　）のレプトスピラ菌株培養基の６０％の生長収率を与える（第３表）。

結果はレプトスピラ菌株ＨＡＲＤＪＯの生長４日後、ｄ当りのｔ４胞数で表わし た。

（’　Ｔｗｅｅｎ　８０　Ｊアルブミン濃度を１０倍に希釈すると、真性強さく ｆｕｌｌ　ｓｔｒｅｎｇｈ）レプトスピラ培養基の６０％収率を与えた。

本発明の効果をさらに説明する為に、他の４つの生長実験を実施した。

１０％「Ｃ８及びＩＴＡＦを含む両方の基礎培養基中でリルン酸と共に「オクチ ル−ｃｙｔｏｄｅｘ　−Ｉ　Ｊビーズ上でのｖｅｒ。

細胞の生長を２３皿（第１図）並びにスピンナーフラスコ（第２図）中で５０− の培養基を用いて行なった。

両方の図から分る通り、１０％ＦＣ３が無い媒体中でのＶｅｒ。

細胞の生長は１０％ＦＣ８含有媒体中に於ける生長と同じように良好であった。

次の応用例は皮膚の発疹を和らげ、かつ治癒するための改良方法に関する。

現在、殺菌し、乾燥したビーズは皮膚の発疹部分から液体を吸収するのに使われ る。か（すると発疹が乾燥して和らぎ治癒する。この技術の有利性は、発疹の全 内部表面が覆われてドレン（排水）されるのに対して、普通の接着性包帯は発疹 の外表面以下には浸透せず、ドレン（排水）も不十分なことが多い。そのうえ、 上記の技術は個々のビーズが細胞と接触するので、はぼ細胞の水準で作用するこ とである。

この応用例は、二つの前提にもとすく上記技術の採用である。（ｉ）ある種の遊 離脂肪酸はバクテリアに対して有高であり、殺菌剤及び／又は制菌剤でもあり得 る。（ｉｉ）ある梯の遊離脂肪酸を発疹部分に供給すると治さ速度が改良される 。

これら二つの因子は治癒を改良し感染を減少させる方向に導くことは明らかであ る。

この応用例に従う方法は、溶剤可溶性活性分子を造り、この混合物を固体表面に さらし、次いで未定着の表面活性分子を洗い去るＰＪ車な工程を包含するだけで ある。表面活性分子、溶剤、固体表面の実例は前記した通りである。洗浄工程は 被覆した固体表面を多量の溶剤（普通は水）にさらして未定着の表面活性分子を 除去するだけの工程を包含する。次の方法は本発明の他の応用例を説明する為の 実施例である。浮遊液中の１００ｄの［オクチル−５ｃｐｈａｒｏｓｅ　Ｊビー ズをペレット化〈すなわち３００ｇで２分間遠心）し、再び１００ｄのアセトン 中に浮遊させる（繰返し）。この浮遊液を再びペレット化し、さらに１００ｄの クロロホルム中に浮遊させる＜ＩＮ返し〉。

１ｍのステアリン酸を１０ｄのクロロホルム中に溶解し、加えて、かつ１０分間 、攪拌する。溶剤を追出し乾燥させ、１００ｄのアセトンを添加し、攪拌し、溶 剤を追出して乾燥する（繰返し）。ビーズを１０００ｄの蒸留水中に浮遊さセ、 沈降させ、表面に浮いた部分を特に注意しながら減圧吸引によって除いて氷表面 に蓄積した脂肪酸を除去する（８繰返し）。最終洗浄後、ビーズを沈降させて大 半の水を取り除く。この被覆ビーズを完全乾燥するまで加熱殺菌する。

この発明の精神と範囲に反することなしに、広範に異なる実施態様を構成させう ろことは明白なので、本発明は後記請求の範囲において限定した以外は、その特 定の実ｍ態様のみに制約されるものではない。

第１表の各数値は比較媒体に対する「オクチル−ａｙｔｏｄｓｘＪの増殖率の％ を示す。

第２表の各数値は比較媒体に対する「オクチル−ｃｙｔｏｄａｘＪの増殖率を示 す。

第２表は別に実施した実験結果を示す。

８筏 第　２　図　リルン酸「オクチル−ｃｙｔｏｄｅｘ−Ｉ　Ｊピーズ上での’Ｖｅ ｒｏＪ細胞の増ＰＬ　（”）印は１０％Ｆ”Ｃ３基礎培養基、（０）は１０４Ｉ ＴＡＦ基礎培養基中におけるものを示す。５０ｍｌの培体を入れたペトリ皿中で 培養を行った。

手続ネ甫正書く方式〉 昭和６１年４月３０８ １、事件の表示 国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８５，１０００１８２、発明の名称 新規な細胞培養方法 ３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 氏名（名称）　サーフェス・コンセブツ・ピーティワイ・リミテッド ４、代理人 住　所　東京都港区南青山−丁目１番１号５、補正命令の日付く　） （発送日）昭和６１年４月１５日 ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定によるま面外国語特許出願明細占第１項の翻 訳文 委任状 ｑ梓Ｆ１胚１−５０１３６７　（５） ＧＢ　２０９３０４０　ＥＰ　５８６Ｂ９　ＳＥ　８００５８３１３　ＷＯ８２ ００６６０ＩＪＳ　４４４８８８４　ＦＲ２５２２６７Ｂ　ＧＢ　２１１６２０ ５　ＪＰ５８１６５７８７ＳＥ　８３０１０１５

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）成熟核細胞及び原子核細胞の表面培養方法であって、固体表面上の皮膜と して表面活性分子を使用する方法。
2. （２）水性溶液中に極めて溶け難く、かつ固体表面上に親油力で定着され、密接 に充填された単分子膜から成る明確な構造をなして保持される表面活性分子を使 用することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）表面活性分子が主な炭素源及びエネルギー源として働くことを特徴とする 請求の範囲第１項又は第２項のいずれかに記載の方法。
4. （４）表面活性分子がりん脂質、トリグリセライド、全ての脂肪酸、全ての蛋白 、合成ペプチド、炭化水素、及びステロルのいずれかであることを特徴とする請 求の範囲第１項、第２項、及び第３項のいずれかに記載の方法。
5. （５）溶剤可溶性表面活性分子をつくり、次いでこの混合物を固体表面にさらし 、後に未定着表面活性分子を洗い去ることを特徴とする請求の範囲第１項、第２ 項、第３項、及び第４項のいずれかに記載の方法。
6. （６）請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、及び第５項のいずれかの方 法を使用してつくられることを特徴とする皮膚発疹治癒用の製品。
7. （７）粉末、軟こう、溶液又はエマルジョンの形態をなすことを特徴とする請求 の範囲第６項に記載の皮膚発疹治癒用の製品。