JPS61502094A

JPS61502094A - 発現マ−カ−としてのＨＢｘＡｇを含むＳＶ４０発現ベクタ−

Info

Publication number: JPS61502094A
Application number: JP60501275A
Authority: JP
Inventors: モリアテイ　アン　エム; アレキサンダー　ハナー; ラーナー　リチヤード　エイ
Original assignee: スクリツプス　クリニツク　アンド　リサ−チ　フアウンデ−シヨン
Priority date: 1984-03-08
Filing date: 1985-03-06
Publication date: 1986-09-25
Anticipated expiration: 2011-03-29
Also published as: DK516585A; AU4067285A; EP0155147A3; FI854395A0; ATE59185T1; EP0155147A2; FI86585C; US4777240A; DK516585D0; US5183734A; AU594642B2; DE3580927D1; JPH0832721B2; NO854448L; NZ211357A; DK175364B1; CA1340732C; IL74544A; FI854395L; US5534405A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＳＶ４０発現ベクター説明関連する出願との関連本願は、１９８４年３月８日に出願された係属出願シリアル阻５８７　、５７０の一部継続出願である。技術分野本発明は、組換えＤＮＡ技術、発現ベクター、及びポリペプチド発現マーカー、及びより詳しくはＢ型肝炎ＨＢｘＡｇのための遺伝子のクローニング、ＨＢｘＡｇを含む発現ベクターならびに体サンプル中のＨＢｘＡｇ及び抗ＨＢｘＡｇの存在を決定するための評価システム及び方法に関する。背景技術Ａ、クローニング及びベクター真核細胞中への外来ＤＮＡの導入は、分子生物学の最も強力な道具の一つとなった。このプロセスは、受容体細胞の核中へのＤＮＡの効率的搬入及び異種ＤＮＡを発現する細胞の続く同定を必要とする。宿主細胞中で複製できる加工されたベクターたとえばプラスミド又はバクテリオファージ（ファージ）又は他のＤＮＡ配列は、多量の特定のビールス蛋白質を作る工場として働らく細胞を構築するために用いうる。組換えプラスミドが、本明細書においてベクターの例として用いられ、クローニングビヒクルとも呼ばれる。引用して本明細書に組み込む米国特許第４，３３８，３９７号を参照されたい。プラスミドは、種々のバクテリア種に見られる染色体外遺伝要素である６それは典型的には、二本鎖の、閉じた、環状ＤＮＡ分子である。最も広く用いられるプラスミドは、ｐＢＲ３２２であり、これはそのヌクレオチド配列及びエンドヌクレアーゼ開裂部位が良く知られているベクターである。プラスミド又はファージベクターを用いる核酸生産は、極めて進展してきた。プラスミド又はファージＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼで開裂され、選択された外来ＤＮＡにインビトロで結合される。得た組換えプラスミド又はファージは次に、大腸菌のような細胞中に導入され、そしてそのように作られた細胞は、加工されたベクターの多数のコピーを作るために誘発される。クローニングベクターにより十分な量のＤＮＡがひとたび作られると、作られた外来ＤＮＡは切除され、そして外来遺伝子によりコードされる蛋白質又はポリペプチドを作る又は転写するために第二のベクター中に入れられる。ＤＮＡ　（完全な遺伝子、ｃＤＮＡ又はバクテリア遺伝子）に依存して、受容体細胞における直接発現に真核転写及び翻訳シグナルを与えることが必要でありうる。これらのシグナルは、外来ＤＮＡをインビトロで発現ベクターと結合することにより与えられうる。発現ベクターは、クローンされた遺伝子の転写及びそれらのメツセンシャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の蛋白質への翻訳のために必要なりＮＡの配列を含む、典型的にはそのような必要な配列又は制御要素は、（１１転写のための開始点をシグナルするプロモーター；（２）転写のための終点をシグナルするターミネータ−；（３）プロモーターを調節するオペレーター；（４）細胞の蛋白質合成機械の初結合のためのリポソーム結合部位；及び（５）蛋白質合成の開始及び終了をシグナルする開始及び停止コドンである。発現ベクターは、有用であるために、いくつかの追加的特性を持たねばならない、それは、比較的に少さくなければならず、また強いプロモーターを含まねばならない０発現ベクターは、形質転換体の同定を可能にする−又は二辺上の選択マーカーを持たねばならない。それはまた、発現のために必須でないベクターの領域で−又は二辺上の制限酵素のための認識部位を含まねばならない。従って発現ベクターの構築は、複雑でいく分子側できない冒険である０発現ベクターの有効性の唯一の真のテストは、適当なｍＲＮＡの合成が開始される顯度を測定することである。しかしｍＲＮＡの定量は、長たらしく、正確な測定を得ることはしばしば困難である。従って他のより実際的な手段が、形質転換を検出するために開発された。一つのそのような手段は、形質転換された細胞における異種蛋白質の合成を酵素的評価によりモニターすることである。いくつかのマーカー遺伝子が、形質転換が起きたことを指示するために開発された。形質転換をモニターするために用いられる別の手段は、免疫学的反応剤の使用を含む、もし、発現された蛋白質の濃度が十分に高いなら、螢光染料たとえばフルオレセイン又はローダミンに結合された抗体との細胞質又は表面免疫螢光が、ベクター特異的蛋白質発現生成物を検出するために用いられうる。より一般には、形質転換された細胞は、免疫沈降の後に放射性の存在下で培養される。このアプローチは、形質転換特異的マーカーを検出するために、免疫複合体黄色ブドウ球菌蛋白質Ａ選択〔ケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ　）、（１９７５）、ジャーナルオプイミエノロジ−（Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、）、１１５：１６１７−１６２４）及びウニスターン　ブロッティング法〔レナート（Ｒｅｎａｒｔ　）ら、（１９７９）、プロシーディングズ　オブ　ナシヨナル　アカデミ−ナプ　サイエンス　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、７６　：３１１６−　３１２０）で用いられた。シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）ベクターを用いる遺伝子発現の分析は、生物学的及び免疫化学的レベルで最も探究された真核形質転換技術である。ＳＶ４０ゲノムの組織に関する遺伝及び生化学情報は、ウィルスゲノムのヌクレオチド配列により確立又は確認された。ドーズ（Ｔｏｏｚｅ）　（１９８０）、モレキューラ−バイオロジー　オブ　チューマー　バイラシーズ、第２版、第２部、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリング　ハーバ−、ニューヨーク、による総説参照０種々のＳＶ４０ベクター分子のデザインは、遺伝子シグナルの正確なマツピング及び　ＳＶ４０ゲノムから所定のフラグメントの単離のための制限エンドヌクレアーゼの使用に依存してきた。ＳＶ４０は当初、リティック（ｌｙｔｉｃ）システムを用いる真核形質導入ベクターとして開発された。マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　）ら、（１９２９）、ネイチア（Ｎａｔｕｒｅ）　（ロンドン）、２７７：１０８−１１４．次に形質転換（非リティック）ベクターが、ＳＶ４０ゲノムの単離されたセグメントにより構築された。エルダー（Ｅｌｄｅｒ）　ら、（１９８１）、＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、＋　１５　：　２９５−３４０゜ハマー（Ｈａｍｅｒ）　らは、ブローベが入手できない遺伝子をクローンするためにＳＶ４０を用いうろことを初めて示唆した。彼らは、ヘテロシニアスｍＲＮＡ集合からの二本鎖ｃＤＮＡが５Ｖ４０ベクター中にシッットガン（ｓｈｏｔｇｕｎｎｅｄ）されうること及び望む配列を持つウィルスが放射性又は螢光性抗体を用いて同定されうろことを示唆した。ハマーらは初めて、１９７９年に発現マーカーを含むＳＶ４０組換え発現ベクターの構築を報告した。バーマーら、（１９７９）、セル（Ｃｅｌｌ）、１７：７２５−７３５．彼らのＳＶ４０ベクターは、０．１４マツプユニツトのＲａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に０．８２マツプユニツトのＨａｅ　ＩＩ制限部位までのウィルスＤＮＡ配列を含んだ、全体の初期遺伝子Ａ及びウィルスＤＮＡ複製のオリジンに加えて、ベクターは、ウィルスプロモーター、リーダー、介在配列、体の５′部分、及びウィルス後期１９５ｍＲＮＡのための３′末端配列を含んだ、それは、ウィルス蛋白質ＵＰＩ、２及び３をコードする後期領域配列の１６６０塩基対（ｂ　ｐ）を含まなかった。プリエルズ（Ｐｒｉｅｒｓ）ら、（１９７８）、ネイチア、２７３：１１３−１２０、及びレソディ（Ｒｅｄｄｙ）　ら、（１９７８）、サイエンス（Ｓａｉｅｎｃｅ）　、２００　：　４９４−５０２゜ラビットβ−グロブリン遺伝子暗号配列は、発現マーカーとして上述のベクター中にリゲートされた。それらの組換えベクターで感染されたモンキー細胞中でラビットβ−グロブリンが合成されたかどうか見るために、ハマーら（前出）は、１．０ナノグラムという少しのグロブリンを検出できるラジオイムノアセイを用いたハマーらは、β−グロブリン発現の肯定的証拠を示すことかできたが、彼らはＳＶ４０組換−グロブリン組換え系の有益性に関していくつかの留保を示した。まず、グロブリンは少ししか可溶でないので、測定のためのサンプルの調製の間にかなりの損失をこうむったであろう、すなわち、感染した細胞におけるグロブリンの量の測定は、１０倍もの誤差を持つかも知れない、第二に、この評価法は、本来のグロブリンと他の免疫学的関連生成物たとえば読み遇し蛋白質又はポリペプチドフラグメントとを区別できない。ハマーらが述べなかったファクターは、総ての真核グロブ１Ｊンの間の高程度の相同性である。この相同性は、宿主細胞系に対して内在性のグロブリンからベクター誘発グロブリン発現を区別することを困難にする。Ｂ、Ｂ型肝炎ウィルスペプチド及び抗ポリペプチド抗体肝炎ウィルスは、かなり種々の物質である。それらは、影響する標的組織、肝臓によって厳密に分類される。多数のウィルスが全身感染の一部として肝臓に影響するが、肝炎ウィルスという言葉は、通常、Ａ型（Ｉ（ＡＶ）　、Ｂ型（）（ＢＶ）及び非Ａ非Ｂ型を意味するものととられる。ウィルスの三つのタイプのうち、ＨＢＶが生物学、免疫化学及び治療レベルではるかに最大に探究されている。ＨＢＶは、ＤＮＡウィルスとして分類され、他の総ての族のＤＮＡウィルスとは多くの点で異る。ＨＢＶは、蛋白質、脂質及び炭水化物より成りかつユニーク抗原複合体すなわちＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を有する外側コート（膜又はエンベロープよりも実体的な）を持つ、またそれは、表面抗原とは明らかに異る抗原特異性を持つ内部ヌクレオキャブシフトすなわちＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含む。可溶性抗原ＨＢｅＡｇがまた、当該技術分野で認められている。この抗原は、ＨＢＶコア中に集められないＨＢｃＡｇポリペプチドより成ると考えられ、かつ従って非集合状態でユニーク抗原特異性を持つ。典型的自己制限的急性ＨＢＶ感染において、下記の血清学的マーカーが、感染された宿主の血清中に連続的に現われる：　ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ　、抗ＨＢＣ，抗ＨＢＥ、及び抗ＨＢＳ、抗ＨＢＨの出現は、検出しうるＨＢｓＡＨの終局的喪失をシグナルする。このことは、自己制限された急性ＨＢＶ感染の総ての場合において妥当する。ＨＢＳがなくなるに続いて、抗ＨＢＳの出現前に２．３週間から数ケ月の遅延がある。慢性的ＨＢＶ感染の間に、ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢＣが存在する。宿主の血清は、ＨＢｅＡｇ又は抗ＨＢＥ血清学的マーカーを示しうる；すなわち患者は、ＨＢｅＡｇ又は抗ＨＢＥ陽性でありうる。ＨＢＶマーカーのいくつかのための敏悪なかつ特異性なラジオイムノアッセイ及び酵素免疫評価が広く用いられる。これらの高度に敏感な血清学的テストは、ＨＢＶ惑染の途上におけるウィルスの出現及び免疫応答マーカーをモニターする基礎を与えた。過去数年の間に、各血清学的マーカーがＨＢＶ複製の間の宿主応答に関する特異的ウィルス事象を知らせることを多くの研究が示した。すなわち、病気の治療途上における種々の段階における血清学的マーカーのプロフィールは、有用な診断及び予後情報を提供しうる。Ｂ型肝炎ウィルスとヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝臓癌の間の関連が大いに研究され、そして血液伝染病学的ならびに履歴病理学的発見は、ＨＢＶが直接又は間接的に肝臓癌の病原に係っていることを強く示唆する。多数の肝癌細胞系統がヒトＨＣＣから誘導され、そのような細胞系統ＰＬＣ／ＰＲＦ１５及びＥＰＨ３Ｂのゲノム中に組込まれたＨＢＶ特異的ＤＮＡの検出が報告された。しかしこれらの細胞系統において、Ｂ型肝炎表面抗原のみが、組織培養においてウィルス特異的遺伝子産生物として発現された。ＨＢＶの他のマーカー、たとえばＢ型肝炎コア抗原、肝炎ＢＥ抗原、及びＤＮＡポリメラーゼは検出されなかった。動物のいくつかのＤＮＡＩ！瘍ウィルスは、ウィルスゲノムの複製及び組込みを司るウィルス遺伝子の作用を通して形質転換を作ることができ、そしてそのようなウィルスによる形質転換された細胞は、形質転換性遺伝子により発現されるＴ（腫瘍）又は新抗原を有しうる。Ｔ抗原に類似の抗原の最近の証拠は、抗補体免疫螢光染色法を用いて、組込まれたＨＢＶ遺伝子を含むヒト肝癌細胞で得られた。この抗原は、ＨＢＶ関連核抗原（ＨＢＮＡ）と名付けられた。ウェン（Ｗｅｎ）　ら、（１９８３）、インフェクロ　イミュン（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍａ＋ｕｎ、）、３９：１３６１−１３６７゜ＨＢＮＡは、いく人かのＨＢｓＡｇ陽性ＨＣ陽性者からの血清において検出され、抗原の発現は細胞培養及び腫瘍組織の両者において示された。加えて、抗ＨＢＮＡ抗体が、ＨＣＣを持ついく人かのｌ（ＢｓＡｇ陽性、患者の血清中で見られた。ＨＢＮＡは、ＨＢＶ遺伝子の従来認識されていなかった発現を示すかも知れない。１９７９年にガリバート（Ｇａ　ｌ　ｉ　ｂｅｒ　ｔ）ら、ネイチア、２８１：６４６−６５０、は、ウィルスのうちで特徴的な、部分的二本鎖かつ部分的−末鎖である約３２００塩基の環状ＤＮＡであるＨＢＶゲノムのヌクレオチド配列を報告した。ゲノムの長い即ちＬ鎖（完全に環状の）は、ウィルス蛋白質を説明するに十分に大きな四つの読み枠を含むことが見い出されている。これらの領域は、ｓ、ｃ、ｐ及びＸと呼ばれ、第１図に図示的に示される。領域Ｓ及びＣは、各々ＨＢｓＡｇ及びｌｌＢｃＡｇのための遺伝子を含むことが見い出された。領域Ｐは、サイズ及びアミノ酸残基内容においてＤＮＡポリメラーゼに類似の蛋白質をコードすると考えらる。領域Ｘは、ＨＢＮＡをコードする遺伝子の可能性ある源の一つであるとウェンら（前出）により考えられている。領域Ｐ及びＸにおける遺伝子のための機能の華なる仮定的割り当ては、ＨＢＶの遺伝子組織及び分子生物学を理解するにおいてまだ存在するギャップを示す、このギャップの理解は、ウィルスの増殖のためのインビトロ系の不存在である。最近まで、ＨＢＶの唯一の源は、ヒト患者の血清であった。細胞培養におけるウィルスの増殖の試みの失敗は、その極めて狭い宿主細胞範囲の結果である。ＨＢＶ　ＤＮＡ及びその遺伝子産生物を作る問題への一つのアプローチは、組換えＤＮＡ技術を用いることであった。この技術は、特定のウィルス蛋白質をコードする核酸配列の大規模生産を可能にする。ティオライス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）ら、（１９８１）、サイエンス、２１３：４０６−４１１、は、ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子を含むｐＢＲ３２２による大腸菌の形質転換を報告し、またその単離された遺伝子のかなりの量の生産を報告した。これら研究者はまた、ＨＢＶゲノム内におけるＨＢｓＡｇ遺伝子の位置、及び蛋白質へのその発現を影響する因子を研究したいと望んだ。これを行うために、彼らは、バクテリア及び哺乳類の両者の細胞で用いるためのＨＢｓＡｇ遺伝子を含む発現ベクターを構築した。ティオライスら（前出）により構築された発現ベクターの一つは、ＨＢｓＡｇ抗原決定基を含む大腸菌における蛋白質の生合成を達成した。　ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子の一部をバタテリオファージｐｌａｃ５　１ｕｖ　Ｓ中に挿入し、自然のＨＢＶの読み枠を保存するようにして作られた。哺乳動物細胞におけるＨＢＶ遺伝子発現を研究するために、ティオライスら（前出）は、全ＨＢＶゲノム内に種々の位置でトランスフェクション要素を挿入することにより一連のＨＢｓＡｇ発現プラスミドを構築した。トランスフェクション要素は、全ＨＢＶゲノムをベクターで形質転換されたマウス細胞のゲノム中にいくつかの異る配位で組込むことを可能にした。この方法でベクターを増加するにおいて、これら研究者はＨＢ　Ｖの自然に生じる遺伝子制御要素を用いることを試みた。ティオライスら（前出）により報告された六つの発現ベクターの僅か三つのみが、望むｌ（ＢｓＡｇ蛋白質の発現を行った。その産生は、ビツジ抗ＨＢｓＡｇ抗血清を用いて組織培養液におけるその存在をテストすることによって検出された。この研究の時点で知られていた他のウィルスマーカー（すなわちｌ（ＢｃＡｇ　、　ＨＢｅＡｇ及びＤＮＡポリメラーゼ）は、形質転換された細胞において検出されなかった。上述のティオライスらの研究の時に、領域Ｘの可能性ある存在は、それが）ｆＢＶ蛋白質をコードする可能性と共に知られていた。すなわち、ＨＢＶゲノムは、従来ウィルスに関連されたのより多い蛋白質をコードする能力を含むことが知られた。この問題は、表現型の研究において遺伝子型と呼ばれた。なかんずく、ウヱンら（前出）が領域Ｘを、ＨＢＮＡをコードする遺伝子を含むと考えたときに彼らが述べたのがこの問題である。上述のティオライスら及びウェンらの研究の前に、サツトクリフェ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）　ら、（１９８Ｇ）、ネイチア、２８１８０１−８０５、は、なかんずくこの問題を解く一般的技術を示した。彼らは、その蛋白質生成物が未知であったウィルス遺伝子のヌクレオチド配列により予告される蛋白質内からのポリペプチドを化学的に合成した。抗体がポリペプチドに対して生ぜられ、ウィルスにより感染された細胞により作られた総ての蛋白質に対して反応された。予告された蛋白質の一部に対する抗体を用いて、サツトクリフェらは、従来未知で認識されていなかったウィルス蛋白質生成物を検出した。今日まで、ＨＢＶゲノム領域Ｘの蛋白質生成物を明瞭に同定するこの方法及び何らかの他の方法の使用は、報告されてし１な０゜これは、合成抗原を作りそして所定の特異性の抗体を誘発するためにこれらを用いる一般的概念は記載されているが、予測性を拒み続ける大きな部分がこの方法に残っている故である。これの理由はいくつかある。第一に、遺伝子配列から導かれた蛋白質アミノ酸残基配列は、もしヌクレオチド配列読み枠が遺伝暗号の冗長性の故に堅固に確立されるというのでなければ、仮説的性質のものである。第二に、合成抗原は、自然な環境において完全な蛋白質と免疫反応する抗体を必ず誘発する訳ではない、第三に、免疫原に対する宿主の自然の抗体が、免疫原のアミノ酸配列の短い線形部分に対応するポリペプチドとほとんど免疫反応しない。発明の詳細な説明本発明は、いくつかの面を持っている。一つの面は、ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子に結合された発現ベクターを含む組換えＤＮＡである。特に好ましい組換えＤＮＡにおいて、ＤＮＡ発現ベクターは、第２図において塩基位置２４６ＢにおけるＢａ＋ｉ　Ｈ１工ンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置７６７における１１ａｅ　ＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位までのシミアンウィルレス４０ウイルスＤＮＡ配列を含む第一のＤＮＡ配列を含む、そしてＨＢＸＡｇをコードする遺伝子°は、第１図において塩基位置１４３７にお番するＨａｓ　ＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置２８におけるＲａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位までのＢ型肝炎ウィルスＤＮＡ配列を含む第二の遺伝子ＤＮＡ配列により備えられる。第−及び第二のＤＮＡ配列は、ＨＢｘＡＨの発現を促進するために操作的に結合される。本発明の別の面は、ＨＢｘＡｇを、又はＨＢｘＡｇの実質的部分を構成するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡにより構成される。特に好ましい組換えＤＮＡは、ｌＢｘＡｇをコードする遺伝子を含み、第１図で塩基位置１４３７から時計方向に２８までをカバーする塩基配列又はその実質的部分を持つ。ＨＢｘＡｇをコードする、又はその実質的部分を構成するポリペプチドをコードする遺伝子を含む少くとも一つの組換えＤＮＡをコードするプラスミドが、本発明のもう一つの面を成す。このプラスミドは、第１図において塩基位置１４３７から時計方向に２８までをカバーする塩基配列又はその実質的部分を含みうる。特に好ましいｒ、＊において、プラスミドは、第２図の塩基位！　２４６ＢのＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置１７１７のＥｃｏ　ＲＴエンドヌクレアーゼ制限部位までのシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）ウィルスＤＮＡ配列を含む第一の［ｌＮＡ配位；第３図の塩基位置３７５のＢａｇ　Ｈｒエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置０のＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位までのプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ配列を含む第二のＤＮＡ配列；及び第１図の塩基位置１４００のＢａｇ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置２８のＢａＩＩＨＩエンドヌクレアーゼ部位までのＢ型肝炎ウィルスＤＮＡ配列を含む第三のＤＮＡ配列を含む、このプラスミドにおいて、第−及び第二のＤＮＡ配列は、これらの各々のＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結合される：第二及び第三のＤＮＡ配列は、これらの各々のＢａｍ＋　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結合される；そして第−及び第三のＤＮＡ配列は、第４図に従いこれらの各々のＲａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結合される。ＨＢｘＡｇ又はＨＢｘＡｇの実質的ポリペプチド部分を作る方法が、本発明の別の面を成す、この面において、本発明の発現系を含む宿主は、ＨＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド部分が宿主又は培養ブロス中で作られ蓄積されるまで、培養ブロス培養基中で増殖される。蓄積されたＨＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド部分は、その後回収される。本発明の別の面は、抗原的合成ポリペプチドを考える。この合成ポリペプチドは、約６〜約４０のアミノ酸残基を含み、配列においてＨＢｘＡｇの抗原決定基の配列に対応する。特に好ましいポリペプチドは、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて下記の式により示されるポリペプチド配列の群から選択されるアミノ酸残基配列を含む。（ｉ　）　Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ −Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ；（ｉｉ　）　Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−τｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ；及び（１ｉｉ）　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−＾１ａ酸化されたシスティン残基により互に結合された合体した合成ポリペプチド繰り返し単位の多数を含む水溶性又は水分散性抗原性ポリマーがまた、本明細書で考慮される。繰返し単位は、アミノ末端及びカルボキシ末端の両者でシスティン残基を含む又は一つの末端に一つのシスティン残基そしてポリペプチド鎖内に一つのシスティン残基を含む、下記に述べるポリペプチドより成る。アミノ及びカルボキシ末端システィン残基を含む特に好ましいポリペプチド繰返し単位は、左から右へかつアミノ酸末端からカルボキシ末端の方向に書いて下記より成る群から選ばれた式により示される。Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｍｅ　ｔ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇ　１　ｕ−Ａ　ｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｂｅ−Ｌｙｓ−４ｓｐ−Ｃｙｓ　；Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇ　ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１　ｕ　−１１ｅ−Ａｒｇ| Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−シａｌ−Ｃｙｓ　；及びＲ’−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−１１：ｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−＾１ａ−Ｒ”ここでＲ１及びＲｔの各々は、システィン残基であるが、但しＲ１とＲ２の一方のみが存在すること。抗体結合部位を含む受容体分子、たとえば上述の抗原性ポリペプチドの一つと免疫反応できる抗体がまた、ここで考慮される。これら受容体分子が免疫反応する特に好ましいポリペプチドは、前述したポリペプチドにより例示される。これら受容分子はまた、ＨＢｘＡｇ又はこれの実質的部分と免疫反応する。評価されるべき体サンプル中での検出しうる量のＨＢｘＡｇの存在を測定するための診断評価系もまた考慮される。この系は、上述の受容体分子を含む剤を収容する少くとも一つの容器を含む、この系は更に、第二の容器中の第二の剤を含む、この第二の剤は、受容体分子が免疫反応する抗原的合成ポリペプチドである。受容体分子とＨＢｘＡｇＯ間の免疫反応をシグナルする手段が、診断評価系の別の一部を構成しうる。体サンプル中の検出しうる量のＨＢｘＡｇの存在を評価するための方法は、本発明の別の面を成す、ここでＨＢｘＡｇの検出しうる量の存在を評価されるべき体サンプルからの蛍白質が、受容体とＨＢｘＡｇＯ間の免疫反応をシグナルするための指示手段の存在下で上述の受容体分子と混合される。混合物は、指示手段が免疫反応の起ったことをシグナルするのに十分な時間維持される。次に１．このシグナルの存在が確認される。図面の簡単な説明本発明の開示の一部を成す図において；第１図は、ティオライスら、（１９８１）、サイエンス、２１３：４０６−４１１からの、かつオノ（Ｏｎｏ）　ら、（１９８３）　−Ｎ、Ａ。Ｒ５，１１：１７４７−１７５７により修飾されたＨＢＶ／ａｄｗゲノムの物理的構造及び遺伝子組織を示す図式的ダイアグラムである。Ｌ鎖の５′末端は、Ｓ鎖の５′末端と塩基対にされていると報告される。弧に結びついた矢印により示される成る制限部位及び制限エンドヌクレアーゼの略記は、オノら（前出）により分析されたＨ　Ｂ　Ｖ　／ａｄｗゲノムの物理的マツプに対応する。ゲノムを囲む幅広の矢印は、Ｌ鎖の四つの大きなオーブン領域に対応する。これら四つの潜在的コーディング領域は、ｓ、ｐ、ｘ及びＣと名付けられる。四つの名付けられた領域の各々に続（カンコ内のアミノ酸残基（ａ　ａ）の数は、各領域によりコードされる仮説的ポリペプチドの長さに対応する。定義された遺伝子Ｓ及びＣに対応する二つの領域は、幅広の矢印内のドツトを付したエリアにより示される。単一のＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ開裂部位が、マツプのオリジンの点として用いられる。第２図は、レディ（Ｒｅｄｄｙ）　ら、（１９７８）、サイエンス、２００：４９４−５０１により出版され、ファン　ツーバースウィン（Ｖａｎ　Ｈｅｕｖｅｒｓｗｙｎ　）及びフイアーズ（Ｆｉｅｒｓ）　、（１９７９）、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＊、、１０（１５１−６０、により修飾された一次配列から作られた５Ｖ４０ＤＮＡ制限マツプを図式的に示す。第３図は、サツトクリフエ（１９７９）、コールド　スプリング　ハーバ−シンポジウム　オン　クオンテイテイテイブ　バイオロジー４３．７７の一次配列データから作られたプラスミドｐＢＲ３２２制限マツプを図式的に示す。第４図は、クローニングベクターＳＶＡＭＩ　９１を作りそして次にＨＢｘＡｇの木質的部分を発現する発現ベクター５ＶＨＢＶ−３を作るために、ＡＭ６　（波状線）　、ｐＢＲ３２２（実線）及びＳＶ４０　（点線）から作られた本発明のベクター中にＤＮＡフラグメントを挿入するのに用いられる、本明細書の材料及び方法の部で述べる方法を図示的に示す、　Ｂａ＋ｍ　ＨＩ　５Ｅｃｏ　ＲＩ及びＨａｅ　Ｉｔに関する制限エンドヌクレアーゼ部位の相対的位置は、各々黒丸、白丸及び黒三角により示される。ＳＶ４０ゲノムのオリジン（ｏｒｉ）及び初期及び後期プロモーターもまた示される。第５図は、ＳＶ４０後期プロモーターのための遺伝子、アミノ末端９９アミノ酸残基（９９ａａ）、及び１３２カルボキシ末端アミノ酸残基をコードするＨＢｘＡｇ遺伝子配列の実質的ポリペプチド部分（１３２ａａ；１５４アミノ酸残基の１３２）を含む５ＶＨＢＶ−３組換え発現ベクターの線形部分を示す。また、ベクターにより発現されるＶ　Ｐ　２　ＨＢｘＡｇ融合蛋白質のための＋５ＲＮＡが示される。第６図は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に示したＨＢｘＡｇをコードする遺伝子の翻訳されたアミノ酸残基配列を示す。５ＶＢＨＶ−３により発現されるＨＢｘＡｇの実質的部分は、発現されたＨＢｘＡｇポリペプチドのアミノ末端残基であるアミノ酸残基位置２３　（Ａｌａ）の矢印で示される。ＨＢｘＡｇ配列中の本発明の９９．１００及び１４２と呼ばれる合成ポリペプチドの相対的位置は、三つのラベルされた、アンダーラインされたアミノ酸残基配列により示される。従って合成ポリペプチド９９のアミノ酸残基配列は、図に示されるアミノ末端Ｍ　ｅ　を残基がら位置１００ないし１１５に対応し、合成ポリペプチドｌｏｏの配列は、図のアミノ末端Ｍｅｔ残基から位置１１５ないし１３１に対応し、そして合成ポリペプチド１４２の配列は図のアミノ末端Ｍｅｔ残基がら位１！！１４４ないし１５４すなわち１１のカルボキシ末端残基に配列において対応する。第７図は、二つのヒト肝癌細胞リセート（１ｙｓａｔｅ　）との抗Ｘ抗血清の反応性を示すオートラジオダラムの写真である。二つのヒト肝癌細胞系統、ＰＬＣ／ＰＲＦ１５及びＨｅｐＧ　２は、１０％胎児ウシ血清によるイーグルの培養基のデュルベッコの修正物中でサブコンフルエンシーまで（コンフルエント培養基から１：５の分裂の第６日）まで増殖された。上澄みを除き、細胞をこすり落して集める前に単層を含むフラスコを５分間氷の上においた。そして集めた細胞を遠心分離によりベレット化した。細胞ペレットをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い、−７０℃で急速冷凍し、−夜凍結真空乾燥した。得た細胞粉をＰＢＳに溶解し、サンプル緩衝液中の２■／ｍ２の最終濃度とした。サンプルを５分間沸騰し、細胞デブリスをベンクマンマイクロ遠心機で遠心分離により除いた。細胞リセートの５０μｇを、ＲＩＰＡ緩衝液〔１％ノニデッド（Ｎｏｎ１ｄｅｔ　）ｐ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニル　エーテル）、Ｏ，ＯＳ％ナトリウムデオキシコレート及び０．１％ＳＤＳを含むＰＢＳ）中で１５分間インキュベートし、クロラミンＴ反応（７ｙ　：ｌ　翠イ（ＭｃＣｏｎａｈｅｙ　）　ら（１９６６）、Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ、　２９　：　１８５−１８９　）により３マイクロキユーリイの１２５１で放射能ラベルした。放射能ラベルされた肝癌リセートの各々の１．５Ｘ１０’カウント／分（ｃｐ＋＊　）を、ＲＩＰＡ中で抗Ｘポリペプチドの１０μりと６０分間反応させた。抗原−抗体複合体（免疫反応生成物）を、ホルマリン固定した黄色ブドウ球菌で沈降した。ベレットをＲＩＰＡで一度、５００ｍＭのＬｉＣ１！、１００ｍＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ＝　８．５　）で二度洗い、放射能を分析した。総てのベレットを、４０μｐサンプル緩衝液（０，０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１（ｐＨ６，８）　、２％ＳＤＳ、１０％グＵ　セｔ）　−ル、５％２−メルカプトエタノール及び０．００１％ブロムフェノールブルー〕に溶解し、３分間沸騰し、細胞デブリスを除くために遠心分離し、下記のように５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。放射能ラベルした細胞リセートを、変性化ナトリウムドデシルサルフェート・ポリアクリルアミド　ゲル（１２，５％）（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥ）上に与え、ラエムリ　（Ｌａｅ＋ｗｍｌｉ　）（１９７０）　、ネイチア、２９７　：　６８０−６８５、の手順に従い電気泳動に付した。蛋白質を、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ　）ら（１９７９）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６　：　４３５０−４３５４、記載のようにニトロセルロースシートに電気泳動的に移した。ニトロセルロースシートを、非特異的結合の減少のためにＢＬＯＴＴＯ（ジテンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ　）ら（１９８３）、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、、　１５９：１．７５１−１７５６）中で４℃で一夜のインキュベージタンの前に、アミドブラック中で着色した。ニトロセルロースストリップをｌ。ｍ　ｊｌ　ＢＬＯＴＴＯの最終体積で抗ポリペプチド抗体の１：３５ｏ希釈により室温で３時間インキュベートした。ストリップを、１２５１ラベルした黄色ブドウ球菌蛋白質Ａ　（１０’　ｃｐｓ　／ｍｊりで１時間のインキュベーション前に、ＢＬＯＴＴＯ中で洗った。ポリペプチドによる競争が下記で示される場合、抗ポリペプチド抗血清は、放射能ラベルされた抗原の添加前に、１ｏｏμｇのポリペプチドで６０分間インキュベートされた。ストリップは上述のように洗われ、水ですすがれ、乾燥され、そしてオートラジオグラフを採られた。レーン１及び５は、抗ポリペプチド９９抗体（抗９９）と反応された；レーン２は、ポリペプチド９９でブレインキュベートされた抗９９と反応された；レーン３は、関連のないポリペプチドでブレインキュベートされた抗９９と反応された；そしてし−ン４は、免疫前（プレイミューン）血清対照品と反応された。ＨｅｐＧ　２細胞からのリセート（レーン１〜４）は、抗ポリペプチド９９と反応しなかった。右余白の矢印は、２８，０００及び４５，０００ダルトンの分子量を持つ蛋白質の移動位置を示す。第８図は、チンパンジー（Ｃｉレーン３及び４）及びヒト（Ｈ；レーン１及び２）肝Ｗａ＆ｌｌ織との抗Ｘ抗血清の反応性を示す写真である６チノパンツー及びヒトからの肝臓切片を、液体窒素中で急速冷凍し、ウス及びキネで細かい粉末に挽いた。細胞粉末を、第７図で述べたように、サンプル緩衝液に溶解し、ゲル電気泳動に付し、プロットした。ニトロセルロースストリップを、第７図で述べたように抗血清の１：５０希釈で現像した。但し、二つの変更点がある：（１）総てのインキュベーション及び洗滌においてＢＬＯＴＴＯの代りに１％ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）溶液を用いた；また（２）抗原に結合した抗体を、ホースラディツシュペルオキシダーゼに接合したヤギ抗うビフ）ＩｇＧで検出した。抗原−抗体免疫反応生成物は、ストリップを下記の現像液に浸すことによって可視化した。現像液は、８■の４−クロル−１−ナフトール及び３３０μｌの３０％過酸化水素を含む無水エタノール２５０μｌを５　Ｑ　ｍ　ｊｌのＴＢＳ緩衝液に３７℃で加えて作った。ポリペプチド９９に対する抗血清（抗９９）が、二つの左方の図（ブロックされた及びブロックされない）において用いられた。一方、ポリペプチド１４２に対する抗血清（抗１４２）が、二つの右方の図（ブロックされた及びブロックされない）において用いられた０図の左側の数字は、各々、６６．４５．３１．２１及び１４キロダルトンの分子量を持つ蛋白質のゲル移動位置を示す。第９図は、結合プローベとしてＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＤＮＡを用いた、Ｘ蛋白質を示す肝ｌ１１Ｍ１織からのヒト及びナンパンジー制限酵素開裂肝１１ＤＮＡのサザーンプロット分析の写真である。全ＤＮＡが、第８図に述べたサンプルから作られた細胞粉末から抽出された。１０μｇのＤＮＡを、１％アガロースゲル上の各（ぼみに与えた。制限酵素消化緩衝剤は、生産業者（Ｂ　ＲＬ）によった、総ての消化は、５０単位の酵素（μｇ単位で５ｘＤＮＡ濃度）で３７℃で一夜実施した。レーン１〜３は、各々、Ｉｌｌａｍ　Ｈｌ、Ｅｃｏ　ＲＩで消化した又は非開裂のチンパンジー（ｃｈｉｓ＋　）　Ａ　−２４３肝１ｆｉＤＮＡを示す；レーン４〜６は、各々、Ｂａｍ　Ｈｒ　％Ｅｃｏ　ＲＩで開裂した又は非開裂のｃｈｉ１１３４４肝１ｉＤＮＡを示す；レーン７〜１０は、各々、旧ｎｄｌ［［、Ｒａｍ　Ｈ１、ＥＣＯＲＩで切断した又は消化なしのヒトＨＢｃＡｇ陽性肝１１ＤＮＡを示す；レーン１１〜１４は、各々、旧ｎｄｌｌｌ、Ｂａ１ｌＨ１，、Ｒｃｏ　ＲＩで消化した又は非消化のヒ）　ＨＢｓＡｇの陰性肝Ｗ＆ＤＮＡを示す。第１０図は、抗Ｘポリペプチド抗血清とＸに指令された遺伝子生成物との反応性を示すオートラジオグラフの写真である。　Ｂ５Ｃ−１細胞のコンフルエント単層（２Ｘ１０’細胞）は、組換え５ＶＨＢＶ−３ストツクウ４　／Ｌ／ス（ｔ　ｓ　Ａｘｓｖ及び５ＶＨＢＶ−３ヴイリオンの混合物）又は野性タイプＳＶ４０で感染された〔モリアーチ４　（Ｍｏｒｉａｒｔｙ　）　ら（１９８１）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８　：　２６０６−２６１０）、培養物を、無血清のＤＭＥＭ中で４０℃で、約５０％の細胞変性効果が起る時まで４８〜７２時間インキュベートした。上澄みを除き、細胞をこすり落して集める前に単層を含むフラスコを氷の上に５分装置いた。集めた細胞を遠心分離し、得た細胞ベレットをＰＢＳで洗い、−７０℃で急速冷凍し、−夜、凍結真空乾燥した。得た細胞粉末をＰＢＳに溶解し、サンプル緩衝液中の２■７ｍ１ｌの最終濃度とした。サンプルを５分間沸騰し、細胞デブリスをベックマンマイクロ遠心分離機で３０分間遠心分離により除いた。細胞リセートの５０〜１００．ｃｏｇを、変性化ポリアクリルアミドゲル゛（１２，５％）上に与え、前述したように電気泳動に付した。蛋白質を、前述したようにニトロセルロースシートに電気泳動的に移した。ニトロセルロースプロットを、非特異的結合の減少のためにＢＬＯＴＴＯ中で４ ℃で一夜のインキュベーションの前に、アミドプラック中で着色した。ニトロセルロースストリップを、１０ｍ　Ｉ　ＢＬＯＴＴＯの最終濃度で抗ペプチド抗体の１　：　３５０希釈で室温で３時間インキュベートした。ストリップを、１℃ ％！ラベルした黄色ブドウ球菌蛋白質Ａ　（１０”　ｃｐｓ　／１０ｍｍりで１時間インキュベーションの前に、ＢＬＯＴＴＯ中で洗った。ストリップを上述のように洗い、水ですすぎ、乾燥し、そしてオートラジオグラフを得た。ポリペプチドでのブロッキングを実施する場合、抗血清を、ニトロセルロースストリップでのインキュベーションの前に、４℃で一夜又は３７℃で２時間１００μｇのポリペプチド溶液でブレインキュベートした０分子量は、低分子量標準（ＢｉｏＲａｄ）に基いたが、これらを図の左余白に示す。レーン１及び３は、各々、抗ポリペプチド９９及び抗ポリペプチド１４２抗体と反応された。レーン２及び４は、各々、ボ・リペプチド９９で又はポリペプチド１４２でブレインキュベートされたこれら同じ抗体と反応された。レーン５及び６は、各々、抗ポリペプチド９９及び１４２抗体と対照細胞リセートとの反応を示す。本発明は、いくつかの利益及び利点を持つ、これら利益の一つは、第一に任意の細胞におけるＨＢｘＡｇの存在が検出されることである。他の利益は、本発明が慢性的にＢ型肝炎感染された宿主動物におけるＨＢｘＡｇの存在を検出する評価法及び系を与えることである。更に別の利益は、本発明の使用がヒト肝臓点から導かれた細胞におけるＨＢｘＡｇの検出を可能にし、それによりＢ型ウィルスとこの形の癌の間の予想された関連を確かにしたことである。本発明の利点の一つは、それがＨＢｘＡｇをコードする遺伝子をクローニングする手段を与えることである。本発明の別の利点は、それが、ヒトの証清中に存在するＨＢｘＡｇに対する抗体（抗Ｘ抗体）の存在についての診断評価における抗原として用いられうるＲＢｘＡｇの実質的ポリペプチド部分を発現するための手段を提供することである。本発明のさらに別の利点は、ＨＢｘＡｇならびにＨＢｘＡｇと抗原決定基を同じくするポリペプチドと免疫反応する抗体を作るために用いられうるＨＢｘＡｇの抗原決定基の配列に対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの製造である。本発明の別の利益及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から当業者には明らかであろう。本発明の詳細な説明定　義トランスフェクション；これは、真核細胞への加えられたＤＮＡの組込みによる新しい遺伝子マーカーの獲得である。形質転換：これは、原核細胞への加えられたＤＮＡの組込みによる新しい遺伝子マーカーの獲得である。クローニングベクター：これは、その中に異種Ｄ　Ｎ　Ａ、が挿入されてクローンされるべき任意のプラスミド又はウィルスである。プラスミド：これは、独自自己複製する余剰染色体環状ＤＮＡである。オープン読み枠：これは、蛋白質へと（潜在的に）翻訳できるＤＮＡ配列である。ヘルパーウィルス：これは、欠陥ウィルスに存在しない機能を備えるウィルスであり、欠陥ウィルスが混合感染の間に感染サイクルを完了することを可能にする。遺伝子（シストロン）：これは、ポリペプチド鎖を産生ずるのに関与するＤＮＡのセグメントである；これはコード領域に先立つ及び続く領域（リーダー及びトレーラ−）ならびに個々のコードセグメント（エキソ刈の間の介在配列（イントロン）を含む。発現：ポリペプチドを作るために構造遺伝子により行なわれるプロセス。これは、転写と翻訳の組合せである。クローン：これは、単一の先祖細胞又は分子を持つ多数の同一の細胞又は分子を意味する。塩基対（ｂｐ）　：これは、ＤＮＡ二本鎖ヘリックスにおけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の対である。発現ベクター：これは、その中に異種ＤＮＡが挿入されうる又は発現されうるプラスミド又はウィルスである。下流；これは、発現の方向に前進する配列を示す；たとえば遺伝子のためのポリペプチドコード領域は、開始コドンから下流にある。Ａ４一般的検討Ｂ型肝炎ウィルス）（ＢＶゲノムの領域Ｘがなかんず（興味がある。なぜなら、最近の証拠は、それの発現の可能性を示し、伝統的ＨＢＶ血清学はその蛋白質生成物又はそのような生成物に対する抗体を見い出していなかったからである。最近開発された組換えＤＮＡ及び合成ポリペプチド技術が、ｌＢＸＡｇの発現に関する伝統的手法が出会ったいくつかの失敗を克服するため、及びヒト肝臓点から誘導されたｍｍ系統からの細胞における及び慢性的＋１８Ｖ感染を持つチノパンツー及びヒトからの肝臓細胞におけるＨＢｘＡｇの発現を例示するために本明細書で用いられる。このために、本発明は、ＨＢｘＡｇのためのクローニング及び発現ベクター、ＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応する及びポリペプチドならびにＨＢｘＡｇ又はこれの本質的部分に結合する合成ポリペプチドに対して生じられた抗体に対応する合成ポリペプチド、ならびにＨＢｘＡｇの存在に対する評価を考慮する。本明細書で検討するクローニング−ベクターはなかんずく、ＨＢχｎ５の含有遺伝子の有用な量を作るために用いられる。そしてこの遺伝子はなかんずく、Ｂ型肝炎病自体の研究に用いられうる多量のＨＢｘＡｇ及びそのポリペプチドフラグメントを作るために用いうる。本発明の新規な合成ポリペプチドはなかんず＜　、ＨＢｘＡｇ及びその本質的ポリペプチド部分と免疫反応するならびに合成ポリペプチド自体と免疫反応する抗体を作る抗原として有用である。そのように作られた抗体はその後、感染された動物宿主細胞又は＆ｌ織埼養物中におけるＩ（ＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド部分の存在を評価するために用いうる。発現ベクターは、細胞をトランスフェクトし、ＨＢｘＡｇの実質的部分を含むポリペプチドの発現を誘発するために用いうる０発現されたポリペプチドは次に、体サンプルにおけるＨＢｘ＾ｇに対する抗体の存在を決める評価において抗原として用いうる。本発明の発現ベクター及び抗体はまた、発現ベクターを含みかつ更にその存在の確認が比較的困難な追加的な結合された遺伝子を含むトランスフェクトされた細胞のためのマーカーとして用いうる。すなわち、後述の５ＶＨＢＶ−３と呼ばれる発現ベクターが開かれ、そして評価が比較的困難な蛋白質をコードする別の異種遺伝子に結合されうる。再環化、このように形成された新しいベクターによる適当な細胞の感染及び単一細胞コロニーへとブレーティングした後に、新しいベクターを組込まれたこれら細胞は、本発明の抗体を用いて、異種遺伝子によりコードされる蛋白質に融合されたＨＢｘＡｇのベクターでコードされる部分の発現によって同定されうる。そのようなマーカーは、ベクターが真核細胞中で発現されることが望まれる場合；すなわちｐＢＲ３２２のようなバクテリア細胞ベクター中に存在する薬品耐性マーカーが存在しない場合に特に有用であることができる。１、　クローニングベクターＨＢｘＡｇ遺伝子を含む本発明の組換１）ＮＡは、たとえばＨＢＶＤＮＡの一部をクローニングすることにより作ることができる。ＨＢ　Ｖゲノム物質を得るために、一本鎖部分を含むゾーン粒子ＤＮＡが、ウィルスの内在ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより完全に二本鎖のＤＮＡに転化される。このようにして得た環状の二本鎖ＨＢＶは、二つのＢａｎ　ＨＥエンドヌクレアーゼ制限部位を含む＊　Ｂａｓ　ＨＩによる開裂は、典型的には、サイズにより分類される三種の線形生成物を与える。最大のものは、唯一つのＢａｇ　Ｈ１部位で開裂される全ＨＢＶゲノムを表わす３２００塩基対（ｂｐ）フラグメントである。ＨＢＶが両Ｂａ＋＊　Ｈ１部位で開裂されるときｔａｓｏｂｐ及び１３５０ｂｐを含むフラグメントが、作られる。ガリバート（Ｇａ１ｉｂｅｒｔ　）　ら、（１９７９）、ネイチア、２８１：６４６−６５０、のＨＢＶヌクレオチド配列の分析は、１８５０　ｂｐ　ＨＢＶ　Ｂａｓ＋ＨＩフラグメントがＨＢｘＡｇをコードする遺伝子を含むことを明らかにする。しかし三つのフラグメントの総てが、ＢａＩＩＨＩ相補性末端を持ち、従ってクローニングプラスミドのＢａＩＩＨ１部位中に挿入されうる。プラスミドｐＢＲ３２２は、第３図の検討から判るように、そのテトラサイクリン耐性投与遺伝子内に位置される単一のＲａｍ　ＨＩ制限部位を持つ、　Ｂａｇ　ＨＴによるｐＢＲ３２２ＤＮＡの開裂は、三つのＢａｍＨＩ　ＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントの各々に相補性末端を持つ単一の線形フラグメントを与える。三つのＢａｍＨＩ　ＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントの各々をＴ４ＤＮＡリガーゼでｐＢＲ３２２中にそのＢａｇ　ＨＴ部位でリゲートして修復し、プラスミドを環化すると、三つのユニーク組換えプラスミドＤＮＡが得られる６組換えクローニングプラスミドは、環状ＤＮＡであり、ＡＭ７　（ｐＢＲ３２２のＢａｇ　ＨＥ部位に挿入された１３５０　ｂｐＢａｓ　Ｈｒ　ＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントを持つｐＢＲ３２２ＤＮＡを含む）；ＡＭ６　（ｐＢＲ３２２のＲａｍ　Ｈ１部位に挿入された全ＨＢＶゲノムを持つｐＢ１１３２２　ＤＮＡを含む）　；及びＡＭＩ　（ｐＢＲ３２２のＲａｍ　Ｈ１部位に挿入されたＨＢｘＡｇ遺伝子を含む１８５０　ｂ９　Ｒａｍ　ＨＩＨＢＶ　ＤＮＡ７ラグメントを持つｐＢＲ３２２ＤＮＡを含む）と呼ばれる。ＢａｍＨＩ　ＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントがＴ４ＤＮＡリガーゼでｐＢＲＢａｍＨ１部位中にリゲートされるとき、そのように発生された組換えプラスミドはテトラサイタリン耐性を授ける能力をもはや持たない、それにより、アンピシリン耐性かつテトラサイクリン感受性の形質転換体が、上述のリゲーシタン生成物で形質転換された大腸菌株ＨＢＩＯＩのコロニーから選択された。組換えプラスミドＡＭＩ、ＡＭ６及びＡＭ７で形質転換された大腸菌ＨＢＩＯＩの三つの薬品選択された株は、各々ＥＣＡＭ１、ＥＣＡＭ６及びＥＣＡＭ７と呼ばれる。上のプラスミドは、上述の形質転換体を後述のように適当な培養基たとえばＬＢジブロス中増殖することによって、比較的大量に作られた。上述のプラスミドＡＭＩ及びＡＭ６から、ＨＢｓＡｇ遺伝子の全体又は部分を含む遺伝子フラグメントが、適当な制限酵素を用いて切除できる。たとえば、プラスミドＡＭＩ及びＡＭ６が制限酵素Ｒａｍ　ＨＩで消化されたとき、ｌＩＢｘＡｇをコードする遺伝子を含む１８５０ｂｐＤＮＡフラグメントが反応生成物から単離された０組換えプラスミド形質転換された大腸菌ＨＢ　１０１株ＥＣＡＭ６又はＥＣＡＭＩを増殖することにより、ＨＢｘＡｇをコードするＤＮＡ配列が比較的大量に得られる。ＤＮＡ塩基配列及びＨＢＶゲノム上の座が決定されたＨＢｘＡｇ遺伝子から、その中にイントロンが存在しないことが明らかである。このことは、遺伝子が、動物細胞ならびにバクテリア細胞におけるメツセンジャーＲＮＡとして表現型発現を結果するよう転写されうろことを意味する。２゜発現ベクターガネム（Ｇａｎｅｍ　）ら（１９７６）、ジャーナｌし　オプ　モレキュラー　バイオロジー、１０１：５７−８３、の方法により動物細胞たとえばアフリカグリーンモンキーの腎臓細胞中への　。適当な発現系によるＨＢｘＡｇ遺伝子の導入は、該細胞におけるＨＢｘＡｇ合成を結果しうる。さらに、適当な発現ベクターを持つＨＢｘＡｇ遺伝子を含むこれらモンキー腎臓細胞の培養は、ＨＢｘＡｇの低コスト大量生産を可能にする。を利には、ＨＢｘＡｇ遺伝子を発現できる組換ＤＮＡが、その読み枠をシフトすることなく完全なＨＢｘＡｇ遺伝子又はそのフラグメントをＳＶ４０後期領域プロモーターから下流でシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）中に挿入することによって構築された。ＳＶ４０後期領域プロモーターを用いる発現のためのベクターは、下記の方法で大量に作られた。５Ｖ４０ＤＮＡ及びｐＢＲ３２２ＤＮＡが、ＢａＩＩＨＩ及びＥｃｏ　Ｒに重制限酵素消化に付された。比較的大きなＳＶ４０及びｐＢＲ３２２フラグメントは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてリゲートされた。リゲーション生成物はＲａｍ　ＨＩ消化に付されて、Ｂａｇ　ＨＩ粘性末端を持つ線形ＤＮＡを形成した。１８５゜ｂｐ　Ｂａ５ＨＩ　ＨＢＶ　ＤＮＡを持つコのＳＶ４０／ｐＢＲ３２２ＤＮＡのリゲーションは、ＳＶＡＭ１９１と呼ばれる環状組換えプラスミドを結果した。組換えＤＮＡ　ＳＶＡＭ１９１は、完全な大腸菌アンピシリン耐性遺伝子を含む、ＳＶＡＭＩ　９１で形質転換された大腸菌ＨＢＩＯＩは、アンピシリン耐性かつテトラサイクリン感受性であり、従って薬品感受性に基づいて選択できる。ＳＶＡＭ１９１で形質転換された大腸菌ＨＢＩＯＩは、ＥＣ−３ＥＣ−３ＶＡと呼ばれ、適当な培養基たとえばアンピシリンを含むＬＢジブロス中増殖でき、それにより該プラスミドの比較的大量が得られる。３、細胞培養このようにして得た組換えＤＮＡプラスミドＡＭＩ、ＡＭ６及びＳＶＡＭ１９° ｌによる宿主細胞の形質転換は、公知の方法〔コーエン（Ｃｏｈｅｎ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ。６９１１１０−２１１４　（１９７２））又はその変法により行える。宿主細胞としてはなかんずく、大腸菌、枯草菌及び酵母のような微生物が挙げられ、好ましくは２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ２７３２５）又はＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１４４７）と呼ばれる株のような大腸菌株である。大腸菌株ＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４）は、特に好ましい宿主細胞系統である。ＨＢｘＡｇ遺伝子を含む新規な組換えプラスミドＤＮＡを有する細胞株の単離は、たとえば下記の手法を含む公知法により達成できる。部分的にのみ二本鎖であるゾーン粒子ＤＮＡは、内在ＤＮＡポリメラーゼ反応を用いて２Ｈ含有αＮＴＰを一本鎖部分に入れる（　ｆｉｌｌ　ｉｎ　）ことによって放射活性にラベルできる。ロビンソン（１９７５）、Ａｓ＋、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、、２７０：１５１−１５９、その後、ラベルされた生成物をブローベとして用いて、先に得た薬品選択された形質転換体のうちから、公知のサザーンブロフト　ハイブリダイゼーション法〔サザーン（１９７５）、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８　：　５０３　）又は公知のコロニー　ハイブリダイゼーション法〔グルンスティン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　）ら（１９７５）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７２　：　３９６１−３９６５）によって、陽性クローンが摘出されうる。形質転換され、この方法で単離された宿主細胞は、公知の培養基で増殖される。培養基は、たとえばＬＢブロス、ペナセイブロス、又はグルコースとカサミノ酸を含むＭ９培養基〔ミラー　（Ｍｉｌｌｅｒ　）　、イクスペリメンツ　イン　モレキュラー　ジエネティクス、４３１−４３３　（コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−、ニューヨーク、１９７２））であることができる。培養は一般に、１５〜４３℃、好ましくは２８〜４０℃で、２〜２４時間、好ましくは４〜１６時間、もし必要なら空気吹き込み及び／又は攪拌下に行われる。培養後に、バクテリア細胞を集め、細胞を緩衝液に懸濁し、たとえばリゾチームにより分解し、凍結−解凍又は超音波処理する。　ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子は、得られた遠心分離上澄みから、続く細胞分解からのＤＮＡ精製のために一般に知られた方法により単離できる。真核細胞においてＨＢｘＡｇを発現するためのベクターを作るために、ｐＢＲ３２２，ｔｌＪジ：＃）ＤＮＡ（７）総てを含むＳｖＡＭｌ　９１　ＤＮＡ＋７）一部が除去される。コノコとは、ＳＶＡＭ１９１をＨｏｅ　１１制限酵素消化に付すことによって達成された。　Ｈａｅ　ＩＴＳＶＡＭＩ　９　］消化生成物の比較的大きなものが環化されたとき、動物細胞中でＨＢｘＡｇを発現できる５ＶＨＢＶ−３と呼ばれるベクターが形成された。哺乳類細胞宿主は、発現系を作るために公知の方法により５ＶＨＢＶ−３によりトランスフェクトされうる。たとえば、５ＶＨＢＶ−３は、制限酵素器ｎｄｌ［Ｉで開裂されるとき、ＣＯ５−７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）中に挿入されうる。〔グルラマン（Ｇｌｕｚｍａｎ　）　（１９８１）−セル、２３：１７５−　］、　８２　；シブイクイ（５ｉｄｄｉｑｕｉ　）　（１９８３）　、Ｍｏ１．　ａｎｄＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　、　３　：　１４３−１４６、を参照されたい、〕また５ＶＨＢＶ−３は、ウシ乳頭腫ウィルス中に挿入でき、それによりマウス細胞系統をトランスフェクトするために用いられうる。より好ましくは、５ＶＨＢＶ−３は、アフリカグリーンモンキー腎臓細胞系統Ｂ５Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）をトランスフェクトするためにＳＶ４０ｔｓＡｚｉｗヘルパーウィルス共に用いられる。そのようにトランスフェクトされるとき、Ｂ　Ｓ　Ｃ−１細胞は、ＨＢｘＡｇ抗原決定基を含むポリペプチドを作つた・クローニング又は発現ビヒクルの選択された制限部位に挿入されたヌクレオチド配列又は遺伝子フラグメントは望む蛋白質のための実際の遺伝子の一部でないヌクレオチドを含みうろこと又はその遺伝子のただフラグメントのみを含みうろことが理解されなければならない、すなわち、遺伝子コードにおける公知の冗長性の故に、挿入される遺伝子がここで述べるＨＢｘＡｇの遺伝子と同じである必要はなく　、ＲＢｘＡｇをコードすることのみが必要なことである。加えて、ＨＢｘＡｇをコードするＤＮＡ配列は１．読み枠が変らない限りで、ＨＢｘＡｇをコードする配列の３′末端及び５′末端の一方又は両者に追加的塩基を含みうる。云いかえればいかなるＤＮＡ配列が挿入されようとも、本発明は、形質転換された又はトランスフェクトされた宿主がＨＢｘＡｇをコードするＤＮＡ、蛋白質ＨＢｘＡｇ　、又は８ＢｘＡｇ蛋白質の実質的部分を含むポリペプチドを作ることのみを要求する。４゜　ポリペプチド、抗原及び抗体後述のように、ＨＢｘＡｇの発現は、そのアミノ酸残基配列がＨＢｘＡｇの抗原決定基のアミノ残基配列に対応するところの合成ポリペプチドにより誘発された抗体を用いて検出できる０本発明のポリペプチドは典型的には、約６〜約４０のアミノ酸残基を含む、より好ましくは、これらポリペプチドは、約１０〜約２０のアミノ酸残基を含む。下記及び第６図に示す、９９．１００及び１４２と名付けられた合成ポリペプチドのアミノ酸残基配列は、ガリバートら（前出）により述べられるようにＨＢＶヌクレオチド配列から決定された。ポリペプチド９９　：　Ｌｅａ−５ｅｒ−＾１ａ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ　。ポリペプチド］、　ＯＯ：　Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ −Ｇｌｕ−ＧＬｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−［１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ −Ｌｙｓ−Ｖａｌ　％及びポリペプチド］　４２　：　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ −Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａここでアミノ酸残基配列の各々は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に示されている。各々ポリペプチド９９及び１００のカルボキシ及びアミノ末端システィン残基の不存在の点を除いてはポリペプチド９９及び１００の配列にアミノ酸残基配列において対応するポリペプチドもここで有用であり、本発明の一部と考えられる。ポリペプチド９９ｂと１００ｂと呼ばれるそのようなポリペプチドは、そのアミノ又はカルボキシ末端残基により担体へ結合されるとき免疫原として有用であり、また第７．８及び１ｅ図の一部で示されかつ後述するのと同様の免疫反応ブロック研究において用いろる。ポリペプチド９９ｂ及び１００ｂのアミノ酸残基配列は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に下記の式により示される。ポリペプチド９９　ｂ　：　Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ −Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ　。ポリペプチド１°ＯＯｂ　：　Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−ＧＬｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ　。ａ、）ランスフエクトされた細胞中のＸ蛋白質複合体としてキイホールリンペットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）担体に結合されたポリペプチド９９．１００又は１４２により免疫化されたラビットは、抗体（各々抗９９、抗１００及び抗１４２）を作り、これらは５ＶＨＢＶ−３によりトランスフェクトされたＢ２Ｏ−１細胞中で発現されたＨＢｘＡｇポリペプチドと免疫反応し、それによりこれら又は任意の細胞におけるＨＢｘＡｇポリペプチドの発現を初めて実証した。これら抗ポリペプチド抗体は、トランスフェクトされていないＢ２Ｏ−１細胞すなわち野性型（ｗｔ）ＳＶ４０で感染された細胞中に見られるどのポリペプチドとも免疫反応しなかった。また、ＨＢｘＡｇポリペプチドを発現した抗ポリペプチド抗体の免疫反応性は、抗体とそれらの相補的（対応する）ポリペプチドすなわちそれらが生じられた相手であるポリペプチド抗原とのブレインキュベーションによって禁止された即ちプロ、りされた、このブロッキングは、抗体が、ＨＢｘＡｇであると予告されるポリペプチドの抗原決定基を特異的に認識したこと、及び合成ポリペプチドが、予告されたＨＢｘＡｇ蛋白質の抗原決定基にアミノ酸残基配列において対応したことを示す。これらのプロフキング結果は、ウェスターンプロット法（材料及び方法の部）及び続く　Ｉ！ＳＩラベルした黄色ブドウ球菌蛋白ｉＡによる結合された抗体の位置決め及び続く評価のオートラジオグラフ現像によって得られた。これら結果は、ポリペプチド９９及び１４２に対する抗血清について第１０図に示される。第１０図のレーン１は、抗９９と、５ＶＨＢＶ−３惑染細胞リセートとの免疫反応を示し、一方、レーン２はポリペプチド９９での抗血清のブレインキュベーションによるこの免疫反応のブロックを示す、同様に、抗１４２はレーン３において細胞リセート蛋白質と免疫反応し、この免疫反応はポリペプチド１４２でのこの抗血清のブレインキュベーションによりブロックされた。レーン５と６は、対照細胞からのリセートとの免疫反応が起きなかったことを示す。第１０図に示されるようにポリペプチド９９及び１４２に対する抗血清により特異的に同定された５ＶＨＢＶ−３）ランスフェクトされた細胞のポリペプチド発現生成物は、約２４．０００ダルトンの分子量を持った。後述のように、約２８．０００ダルトンの分子量を持つポリペプチドが、ヒト肝癌由来細胞系統ＰＬＣ／ＰＲＦ１５からのリモート中で同定された。二つの細胞系統により発現されたポリペプチド（蛋白質）における分子量の違いは、発現されたポリペプチドが別の蛋白質又はポリペプチドとのＸ蛋白質の融合から得られるという事実による。すなわち、すでに述べたように５ＶＨＢＶ−３は、完全なＸをコードするゲノムの一部を欠く、第６図は、５ＶＨＢＶ−３に含まれるＸ遺伝子の一部がメチオニン開始コドン＾ＴＧを含むと推定されるＸ蛋白質の初めの２２のアミノ酸残基のためのコドンを含まないことを示している。従って、５ＶＨＢＶ−３によりトランスフェクトされた細胞により発現されたポリペプチドは、ベクター中に存在す、るＳＶ４０構造蛋白質ＶＰ２配列との融合生成物であろうことが予言された。融合蛋白ｔ（ポリペプチド）の予言されたサイズは、２４．５００ダルトと予言された。約２４，０００ダルトンの分子量を持つ発現されたポリペプチドの発見は、この予言と一致する。２８．ＯＯＯダルトン融合蛋白質（ポリペプチド）は、下で検討される。ｂ、肝臓癌細胞において発現されたＸ蛋白質ＢＨｘＡｇの発現はまた、いくつかのＨＢＶ疾病状態の機能であると考えられる。たとえば、ポリペプチド９９に対する抗体（抗９９）は、ヒト肝臓癌由来細胞系統Ｐ　Ｌ　Ｃ／Ｐ　ＲＦ１５　（ＡＴＣＣＣＲＬ８０２４）で発現された２８，０００ダルトン蛋白質を特異的に認識した。正常なラビットの血清は、この蛋白質を認識せず、抗９９認識はポリペプチド９９でのブレインキュベーションによりブロックされた。この細胞系統は、組込まれたＨＢＶ　ＤＮＡを含むと知られる。チャクラパテ４　（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ　）ら、（１９８０）、ネイチア、２８６：５３１−５３３、エドマン（Ｅｄｍａｎ　）ら、（１９８０）、ネイチア、２８６　：　５３５−５３８、及びマリオン（Ｍａｒｉｏｎ　）ら、　（１９８０）、Ｖｉｒｏｌ、、３３ニア９５　８０６．［ｌＢｓＡｇがこの腎臓癌細胞系統において検出され〔マリオン（ＭｃＮａｂ　）ら、（１９７６）、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ　）　、　３４　：　５０９−５ｔＳ、及びアゾンら、（１９７９）、ネイチア、２８２：６１５−６１６）、一方、ＨＢｅＡｇ及びｌｌＢｅＡｇのための総ての標準的評価は陰性であった。ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣＣＣＬ２３）と呼ばれる細胞系統はまた、ヒト肝臓細胞系統であるが、しかし組込まれたＨＢＶ　ＤＮＡ配列を含まない、アゾンら（前出）。これらの結果は、ｐ　Ｌｃ／ｐＲＦ１５細胞蛋白質を放射能ラベルし、抗９９及び黄色ブドウ球ｍ！白質Ａを用いて繰返し免疫沈降させ、そして回収された沈降物の電気泳動によって得られた。２８．０００ダルトン蛋白質が次に、オートラジオグラフィにより同定された。この手順はまた、材料及び方法の部でも述べられる。ＰＬＣ／ＰＲＦ１５及びＨｅｐＧ　２細胞からのリセートを用いる同様の研究からの結果を第７図に示す、第７図は、２８，０００ダルトンのＸ特異的蛋白質がＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞（レーン５）において検出されたことを示す。免疫反応性は、抗体がポリペプチド９９でブレインキュベートされたとき（レーン６）失われ、しかし関連ないポリペプチドでブレインキュベートされたとき（レーン７）は失われない。対照ＨｅｐＧ　２　’Ｊセード（レーン１〜４）では、Ｘ特異的反応性は検出されなかった。これらの結果は、Ｘ遺伝子生成物が、組込まれたＨＢＶ　ＤＮＡ配列を含む肝臓癌細胞系統において発現されることを確認した。Ｃ１肝臓細胞におけるＸ蛋白質発現また、ＨＢＶ感染の履歴あり又はなしの、ヒト及びチンパンジーからの四つの肝臓サンプルが、抗Ｘポリペプチド抗体を用いるＸ関連蛋白質の存在についてのウェスターンプロット評価において検査された。これら検査の結果を第８図に示す。一つのヒトサンプル（Ｈ）は、慢性的にＨＢＶ惑染感染た肝臓癌肝臓からであり、他は急性相ＨＢＶ感染（Ｈ）からであった。非感染チンパンジー（Ｃ）及びＨＢＶで慢性的に感染されたもの（Ｃ）がともに、抗Ｘポリペプチド抗体に対して反応する肝臓細胞リセートを得るために用いられた。抗９９抗体は、４５，０００及び２８，０００（左余白矢印、右余白ｐ２８）ダルトン蛋白質の両者に対して反応した。再反応性とも、これら抗体がポリペプチド９９でブレインキュベートされたとき、ブロックされた。抗１４２抗体がこれら同じ細胞リセートに対して反応したとき、４０．０００　（ｐ４０）、２８．０００　（ｐ　２８）及び１７．ＯＯＯ（ｐ　１７）の特異的バンンドが検出された。これら蛋白質に対する反応性は、それらが、抗１４２抗体がポリペプチド１４２でブレインキュベートされるとき、除かれるので、特異的であると考えられる。対照サンプル、即ち感染されていないチンパンジー肝臓（総てのパネルのレーン３）は、抗９９の抗体での約４５．ｏｏ。ダルトン蛋白質（ｐ４５）、及び抗１４２抗体でのｐ４０及びｐ１７を示した。蛋白質２８は、ＨＢＶ感染された組織でのみ発現された（レーン細胞（レーン５））、免疫反応性は、抗体がポリペプチド９９　（レーン６）でブレインキュベートされたとき失われたが、関連ないポリペプチドでは失われない（レーン７）、免疫前血清対照は、免疫反応しなかった（レーン８）。対照ＨａｐＧ　２リセート（レーン１〜４）中でＸ特異的反応性が検出されなかった。これら結果は、Ｘ遺伝子生成物が、組込まれたＨＢＶ　ＤＮＡ配列を含むヒト肝臓細胞系統において発現されることをＶｆ！認した。４５．０００ダルトン蛋白質の存在は、第７図に示すＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞からのリモート中にも比較的少量で観察された。抗９９抗体と４５，０００ダルトン蛋白質の間の免疫反応はまた、免疫化ポリペプチド９９による抗体のブレインキュベーションによりブロックされた。これは、第７図のレーン６に示される。正常なヒト肝臓細胞抽出物（ＨＢＶ血清陰性）は、抗９９を用いるウェスターンプロット評価において４５，０００ダルトン蛋白質のみを発現することが見い出された。また、ＨＢｓ、ＨＢｃ　、及びＨＢｅに対して生じた市販入手できる抗体（アボット　ラボラトリーズ、）・−ス　シカゴ、イリノイ）を用いて行われた対照評価は、本発明の抗体により位置決めされるどの蛋白質をも同定するのに失敗した。この証拠はやはり、４５．０００ダルトン蛋白質がＨＢｘＡｇに相同な抗原決定基を持・つこと、しかし抗９９で認識された２８，０００ダルトン蛋白質はＨＢＶ疾病状態に特異的であり、ＨＢｓＡｇ　、　ｌｌＢｅＡｇ及びＨＢｃＡｇとは異なることを示唆する。ｄ５肝’ｆｉａｍ胞中のＸ遺伝子ＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞における９２８の発現は、化工ＤＮＡ中に組込まれたＨＢＶ　ＤＮＡからであった。これが、Ｘ蛋白質が発現されうる唯一の方法であったことを知ることは興味深かった。従って、Ｘ蛋白質を示すこれらチノパンツー及びヒト肝臓ＤＮＡを、ＨＢＶ　ＤＮＡでブローへしたく第９図）、全ＤＮＡを、第８図に示される肝臓組織から単離し、１（Ｂ　Ｖ　−ＤＮＡ配列の存在について分析した。２８．０００ダルトン蛋白質を含むチンパンジーからのＤＮＡは、ＢａｍＨＩ　、ＲｃｏＲＩで開裂されるとき又は消化されないとき（第９図、各々レーンＪ、２及び３）相同なバンドを現わしたａ　Ｒａｍ　ＨＩは、環状のＨＢＶ　ＤＮＡを二つのフラグメントに開裂しく　１８５０及び１３５０ｂｐ）、５．８　ｋｂでのバンド（レーン１）は、ゲノムサイズより大きな組込まれた配列を示す。高分子量ＤＮＡバンドより下にバンドは見られないので（レーン３）、ＨＢＶの組込まれた配列のみがこのＤＮＡ中に存在すると結論される。また、ｌ（ＢｃＡｇ陽性ヒト肝臓からのＤＮＡが調製され、ＨＢＶＤＮＡでブローベされた。　＋１ｉｎｄＩＩ、　Ｂａｇ　ＨＩ　、Ｅｃｏ　ＲＩによる制限酵素開裂又は未消化ＤＮＡは（各々、第９図のレーン７〜１．０）は、ゲノムサイズと同じ又はより小さい相互の配列を現わし、それによりこれらヒトＤＮＡサンプルが組込まれた配列を含むことの何らかの証拠を除去する。２８．０Ｏ０ダルトン蛋白質を欠くチノパンツー及びヒト肝５ｙｉｉ＋ままた一ＨＢＶ’　ＤＮＡ配列に対して陰性でありだ（第９図、レーン４〜６及び１１〜１４）。第９図に示すデータ番よ、Ｘ蛋白質がＨＢＶゲノムの状態に無関係にＨＢＶ感染した組織におし）で発現されることを確認し、従って、Ｘ発現のための１（ＢＶＤＮＡ組込みの前提条件を除去する。ｅ、結果のまとめ上述の結果は、ＨＢＶ惑染感染ヒト及びチンツインジー肝臓組織における従来同定されていなし）、ウィルスでコードされる蛋白質の存在を示す、この２８，０００り゛ルトン蛋白質（ｐ２８）は、それが染色体外の形で遊離に存在する力１又番よ細胞ＤＮＡ中に集積されて見い出されるかに拘らず、Ｉ（ＢＶゲノムによりコードされる。２８．０００ダルトン蛋白質（ｐ　２　Ｂ）しよ、Ｘ？＋ＪＩ域の華独の生成物でなく、さらにＨＢＶ配列を含む。ギルノイートら（前出）により報告された配列に基づくＸ蛋白質の予測されるサイズ（よ約１７，０００ダルトン（第６図）である。し力）し、ＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞ならびにチン！ぐンジー及びヒトｎＢＶ感染された組織において抗Ｘペプチド抗体により検出されたＸ蛋白質の分子量は、２８，０００ダルトンである。サイズの食し１違し）番よ、Ｘ遺伝子と細胞配列との融合によるので番よなし）。なぜなら、ｐ２８を発現するヒト組織における組込まれた　ＨＢＶ　ＤＮＡの欠除（第９図、レーン７〜１０）は、Ｘ蛋白ｆ（ｐ２８）力＜）ＩＢＶゲノムのみから翻訳されることを示す力）らである。Ｘ蛋白質のサイズの増大は、もし蛋白質がＨＢｓＡｇ　−Ｘ又（まＸ−ｔｌＢｃＡｇ融合であれば説明できる。そのような融合の可能性番よ、ゲノム上でのこれらＨＢＶ遺伝子相互の近さによって示唆されＲＮＡレベルでのそのような融合の存在を確かめようとする試みは、χ配列を含むと判ったＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞において得られた転写物（トランスクリプト）がまた表面又はコア配列ならびにＸを示す（データは省略）という事実の故に不成功であった。同様の結果がボウ（Ｇｏｕｇｈ）　、　（１９８３）、Ｊ、　Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ、、１．６５：６８３−６９９、により報告されている。Ｘ−コア融合の証拠は、ヘパドナウィルス族の別の一員、アヒルＢ型肝炎ウィルス（Ｄ　ＨＢ　Ｖ）のＤＮＡ配列（そこでは両遺伝子は、単一蛋白質として翻訳される〔マンダート（Ｍａｎｄａｒｔ）ら（１９８４）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、４９　：　７８２−７９２）から及びフェイテルソン（Ｆｅｉ　ｔｅｌｓｏｎ）　ら、　（１９８２）　、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、。４３　：　６８７−６９６、の研究から得られる。ＨＢ　ＶのＸ　％ｌ域が発現されるという事実が確認された。しかし、この遺伝子生成物の機能は未知である。Ｘ領域の翻訳生成物であると示唆された蛋白質分子は、ＨＢＶゲノムと関連すると見い出され、又はより詳しくはＬ鎖の５′ニツク（ｎｉｃｋ）に共存結合される〔ゲルリンチ（Ｇｅｒｌｉｃｈ）ら、（１９８０）、セル、２１：８０１−８０９）、ＤＮＡ結合蛋白質を表わすＸ蛋白質のアイデアは、ＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞又はＨＢＶ感染した組織のＤＮＡアーゼ処理がｐ２８活性を除去する又は変えることに失敗した（データは省略）ときに排除された。現在、ＨＢＶ感染の生物学又はＨＢＶ怒染及び続く肝細胞癌腫の開始の間の関連に関してはほとんど知られていない。この目的のために、ＨＢＶ感染のための又はＨＢＶ配列の存在のための何らかの付加的マーカーは、極めて重要である。ヒト血清は現在、抗Ｘ抗体及びＸ蛋白質の存在について検査されている。本明細書及び請求の範囲において、「対応する」という言葉が、種々の文法形で、ポリペプチド配列に関連して、記述されるポリペプチド配列±（アミノ及びカルボキシ末端の一方又は両方における三つまでのアミノ酸残基）及びポリペプチド配列に沿う特定のアミノ酸残基における保守的置換のみの含有を意味して用いられる。上述で用いられたような「保守的置換」という言葉は、一つのアミノ酸残基が別の生物学的に類似の残基により置き代えられていることを意味するために用いられる。保守的置換の例としては、Ｉｌｅ、Ｖａｔ、Ｌｅｕ又はＭｅｔのような疏水性残基同志の置換、又はＡｒｇとＬｙｓ、　ＧｌｕとＡｓｐ又はＧｌｎとＡｓｎ等々のような掻性基間の置換があげられる。いくつかの例では、一つのイオン性残基を反対に＠電されたイオン残基により置換すること、たとえばＡｓｐのＬｙｓによる置換が、これらイオン性基が華に溶解性補助を与えるだけであると考えられて保守的と呼ばれてきた。しかし一般に、本明細書で述べる置換が全蛋白質に比べて比較的短い合成ポリペプチド抗体上でのことであるので、イオン性残基を反対電荷の別のイオン性残基で置換することは、非イ・オン性残基とイオン性残基の間の置換、及び嵩ぼった残基たとえばＰｈｅ、　Ｔｙｒ又はＴｒｐと嵩ぼらない残基Ｇｌｙ、　Ｉｌｅ　及びνａ１の間の置換と同様に「根本的置換」であると考えられる。「非イオン性」及び「イオン性」残基という言葉は、生理学的ｐＨ値で、各々、電荷を通常持たない又は電荷を通常持つアミノ酸残基を指す通常の意味で用いられる。非イオン性残基の例としては、Ｔｈｒ及びＧｉｎが挙げられ、イオン性残基の例としてはＡｒｇ及びＡｓｐが挙げられる。「抗原」という言葉は歴史的に、抗体により結合されるものを指すため、及び抗体の生産を誘発するものを指すために用いられてきた。より最近の用法は、抗原の意味を抗体により結合されるものに限定し、一方、「免疫原」という言葉が抗体生産を誘発するものに対して用いられる。いくつかの例では、抗原と免疫原は同じものであり、たとえば合成ポリペプチドが、このポリペプチドに結合する抗体の生産を誘発するために用いられる場合である。しかし、同じポリペプチド（９９１，１００又はｔ　４２　）が全蛋白質たとえはＨＢｘＡｇに結合する抗体をも誘発し、この場合にポリペプチドは免疫原かつ抗原であり、一方、ＨＢｘＡｇは抗原である６本明細書で述べるものが免疫原的かつ抗原的である場合、それは一般には抗原と云われる。５、評価系及び方法上述の結果は、５ＶＨＢＶ−３が発現ベクターとして用いられうろことを示す、それは、ＨＢｘＡｇ遺伝子から下流で読み枠に挿入された異種ＤＮＡ配列のための発現制御要素を与える。結果はまた、合成ポリペプチド９９．１００及び１４２、及びこれらに対するアンチペプチド抗体が、評価されるべき体サンプルたとえばＨＢｘＡｇを持つと疑われる動物宿主からの肝臓癌細胞又は肝ｘｍ胞におけるＨＢｘＡｇの存在を検出するための評価系又は方法の一部°として、５ＮＨＢＶ−３によるトランスフェクシヨンの成功を検出するため及び５ＮＨＢＶ−３が発現ベクターとして用いられるときに発現をモニターするために用いられることを示している。そのような系は、抗体、はぼ完全な抗体又は周知のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）を抗体部分のような抗体結合部位を含み、本発明の合成ポリペプチドと免疫反応できる即ち本発明の合成ポリペプチドに対して生じられた受容体分子を含む少くとも一つの第一の反応剤を含む、第一の反応剤の受容体と発現特異的ＨＢｘＡｇとの免疫反応をシグナルするための指示手段、たとえばフルオレセイン又はローダミンのような螢光染料、１−１２５又はＣ−】４のような放射性元素又は第一の反応剤の受容体に対して生じられた酵素結合抗体（たとえばペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラビットＩｇＧ）もまた備えられる。指示手段は当初、第一の剤と結合されていても又は別々になっていてもよい、そのようなＨＢｘＡｇ評価反応剤系の典型的使用としては、酵素結合免疫吸収評価（Ｅｌ、ｌ５Ａ）、ラジオイムノアッセイ及び免疫螢光７ンセイ　（ＩＦ＞が挙げられる。　本発明のポリペプチド及びその抗ポリペプチド抗体を利用する、体サンプル中の１ｌＲｘＡｌの存在を測定する診断評価は、すでに幅広く記述した。そのような診断評価の商業的実施ａ様では、診断評価系が考えられる。そのような系の一つは、第一の反応剤として抗９９又は抗１４２のような抗ポリペプチド受容体を持つ少くとも一つの容器を備える。それに対して抗ポリペプチド抗体が生じられたところのポリペプチドたとえばポリペプチド９９又は１４２のある量を持つ第二の容器もまた、第二の反応剤を備えるために提供されるであろう、上述の指示手段、−以上の緩衝剤及び他の周知のもの等を持つ別の追加的容器もまた、診断系に備えられうる。ＨＢｘＡｇの検出しうる量の存在を評価する方法はまた、上で幅広く記述した。ｆ！！単に云えば、この方法は、評価されるべき体サンプルたとえば肝臓癌細胞又は肝臓細胞からの蛋白質を、本発明の合成ポリペプチドと及びＨＢｘＡｇと免疫反応できる抗体結合部位を含む受容体たとえば抗９９又は抗１４２又はそのＦａｂ又はＦ（ａｂ’）を部分とを、ＨＢｘＡｇと受容体の間の免疫反応をシグナルする指示手段たとえば］−１２５ラベルした黄色ブドウ球菌蛋白質Ａ又は酵素ラベルたとえば上述の受容体の一つに結合されるホースラディツシュペルオキシダーゼの存在下で混合することを含む、この混合は、免疫反応が起ったことを指示手段がシグナルするのに十分な時間維持され、シグナルの存在はたとえばオートラジオグラムにより確認される。体サンプル又はそれからの蛋白質は好ましくは、受容体と混合される前に固体マトリックスたとえばニトロセルロースシート又はガラススライドに吸着又はさもなくば固定（結合）される。指示手段が独立した別途の分子たとえば放射能ラベルされた黄色ブドウ球菌蛋白質Ａである場合、結合された体サンプルと受容体分子はまず指示手段の不存在下で混合され、この混合は結合した免疫反応生成物の形成のために十分な時間維持される。次に、結合した免疫生成物がすすがれる。独立した分子である指示手段が次に、結合した免疫反応生成物と混合され、この混合は結合された第二の反応生成物が形成されるのに十分な時間維持される。結合された第二の反応生成物は次にすすがれ、指示手段からのシグナルの存在が確かめられる。指示手段が本発明の受容体の一部である場合、このラベルされた受容体は、評価されるべき結合された体サンプルと混合され、この混合は免疫反応生成物が形成されるに十分な時間維持される。結合された免疫反応生成物は次にすすがれ、指示手段からのシグナルの存在が確かめられる。上述の第二の反応剤たとえばポリペプチド９９及び１４２は、非特異的よりも特異的免疫結合が起ったことを検証するために免疫反応ブロッキング研究において対照剤として用いうる。このようなブロッキングの研究は、第７．８及び１０図に示される。発現ベクターとして５ＮＨＢＶ−３を用いるために、異種ＤＮＡがＨＢｘＡｇ遺伝子から下流に、好ましくはそのユニークＲａｍ　ＨＩ制限部位に挿入され、そのように作った新しいベクターは細胞をトランスフェクトするために用いられる。トランスフェクトされた細胞におけるｌＢｘＡｇの発現は、５ＮＨＢＶ−３に挿入された異種ＤＮＡの発現の仮定的証拠である。上述のＨＢｘＡｇ発現評価系により検出されるＨＢｘＡｇの発現は、５ＮＨＢＶ−３に挿入された異１ｌＩＤＮＡの発現を示す。すなわち、上述の評価系を用いる、トランスフェクションの試みの後に作られた細胞コロニーの検査は、トランスフェクションが成功したコロニーの選択のために利用できる。たとえば、真核細胞へのベクターの導入の試みから得たコロニーからの細胞が回収され、分解され、細胞蛋白質が抽出される。抽出された細胞蛋白質はその後、電気泳動により５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離され、分離された蛋白質はニトロセルロース上にプロットされる。異種遺伝子によりコードされるポリペプチドに融合された発現されたＨＢｘＡｇ部分の存在を示すオートラジオグラフを作るために、プロットした蛋白質を過剰の受容体及び上述した評価系のラベルたとえば合成ポリペプチド９９又は１４２に対する！−１２５ラベルした抗体と接触させ、次に免疫反応しなかった抗体（受容体）を除くためにすすぐことが行われうる。上述の評価法及び系は、体サンプルとくに組織サンプルたとえば肝臓生検からの細胞中に存在するかも知れないＸ蛋白質又はその実質的部分を同定するために特に有用である。後述の診断評価及び方法は、体サンプルたとえば全血、血清又は血漿中に存在するかも知れないＸ蛋白質の測定のために特に有用である。そのような診断法の例として　？）ニスターンプロット分析が用いられよ・う。しかし、本方法を利用する産業的実施６ｍの一つはＥＬ　Ｉ　ＳＡ診断系である。ここで、、　５ＮＨＢＶ　−３ヘクターをトランスフェクトされた細胞からの発現生成物、たとえば第１（１図に関連して述べられるＲ　Ｓ　Ｃ：　−］細胞で発現された約２４，０００ダルトン蛋白質（ポリペプチド）が、抗原として好ましく用いられ、しかし本発明の好ましいポリペプチドたとえはポリペプチド９９又は】４２もまた抗原として用いうる。１″なわぢ、後述するような親和性クロマトグラフィにより得られるような本質的に精製された形で用いられるＨＢｘＡｇ分子自体、　５ＮＨＢＶ−３トランスフェクトされたＢＳ（、−１細胞により発現されるようなＨＢｘＡｇ分子の実質的部分（２４，０００ダルトンポリペプチド）、又はアミノ酸残基配列においてＨａχＡｇの抗原決定基に対応するポリペプチドが抗原として使用できる。抗原は好ましくは、固体支持物を形成するために固体マトリックス、たとえば架橋デキストラン（ファーマンア　ファインケミカルズ社、ビス力タウエイ、二、１・−ジャーシイから商標Ｓ　Ｅ　Ｐ　ＨＡ　ＤＥ　Ｘとして人手できる）、アガロース、ガラスピーズ、ポリ塩化ビニル、ボリスチＩ／ン、架橋アクリル７ミド、ニトロセルロース、又は微小力価プレートのくぼみに結合される（吸着される）又はさもなくば固定される。好ましくは固体支持物の一部としての固体マトリックスに結合された抗原は、評価されるべき液状体サンプルと混合されて、固−液相混合物を形成する。混合は、体す゛／プル中に存在する抗Ｘ蛋白質（抗ＨＢｘＡｇ　）抗体が抗原と免疫反応するのに十分な時間維持される。次に免疫反応の存在が、評価される体サンプル中の抗Ｘ蛋白質抗体の存在をシグナルする指示手段などによって決定される。たとえば一つの研究において、５ＮＨＢシー３ベクタートうンスフェクトされたＢ１０−１細胞リセートが調製され、電気泳動的に分離され、そして固相を形成するために、第１０図に関連して述べたとほぼ同様にして固体マトリックスとしてのニトロセルロースに移され結合された。種々の肝臓病を持つ６人の患者からの１＝５０希釈血清を別々に、ニトロセルロースに結合されたトランスフェクトされたＢ１０−１細胞蛋白質と混合して、固−液相混合物を形成した。これらの混合物を、血清中に存在する抗Ｘ抗体が結合された抗原と免疫反応するに十分な時間（２時間）維持した。固相と液相を分けるためにすすいだ後に、上の段階で得た固相を別々に、指示手段としてのホースラディツシュペルオキシダーゼに複合されたヤギ抗ヒト又は抗ラビット抗体の１　：　２００希釈を含む液体溶液と混合して、第二の固−液相混合物を形成した。第二の固−液相混合物の各々を、ラベルした抗体が、マトリックスに結合された抗原と免疫反応したヒト抗Ｘ抗体と反応するに十分な時間（１時間）維持した。ラビット抗ポリペプチド抗体が、ヤギ抗ラビット抗体の対照として用いられた。得た固−液相混合物を再び分け、そしてすすいだ、得た固相を次に、第８図について述べたように４−クロル−１−ナフトールを含む溶液を用いて現像した。この研究の結果は、肝細胞癌腫を持つと診断された患者からの血清はトランスフェクトされたＢ１０−１細胞中で５ＮＨＢシー３ベクターにより発現されたポリペプチドに結合した抗体を含んだことを示す、従ってこれら抗体は抗Ｘ抗体であり、その存在はＨＢＶ感染のある段階における真正の抗原としてのＸ遺伝子生成物を確認する。上述のウェスター：／プロット評価で用いられた約２４，０００ダルトンポリペプチド発現生成物が後述のようなＥＬ　Ｔ　ＳＡで又は他の類似の評価で抗原として用いられる場合、このポリペプチドは好ましくはそのような使用の前に精製され単離される。この精製及び単離は、周知の方法で行える。たとえば抗９９又は抗１４２抗体又はこれらの抗体結合部位は、本明細書で述べるようにして作られ、固体マトリックスたとえばアガロース及び架橋アガロース誘導体（ファーマシアファイン　ケミカルズ社がら商［５ＥＰＨＡＲＯ５Ｅ　６　Ｂ、ＣＬ　６　Ｂ。４Ｂ及びＣＬ４Ｂとして、又はバイオ−ラド　ラボラリーズ社、リッチモンド、カリフォールニアから商標Ｂ１ｏ−Ｇｅ１　Ａ　−０，５Ｍ、Ａ　−１，５Ｍ及びＡ−５０Ｍとして市販されている）に結合されうる。前述の架橋デキストラン（商１１ｉ　５ＥＰＨＡＤＥＸ　）及びポリアクリルアミドビーズ　（パイオーラド　ラボラトリーズがら商標Ｂｉｏ−Ｇｅｔ　Ｐ　−２、Ｐ−３０ＳＰ−１００及びＰ−３００として市販）もまた、有用な固体マトリックスである。アガロース誘導体より成るマトリックスの使用が、例として下記で述べられる。アガロースマトリックスは典型的には、ンアノゲンブロマイドを用いて結合のために活性化される。活性化されたマトリックスは次に洗われ、活性マトリックスを乾燥することなく、望む抗体（受容体）分子に結合される。マトリックス結合抗体は次に洗われ、使用準備がととのう、マトリ、ラス上の反応しなかった反応性基は、もし望むならアミンたとえばエタノールアミン又はＴｒｉｓと反応させることができるが、しかしこれら反応性基は迅速に崩壊する。親和性吸着剤は、たとえばビーカー又はフラスコ中でルーズな状態で使用でき、又はそれはカラムに詰める口とができる。使用前に、親和性吸着剤を、緩衝剤、又は約２４，０００ダルトンポリペプチドを含む細胞リセートの精製のために用いられた他の水性媒体中で洗って、非特異的に結合した蛋白質又は支持体に不安定に結合された抗体を除去することが好ましい。５ＶＨＢＶ−３ベクターでトランスフェクトされた細胞リセートを含む水性組成物を用意し、次に親和性吸着剤と混合する。この混合物は、結合された抗体（受容体）と約２４，０００ダルトンポリペプチド（抗原）の間の可逆的な、結合抗体−抗原（受容体−リガント）複合体を形成する。結合抗体−リガント複合体は次に、複合化されなかった水性組成物の残部と分けられ、それにより親和性吸着剤に結合された精製された形のポリペプチド抗原を得る。混合がビーカー又はフラスコで行われる場合、この分離は濾過及び洗滌により行うことができる。吸着剤がカラムに詰められる場合、分離は、複合化されなかった水性媒体の溶出及び好ましくは続く洗滌段階により行える。精製されたポリペプチド抗原が親和性吸着剤を含まないことが望まれる場合、それは典型的には種々の手順で得られる。これら手順のいずれにおいても、可逆的な結合受容体−リガント複合体は、そのマトリックスに結合した受容体とポリペプチド抗体リガンドの成分へと解離され、次にポリペプチド抗体リガンドを結合された受容体から分けて、親和性吸着剤を含まない精製されたポリペプチド抗原リガンドの溶液が得られる。溶液はそのまま用いることができ、又はそれは使用前に望むように濃縮され又は乾燥しうる。ある例では、使用前に溶液を公知のように脱塩することが望ましい。可逆的複合体の解離は、多数の方法で行える。約２．５のｐｉ（値の０．２Ｍグリシン塩酸塩溶液が典型的に用いられる。あるいは、結合されたポリペプチド抗原リガンドは、抗体を生じるために用いられた過剰の免疫原ポリペプチドたとえば抗９９抗体がマトリックスに結合される場合のポリペプチド９９との可逆的複合体の混合により、結合された受容体から競争させられることができる。そのような競争は、ポリペプチド抗原の起りうる変性を避ける。解離されたポリペプチドの親和性吸着剤からの分離は上述のようにして行いうる。親和性吸着剤の調製及びその使用は広く知られている。しかし、本発明の抗体及び抗原分子を組込んだ物質及び使用は、従来なかった。抗原がマトリックスに結合されている。親和性吸′　着剤、その調製法及び使用は、「アンチボディ゛　アズ　ア　ツール」、マーカロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）及びワール（Ｗａｒｒ）　［、ジシーンワイリーアンドサンズ、ニューヨーク、第６４〜６７及び７６〜９６頁（１９８２）、に記載される。上述の方法を利用する已ＬＴＳＡの例は、固体支持物を形成するために、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル製の２０〜９６個のくぼみの微小力価プレートの壁より成る個体マトリックスに吸着された又は固定された本発明の前述の抗原から成る固体支持物を用いる。微小力価くぼみの壁土の非特異的結合部位は、その後典型的には蛋白質たとえばウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）によりブロックされる。結合されなかった抗原及びＢＳＡは、たとえばすすぐことにより微小力価くぼみから除去される。゛ヒト血清、血液又は血漿のような体サンプルの一部は、上述の抗原結合固体支持物と混合されて、固体及び液体相を含む混合物を形成する。固−液相混合物は、体サンプル中の抗Ｘ蛋白質抗体が抗原と免疫反応するのに十分な時間たとえば約３０分間〜約２時間維持される。固及び液相は、その後に一般に分離される。第二の、ラベルされた、指示手段を含む抗体、抗体部位、又は初めに挙げた抗体と免疫する黄色ブドウ球菌蛋白質Ａの液状溶液が次に固相と混合されて、別の固 −液相混合物を形成する。第二の抗体の例は、初めに挙げた抗体がヒト体サンプルからである場合のペルオキシダーゼでラベルしたヤギ抗ヒトＩｇ抗体である。他の有用な酵素ラベルとしては、アルカリ性ホスフｙ　−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。固相（固体マトリックスに結合した抗原−抗体反応生成物）と第二のラベルした抗体溶液から形成された混合物は、結合された初めに挙げた抗体と指示手段の間の反応生成物たとえば二つの抗体の間の免疫反応を形成するのに十分な時間（たとえば約１時間）維持される（インキュベートされる）、固体及び液体相は、その後分離される。上述の第二の抗体はまた、免疫グロブリンのクラスの唯一つ（たとえばＩｇＧ　、　ＩｇＭ　、ＩｇＥ　、　Ｉｇ＾又はＩｇＤ　）に対して特異的であり、免疫反応してもよい。そのような抗体は、体サンプル中に存在する抗Ｘ蛋白質抗体の免疫グロブリンクラスを同定する能力を与える。また、第二の抗体又は抗体結合部位は、免疫グロブリンＬ鎖二つのタイプの唯一つ（たとえばカッパ又はラムダ）に対して特異的であり、免疫反応してもよい。これら抗体は、体サンプル中に存在する免疫グロブリン分子のイソタイプを同定する能力を与え、周知である。次に酵素ラベルのための培養基たとえばペルオキシダーゼのための過酸化水素、及び色形成性染料前駆体たとえば０−フェニレンジアミン又は４−クロル−１− ナフトール、又はアルカリ性ホスファターゼのためのｐ−ニトロフェニルホスフェートを含む溶液が、固相と混合される６次に、予め選んだ波長（たとえば各々４９０又は４０９ｎａ）での光学的濃度が、十分な時間（たとえば６０分間）の経過後に測定され、抗Ｘ蓋白質抗体が体サンプル中に存在したかどうか決定するために対照の光学的濃度と比較される。本発明の別の実施態様は、固体マトリックスたとえばポリスチレンの２０個のくぼみの微小力価ストリップ及びこの固体マトリックスに吸着（結合）又は固定されて固体支持物を形成する本発明の前述の抗原より成る固体支持物を含むキットの形の診断系を包含する。この系は好ましくはまた、結合された指示手段たとえばベルオキダーゼラベルされたヤギ抗ヒトＩｇ抗体を持つ別に包装された抗ヒトＩｇ抗体を含む、またこれは、結合された指示手段のための培養基たとえば過酸化水素、及び色形成性染料前駆体たとえばＯ−フェニレンジアミンを更に別の包装として含むことができる。過酸化水素は典型的には、その比較的不安定さの故にキットに含められず、典型的には最終ユーザーにより供給されるが、しかし過酸化水素の容器が診断系の一要素であることができる。この系を利用する評価において有用な緩衝塩はまた、乾燥した又は液体の形で一以上の別の包装に含められうる０本発明の好ましいポリペプチドたとえばポリペプチド９９はまた、対照として競争結合研究で用いられる別の包装に含められることができる０体サンプルたとえば血清中の抗Ｘ蛋白質抗体の存在についての評価は、上述の方法を用いてこの診断系により実施できる。６、ポリマーの調製本発明のポリペプチドは、多数のポリペプチド繰返し単位を含む水溶性又は水分散性抗原ポリマーを形成するために、互に接続されうる。そのようなポリマーは、免疫学的反応の増加という利点を持つ、ポリマーを構成するために種々のポリペプチドが用いられる場合、そのようなポリマーは多数のＨＢｘＡｇの抗原決定基と免疫反応する抗体を誘発する追加的能力を持つ。ポリマーは、二つのシスティン残基を含むように、後述するようにポリペプチドを合成することにより作ることができる。二つのシスティン残基は、一つの末端とポリペプチド鎖内に、又はアミノ末端とカルボキシ末端の両者に存在することができる。二つのシスティンを含むポリペプチドは、本明細書で一般に、ｄｉ　Ｃｙｓポリペプチドと云われ、一方、二つの末端システィン残基を含むポリペプチドは、ｄｉ　Ｃｙｓ末端ポリペプチドと云われる。ポリペプチド鎖内又はポリペプチド鎖末端のそのようなシスティン残基は、ポリペプチドが対応するところのＨＢｘＡｇ配列中に存在することができ、たとえばポリペプチド１４２の中央システィン（カルボキシ末端アラニン（Ａｌａ）から第７番目の残基）、ポリペプチド９９のカルボキシ末端システィン（Ｃｙｓ）である、又は末端システィン残基は、ポリマー作成のために加えられることができる。有用なｄｉ　Ｃｙｓポリペプチドの例は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて下記の式により示されるものである。ポリペプチド９９　ａ　：　Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−５ｅｒ −Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ３ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ −Ａｓｐ−Ｃｙｓ　Ｓポリペプチド１００　ａ　：　Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ− Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−しｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ− １１ｅ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ　、及びポリペプチド１４２　ａ　：　Ｒ’−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ− Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｒ”ここでＲ１及びＲ２は各々、システィン残基であり、５但し、Ｒ’　とＲ２の一方のみが存在する。第６図に示すように、ポリペプチド９９１．１．００及び１０４の各々は、翻訳されたＸゲノムのアミノ酸残基配列に存在する一つのシスティン残基を含む。ポリペプチド９９及び１００のアミノ酸残基配列（末端システィン残基を除き）を持つポリペプチドが本明細書において免疫反応プロフキング研究で有用であり、また後述するようにＭＢＳ以外の手段により担体に結合されて用いられることを繰返し述べておく。一つ又は二つの末端システィン残基が、ポリマー製造のために加えられ、残りのアミノ酸残基配列はＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応し、ポリペプチド繰返し単位はまだＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応すると考えられる。典型的な実験室製造において、ｄｉ　Ｃｙｓポリペプチド（非酸化形のシスティンを含む）の１０ｇが、約８のｐＨを持つ０．１Ｍ重炭酸”アンモニウムの２５０ｍｌに溶解される。溶解されたｄｉＣｙｓ末端ポリペプチドは次に、得た溶液をゆっくり約１８時間又はエルマンテストにより遊離メルカプタンが検出されなくなるまでゆづくり撹拌するごとにより空気酸化される。〔エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）、　（１９５９）　、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｅｈｅ＋ａ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、８　？、ニア　０−７　′７　）このようにして作られたポリマーは、繰返し単位として多数の本発明のポリペプチドを含む。これらポリペプチド繰返し単位は、酸化されたシスティン残基により互に結合される。多数の本発明のポリペプチドを含むそのようなポリマーは、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて下記式により表わされうる。＜Ａ、）ａ　、　（Ｂ）ｂここでＡ及びＢは、異るポリペプチド繰返し単位たとえばポリペプチド９９．１００及び１４２である。下付き文字ａ及びｂは整数であり、各々θ〜約２０００の平均値を持ち、但しａとｂの平均値の合計は少くとも２であり、従ってポリマー中に少くとも二つのポリペプチド繰返し単位が存在する。下付き文字ａ及びｂの平均値の合計は典型的には、得られたポリマーが、約ｓ、ｏｏｏ、ｏｏｏダルトンの平均分子量を持つように、約２０００より大きくない。好ましい態様では、ポリマーの平均分子量は、約５０，０００〜約１，０００，０００ダルトンである。上述の式は、ポリマーの繰返し単位及び存在する各繰返し単位の平均数の一般化した表示であることを意図される。二つの異る繰返し単位を含む本発明のポリマーは、典型的にはランダムコポリマーである。すなわち、上述の式は、ポリペプチド繰返し単位がポリマーたとえばブロックコポリマー中に存在する順序を表わすことを意図するものではない。本発明の上述の水溶性又は水分散性ポリマーは、免疫原性かつ抗原性であり、従って前述したように本明細書では抗原性と記述される。そのような抗原性ポリマーは、生理学的に許容される希釈剤中に分散され、たとえばラビット−匹当り４００μｇのポリマーの量で免疫化注射により導入されるとき、ＨＢｘＡｇと免疫反応する二ニーシランドレッドラビットにおいて抗体の産生を誘発できる。生理学的に許容される希釈剤の例は、免疫学で周知であり、下記に更に詳しく述べられる。７、蛋白質担体へのポリペプチドの結合ここで用いられる合成ポリペプチドは、下記の周知の方法を用いてキイホールリンベットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に結合された。、ＫＬＨ担体はまず、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化され、次にポリペプチドアミノ末端（ポリペプチド１００）、カルボキシ末端（ポリペプチド９つ）に存在するシスティン残基を介して、又はポリペプチド】４２の中央システィンを用いて、リウ（１，ｉｕ）　ら、（１９７９）、バイオケミストリー、８０．６９０、記載のようなミカエル付加反応によりポリペプチドに結合された。本発明のポリペプチドはまた、種々の手段で担体に結合でき、またＫ　Ｌ　Ｈ以外の担体に結合できる。たとえばポリペプチド９９ｂのようなポリペプチドは、周知のように０゜０４％グルタルアルデヒド溶液を用いて、遊離アミノ基を介して破傷風トキソイド担体に結合されうる。たとえばクリブスティン（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎ）　ら、（１９８３）　、　Ｊ、　丁ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓｃ、、　１　４　７　：３１８参照。合成ポリペプチドのアミノ又はカルボキン末端又は中央部分に存在するシスティン残基は、ジスルフィド結合及びミカエル付加反応生成物を介して接合体を形式するために特に有用であることが見い出された。しかし、接合体を作るために従来周知の他の方法もまた用いうる。追加的結合（リンキング）手順の例は、ジアルデヒドたとえばグルタルアルデヒド（上述）などの使用、担体とポリペプチドの間のアミド結合を形成するための水溶性カルボジイミドたとえばｌ−エチル− ３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの使用を包含する。有用な担体は当該分野で周知であり、一般に蛋白質そのものである。そのような担体の例は、キイホ〜ルリンベソト　ヘモシアニン（ＫＬＨ）　、エデスチン、チロクロプリン、アルブミンたとえばウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブ砲ン（各々ＢＳＡ又はＨ５Ａ）、赤血細胞たとえばヒツジ赤血球（５ＲＢＣ＞、破傷風トキソイド、コレラトキソイドならびにポリアミノ酸たとえばポリ　（Ｄ− １リシン：Ｄ−グルタミン酸）などである。また周知のように、合成ポリペプチドをその担体に中間の結合基により結合することがしばしば有利である。上述のように、グルタルアルデヒドは、そのような結合基の一つである。しかし、システィンが用いられるとき、中間結合基は好ましくは、やはり上述したｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド　エステル（ＭＢＳ）である、ＭＢＳは典型的にはまず、エステル−アミド交換反応により担体に付加される。その後に、上述のミハエル反応が続き、又はＭＢＳ付加の次に、ブロックされたメルカプト基たとえばチオール酢酸（Ｃ）［３ＣＯ５Ｈ）のマレイミドニ重結合を横切るミハエル付加が行われうる。アシルブロッキング基解離の後に、ブロックを解かれた結合基メルカプタンと合成ポリペプチドの加えられたシスティン残基のメルカプタンの間にジスルフィド結合が形成される。担体の選択は、抗原の決定基部分によりも、抗原の意図される最終用途に依存し、本発明に特に含まれない判断基準に基づく、たとえば、もし、ＨＢｘＡｇの存在の評価のために用いられる抗ポリペプチド抗体の生産に関して接種物が動物で用いられるのであれば、特定の動物で不都合な反応を起さない担体が選ばれるべきである。もし接種物たとえばＨＢｘＡｇに対するワクチンがヒトで用いられるなら担体及び／又は得られる抗原の免疫化学的又は他の副反応のないこと、安全性及び効率（つまりヒトでの使用を意図されるすべてのワクチンに妥当する同じ配慮）に最大の考慮が払われる。８、免疫化手順免疫化のために用いられる接種物は、酸化されたシスティン残基を介して互に結合された個々のポリペプチドのポリマーとして、又は担体に結合されたポリペプチドの接合体として、ポリペプチドの有効量を含む、−接種当りのポリペプチドの有効量は、なかんずく接種される動物種、動物体重及び選ばれた接種部分に周知のように依存する。接種物は典型的には、乾燥した固体のポリペプチド接合体又はポリペプチドポリマーから、ポリペプチド接合体又はポリペプチドポリマーを水、食塩水又はアジュバントに懸濁することにより調製される。これら接種物は典型的には、−接種当り約２０μｇ〜約５００■の濃度のポリペプチドを含む、述べたポリペプチド量は、担体が用いられる場合、担体重量を除くポリペプチドの重量を指す。接種物はまた、生理学的に許容される希釈剤たとえば水、リン酸塩緩衝される食塩水、又は食塩水を含み、更に典型的には希釈剤の一部としてアジュバントを含む、完全フロイントのアジュバント（ＣＦＡ）　、不完全フロイントのアジュバント（ＩＦＡ）及び明ばんのようなアジュバントは、当該分野で周知の物質であり、いくつかの供給源から市販入手できる。接種物好Ｒ溶液は、ＣＦＡ、ＩＦＡ又は明ばんから下記のように作られるニー接種当り望む量のポリペプチドを与えるのに十分な量の合成ポリペプチド接合体又はポリマー状ポリペプチドが７．２のｐＨ値でリン酸塩緩衝された食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に溶解される０次に等量のＣＦＡ、ＩＦＡ又は明ばんをポリペプチド溶液と混合して、水ニオイル比が約１：ｌである、ポリペプチド、水及びアジュバントを含む接種物を得る。混合物を次にホモゲナイズして、接種物貯蔵溶液を得る。接ポリペプチド抗体を生じるためにここで用いられるラビットは、完全フロイントのアジュバント（ＣＦ　Ａ）に乳化されたポリペプチド接合体（ポリペプチド＋担体）の２００μｇ；不完全フロイントのアジュバント（ＩＦＡ）中のポリペプチド接合体の２００μｇ；及びポリペプチド接合体の２００μｇ（腹膜内注射される４■の明ばんを伴い）を含む接種物を皮下注射で、各々第０．１４及び２０日の免疫化スケジュールで与えられた。各接種は、接種物の四回の注射より成った。マウスは、−往射当り上述の投与量の約１０分の１を用いて同じ方法で免疫化されうる。動物は、典型的には第一回注射の後第４及び第１５週に採血される。対照免疫化前血清は、各動物から最初の免疫化の直前に採血して得られた。対照接種物貯蔵溶液はまた、キイホールリンペット　ペモシアニン（ＫＬＨ）　、ＩＦＡ　（不完全なフロイントのアジュバント）中のＫＬＨ，ＫＬＨ−明ばん吸収、ＫＬＨ−明ばん吸収−百日ぜき、エデスチン、チログロブリン、破傷風トキソイド、ＩＦＡ中の破傷風トキソイド、コレラトキソイド、及びＩＦＡ中のコレラトキソイドを用いて作ることができる。宿主動物に抗原又は接種物の注射又は他の導入をすると、動物の免疫系は大量の抗体を作ることによって抗原に応答する。製造された抗原、すなわち担体に結合された合成ポリペプチド又はポリマーから形成された抗原の特異的抗原決定基は興味の天然の抗体の決定基に対応するので、宿主動物は、合成ポリペプチドに対するのみでなく、合成ポリペプチド抗原が対応する蛋白質又はポリペプチド即ちＩ（ＢｘＡｇに対する抗体を作る。９、寄託下記の物質が１９８４年３月８日にアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、各々、表示する寄託番号を持つ０文字ＦＡＴＣＣＪと続く数字及び／又は文字と数字を含む、細胞系統、ベクター等に対する総ての表記は、上述のアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション１２３０１　バークロン　ドライブ、ロックビル、ＭＤ　２０８５２に寄託された物質を云う。５ＶＨＢＶ−３４０１０２ＡＭ６　４０１０１ＳＶＡＭ１９１　４０１０３太盪皿ＥＣ−ＡＭ６　３９６３０ＥＣ−ＡＭＩ　３９６２９ＥＣ−ＳＶＡＭ１９１　３９６３１本発明者によりＡＴＣＣに寄託された上述の物質に加えて、他の人により作られ、ここで用いられた物質もまたＡＴＣＣに寄託された。これら物質のリストを下記に示す。立−−！　人ユ匹ｃｉす（１号太■皿Ｗ３１１０　２７３２５ＲＲＩ　３１４４７ＨＢＩＯＩ　３３６９４璽１翌豊嵐ＨｅｐＧ２　ＣＣＬ　２３ＢＳＣ−Ｉ　ＣＣＬ　２６ＣＯ３−７ＣＲＬ　１６５１ＰＬＣ／ＰＲＦ１５　ＣＲＬ　８０２４Ｂ、材料及び方法１、　ＨＢＶ　ＤＮＡ単離及び調製８５　ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａは、ロビンソンの方法（Ａｓ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、＋（１９７５）２７０：１５１−１５９）に従ってＨＢｓＡｇ陽性ヒト提供者の血漿からのゾーンね子、サブタイプａｄｗ　（ナショナル　インティチュート　オブ　ヘルス＃７３７１３９）から単離された。簡単に云えば、血漿の１．　Ｑ　ｍ　ｌを２，０、ＯＯＩＭのＴｒｉｓ−Ｈ（１（ｐＨ７，４）及び０．５ＭのＨ（Ｊを含むＴＮｉｌ衝液で３．０ＩＨに希釈した。希釈した血漿を１（ＬＯＯＯｘｇで１０分間遠心分離して大きなデブリスを除き、次にＴＮ、Ｏ，ＯＯＩＭＥＤＴＡ（０，１％２−メルカプトエタノール及び１■／　ｍ　Ａのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（これは沈澱したＢＳＡを除くために予めｌｏ、ｏｏＯｘｇで１０分間遠心分離されている）〕を含む３０％（ｗ　／　ｖ　３蔗塘の２．５　ｍ　Ｉｔ上に層状にしたｅ　５ｐ１ｎＣＯＳＷ−６５０−タ−（商標：ベフクマンインストルメンツ社）で４℃で５０．０００ｒｐ＋ｍで４時間遠心分離の後に、上澄を注意深く除き、ペレットを、】％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（商標：ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル；シグマ　ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）　Ｔｊｔ、び０１１％２−メルカプトエタノールを含むＴＮ緩衝液の５０μｌに懸濁した。上述で単離されたＨＢＶ　ＤＮＡの一本鎖部分は、２５μｌの＋＊１ｘ−Ｅ　（０゜２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＩＣ！１（ｐＨ７，４）　、　Ｏｏｏ　８　Ｍ　ＭｇＣｊ！　ｘ、０、２４　ＮＨ，ＣＪ、各々１．０ｗＭのｄａＴＰ、　ｄＴＴＰ、、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ　）を再懸濁したＨＢＶ　ＤＮＡの５０μｌに加え、３７℃ で３時間インキュベートすることにより二本鎖にされた。ロビンソン（１９７５）　、　Ａｍ’、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｔ、＋　２ＴＯ：１５１　１５９゜ゲノムプローベとして用いられる放射性ラベルされたＨＢＶＤＮＡは、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの代りに各々０．２５　ｐ　１２の３ＨｄｃＴＰ及び３ＨｄＧＴＰ　（両者とも２１キユ一リー／＋＊Ｍ）を用いることにより、上述の埋め込み（フィリングイン）法を用いて作られた。２、　８ＢｘＡｇクローニングＨＢｘＡｇをコー１゛するＤＮＡ配列を含むＨＢ　Ｖケ゛ツムの部分は、大腸菌に導入されたプラスミドｐＢＲ３２２を用いてクローンされた。上で単離された二本鎖のラベルされどいないＨＢＶＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＲａｍ　ＨＩ　（５０＋ＩＭＮａＣ１，。１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７゜５）　、１０ｍＭ　Ｍｇｃｌ、１１ジチオスレイトール〕で分解された。反応混合物を０．６％アガロース水平スラブゲルで１００アンペアで２時間電気泳動した（０．０４Ｔｒｉｓ−アセテート、Ｃ９００２Ｍ　ＥＤＴＡ）。１％エチジウムブロマイドでの着色により三つのＨＢＶＤＮＡフラグメントが現われ、これはゲノム中の二つのＢａｇ　ＨＩ制限部位の存在を示す、３２００ｂｐフラグメントは、Ｒａｍ　ＨＩ部位の唯一ケ所で切断された結果として線形の全ＨＢＶゲノムを表わした。１８５０ｂｐ及び１３５０ｂρフラグメントは、完全なりａａ　ＨＴ分解の結果として二つのフラグメントに切断されたゲノムを表わした。上で単離された三つのＢａ＋＊ＨＩ　ＨＢＶ　ＤＮＡ制限フラグメントのコピーが、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）　［サントクリフｘ　（１９７８）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ、７５：３７３７　３７９１）でのクローニングにより得られた。ＨＢＶ　ＤＮＡ　Ｂａｇ　ＨｌフラグメントをｐＢＲ３２２に挿入するために、プラスミドは、Ｂａｇ　Ｈ１（５０ｍＭ　ＮａＣ１、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐ）１７゜５）　、　１　０ｍＭ　Ｍｇｔｌ。１ｍＭジチオスレイトール〕で分解して線形化されて、ＨＢＶフラグメントの末端に対し相補的な末端を形成した。三つのＨＢνＤＮＡフラグメントとｐＢＲフラグメントを混合し、Ｔ４［ＩＮＡリガーゼ（６６ｓＭ　Ｔｒｉｓ−１（（１（ｐＨ７，６）　、６６ｍ？ｌ　ｌ’１ｇｃｊｌｚ　、１０＋ｍＭジチオスレイトール及び０．４ｓ＋Ｍ　ＡＴＰ）によるＤＮＡリゲーションに付した。上の反応で得られたリゲーション反応生成物は、線形化ｒ＋ＢＲ３２２及びＨＢＶフラグメントからめ、相補性末端で結合された環状ＤＮＡである。この環状組換えプラスミドは、コーエンら、（１９７２）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　６９：２１１０−２１１４の方法に従って大腸菌株ＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４；ナショナル　キャンサー　インスティチュート、ＮＩＨ，ベセスダ、ＭＤ、のディーン・ハンター博士により提供〕に導入された。簡単に云えば、大腸菌ＨＢ　１０１株は、０．０３ＭＣａＣｊ！２溶液中で０℃ で２０分間インキュベートされた。組換えプラスミドの１１００ｎが加えられた同じ溶液のＱ、３ＩＨに約５×１０”バクテリア細胞が加えられた。この形質転換反応混合物は、０℃で６０分間インキュベートされた。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性授与遺伝子を含む、このプラスミドで形質転換された薬品感受性バクテリア細胞は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性を示す。ｐＢＲ３２２ＤＮＡは、テトラサイクリン耐性遺伝子上にある唯一つのＢａａ　ＨＴ開裂部位を持つので、Ｂａ＋ｍＨ１部位でのＨＢＶフラグメント・の挿入はこの遺伝子を崩壊する。　Ｂａｎ　Ｈ１部位に挿入されたＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントを持つｐＢＲ３２２から導かれたプラスミド（クローニングベククター）により形質転換された薬品感受性大腸菌ＨＢＩＯＩは、従ってアンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を示す。形質転換された大腸菌、すなわちプラスミドアンピシリン耐性授与遺伝子を含むものは、形質転換反応混合物を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ肉汁寒天培養基［１７！当り１０ｇバクトアガー、１０ｇバタトリプトン、５ｇバクト酵母エキス（各々ディフコ　ラブダ、ディロイド、ミシガン、から入手）及び５ｇＮａＣｎを含む増殖培Ｖ＃基〕上に塗付することにより選択された。塗付された大腸菌は、３７℃で２日間インキュベートされたいと述の手順による形質転換後にアンピシリン耐性を示したコロニーのうちから、テトラサイクリン耐性コロニーが、アンピシリンの代りに５０μｇ　／　ｍ　ｊ！のテトラサイクリンを含むＬＢ肉汁（上述）上にコロニーを塗付することにより選択された。この塗付されたコロニーはまた、３７℃で２日間インキュベートされた。テトラサイクリン耐性遺伝子中のＢａ１ＩＨＩ開裂部位に挿入されたＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントを持つｐＢＲ３２２を含む大腸菌Ｈ８１０１株が、かくして得られたゆ３゜　プラスミドＤＮＡ抽出上のように分離された組換えＤＮＡ含有大腸菌ＨＢ　１．０１細胞は、２０μｇ　／　ｍ　ｅのアンピシリンを含むＬＢ肉汁培養基中で、対数成長期に１７０μ ｇ　／　ｍ　１の濃度にクロラムフェニコールを加えて、増殖された。プラスミドＤＮＡを増やすために、培養を数時間続けた。次に細胞を、５００ｍｆｆの細胞に５０ｍＭ　丁ｒｉｓ−Ｈ（１（ｐＨ８，０）溶液中２５％蔗糖の５ＩＨを加えることにより分解した。０℃で１０分間インキュヘート後に、０．２５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｔ　（ｐＨ７，５）中の１％リゾチームの１ＩＨ加え混合した。０℃で１０分間のインキュベーション後に、２５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）の２ＩＨをゆっくり添加混合した。０℃で１０分間のインキュベーション後に、０．１５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）　、０．２ＭＥＤＴＡ　（ｐ）１８．０）中の１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル〕の８ＩＨを添加混合し、再び０℃でｌＯ分間インキュベートした。得たリセートを５ｐｉｎｃｏ　Ｓ　Ｗ　−６３０−ター（ベックマンインストルメンツ）で３０．００　Ｏｒｐｍで遠心分離して、変性蛋白質及び細胞デブリスを除去した。ＤＮＡは、明澄なリセートから、２Ｍ酢酸ナトリウムの１７１０体積及び９９％エタノールの２．５体積を添加混合し、−２０℃で３０分間インキュベートすることによって沈降された。ＤＮＡ沈降物は、１０，０００χｇで３０分間の遠心分離によりベレット化された。蛋白質除去は、０゜０１．　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，６）、０．１ＭＮａＣ１及びＯ，００１２Ｍ　ＥＤＴＡを飽和されたフェノールの１ｍｌを用いて二度行われた。ランダーズ（Ｌａｎｄｅｒｓ　）ら、（１９７９）　、Ｊ、Ｖｉｒａｌ、、２３　：　３６８−３７６、上述の手順から水性層を取り出し、これから２Ｍ酢酸ナトリウムの１７１０体積及び９９％エタノールの２．５体積を加え、−２０℃で２０分間インキュベートすることによりＤＮＡを沈降した。　１０．０００ｘｇで１０分間の遠心分離は、ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子を含む完全に二本鎖のＤＮＡのベレットを与えた。４゜　プラスミドＤＮＡ分析クローン中のＨＢＹ　ＤＮＡの存在は、サザーン移動及びハイブリダイゼーション法を用いて確認された。サザーン（１９７５）、Ｍｏ１．　Ｂｉａｌ、、９８　：　５０３．上述のように分離された各クローンからのプラスミドＤＮＡの１０■をＲａｍ　ＨＴ　（５０ｍＭ　ＮａＣ１゜］、　ＯｓＭ　Ｔｒｉｓ−’）Ｉ（Ｊ　（ｐＨ７，５）　、Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＣ１，，１ｍＭ　ジチオスレイトール〕で分解した。反応混合物を０．６％アガロース水平スラブゲルで１００アンペアで２時間電気泳動した（　０．０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−酢酸塩、０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ）。ゲル中のＤＮＡは、ゲルを１．５ＭＮａＣｆｆ１及び０．５　Ｍ　Ｎａ０１ｌの数倍体積中に室温で１時間、一定攪拌又は振とう下に浸すことによって変性された。ある例では、ゲル中のＤＮＡは、アルカリ変性の前にゲルを０．２５ＭＨＣｆ中に１５分間ずつ２回室温で浸することによって酸脱プリンにより加水分解された。変性後に、ゲルは、ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）及び１．５ＭＮａＣ１の溶液の数倍体積中に室温で１時間、一定振とう下に浸すことによって中和された。ゲル中のＤＮＡは、マニアチスら（１９８２）、ジャーナルオブ　モレキユラー　クローニング（Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド　スプリング　ハーバ−１に記載されるとほぼ同様にしてニトロセルロースに移された。簡単に云走ば、ニトロセルロース（カタログＮＩＢＡ８５、シュライヒャー　アンド　ジェニル社、オハイオ）がゲルの上に置かれ、ワットマン（Ｗｈａｔ曽ａｎ）３ＭＮ紙の数層がニトロセルロース上に置かれた。このサントイフチは次に、その端が０．９　Ｍ　ＮａＣｌ及び０．０９Ｍクエン酸ナトリウムを含む緩衝液にひたされるところのワットフッ３ＭＮ芯上にゲル端を下げて落かれた。これによる緩衝液の毛管移動がＤＮＡをゲルからセルロースに移した。ＤＮＡは、真空下で８０℃で２時間焼くことによってニトロセルロースに固定された。上のようにして調製されたニトロセルロース上のプラスミドＤＮＡ　（サザーン　フィルター）は、マニアチスら（前出）の方法でＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントの存在についてプローベされた。簡単に云えば、サザーンフィルターは、ブレハイブリダイゼーション液０．９Ｍ　ＮａＣｆ５０．０９クエン酸ナトリウム、５％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）、１００■／　ｍ　ｊｌ変性サケ精液ＤＮＡ及び５Ｘデンハルトの溶液（ｌｆｆｉ当り１ｇフィコル、１ｇポリビニルピロリドン、及びＩｇ　ＢＳＡフラクションＶを含む）に６８℃で４時間浸すことによってプレハイブリッドされた。ハイブリダイゼーションは、サザーンフィルターを湿らせておくのに丁度十分なハイブリダイゼーション溶液（５０１１１／フィルター−）を入れた熱密閉できるバンク中で行われた。ハイブリダイゼーション溶液は、０．９　Ｍ　ＮａＣ１，０，０９Ｍクエン酸ナトリウム、０．ＯＩＭ　ＥＤＴＡ、５Ｘデンハルトの溶液、０．５％ＳＤＳ、１１００ｕ／ｍｊｌ変性サケ精液ＤＮＡ及び５×１０’ｃ＋ｗｐの上述で調製した放射性ラベルされたＨＢＶ［ｌＮＡを含んだ。サザーンフィルターは、ハイブリダイゼーション溶液中で６８℃で１２時間インキュベートされた。フィルターを２時間洗った（０．３Ｍ　ＮａＣｊｌ、　０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）後に、フィルターにＸｗＡフィルム（ＸＲＰ−１、コダック）を露出して、オートラジオグラフイメージを得た。上の手順を用いて三つの組換えプラスミドが単離され、ＡＭ６、ＡＭ７及びＡＭＩと名付けられた。ＡＭ６は、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ及び全ＨＢＶゲノムを含んだ、ＡＭＩは、ｐ　Ｂ　Ｒ３２，２ＤＮＡ及びＨＢｘＡｇをコードする遺伝子を含む１８５　ｏｂｐ　ＩＩＢＶＤＮＡフラグメントを含んだ。５、Ｓ　Ｖ　４０　／ＨＢｘＡｇ発現ベクターＤＮＡを含む複製プラスミドの構築ディーン　ハマ−（前出）から得られた欠陥ＳＶ４０ウィルスは、５０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｗＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣＩ２　を及び１＋Ｍ　ジチオスレイトールを含む緩衝液中でＢａｎ＋　ＨＩ及びＥｃｏ　ＲＩ開裂に付された。プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡは、かく開裂された５Ｖ４０ＤＮＡに対し相補的な末端を形成すべく、前述の二重消化（分解）に付された。この消化の各々の開裂生成物を分離し、塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製した。タナ力ら（１９７５）　、Ｊ、Ｂａｃｔ、、１２１　：３５４ −３６２．かく単離した４４９２ｂｐ　５Ｖ４０７ラグメント及び３９８７ｂｐ　ｐＢＲ３２２フラグメントを、６６ｗＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，６）　、６．６ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ　、１０ｍＭ　ジチオスレイトール、及び０．４ ■Ｍ　ＡＴＰを含む緩衝液中でＴ４　ＤＮＡリガーゼに”よるＤＮＡリゲーションに付してｐＢＲ３Ｖ　（第４図）を形成した。上述の反応で得たリゲーション反応生成物は、線形化ｐＢＲ３２２３９８７ｂ、及びＳＶ４０　４４９２ｂｐ７−ｙグメントから導かれた、それらの相補性Ｅｃｏ　ＲＩ及びＲａｍ　Ｈｌ末端で結合した環状ＤＮＡである。この環状プラスミドは次に、リゲーシッンの間に形成されたＢａ■Ｈ１制限部位での開裂により線形化されて、各端にＢａａ＋　ＨＩ粘性末端を作る。ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子を含む１８５０　ｂｐ　ＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントは、上述で単離されたプラスミドＡＭ６を、５０ｍＭＮａｃ１．１０ｓＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）　、１０ｓＭ　ＭｇＣｊ＋を及び１ａ＋Ｍ　ジチオスレイトールを含む緩衝液中でのＢａｎ　ＨＩによる分解に付すことにより単離された０反応混合物を、０．８％、アガロースを用いて１００アンペアで２時間電気泳動に付し、１８５０ｂｐバンドを切り出し、６８℃で１５分間融解した。１７１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、得た溶液を上述の蛋白質除去手順に付した。かく単離したＨＢｘＡｇ遺伝子含有ＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントは、ＢａａｌＨＴ相補性末端を持った。このＤＮＡフラグメントは次に、Ｌで作ったｐＢＲ−３Ｖに、６６＋＊Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｉｌｌ　（ｐＨ７，６）　、　＋ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ　、１０＋ｓＭ　グチオス１／イトール及びＯ３４ｍＭＡＴＰを含む緩衝液中でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＩＩゲートされた。士のリゲーシッン反応の生成物は、環状プラスミドＤ　Ｎ　Ａであり、ＳＶＡＭ１９１と名付けられた。それは、時計方向順に、塩基位置２４６８のＢａ層Ｈ１部位から塩基位置〕７１７のＥｃ。Ｒ１部位までの４４９２ｂ、５Ｖ４０ＤＮＡ７ラグメント、塩基位置０のＥｃｏ　Ｒ１部位から塩基位Ｗ３７５のＢａＩＩＨ１部位までの３９８７ｂｐ　ｐＢＲ３２２ＤＮＡフラグメント１．及び塩基位！１４．００のＦ３ａａ　Ｈ１部位から塩基位置２８のＲａｍ　Ｈ１部位までの１８５０ｂｐ　ＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントを含んだ。プラスミドＳＶＡＭＩ　９１は、第４図に図式的に示される。ＳＶＡＭＩ　９　＋は、前述の形質転換法を用いて大腸菌ＨＢ１０１に導入された。この形質転換大腸菌はまた、アンピシリン耐性かつテトラサイクリン感受性なので、それらは大腸菌クローニングベクターのために前述したのと同じ分離手順に付された。上述した製造、分離、精製及び分析のための手順が、実質上純粋なＳＶＡＭｌ、９１　ＤＮＡの■量を得るために用いられた。６、Ｓ　Ｖ　４　Ｑ　／ｌ（ＲｘＡｇ発現ベクターの構築真核細胞におけるＨＢｘＡｇの産生を誘発できるベクターが、ＳＶＡＭｌ、９１　ＤＮＡの一部を切断することによって作られた。このことは、ＳＶＡＭ１９１　ＤＮＡを、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！、及び１ｍＭジチオスレイトールを含む緩衝液中でのＨａｅ　ｎエンドヌクレアーゼにより分解して、ＳＶ４０　ＤＮＡｊＩ域の塩基位置７６７及びＨＢＶＤＮＡ領域の塩基位置１４３７のＨａｅ　■部位でＳＶＡＭ１９１を開裂することによって達成された。上の反応から得た二つのＤＮＡフラグメントは、前述のアガロースゲル電気泳動によ、って分離された。ＳＶ４０及びＨＢ　ＶＤＮＡのみを含む、かく単離された比較的大きなフラグ、エンドは、そのＨａｅｎ相補性末端を前述のＴ４　ＤＮＡリゲーション手順に付して環化された。上で形成された環状ＤＮＡ発現ベクターは、５ＶＨＢＶ−３と名付けられた（第４及び５図）、それは、ＳＶ４０からの発現制御要素、及びＨＢＶからのＨＢｘＡｇをコードする遺伝子を含む。７、　５ＶＨＢＶ−３による真核宿主細胞のトランスフエフシランＳＶ４０のための許容される宿主であるＢ２Ｏ−１アフリカグリーンモンキー腎臓細胞系統（ＡＴＣＣＣＣＬ２６；ソーントン博士、ジッーンソン　アンド　ジョーンソン　バイオテクノロジー　センター社、ラ　ジョグ、カリフォルニアから得た）が、５ＶＨＢＶ−３によるトランスフェクシヨンのために選ばれた。約１０７細胞の集合単層が、ｌＯ％胎児ウシ血清、１００単位／ｍ！ペニシリン、１００μｇ　／　ｍ　１ストレプトマイシン及び３ｍＭ　Ｌ−グルタミンを補われたイーグルの最小必須培養基（ＥＭＥＭ）で３７℃で培養することによって得られた。この単層は、ガネム（Ｇａｎｃ＋＋ｓ　）　ら（１９７６）、Ｊ、　Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ、、１０１　：　５７　８３、記載のようにＤＥＡＥ−デキストランの存在下でベクター５ＶＨＢＶ−３ＤＮＡにより感染された。一つのフラスコは、ヘルパーとしてのＳ　Ｖ　４０　ｔｓＡｚｓｑＤＮＡ（７）０．０５７μｇと共に１．６μｇ（７）ｕ換え５ＶＨＢＶ−３により感染された。対照品は、゛同じ量のベクターヘルパーＤＮＡのみを与えられた、培養物は４０℃で１２日間インキュベートされ、次に凍結−解凍により分解され、そして− ７０℃で貯蔵された。細胞蛋白質は、上で得た凍結−解凍された細胞粉末から、、先ず２■の細胞粉末を１ｍｌの蛋白質抽出緩衝液〔２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、Ｏ，Ｑ　８Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ６（ｐＨ６，８）　、２ｍＭフェニル　メチル　スルホニル　フルオライド、０．１　Ｍジチオスレイトール、０．００１％　ブロム　フェノール　ブルー〕に加えることにより抽出された。この溶液は次に、５分間沸謄され、１５．００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離され、そしてこれから上澄みが集められる。１００／Ｊｇのサンプル蛋白質を与えるのに十分な量の上澄みを次に、後記のウェスターンプロット法で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。８、　ポリペプチド合成本発明のポリペプチドは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）ら（１９６３）　、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、８５　：　２１４９　；メリフィールドら（１９７０）、＾、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３９　：　８４　Ｌ　−８６６及びホウテン（ＨｏｕｇｈＬｅｎ　）ら（１９８Ｑ）　、＋ｎｔ、　Ｊ。Ｒｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔ、　Ｒｅｓ、、１６　：　３１１−３２０、記載の固相法により化学的に合成された。ここで用いられる比較的短いポリペプチドは、ＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応する。第６図は、ＨＢｘＡｇの１５４アミノ酸残基配列を示す。ここで述べる好ましい合成ポリペプチド（９９，１００及び１４２）のアミノ酸残基配列がまた、第６図に示される。二つの合成ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析により確認された。一般に、免疫原つまり合成ポリペプチドは、ＨＲｘＡｇの抗原決定基領域のアミノ酸残基に対応する適当に保護された多数のアミノ酸を用意すること、及びこれらアミノ酸を、該抗原決定基作られた合成ポリペプチドは、通常これを担体に結合して接合体を作り、そして有効量の接合体を生理学的に許容される希釈剤に分散することにより接種物を作るために用いることができる。ポリペプチドは好ましくは、システィン樹脂を用いて上述の固相法によって合成される。この方法を用いて、加えられる各アミノ酸のαアミノ基は典型的には、アミノ酸が成長するポリペプチド鎖に加えられる前に、第三ブトキシカルボニル（１−ＢＯＣ）基により保護される。次にｔ−ＢＯＣ基は、成長するポリペプチド鎖への次のアミノ酸の付加の前に除去される０個々のアミノ酸の鎖鎖は、下記のように保護される：　Ａｒｇ　−）シル；５ｅｒ−１Ｔｈｒ−１Ｇｌｕ　−及びＡｓｐ　−０−ベンジル；丁ｙｒ　−０−ブロモベンジロキシカルバミル；Ｔｒｐ−Ｎ−ホルミル；システィンのためにＳ−メトキシベンジル；リジンのために２−クロルベンゾキシカルボニル；及びヒスチジンのためのジニトロフェニル。アスパラギンが用いられるとき、等モル量のＮ−ヒドロキシ−ベンズトリアゾールに保護されたアミノ酸が加えられ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）がカンプリング溶媒として用いられる。Ｔｒｐ残基上のＮ−ホルミル基は、樹脂支持物からのポリペプチドの解離後に、１．０■／　ｍ　１のポリペプチド濃度で１．０　Ｍ重炭酸ナトリウムアンモニウムによる室！ＪＬ１６時間の処理により除去される。ヤマシロら＜１９７３）　、Ｊ、　Ｏｒｇ。Ｃｈｅａ、、３８　：　２９５　／、−２５９７，各段階での力、プリングの効率は、ニンヒドリン又はピクリン酸によりモニターされ、好ましくは総ての場合に９９％より大きい、ギシン（Ｇｔｓｉｎ　）（１９７２）　、、Ａｎａｌ、Ｃｈｅｗ、Ａｃｔａ。、５８：２４８−　２４９；及びカイザー（Ｋａｉｓｅｔ　）（１９８Ｑ）、Ａｎａｌ、　Ｒｉｏｃｈｅｓ、＋　３４　：５９５−５９８゜望むポリペプチドの鋼製後に、得た保護されたポリペプチドの一部（約１ｇ）は、２ｍｌのアニソール及び約２０ｍ１の無水フン化水素で処理され、ドライアイス温度で反応容器中に凝縮される。得た混合物を約４℃で約１時間攪拌して、保護基を解離しかつ樹脂からポリペプチドを離す、４℃でＮｔ流を用いてフン化水素を気化させた後に、残渣を無水ジエチルエーテルで三度抽出してアニソールを除き、残渣を減圧乾燥する。減圧乾燥された物質を５％酢酸水溶液で抽出して（３回５０ｍｊ＋）　、樹脂から遊離のポリペプチドを分離させる。抽出物含有溶液を真空凍結乾燥して、七ツマー状の非酸化ポリペプチドを得る。簡単に云えば、各ポリペプチドのための一般化した手順として、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）の０．２５　ｍＪ中の４■のＫＬＨが、ＤＭＦに溶解したＭＢＳの０．７■と反応させられ、得た混合物は室温で３０分攪拌される。ＫＬＨは約３０％以上のＤＭＦ濃度で不溶なので、ＤＭＦの局部的濃度が高すぎないようにＭＢＳ溶液が滴加される０反応生成物ＫＬＨ−ＭＢは、遊離のＭＢＳを除くために、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５（ファーマシア　ファイン　ケミカルズ、ピスカタウェイ、ニエージャージー）を備えられたクロマトグラフィーカラムに通される一２８Ｏｒ＋−でモニターされる、カラム溶出物のピーク分画カーらのＫＬＨ回収率は、典型的には約８０％である。かく作られたＫＬＩ（−ＭＢは次に、１ｍｌの緩衝液中に溶解された５■のポリペプチドと反応される。得た反応組成物のｐＨ値が７〜７．５に調節され、そして反応組成物は室温で３時間攪拌されて、ポリペプチド−担体複合体を与える。９、　ウェスターンプロット抗ポリペプチド抗体（抗９９、抗１００及び抗１４２）４！、ＨＢｘＡｇに関するその予定された特異性を確認するため、及びトランスフェクトされた細胞におけるＨＢｘＡｇの実質的ポリペプチド部分の発現を確認するために、ウェスターンプロット法を用いて調べられた。　ＲＢｘＡｇを含む細胞蛋゛白質は、１２．５％５ＤＳ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ラエムリ（Ｌａｅｓａ＋１ｉ　）（１９７０）、ネイチア、２７７：６８０−６８５；及びトウビンら（１９７９）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ。７６：４３５０−４３５４参照。蛋白質は、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅｓ　１９２　ｍＭグリシン、２０％メタノール及び０．１％５Ｉ）Ｓ　（ｐＨ８，３）より成る緩衝液を用いてエレクトロプロット装置（Ｅ、　Ｃ，ア／寸しイタス社、ジャクフンビル、フロリダ）でトウビンら（前出）記載のようにニトロセルロース（シエライヒヤー　アンド　ジェニル、カタログＮＩＢＡ８５）に電気泳動的に移された。移動に続し１て、ニトロセルロースは、非特異的結合を低減するためにＢＬＯＴＴＯ〔ボビン　ラクト　トランスファー　テクニック　オプチマイザー、ジョーンソンら（１９８３）、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１５９：１７５１−１７５６；５％（Ｗ／Ｖ無脂乾燥マＪレク；０．０１％消泡剤Ａ（シグマ社、カタログ１ｈＡ５７５８）及び０．０００１％メルチオレート（シグマ社、カタログＴｈ５２１５）　、ｐＨ７，２のＰＳＢ中〕でブロックされた。プロットは、１０ｍｊ！のＢＬＯＴＴＯ中で３時間抗ペプチド抗体の１００μｌと反応させられ、次に新鮮なりＬＯＴＴＯの５０ｍ１で１時間三度洗われた。ベクター特異的蛋白質に結合した抗ポリペプチド抗体はプロットを１０ｍ１のＢＬＯＴＴＯ中の１−１２５ラベルした黄色ブドウ球菌蛋白質Ａの２５μｌと１時間反応させることによって検出された０次にプロットは、新鮮なりＬＯＴＴＯの５　Ｑｍ７！で１５分間五度洗われ、そして流水中で２０分間洗われた。１０、肝臓癌細胞抽出物のｌ−１２５ラベル印加ＨＢＶの組込まれた（　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　）配列を含むと知られるヒト肝臓癌由来細胞系統ＰＬＣ／ＰＲＦ１５　（アレキサングーら（１９７６）　、ＡｆｒｉｃａｎＭｅｄ、　Ｊ、、５０　：　２１　２４；　ＡＴＣＣＣＲＬ８０２４）の単層を真空凍結乾燥した。細胞粉を、１■／ｍｊ＋の蓋白質濃度となるように、リン酸塩緩衝される食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に溶解した。細胞デブリスを除くために１０，０００ｘｇで遠心分離後に、上述の溶液５０ｐｌに、？５μｆｆｉのＲＩＰＡ（０，１５Ｍ　ＮａＣｊ！、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７；５）、１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　１１　４０．０．５％ナトリウムデオキシコレート、０．１％５ＤＳ）及び２０１！の０．２　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）を添加混合した。一つの研究では、かく可溶化された細胞蛋白質は、クロラミンＴ反応を用いて５ミリキユーリーのＩｚＳ■でラベルされた。第７図に示す研究では、細胞リセートは、同じ反応を用いて３マイクロキユーリーの１２ＳＩでラベルされた。上述の反応混合物を、ＰＢＳで洗われた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５（ファーマシア　ファイン　ケミカルズ社、ビス力タウェイ、ＮＪ）カラムに通した。得られる放射性ラベルされたピーク分画（９Ｘ１０’ｃｐ曽／　ｍ　１．　）は、非特異性結合を除くために、正常ラビット血清でプレインキュベートされた。簡単に云えば、ピーク分画の２０ｐｌを１．　Ｏｍ　１のＲＩＰＡ、２０μｊ！Ｔｒａｓｙｌｏｌ　（ブロチニンの商標；シグマ社、１９８４年２月カタログ第１６３頁）及び１００μβＮＲ３と混合した。０℃で１時間のインキュベーション後に、ホルマリン固定した黄色ブドウ球菌（５ｔａｐｈ　Ａ　ｉカルバイオケム、ラ　ジツラ、ＣＡ）細胞の５００μａを添加混合し、混合物を０℃で３０分間インキュベートした。　５ｔａｐｈ　Ａ沈降物を１０．０００ｘｇで１０分間の遠心分離により除き、上澄みを回収した。１１、免疫沈降（ＩＰ）ポリペプチド９９に対するラビット抗ポリペプチド血清（抗９９）を、上で得た放射性ヨウ素ラベルした細胞蛋白質と反応させた。ＮＪ単に云えば、１０μ！の抗９９を２ｘｌＯ’ｃｐｓ１のラベルされた抽出物と混合し、０℃で１時間インキュベートした８次に４０μｌの５ｔａｐｈ　Ａを加え、０℃で３０分間インキュベートした。　５ｔａｐｈ　Ａ沈降物を１０．０００ｘｇで１０分間の遠心分離により除き、ペレットを回収した。ペレットを１ｍｌのＲＩＰＡに再懸濁し、上のように遠心分離した。得たペレットを１．０　ｍ　Ｉ　ＬｉＣｊ！溶液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ、　５００ｍＭＬｉＣｊりに再懸濁し、再び遠心分離したａ　ＬｉＣｊ！溶液処理を繰返シテ、ペレットを回収した。上で得たペレットをサンプル緩衝液の５０μｌに再懸濁し、３分間沸騰した。混合物を１０，０００ｘｇで１分間遠心分離し、上澄みを回収し、１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。上述のゲルをＸＲＰ−ＩＸ！フィルムに露出して、オートラジオグラフを得た。１２．チンパン・ジー及びヒト肝臓細胞抽出物の調製及び評価二つのＨＢＶ慢性的感染チノパンツー及びヒト肝臓、及び正常チノパンツー及びヒト（ＨＢＶ血清陰性）肝臓からの肝臓サンプルを液体窒素中で急速凍結し、粉末へと挽いた。粉末をサンプル緩衝液（０，０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！　＜　ｐｌ（６，８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール及びｏ、ｏｏｉ％ブロムフェノールブルー〕に添加混合し、５分間沸騰した。混合物を１０．０００ｘｇで遠心分離して細胞デブリスを除いた。サンプルを次に、７５μ ｇ蛋白質／ゲルレーンを用いて前述のようなウェスターンプロット分析に付した。】３．ヒト血清における抗Ｉｔ　Ｂ　ｘ　Ａ　ｇ抗体の同定２０μｇ／レーンの５ＶＨＢｖ−３）ランスフエクシヨンされたＢ　Ｓ　Ｃ−１細胞抽出物を、１２％アクリルアミドゲルで５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、分離された蛋白質を前述のようにニトロセルロースシートに電気泳動的に移した。得たニトロセルロースシートを、ＨＢＶに関連する感染を持つと診断された６人（徴候のキャリア及び肝臓細胞癌腫患者を含めて）からの血清の１：５０希釈物と混合した。対照シートは、本発明のラビット抗ポリペプチド抗体と混合された。ニトロセルロース−蛋白質血清混合物を室温に２時間維持した０次にシートをすすぎ、ホースラディッシ工ペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ヒト又は抗ラビット抗体の１：２００希釈と適当に混合した。この混合物を、結合された抗Ｘ抗体を適当な抗体と反応させるために１時間維持した。シートを洗い、そして前述のように４−クロル−１−ナフトールで現像した。肝臓細胞癌腫患者からの血清は、５ＶＨＢＶ−３１−ランスフエフシランされた細胞により発現された約２４，０００ダルトンポリペプチドとの強い免疫反応を示した。１４、細胞系統及び組織サンプルＰＬＣ／ＰＲＦ１５及び）ｌｅｐＧ　２細胞は１．Ｄ、ミリヒ（ＭｉｌｉｃＪ　）博士、基礎及び治療研究部門、スクリソブス　クリニック　アンド　リサーチ　フプンデーシヲン（５ｃｒｉｐｐｓ　）、ラ　ジヲラ、カリフォルニア、により提供された。チノパンツー・肝臓組織サンプルは、Ｒ３パーセル（ＰｕｒｃｅｌＬ　）及びＰ、カブラン（Ｋａｐｌａｎ　）両博士、各々、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＤｉｓｅａｓｅｓ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ＭＰＳ′ＥｔびＯｒｔ、ｈｏ　Ｏｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ−Ｒａｒｉｔａｏ　Ｎ　Ｊ、から提供された。ヒト肝ｌ１ｉ１組織サンプルは、Ｆ。キサリ　（Ｃｈｉｓａｒｉ　）、Ｊ。ディーンスタグ（Ｄｔｅｎｓｔａｇ　）及び＾。ユ（ｖｕ　）博士、各々、５ｅｒｉｐｐｓ　、バーバード大学薬学部、ボストン、カリフォルニア大学−サンジエゴ小児科、から提供された。上記は本発明を例示するためのものであって、限定するものではない、多数の変更及び修正が、本発明の新規な概念の真の精神及び範囲を離れることなく行われうる。浄δ（内容に変更なし）ＦＩＧ、　２ＦＩＧ。３ＦＩＧ、　４日Ｇ、　７（尊）ｉ２３４　５６７８ □ ＦＩＧ、　９ＩＱ）　１　ｘｓ　４　ａ＊署　７　８　９ｔ０　１１１２１３１４日Ｇ、ＩＯ１゜事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ８５１００３５９２９発明の名称　発現マーカーとしてのＨＢＸＡ９を含むＳＶ４０発現ベクター３ｏ補正をする者事件との関係　出願人５、補正命令の日付　昭和６１年５月１３日国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＢｘＡｇをコードする又はＨＢｘＡｇの実質的部分を成すポリペプチドをコードする遺伝子に結合された発現ベクターＤＮＡを含む組換えＤＮＡ。
２．上記ＤＮＡ発現ベクターが第２図に従い塩基位置２４６８のＢａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置７６７のＨａｅ　ＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位までのシミアンウイルス４０ウイルスＤＮＡ配列を含む第一のＤＮＡ配列を含み；上記遺伝子ＤＮＡ配列が第１図に従い塩基位置１４３７のＨａｅ　ＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置２８のＢａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位までのＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ配列を含み；かつここで第一及び第二のＤＮＡ配列は操作的に結合されてＨＢｘＡｇの発現を促進するところの請求の範囲第１項に従う組換えＤＮＡ。
３．ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子が、塩基１４３７から時計方向に２８までを含むような第１図に示される塩基配列又はその実質的部分を持つ請求の範囲第１項に従う組換えＤＮＡ。
４．請求の範囲第１項に従う組換えＤＮＡ分子の少くとも一つを含む宿主。
５．宿主が枯草菌、大腸菌、酵母、ＣＯＳ−７細胞及びアフリカグリーンモンキー腎臓細胞より成る群から選ばれる請求の範囲第４項に従う宿主。
６．請求の範囲第１項の組換えＤＮＡを含む組換えＤＮＡの少くとも一つをコードするプラスミド。
７．プラスミドが、第２図に従い塩基位置２４６８のＢａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置１７１７のＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位までのシミアンウイルス４０ウイルスＤＮＡ配列を含む第一のＤＮＡ配列；第３図に従い塩基位置３７４のＢａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置０のＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位までのプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ配列を含む第二のＤＮＡ配列；及び第１図に従い塩基位置１４００のＢａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置２８のＢａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位までのＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ配列を含む第三のＤＮＡ配列を含み、ここで第一及び第二のＤＮＡ配列は、それらの各Ｅｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結合されており；第二及び第三のＤＮＡ配列は、それらの各Ｂａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結合されており；第一及び第三のＤＮＡ配列は、第４図に従いそれらの各Ｂａｍ　ＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結合されている請求の範囲第６項に従うプラスミド。
８．ＨＢｘＡｇ又はＨＢｘＡｇの実質的ポリペプチド部分を作る方法において、ＨＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド部分をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡを含む宿主中の発現系を培養プロス中で、ＨＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド部分が該宿主中又は該培養プロス中で作られ蓄積されるまで増殖すること、及び蓄積したＨＢｘＡｇ又はポリペプチドを宿主又は培養プロスから回収することを含む方法。
９．アミノ酸残基配列においてＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応する約６〜約４０のアミノ酸残基を含む抗原性合成ポリペプチド。
１０．左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて下記の式【配列があります】（ｉ）【配列があります】（ｉｉ）；及び【配列があります】（ｉｉｉ）により表わされるポリペプチド配列の群から選ばれるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第９項に従うポリペプチド。
１１．酸化されたシステイン残基により互いに結合された多数の合体された合成ポリペプチド操返し単位を含む水溶性又は水分散性抗原性ポリマーであって、上記繰返し単位は左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】【配列があります】；及び【配列があります】（ここでＲ１及びＲ２の各々はシステイン残基であり、但しＲ１とＲ２の一方のみが存在すること）より成る群から選ばれる式により表わされるところの抗原性ポリマー。
１２．請求の範囲第９項に従う抗原性合成ポリペプチドと免疫反応することができる抗原結合部位を含む受容体分子。
１３．上記ポリペプチドが左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式【配列があります】（ｉ）【配列があります】（ｉｉ）；及び【配列があります】（ｉｉｉ）により表わされるポリペプチド配列の群から選ばれるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第１２項に従う受容体。
１４．体サンプル中のＨＢｘＡｇの存在を測定するための診断評価系において、ＨＢｘＡｇと及び請求の範囲第９項に従う抗原性合成ポリペプチドと免疫反応できる抗体結合部位を含む受容体分子を含む第一の反応剤の容器の少くとも一つを含む診断評価系。
１５．受容体が請求の範囲第１３項に従う受容体である請求の範囲第１４項に従う診断評価系。
１６．上記受容体が免疫反応できるところの抗原性合成ポリペプチドである第二の反応剤を第二の容器中に含む請求の範囲第１４項に従う診断評価系。
１７．検出しうる量のＨＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド部分の存在を評価する方法において、評価されるべき体サンプルからの、固体マトリックスに結合された蛋白質を請求の範囲第１２項に従う受容体分子と、該受容体と上記ＨＢｘＡｇの間の免疫反応をシグナルするための指示手段の存在下で混合すること；該混合物を、上記指示手段が免疫反応の起きたことをシグナルするのに十分な時間維持すること；及び該シグナルの存在を確認することを含む方法。
１８．体サンプルと受容体が指示手段の不存在下で混合され、混合物は結合された免疫反応生成物を形成するのに十分な時間維持され、そして指示手段は免疫反応生成物がすすがれた後に免疫反応生成物と混合される請求の範囲第１７項に従う方法。
１９．体サンプル中に存在する抗ＨＢｘＡｇ抗体の存在を評価する方法において、（ａ）固体支持物を形成するために固体マトリツクスに固定された抗原を用意すること、ここで抗原は、実質的に精製された形のＨＢｘＡｇ、ＨＢｘＡｇの実質的なポリペプチド部分、及びアミノ酸残基配列においてＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応する約６〜約４０のアミノ酸残基を含むポリペプチドより成る群から選ばれること；（ｂ）上記固体支持物を評価されるべき液状体サンプルと混合して固液相を形成すること；（ｃ）該混合物を、体サンプル中に存在する抗ＨＢｘＡｇ抗体が上記固体支持物の抗原と免疫反応するのに十分な時間維持すること；及び（ｄ）該免疫反応の存在を指示手段により決定することの段階を含む方法。
２０．上記抗原が、ＡＴＣＣ寄託番号４０１０２のベクターによる細胞のトランスフェクションにより発現される約２４、０００ダルトンの分子量を持つポリペプチドである請求の範囲第１９項に従う方法。