JPH0832721B2 - 発現マ−カ−としてのＨＢｘＡｇを含むＳＶ４０発現ベクタ− - Google Patents

発現マ−カ−としてのＨＢｘＡｇを含むＳＶ４０発現ベクタ−

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JPH0832721B2 JP60501275A JP50127585A JPH0832721B2 JP H0832721 B2 JPH0832721 B2 JP H0832721B2 JP 60501275 A JP60501275 A JP 60501275A JP 50127585 A JP50127585 A JP 50127585A JP H0832721 B2 JPH0832721 B2 JP H0832721B2
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Description

【発明の詳細な説明】 関連する出願との関連 本願は、1984年３月８日に出願された係属出願シリア
ルNo.587,570の一部継続出願である。
技術分野 本発明は、組換えDNA技術、発現ベクター、及びポリ
ペプチド発現マーカー、及びより詳しくはＢ型肝炎HBxA
gのための遺伝子のクローニング、HBxAgを含む発現ベク
ターならびに体サンプル中のHBxAg及び抗HBxAgの存在を
決定するための評価システム及び方法に関する。
背景技術 A.クローニング及びベクター 真核細胞中への外来DNAの導入は、分子生物学の最も
強力な道具の一つとなった。このプロセスは、受容体細
胞の核中へのDNAの効率的搬入及び異種DNAを発現する細
胞の続く同定を必要とする。
宿主細胞中で複製できる加工されたベクターたとえば
プラスミド又はバクテリオファージ（ファージ）又は他
のDNA配列は、多量の特定のビールス蛋白質を作る工場
として働らく細胞を構築するために用いうる。組換えプ
ラスミドが、本明細書においてベクターの例として用い
られ、クローニングビヒクルとも呼ばれる。引用して本
明細書に組み込む米国特許第4,338,397号を参照された
い。
プラスミドは、種々のバクテリア種に見られる染色体
外遺伝要素である。それは典型的には、二本鎖の、閉じ
た、環状DNA分子である。最も広く用いられるプラスミ
ドは、pBR322であり、これはそのヌクレオチド配列及び
エンドヌクレアーゼ開裂部位が良く知られているベクタ
ーである。
プラスミド又はファージベクターを用いる核酸生産
は、極めて進展してきた。プラスミド又はファージDNA
は、制限エンドヌクレアーゼで開裂され、選択された外
来DNAにインビトロで結合される。得た組換えプラスミ
ド又はファージは次に、大腸菌のような細胞中に導入さ
れ、そしてそのように作られた細胞は、加工されたベク
ターの多数のコピーを作るために誘発される。クローニ
ングベクターにより十分な量のDNAがひとたび作られる
と、作られた外来DNAは切除され、そして外来遺伝子に
よりコードされる蛋白質又はポリペプチドを作る又は転
写するために第二のベクター中に入れられる。
DNA（完全な遺伝子、cDNA又はバクテリア遺伝子）に
依存して、受容体細胞における直接発現に真核転写及び
翻訳シグナルを与えることが必要でありうる。これのシ
グナルは、外来DNAをインビトロで発現ベクターと結合
することにより与えられうる。
発現ベクターは、クローンされた遺伝子の転写及びそ
れらのメッセンジャーRNA（mRNA）の蛋白質への翻訳の
ために必要なDNAの配列を含む。典型的にはそのような
必要な配列又は制御要素は、（１）転写のための開始点
をシグナルするプロモーター；（２）転写のための終点
をシグナルするターミネータ；（３）プロモーターを調
節するオペレーター；（４）細胞の蛋白質合成の機械の
初結合のためのリボソーム結合部位；及び（５）蛋白質
合成開始及び終了をシグナルする開始及び停止コドンで
ある。
発現ベクターは、有用であるために、いくつかの追加
的特性を持たねばならない。それは、比較的に少さくな
ければならず、また強いプロモーターを含まねばならな
い。発現ベクターは、形質転換体の同定を可能にする一
又は二以上の選択マーカーを持たねばならない。それは
また、発現のために必須でないベクターの領域で一又は
二以上の制限酵素のための認識部位を含まねばならな
い。
従って発現ベクターの構築は、複雑でいく分予測でき
ない冒険である。発現ベクターの有効性の唯一の真のテ
ストは、適当なmRNAの合成が開始される頻度を測定する
ことである。しかしmRNAの定量は、長たらしく、正確な
測定を得ることはしばしば困難である。従って他のより
実際的な手段が、形質転換を検出するために開発され
た。
一つのそのような手段は、形質転換された細胞におけ
る異種蛋白質の合成を酵素的評価によりモニターするこ
とである。いくつかのマーカー遺伝子が、形質転換が起
きたことを指示するために開発された。
形質転換をモニターするために用いられる別の手段
は、免疫学的反応剤の使用を含む。もし、発現された蛋
白質の濃度が十分に高いなら、螢光染料たとえばフルオ
レセイン又はローダミンに結合された抗体との細胞質又
は表面免疫螢光が、ベクター特異的蛋白質発現生成物を
検出するために用いられうる。
より一般には、形質転換された細胞は、免疫沈降の後
に放射性の存在下で培養される。このアプローチは、形
質転換特異的マーカーを検出するために、免疫複合体黄
色ブドウ球菌蛋白質Ａ選択〔ケスラー（Kessler）、（1
975）、ジャーナルオブイミュノロジー（J.Immuno
l.）、115:1617−1624〕及びウェスターン ブロッティ
ング法〔レナート（Renart）ら、（1979）、プロシーデ
ィングズ オブ ナショナル アカデミー ナブ サイ
エンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:31
16−3120〕で用いられた。
シミアンウィルス40（SV40）ベクターを用いる遺伝子
発現の分析は、生物学的及び免疫化学的レベルで最も探
究された真核形質転換技術である。SV40ゲノムの組織に
関する遺伝及び生化学情報は、ウィルスゲノムのヌクレ
オチド配列により確立又は確認された。トーズ（Tooz
e）（1980）、モレキューラーバイオロジー オブ チ
ューマー バイラシーズ、第２版、第２部、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー、コールドスプリ
ング ハーバー、ニューヨーク、による総説参照。種々
のSV40ベクター分子のデザインは、遺伝子シグナルの正
確なマッピング及びSV40ゲノムから所定のフラグメント
の単離のための制限エンドヌクレアーゼの使用に依存し
てきた。
SV40は当初、リティック（lytic）システムを用いる
真核形質導入ベクターとして開発された。マリガン（Mu
lligan）ら、（1929）、ネイチア（Nature）（ロンド
ン）、277:108−114。次に形質転換（非リティック）ベ
クターが、SV40ゲノムの単離されたセグメントにより構
築された。エルダー（Elder）ら、（1981）、Annu.Rev,
Genet.,15:295−340。
ハマー（Hamer）らは、プローベが入手できない遺伝
子をクローンするためにSV40を用いることを初めて示唆
した。彼らは、ヘテロジニアスmRNA集合からの二本鎖cD
NAがSV40ベクター中にショットガン（shotgunned）され
うること及び望む配列を持つウィルスが放射性又は螢光
性抗体を用いて同定されうることを示唆した。
ハマーらは初めて、1979年に発現マーカーを含むSV40
組換え発現ベクターの構築を報告した。ハーマーら、
（1979）、セル（Cell）、17:725−735。彼らのSV40ベ
クターは、0.14マップユニットのBam HIエンドヌクレア
ーゼ制限部位から時計方向に0.82マップユニットのHae
II制限部位までのウィルスDNA配列を含んだ。全体の初
期遺伝子Ａ及びウィルスDNA複製のオリジンに加えて、
ベクターは、ウィルスプロモーター、リーダー、介在配
列、体の５′部分、及びウィルス後期195mRNAのための
３′末端配列を含んだ。それは、ウィルス蛋白質UPI、
２及び３をコードする後期領域配列の1660塩基対（bp）
を含まなかった。プリエルズ（Priers）ら、（1978）、
ネイチア、273:113−120、及びレッディ（Reddy）ら、
（1978）、サイエンス（Saience）、200:494−502。
ラビットβーグロブリン遺伝子暗号配列は、発現マー
カーとして上述のベクター中にリゲートされた。それら
の組換えベクターで感染されたモンキー細胞中でラビッ
トβーグロブリンが合成されたかどうか見るために、ハ
マーら（前出）は、1.0ナノグラムという少しのグロブ
リンを検出できるラジオイムノアセイを用いた ハマーらは、β−グロブリン発現の肯定的証拠を示す
ことができたが、彼らはSV40/β−グロブリン組換え系
の有益性に関していくつかの留保を示した。まず、グロ
ブリンは少ししか可溶でないので、測定のためのサンプ
ルの調製の間にかなりの損失をこうむったであろう。す
なわち、感染した細胞におけるグロブリンの量の測定
は、10倍もの誤差を持つかも知れない。第二に、この評
価法は、本来のグロブリンと他の免疫学的関連生成物た
とえば読み過し蛋白質又はポリペプチドフラグメントと
を区別できない。
ハマーらが述べなかったファクターは、総ての真核グ
ロブリンの間の高程度の相同性である。この相同性は、
宿主細胞系に対して内在性のグロブリンからベクター誘
発グロブリン発現を区別することを困難にする。
B.B型肝炎ウィルスペプチド及び抗ポリペプチド抗体 肝炎ウィルスは、かなり種々の物質である。それら
は、影響する標的組織、肝臓によって厳密に分類され
る。多数のウィルスが全身感染の一部として肝臓に影響
するが、肝炎ウィルスという言葉は、通常、Ａ型（HA
V）、Ｂ型（HBV）及び非Ａ非Ｂ型を意味するものととら
れる。ウィルスの三つのタイプのうち、HBVが生物学、
免疫化学及び治療レベルではるかに最大に探究されてい
る。
HBVは、DNAウィルスとして分類され、他の総ての族の
DNAウィルスとは多くの点で異る。HBVは、蛋白質、脂質
及び炭水化物より成りかつユニーク抗原複合体すなわち
Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）を有する外側コート（膜又
はエンベロープよりも実体的な）を持つ。またそれは、
表面抗原とは明らかに異る抗原特異性を持つ内部ヌクレ
オキャプシッドすなわちＢ型肝炎コア抗原（HBcAg）を
含む。
可溶性抗原HBeAgがまた、当該技術分野で認められて
いる。この抗原は、HBVコア中に集められないHBcAgポリ
ペプチドより成ると考えられ、かつ従って非集合状態で
ユニーク抗原特異性を持つ。
典型的自己制限的急性HBV感染において、下記の血清
学的マーカーが、感染された宿主の血清中に連続的に現
われる:HBsAg、HBeAg、抗HBC、抗HBE、及び抗HBS。抗HB
Eの出現は、検出しうるHBsAgの終局的喪失をシグナルす
る。このことは、自己制限された急性HBV感染の総ての
場合において妥当する。HBSがなくなるに続いて、抗HBS
の出現前に２、３週間から数ヶ月の遅延がある。
慢性的HBV感染の間に、HBsAg及び抗HBCが存在する。
宿主の血清は、HBeAg又は抗HBE血清学的マーカーを示し
うる；すなわち患者は、HBeAg又は抗HBE陽性でありう
る。
HBVマーカーのいくつかのための敏感なかつ特異性な
ラジオイムノアッセイ及び酵素免疫評価が広く用いられ
る。これらの高度に敏感な血清学的テストは、HBV感染
の途上におけるウィルスの出現及び免疫応答マーカーを
モニターする基礎を与えた。
過去数年の間に、各血清学的マーカーがHBV複製の間
の宿主応答に関する特異的ウィルス事象を知らせること
を多くの研究が示した。すなわち、病気の治療途上にお
ける種々の段階における血清学的マーカーのプロフィー
ルは、有用な診断及び予後情報を提供しうる。
Ｂ型肝炎ウィルスとヒト肝細胞癌（HCC）、肝臓癌の
間の関連が大いに研究され、そして血液伝染病学的なら
びに履歴病理学的発見は、HBVが直接又は間接的に肝臓
癌の病原に係っていることを強く示唆する。多数の肝癌
細胞系統がヒトHCCから誘導され、そのような細胞系統P
LC/PRF/5及びEPH3Bのゲノム中に組込まれたHBV特異的DN
Aの検出が報告された。しかしこれらの細胞系統におい
て、Ｂ型肝炎表面抗原のみが、組織培養においてウィル
ス特異的遺伝子産生物として発現された。HBVの他のマ
ーカー、たとえばＢ型肝炎コア抗原、肝炎BE抗原、及び
DNAポリメラーゼは検出されなかった。
動物のいくつかのDNA腫瘍ウィルスは、ウィルスゲノ
ムの複製及び組込みを司るウィルス遺伝子の作用を通し
て形質転換を作ることができ、そしてそのようなウィル
スによる形質転換された細胞は、形質転換性遺伝子によ
り発現されるＴ（腫瘍）又は新抗原を有しうる。Ｔ抗原
に類似の抗原の最近の証拠は、抗補体免疫螢光染色法を
用いて、組込まれたHBV遺伝子を含むヒト肝癌細胞で得
られた。この抗原は、HBV関連核抗原（HBNA）と名付け
られた。ウェン（Wen）ら、（1983）、インフェクト．
イミュン（Infect.Immun.）、39:1361−1367。
HBNAは、いく人からのHBsAg陽性HCC患者からの血清に
おいて検出され、抗原の発現は細胞培養及び腫瘍組織の
両者において示された。加えて、抗HBNA抗体が、HCCを
持ついく人かのHBsAg陽性患者の血清中で見られた。HBN
Aは、HBV遺伝子の従来認識されていなかった発現を示す
かも知れない。
1979年にガリバート（Galibert）ら、ネイチア、281:
646−650、は、ウィルスのうちで特徴的な、部分的二本
鎖かつ部分的一本鎖である約3200塩基の環状DNAであるH
BVゲノムのヌクレオチド配列を報告した。ゲノムの長い
即ちＬ鎖（完全に環状の）は、ウィルス蛋白質を説明す
るに十分に大きな四つの読み枠を含むことが見い出され
ている。これらの領域は、Ｓ、Ｃ、Ｐ及びＸと呼ばれ、
第１図に図示的に示される。
領域Ｓ及びＣは、各々HBsAg及びHBcAgのための遺伝子
を含むことが見い出された。領域Ｐは、サイズ及びアミ
ノ酸残基内容においてDNAポリメラーゼに類似の蛋白質
をコードすると考えらる。領域Ｘは、HBNAをコードする
遺伝子の可能性ある源の一つであるとウェンら（前出）
により考えられている。
領域Ｐ及びＸにおける遺伝子のための機能の単なる仮
定的割り当ては、HBVの遺伝子組織及び分子生物学を理
解するにおいてまだ存在するギャップを示す。このギャ
ップの理解は、ウィルスの増殖のためのインビトロ系の
不存在である。
最近まで、HBVの唯一の源は、ヒト患者の血清であっ
た。細胞培養におけるウィルスの増殖の試みの失敗は、
その極めて狭い宿主細胞範囲の結果である。
HBV DNA及びその遺伝子産生物を作る問題への一つの
アプローチは、組換えDNA技術を用いることであった。
この技術は、特定のウィルス蛋白質をコードする核酸配
列の大規模生産を可能にする。
ティオライス（Tiollais）ら、（1981）、サイエン
ス、213:406−411、は、HBsAgをコードする遺伝子を含
むpBR322による大腸菌の形質転換を報告し、またその単
離された遺伝子のかなりの量の生産を報告した。これら
研究者はまた、HBVゲノム内におけるHBsAg遺伝子の位
置、及び蛋白質へのその発現を影響する因子を言及した
いと望んだ。これを行うために、彼らは、バクテリア及
び哺乳類の両者の細胞で用いるためのHBsAg遺伝子を含
む発現ベクターを構築した。
ティオライスら（前出）により構築された発現ベクタ
ーの一つは、HBsAg抗原決定基を含む大腸菌における蛋
白質の生合成を達成した。HBsAgをコードする遺伝子の
一部をバクテリオファージplac5−luv5中に挿入し、自
然のHBVの読み枠を保存するようにして作られた。
哺乳動物細胞におけるHBV遺伝子発現を研究するため
に、ティオライスら（前出）は、全HBVゲノム内に種々
の位置でトランスフェクション要素を挿入することによ
り一連のHBsAg発現プラスミドを構築した。トランスフ
ェクション要素は、全HBVゲノムをベクターで形質転換
されたマウス細胞のゲノム中にいくつかの異る配位で組
込むことを可能にした。この方法でベクターを増加する
において、これら研究者はHBVの自然に生じる遺伝子制
御要素を用いることを試みた。
ティオライスら（前出）により報告された六つの発現
ベクターの僅か三つのみが、望むHBsAg蛋白質の発現を
行った。その産生は、ビツジ抗HBsAg抗血清を用いて組
織培養液におけるその存在をテストすることによって検
出された。この研究の時点で知られていた他のウィルス
マーカー（すなわちHBcAg、HBeAg及びDNAポリメラー
ゼ）は、形質転換された細胞において検出されなかっ
た。
上述のティオライスらの研究の時に、領域Ｘの可能性
ある存在は、それがHBV蛋白質をコードする可能性と共
に知られていた。すなわち、HBVゲノムは、従来ウィル
スに関連されたのより多い蛋白質をコードする能力を含
むことが知られた。
この問題は、表現型の研究において遺伝子型と呼ばれ
た。なかんずく、ウェンら（前出）が領域Ｘを、HBNAを
コードする遺伝子を含むと考えたときに彼らが述べたの
がこの問題である。
上述のティオライスら及びウェンらの研究の前に、サ
ットクリフェ（Sutcliffe）ら、（1980）、ネイチア、2
87:801−805、は、なかんずくこの問題を解く一般的技
術を示した。彼らは、その蛋白質生成物が未知であった
ウィルス遺伝子のヌクレオチド配列により予告される蛋
白質内からのポリペプチドを化学的に合成した。抗体が
ポリペプチドに対して生ぜられ、ウィルスにより感染さ
れた細胞により作られた総ての蛋白質に対して反応され
た。予告された蛋白質の一部に対する抗体を用いて、サ
ットクリフェらは、従来未知で認識されていなかったウ
ィルス蛋白質生成物を検出した。
今日まで、HBVゲノム領域Ｘの蛋白質生成物を明瞭に
同定するこの方法及び何らかの他の方法の使用は、報告
されていない。これは、合成抗原を作りそして所定の特
異性の抗体を誘発するためにこれらを用いる一般的概念
は記載されているが、予測性を拒み続ける大きな部分が
この方法に残っている故である。
これの理由はいくつかある。第一に、遺伝子配列から
導かれた蛋白質アミノ酸残基配列は、もしヌクレオチド
配列読み枠が遺伝暗号の冗長性の故に堅固に確立される
というのでなければ、仮説的性質のものである。
第二に、合成抗原は、自然な環境において完全な蛋白
質と免疫反応する抗体を必ず誘発する訳ではない。第三
に、免疫原に対する宿主の自然の抗体が、免疫原のアミ
ノ酸配列の短い線形部分に対応するポリペプチドとほと
んど免疫反応しない。
発明の簡単な説明 本発明は、いくつかの面を持っている。一つの面は、
HBxAgをコードする遺伝子に結合された発現ベクターを
含む組換えDNAである。特に好ましい組換えDNAにおい
て、DNA発現ベクターは、第２図において塩基位置2468
におけるBam HIエンドヌクレアーゼ制限部位から時計
方向に塩基位置767におけるHae IIエンドヌクレアーゼ
制限部位までのシミアンウィルス40ウィルスDNA配列を
含む第一のDNA配列を含む。そしてHBxAgをコードする遺
伝子は、第１図において塩基位置1437におけるHae IIエ
ンドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置28に
おけるBam HIエンドヌクレアーゼ制限部位までのＢ型肝
炎ウィルスDNA配列を含む第二の遺伝子DNA配列により備
えられる。第一及び第二のDNA配列は、HBxAgの発現を促
進するために操作的に結合される。
本発明の別の面は、HBxAgを、又はHBxAgの実質的部分
を構成するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換
えDNAにより構成される。特に好ましい組換えDNAは、HB
xAgをコードする遺伝子を含み、第１図で塩基位置1437
から時計方向に28までをカバーする塩基配列又はその実
質的部分を持つ。
HBxAgをコードする。又はその実質的部分を構成する
ポリペプチドをコードする遺伝子を含む少くとも一つの
組換えDNAをコードするプラスミドが、本発明のもう一
つの面を成す。このプラスミドは、第１図において塩基
位置1437から時計方向に28までをカバーする塩基配列又
はその実質的部分を含みうる。特に好ましい態様におい
て、プラスミドは、第２図の塩基位置2468のBam HIエン
ドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置1717の
Eco RIエンドヌクレアーゼ制限部位までのシミアンウィ
ルス40（SV40）ウィルスDNA配列を含む第一のDNA配位；
第３図の塩基位置375のBam HIエンドヌクレアーゼ制限
部位から時計方向に塩基位置０のEco RIエンドヌクレア
ーゼ制限部位までのプラスミドpBR322DNA配列を含む第
二のDNA配列；及び第１図の塩基位置1400のBam HIエン
ドヌクレアーゼ制限部位から時計方向に塩基位置28のBa
m HIエンドヌクレアーゼ制限部位までのＢ型肝炎ウィル
スDNA配列を含む第三のDNA配列を含む。このプラスミド
において、第一及び第二のDNA配列は、これらの各々のE
co RIエンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結合され
る；第二及び第三のDNA配列は、これらの各々のBam HI
エンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結合される；そ
して第一及び第三のDNA配列は、第４図に従いこれらの
各々のBam HIエンドヌクレアーゼ制限部位で操作的に結
合される。
HBxAg又はHBxAgの実質的ポリペプチド部分を作る方法
が、本発明の別の面を成す。この面において、本発明の
発現系を含む宿主は、HBxAg又はその実質的ポリペプチ
ド部分が宿主又は培養ブロス中で作られ蓄積されるま
で、培養ブロス培養基中で増殖される。蓄積されたHBxA
g又はその実質的ポリペプチド部分は、その後回収され
る。
本発明の別の面は、抗原的合成ポリペプチドを考え
る。この合成ポリペプチドは、約６〜約40のアミノ酸残
基を含み、配列においてHBxAgの抗原決定基の配列に対
応する。特に好ましいポリペプチドは、左から右へかつ
アミノ末端からマルボキシ末端の方向に書いて下記の式
により示されるポリペプチド配列の群から選択されるア
ミノ酸残基配列を含む。
（ｉ）Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-
Tyr-Phe-Lys-Asp; （ii）Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-
Ile-Arg-Leu-Lys-Val;及び （iii）Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala 酸化されたシスティン残基により互に結合された合体
した合成ポリペプチド繰り返し単位の多数を含む水溶性
又は水分散性抗原性ポリマーがまた、本明細書で考慮さ
れる。繰返し単位は、アミノ末端及びカルボキシ末端の
両者でシスティン残基を含む又は一つの末端に一つのシ
スティン残基そしてポリペプチド鎖内に一つのシスティ
ン残基を含む、下記に述べるポリペプチドより成る。ア
ミノ及びアルボキシ末端システィン残基を含む特に好ま
しいポリペプチド繰返し単位は、左から右へかつアミノ
酸末端からマルボキシ末端の方向に書いて下記より成る
群から選ばれた式により示される。
Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Ty
r-Phe-Lys-Asp-Cys; Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Il
e-Arg-Leu-Lys-Val-Cys;及び R1‐Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R2 ここでR1及びR2の各々は、システィン残基であるが、
但しR1とR2の一方のみが存在すること。
抗体結合部位を含む受容体分子、たとえば上述の抗原
性ポリペプチドの一つと免疫反応できる抗体がまた、こ
こで考慮される。これら受容体分子が免疫反応する特に
好ましいポリペプチドは、前述したポリペプチドにより
例示される。これら受容分子はまた、HBxAg又はこれの
実質的部分と免疫反応する。
評価されるべき体サンプル中での検出しうる量のHBxA
gの存在を測定するための診断評価系もまた考慮され
る。この系は、上述の受容体分子を含む剤を収容する少
くとも一つの容器を含む。この系は更に、第二の容器中
の第二の剤を含む。この第二の剤は、受容体分子が免疫
反応する抗原的合成ポリペプチドである。受容体分子と
HBxAgの間の免疫反応をシグナルする手段が、診断評価
系の別の一部を構成しうる。
体サンプル中の検出しうる量のHBxAgの存在を評価す
るための方法は、本発明の別の面を成す。ここでHBxAg
の検出しうる量の存在を評価さえるべき体サンプルから
の蛋白質が、受容体とHBxAgの間の免疫反応をシグナル
するための指示手段の存在下で上述の受容体分子と混合
される。混合物は、指示手段が免疫反応の起ったことを
シグナルするのに十分な時間維持される。次に、このシ
グナルの存在が確認される。
図面の簡単な説明 本発明の開示の一部の成す図において； 第１図は、ティオライスら、（1981）、サイエンス、
213:406−411からの、かつオノ（Ono）ら、（1983）、
N.A.R.、11:1747−1757により修飾されたHBV/adwゲノム
の物理的構造及び遺伝子組織を示す図式内ダイアグラム
である。Ｌ鎖の５′末端は、Ｓ鎖の５′未満と塩基対に
されていると報告される。弧に結びついた矢印により示
される或る制限部位及び制限エンドヌクレアーゼの略記
は、オノら（前出）により分析されたHBV/adwゲノムの
物理的マップに対応する。ゲノムを囲む幅広の矢印は、
Ｌ鎖の四つの大きなオープン領域に対応する。これら四
つの潜在的コーディング領域は、Ｓ、Ｐ、Ｘ及びＣと名
付けられる。四つの名付けられた領域の各々に続くカッ
コ内のアミノ酸残基（aa）の数は、各領域によりコード
される仮説的ポリペプチドの長さに対応する。定義され
た遺伝子Ｓ及びＣに対応する二つの領域は、幅広の矢印
内のドットを付したエリアにより示される。単一のEco
RIエンドヌクレアーゼ開裂部位が、マップのオリジン
の点として用いられる。
第２図は、レディ（Reddy）ら、（1978）、サイエン
ス、200:494−501により出版され、ファン フーバース
ウィン（Van Heuverswyn）及びフィアーズ（Fiers）、
（1979）、Eur.J.Biochem.、100:51−60、により修飾さ
れた一次配列から作られたSV40DNA制限マップを図式的
に示す。
第３図は、サットクリフェ（1979）、コールド スプ
リング ハーバー シンポジウム オン クオンティテ
イティブ バイオロジー43、77の一次配列データから作
られたプラスミドpBR322制限マップを図式的に示す。
第４図は、クローニングベクターSVAM191を作りそし
て次にHBxAgの本質的部分を発現する発現ベクターSVHBV
−３を作るために、AM6（波状線）、pBR322（実線）及
びSV40（点線）から作られた本発明のベクター中にDNA
フラグメントを挿入するのに用いられる。本明細書の材
料及び方法の部で述べる方法を図式的に示す。Bam HI、
Eco RI及びHae IIに関する制限エンドヌクレアーゼ部位
の相対的位置は、各々黒丸、白丸及び黒三角により示さ
れる。SV40ゲノムのオリジン（ori）及び初期及び後期
プロモーターもまた示される。
第５図は、SV40後期プロモーターのための遺伝子、ア
ミノ末端99アミノ酸残基（99aa）、及び132カルボキシ
末端アミノ酸残基をコードするHBxAg遺伝子配列の実質
的ポリペプチド部分（132aa;154アミノ酸残基の132）を
含むSVHBV−３組換え発現ベクターの線形部分を示す。
また、ベクターにより発現されるVP2 HBxAg融合蛋白質
のためのmRNAが示される。
第６図は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ
末端の方向に示したHBxAgをコードする遺伝子の翻訳さ
れたアミノ酸残基配列を示す。SVBHV−３により発現さ
れるHBxAgの実質的部分は、発現されたHBxAgポリペプチ
ドのアミノ末端残基であるアミノ酸残基位置23（Ala）
の矢印で示される。HBxAg配列中の本発明の99、100及び
142と呼ばれる合成ポリペプチドの相対的位置は、三つ
のラベルされた、アンダーラインされたアミノ酸残基配
列により示される。従って合成ポリペプチド99のアミノ
酸残基配列は、図に示されるアミノ末端Met残基から位
置100ないし115に対応し、合成ポリペプチド100の配列
は、図のアミノ末端Met残基から位置115ないし131に対
応し、そして合成ポリペプチド142の配列は図のアミノ
末端Met残基から位置144ないし154すなわち11のカルボ
キシ末端残基に配列において対応する。
第７図は、二つのヒト肝癌細胞リセート（lysate）と
の抗Ｘ抗血清の反応性を示すオートラジオグラムの写真
である。二つのヒト肝癌細胞系統、PLC/PRF/5及びHepG2
は、10％胎児ウシ血清によるイーグルの培養基のデュル
ベッコの修正物中でサブコンフルエンシーまで（コンフ
ルエント培養基から1:5の分裂の第６日）まで増殖され
た。上澄みを除き、細胞をこすり落して集める前に単層
を含むフラスコを５分間氷の上においた。そして集めた
細胞を遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを
リン酸塩緩衝食塩水（PBS）で洗い、−70℃で急速冷凍
し、一夜凍結真空乾燥した。得た細胞粉をPBSに溶解
し、サンプル緩衝液中の2mg/mlの最終濃度とした。サン
プルを５分間沸騰し、細胞デブリスをベックマンマイク
ロ遠心機で遠心分離により除いた。細胞リセートの50μ
ｇを、RIPA緩衝液〔１％ノニデット（Nonidet）ｐ−40
（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニル エーテ
ル）、0.05％ナトリウムデオキシコレート及び0.1％SDS
を含むPBS〕中で15分間インキュベートし、クロラミン
Ｔ反応（マッコネイ（McConahey）ら（1966）、Int.Arc
h.Allergy、29:185−189）により３マイクロキューリィ
の125Iで放射能ラベルした。放射能ラベルされた肝癌リ
セートの各々の1.5×106カウント／分（cpm）を、RIPA
中で抗Ｘポリペプチドの10μｌと60分間反応させた。抗
原−抗体複合体（免疫反応生成物）を、ホルマリン固定
した黄色ブドウ球菌で沈降した。ペレットをRIPAで一
度、500mMのLiCl、100mMのTris（pH＝8.5）で二度洗
い、放射能を分析した。総てのペレットを、40μｌサン
プル緩衝液〔0.0625M Tris−HCl（pH6.8）、２％SDS、1
0％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール及び
0.001％ブロムフェノールブルー〕に溶解し、３分間沸
騰し、細胞デブリスを除くために遠心分離し、下記のよ
うにSDS−PAGEに付した。
放射能ラベルした細胞リセートを、変性化ナトリウム
ドデシルサルフェート・ポリアクリルアミド ゲル（1
2.5％）（SDS−PAGE）上に与え、ラエムリ（Laemmli）
（1970）、ネイチア、297:680−685、の手順に従い電気
泳動に付した。蛋白質を、トウビン（Towbin）ら（197
9）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76:4350−4354、記載の
ようにニトロセルロースシートに電気泳動的に移した。
ニトロセルロースシートを、非特異的結合の減少のため
にBLOTTO〔ジョンソン（Johnson）ら（1983）、J.Exp.M
ad.,159:1751−1756〕中で４℃で一夜のインキュベーシ
ョンの前に、アミドブラック中で着色した。ニトロセル
ロースストリップを10ml BLOTTOの最終体積で抗ポリペ
プチド抗体の1:350希釈により室温で３時間インキュベ
ートした。ストリップを、125Iラベルした黄色ブドウ球
菌蛋白質Ａ（106cpm/ml）で１時間のインキュベーショ
ン前に、BLOTTO中で洗った。ポリペプチドによる競争が
下記で示される場合、抗ポリペプチド抗血清は、放射能
ラベルされた抗原の添加前に、100μｇのポリペプチド
で60分間インキュベートされた。ストリップは上述のよ
うに洗われ、水ですすがれ、乾燥され、そしてオートラ
ジオグラフを採られた。レーン１及び５は、抗ポリペプ
チド99抗体（抗99）と反応された；レーン２は、ポリペ
プチド99でプレインキュベートされた抗99と反応され
た；レーン３は、関連のないポリペプチドでプレインキ
ュベートされた抗99と反応された；そしてレーン４は、
免疫前（プレイミューン）血清対照品と反応された。He
pG2細胞からのリセート（レーン１〜４）は、抗ポリペ
プチド99と反応しなかった。右余白の矢印は、28,000及
び45,000ダルトンの分子量を持つ蛋白質の移動位置を示
す。
第８図は、チンパンジー（C;レーン３及び４）及びヒ
ト（H;レーン１及び２）肝臓組織との抗Ａ抗血清の反応
性を示す写真である。チンパンジー及びヒトからの肝臓
切片を、液体窒素中で急速冷凍し、ウス及びキネで細か
い粉末に挽いた。細胞粉末を、第７図で述べたように、
サンプル緩衝液に溶解し、ゲル電気泳動に付し、ブロッ
トした。ニトロセルロースストリップを、第７図で述べ
たように抗血清の1:50希釈で現像した。但し、二つの変
更点がある：（１）総てのインキュベーション及び洗滌
においてBLOTTOの代りに１％ウシ血清アルブミン（BS
A）溶液を用いた；また（２）抗原に結合した抗体を、
ホースラディッシュペルオキシダーゼに接合したヤギ抗
ラビットIgGで検出した。抗原−抗体免疫反応生成物
は、ストリップを下記の現像液に浸すことによって可視
化した。現像液は、8mgの４−クロル−１−ナフトール
及び330μｌの30％過酸化水素を含む無水エタノール250
μｌを50mlのTBS緩衝液に37℃で加えて作った。ポリペ
プチド99に対する抗血清（抗99）が、二つの左方の図
（ブロックされた及びブロックされない）において用い
られた。一方、ポリペプチド142に対する抗血清（抗14
2）が、二つの右方の図（ブロックされた及びブロック
されない）において用いられた。図の左側の数字には、
各々、66、45、31、21及び14キロダルトンの分子量を持
つ蛋白質のゲル移動位置を示す。
第９図は、結合プローベとしてＢ型肝炎ウィルス（HB
V）DNAを用いた、Ｘ蛋白質を示す肝臓組織からのヒト及
びチンパンジー制限酵素開裂肝臓DNAのサザーンブロッ
ト分析の写真である。全DNAが、第８図に述べたサンプ
ルから作られた細胞粉末から抽出された。10μｇのDNA
を、１％アガロースゲル上の各くぼみに与えた。制限酵
素消化緩衝剤は、生産業者（BRL）によった。総ての消
化は、50単位の酵素（μｇ単位で５×DNA濃度）で37℃
で一夜実施した。レーン１〜３は、各々、Bam HI、Eco
RIで消化した又は非開裂のチンパンジー（chim）Ａ−24
3肝臓DNAを示す；レーン４〜６は、各々、Bam HI、Eco
RIで開裂した又は非開裂のchim344肝臓DNAを示す；レー
ン７〜10は、各々、HindIII、Bam HI、Eco RIで切断し
た又は消化なしのヒトHBcAg陽性肝臓DNAを示す；レーン
11〜14は、各々、HindIII、Bam HI、Eco RIで消化した
又は非消化のヒトHBsAgの陰性肝臓DNAを示す。
第10図は、抗Ｘポリペプチド抗血清とＸに指令された
遺伝子生成物との反応性を示すオートラジオグラムの写
真である。BSC−１細胞のコンフルエント単層（２×107
細胞）は、組換えSVBHV−３ストックウィルス（tsA239
及びSVHBV−３ヴィリオンの混合物）又は野性タイプSV4
0で感染された〔モリアーティ（Moriarty）ら（198
1）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78:2606−2610〕。培養
物を、無血清のDMEM中で40℃で、約50％の細胞変性効果
が起る時まで48〜72時間インキュベートした。上澄みを
除き、細胞をこすり落して集める前に単層を含むフラス
コを氷の上に５分間置いた。集めた細胞を遠心分離し、
得た細胞ペレットをPBSで洗い、−70℃で急速冷凍し、
一夜、凍結真空乾燥した。得た細胞粉末をPBSに溶解
し、サンプル緩衝液中の2mg/mlの最終濃度とした。サン
プルを５分間沸騰し、細胞デブリスをベックマンマイク
ロ遠心分離機で30分間遠心分離により除いた。細胞リセ
ートの50〜100μｇを、変性化ポリアクリルアミドゲル
（12.5％）上に与え、前述したように電気泳動に付し
た。蛋白質を、前述したようにニトロセルロースシート
に電気泳動的に移した。ニトロセルロースブロットを、
非特異的結合の減少のためにBLOTTO中で４℃で一夜のイ
ンキュベーションの前に、アミドブラック中で着色し
た。ニトロセルロースストリップを、10ml BLOTTOの最
終濃度で抗ペプチド抗体の1:350希釈で室温で３時間イ
ンキュベートした。ストリップを、125Iラベルした黄色
ブドウ球菌蛋白質Ａ（106cpm/10ml）で１時間インキュ
ベーションの前に、BLOTTO中で洗った。ストリップを上
述のように洗い、水ですすぎ、乾燥し、そしてオートラ
ジオグラムを得た。ポリペプチドでのブロッキングを実
施する場合、抗血清を、ニトロセルロースストリップで
のインキュベーションの前に、４℃で一夜又は37℃で２
時間100μｇのポリペプチド溶液でプレインキュベート
した。分子量は、低分子量標準（BioRad）に基いたが、
これらを図の左余白に示す。レーン１及び３は、各々、
抗ポリペプチド99及び抗ポリペプチド142抗体と反応さ
れた。レーン２及び４は、各々、ポリペプチド99で又は
ポリペプチド142でプレインキュベートされたこれら同
じ抗体と反応された。レーン５及び６は、各々、抗ポリ
ペプチド99及び142抗体と対照細胞リセートとの反応を
示す。
本発明は、いくつかの利益及び利点を持つ。これら利
益の一つは、第一に任意の細胞におけるHBxAgの存在が
検出されることである。
他の利益は、本発明が慢性的にＢ型肝炎感染された宿
主動物におけるHBxAgの存在を検出する評価法及び系を
与えることである。
更に別の利益は、本発明の使用がヒト肝臓癌から導か
れた細胞におけるHBxAgの検出を可能にし、それにより
Ｂ型ウィルスとこの形の癌の間の予想された関連を確か
にしたことである。
本発明の利点の一つは、それがHBxAgをコードする遺
伝子をクローニングする手段を与えることである。
本発明の別の利点は、それが、ヒトの血清中に存在す
るHBxAgに対する抗体（抗Ｘ抗体）の存在についての診
断評価における抗原として用いられうるHBxAgの実質的
ポリペプチド部分を発現するための手段を提供すること
である。
本発明のさらに別の利点は、HBxAgならびにHBxAgと抗
原決定基を同じくするポリペプチドと免疫反応する抗体
を作るために用いられうるHBxAgの抗原決定基の配列に
対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの製
造である。
本発明の別の利益及び利点は、下記の詳細な説明及び
請求の範囲から当業者には明らかであろう。
本発明の詳細な説明 定義 トランスフェクション：これは、真核細胞への加えら
れたDNAの組込みによる新しい遺伝子マーカーの獲得で
ある。
形質転換：これは、原核細胞への加えられたDNAの組
込みによる新しい遺伝子マーカーの獲得である。
クローニングベクター：これは、その中に異種DNAが
挿入されてクローンされるべき任意のプラスミド又はウ
ィルスである。
プラスミド：これは、独自自己複製する余剰染色体環
状DNAである。
オープン読み枠：これは、蛋白質へと（潜在的に）翻
訳できるDNA配列である。
ヘルパーウィルス：これは、欠陥ウィルスに存在しな
い機能を備えるウィルスであり、欠陥ウィルスが混合感
染の間に感染サイクルを完了することを可能にする。
遺伝子（シストロン）：これは、ポリペプチド鎖を産
生するのに関与するDNAのセグメントである；これはコ
ード領域に先立つ及び続く領域（リーダー及びトレーラ
ー）ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間
の介在配列（イントロン）を含む。
発現：ポリペプチドを作るために構造遺伝子により行
なわれるプロセス。これは、転写と翻訳の組合せであ
る。
クローン：これは、単一の先祖細胞又は分子を持つ多
数の同一の細胞又は分子を意味する。
塩基対（bp）：これは、DNA二本鎖ヘリックスにおけ
るアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はシトシン（Ｃ）
とグアニン（Ｇ）の対である。
発現ベクター：これは、その中に異種DNAが挿入され
うる又は発現されうるプラスミド又はウィルスである。
下流：これは、発現の方向に前進する配列を示す；た
とえば遺伝子のためのポリペプチドコード領域は、開始
コドンから下流にある。
A.一般的検討 Ｂ型肝炎ウィルスHBVゲノムの領域Ｘがなかんずく興
味がある。なぜなら、最近の証拠は、それの発現の可能
性を示し、伝統的HBV血清学はその蛋白質生成物又はそ
のような生成物に対する抗体を見い出していなかったか
らである。最近開発された組換えDNA及び合成ポリペプ
シド技術が、HBxAgの発現に関する伝統的手法が出会っ
たいくつかの失敗を克服するため、及びヒト肝臓癌から
誘導された細胞系統からの細胞における及び慢性的HBV
感染を持つチンパンジー及びヒトからの肝臓細胞におけ
るHBxAgの発現を例示するために本明細書で用いられ
る。
このために、本発明は、HBxAgのためのクローニング
及び発現ベクター、HBxAgの抗原決定基に対応する及び
ポリペプチドならびにHBxAg又はこれの本質的部分に結
合する合成ポリペプチドに対して生じられた抗体に対応
する合成ポリペプチド、ならびにHBxAgの存在に対する
評価を考慮する。
本明細書で検討するクローニング−ベクターはなかん
ずく、HBxAgの含有遺伝子の有用な量を作るために用い
られる。そしてこの遺伝子はなかんずく、Ｂ型肝炎病自
体の研究に用いられうる多量のHBxAg及びそのポリペプ
チドフラグメントを作るために用いうる。
本発明の新規な合成ポリペプチドはなかんずく、HBxA
g及びその本質的ポリペプチド部分と免疫反応するなら
びに合成ポリペプチド自体と免疫反応する抗体を作る抗
原として有用である。そのように作られた抗体はその
後、感染された動物宿主細胞又は組織培養物中における
HBxAg又はその実質的ポリペプチド部分の存在を評価す
るために用いうる。
発現ベクターは、細胞をトランスフェクトし、HBxAg
の実質的部分を含むポリペプチドの発現を誘発するため
に用いうる。発現されたポリペプチドは次に、体サンプ
ルにおけるHBxAgに対する抗体の存在を決める評価にお
いて抗原として用いうる。
本発明の発現ベクター及び抗体はまた、発現ベクター
を含みかつ更にその存在の確認が比較的困難な追加的な
結合された遺伝子を含むトランスフェクトされた細胞の
ためのマーカーとして用いうる。すなわち、後述のSVHB
V−３と呼ばれる発現ベクターが開かれ、そして評価が
比較的困難な蛋白質をコードする別の異種遺伝子に結合
されうる。再環化、このように形成された新しいベクタ
ーによる適当な細胞の感染及び単一細胞コロニーへとプ
レーティングした後に、新しいベクターを組込まれたこ
れら細胞は、本発明の抗体を用いて、異種遺伝子により
コードされる蛋白質に融合されたHBxAgのベクターでコ
ードされる部分の発現によって同定されうる。そのよう
なマーカーは、ベクターが真核細胞中で発現されるこお
が望まれる場合；すなわちpBR322のようなバクテリア細
胞ベクター中に存在する薬品耐性マーカーが存在しない
場合に特に有用であることができる。
1.クローニングベクター HBxAg遺伝子を含む本発明の組換DNAは、たとえばHBVD
NAの一部をクローニングすることにより作ることができ
る。HBVゲノム物質を得るために、一本鎖部分を含むデ
ーン粒子DNAが、ウィルスの内在DNAポリメラーゼを用い
ることにより完全に二本鎖のDNAに転化される。
このようにして得た環状の二本鎖HBVは、二つのBam
HIエンドヌクレアーゼ制限部位を含む。Bam HIによる
開裂は、典型的には、サイズにより分類される三種の線
形生成物を与える。最大のものは、唯一のBam HI部位
で開裂される全HBVゲノムを表わす3200塩基対（bp）フ
ラグメントである。HBVが両Bam HI部位で開裂されると
き1850bp及び1350bpを含むフラグメントが、作られる。
ガリバート（Galibert）ら、（1979）、ネイチア、28
1:646−650、のHBVヌクレオチド配列の分析は、1850bp
HBV Bam HIフラグメントがHBxAgをコードする遺伝子を
含むことを明らかにする。しかし三つのフラグメントの
総てが、Bam HI相補性末端を持ち、従ってクローニング
プラスミドのBam HI部位中に挿入されうる。
プラスミドpBR322は、第３図の検討から判るように、
そのテトラサイクリン耐性投与遺伝子内に位置される単
一のBam HI制限部位を持つ。Bam HIによるpBR322DNAの
開裂は、三つのBam HI HBV DNAフラグメントの各々に相
補性末端を持つ単一の線形フラグメントを与える。
三つのBam HI HBV DNAフラグメントの各々をT4DNAリ
ガーゼでpBR322中にそのBam HI部位でリゲートして修復
し、プラスミドを環化すると、三つのユニーク組換えプ
ラスミドDNAが得られる。組換えクローニングプラスミ
ドは、環状DNAであり、AM7（pBR322のBam HI部位に挿入
された1350bp Bam HI HBV DNAフラグメントを持つpBR32
2DNAを含む）;AM6（pBR322のBam HI部位に挿入された全
HBVゲノムを持つpBR322DNAを含む）；及びAM1（pBR322
のBam HI部位に挿入されたHBxAg遺伝子を含む1850bp Ba
m HI HBV DNAフラグメントを持つpBR322DNAを含む）と
呼ばれる。
Bam HI HBV DNAフラグメントがT4DNAリガーゼでpBRBa
m HI部位中にリゲートされるとき、そのように発生さ
れた組換えプラスミドはテトラサイクリン耐性を授ける
能力をもはや持たない。それにより、アンピシリン耐性
かつテトラサイクリン感受性の形質転換体が、上述のリ
ゲーション生成物で形質転換された大腸菌株HB101のコ
ロニーから選択された。
組換えプラスミドAM1、AM6及びAM7で形質転換された
大腸菌HB101の三つの薬品選択された株は、各々ECAM1,E
CAM6及びECAM7と呼ばれる。上のプラスミドは、上述の
形質転換体を後述のように適当な培養基たとえばLBブロ
ス中で増殖することによって、比較的大量に作られた。
上述のプラスミドAM1及びAM6から、HBxAg遺伝子の全
体又は部分を含む遺伝子フラグメントが、適当な制限酵
素を用いて切除できる。たとえば、プラスミドAM1及びA
M6が制限酵素Bam HIで消化されたとき、HBxAgをコード
する遺伝子を含む1850bp DNAフラグメントが反応生成物
から単離された。組換えプラスミド形質転換された大腸
菌HB101株ECAM6又はECAM1を増殖することにより、HBxAg
をコードするDNA配列が比較的大量に得られる。
DNA塩基配列及びHBVゲノム上の座が決定されたHBxAg
遺伝子から、その中にイントロンが存在しないことが明
らかである。このことは、遺伝子が、動物細胞ならびに
バクテリア細胞におけるメッセンジャーRNAとして表現
型発現を結果するよう転写されうることを意味する。
2.発現ベクター ガネム（Ganem）ら（1976）、ジャーナル オブ モ
レキュラー バイオロジー、101:57−83、の方法により
動物細胞たとえばアフリカグリーンモンキーの腎臓細胞
中への適当な発現系によるHBxAg遺伝子の導入は、該細
胞におけるHBxAg合成を結果しうる。さらに、適当な発
現ベクターを持つHBxAg遺伝子を含むこれらモンキー腎
臓細胞の培養は、HBxAgの低コスト大量生産を可能にす
る。
有利には、HBxAg遺伝子を発現できる組換DNAが、その
読み枠をシフトすることなく完全なHBxAg遺伝子又はそ
のフラグメントをSV40後期領域プロモーターから下流で
シミアンウィルス40（SV40）中に挿入することによって
構築された。SV40後期領域プロモーターを用いる発現の
ためのベクターは、下記の方法で大量に作られた。
SV40DNA及びpBR322DNAが、Bam HI及びEco RI二重制限
酵素消化に付された。比較的大きなSV40及びpBR322フラ
グメントは、T4DNAリガーゼを用いてリゲートされた。
リゲーション生成物はBam HI消化に付されて、Bam HI粘
性末端を持つ線形DNAを形成した。1850bp Bam HI HBV D
NAを持つこのSV40/pBR322DNAのリゲーションは、SVAM19
1と呼ばれる環状組換えプラスミドを結果した。
組換えDNA SVAM191は、完全な大腸菌アンピシリン耐
性遺伝子を含む。SVAM191で形質転換された大腸菌HB101
は、アンピシリン耐性かつテトラサイクリン感受性であ
り、従って薬品感受性に基づいて選択できる。SVAM191
で形質転換された大腸菌HB101は、EC−SVAM191と呼ば
れ、適当な培養基たとえばアンピシリンを含むLBブロス
中で増殖でき、それにより該プラスミドの比較的大量が
得られる。
3.細胞培養 このようにして得た組換えDNAプラスミドAM1、AM6及
びSVAM191による宿主細胞の形質転換は、公知の方法
〔コーエン（Cohen）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、69:
2110−2114（1972）〕又はその変法により行える。宿主
細胞としてはなかんずく、大腸菌、枯草菌及び酵母のよ
うな微生物が挙げられ、好ましくは294（ATCC31446）、
W3110）（ATCC27325）又はRR1（ATCC31447）と呼ばれる
株のような大腸菌株である。大腸菌株HB101（ATCC3369
4）は、特に好ましい宿主細胞系統である。
HBxAg遺伝子を含む新規な組換えプラスミドDNAを有す
る細胞株の単離は、たとえば下記の手法を含む公知法に
より達成できる。
部分的にのみ二本鎖であるデーン粒子DNAは、内在DNA
ポリメラーゼ反応を用いて3H含有αNTPを一本鎖部分に
入れる（fill in）ことによって放射活性にラベルでき
る。ロビンソン（1975）、Am.J.Med.Sci.,270:151−15
9。その後、ラベルされた生成物をプローベとして用い
て、先に得た薬品選択された形質転換体のうちから、公
知のサザーンブロット ハイブリダイゼーション法〔サ
ザーン（1975）、J.Mol.Biol.,98:503〕又は公知のコロ
ニー ハイブリダイゼーション法〔グルンステイン（Gr
unstein）ら（1975）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、72:39
61−3965〕によって、陽性クローンが摘出されうる。
形質転換され、この方法で単離された宿主細胞は、公
知の培養基で増殖される。培養基は、たとえばLBブロ
ス、ペナセイブロス、又はグルコースとカサミノ酸を含
むM9培養基〔ミラー（Miller）、イクスリメンツ イン
モレキュラー ジェネティクス、431−433（コールド
ズプリング ハーバー ラボラトリー、ニューヨー
ク、1972）〕であることができる。
培養は一般に、15〜43℃、好ましくは28〜40℃で、２
〜24時間、好ましくは４〜16時間、もし必要なら空気吹
き込み及び／又は攪拌下に行われる。
培養後に、バクテリア細胞を集め、細胞を緩衝液に懸
濁し、たとえばリゾチームにより分解し、凍結−解凍又
は超音波処理する。HBxAgをコードする遺伝子は、得ら
れた遠心分離上澄みから、続く細胞分解からのDNA精製
のために一般に知られた方法により単離できる。
真核細胞においてHBxAgを発現するためのベクターを
作るために、pBR322オリジンのDNAの総てを含むSVAM191
DNAの一部が除去される。このことは、SVAM191をHae II
制限酵素消化に付すことによって達成された。Hae II S
VAM191消化生成物の比較的大きなものが環化されたと
き、動物細胞中でHBxAgを発現できるSVBHV−３と呼ばれ
るベクターが形成された。
哺乳類細胞宿主は、発現系を作るために公知の方法に
よりSVHBV−３によりトランスフェクトされうる。たと
えば、SVHBV−３は、制限酵素HindIIIで開裂されると
き、COS−７細胞（ATCC CRLI651）中に挿入されうる。
〔グルツマン（Gluzman）（1981）、セル、23:175−18
2;シディクィ（Siddiqui）（1983）、Mol.and Cell Bio
logy、3:143−146、を参照されたい。〕またSVHBV−３
は、ウシ乳頭腫ウィルス中に挿入でき、それによりマウ
ス細胞系統をトランスフェクトするために用いられう
る。
より好ましくは、SVHBV−３は、アフリカグリーンモ
ンキー腎臓細胞系統BSC−１（ATCC CCL26）をトランス
フェクトするためにSV40tsA239ヘルパーウィルス共に用
いられる。そのようにトランスフェクトされるとき、BS
C−１細胞は、HBxAg抗原決定基を含むポリペプチドを作
った。
クローニング又は発現ビヒクルの選択された制限部位
に挿入されたヌクレオチド配列又は遺伝子フラグメント
は望む蛋白質のための実際の遺伝子の一部でないヌクレ
オチドを含みうること又はその遺伝子のただフラグメン
トのみを含みうることが理解されなければならない。す
なわち、遺伝子コードにおける公知の冗長性の故に、挿
入される遺伝子がここで述べるHBxAgの遺伝子と同じで
ある必要はなく、HBxAgをコードすることのみが必要な
ことである。加えて、HBxAgをコードするDNA配列は、読
み枠が変らない限りで、HBxAgをコードする配列の３′
末端及び５′末端の一方又は両者に追加的塩基を含みう
る。云いかえればいかなるDNA配列が挿入されようと
も、本発明は、形質転換された又はトランスフェクトさ
れた宿主がHBxAgをコードするDNA、蛋白質HBxAg、又はH
BxAg蛋白質の実質的部分を含むポリペプチドを作ること
のみを要求する。
4.ポリペプチド、抗原及び抗体 後述のように、HBxAgの発現は、そのアミノ酸残基配
列がHBxAgの抗原決定基のアミノ残基配列に対応すると
ころの合成ポリペプチドにより誘発された抗体を用いて
検出できる。本発明のポリペプチドは典型的には、約６
〜約40のアミノ酸残基を含む。より好ましくは、これら
ポリペプチドは、約10〜約20のアミノ酸残基を含む。
下記及び第６図に示す、99、100及び142と名付けられ
た合成ポリペプチドのアミノ酸残基配列は、ガリバート
ら（前出）により述べられるようにHBVヌクレオチド配
列から決定された。
ポリペプチド99:Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-L
eu-Glu-Ala-Thr-Phe-Lys-Asp-Cys、 ポリペプチド100:Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-GLu-
Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val、及び ポリペプチド142:Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-
Thr-Ser-Ala ここでアミノ酸残基配列の各々は、左から右へかつア
ミノ末端からカルボキシ末端の方向に示されている。
各々ポリペプチド99及び100のカルボキシ及びアミノ
末端システィン残基の不存在の点を除いてはポリペプチ
ド99及び100の配列にアミノ酸残基配列において対応す
るポリペプチドもここで有用であり、本発明の一部と考
えられる。ポリペプチド99bと100bと呼ばれるそのよう
なポリペプチドは、そのアミノ又はカルボキシ末端残基
により担体へ結合されるとき免疫原として有用であり、
また第７、第８及び10図の一部で示されかつ後述するの
と同様の免疫反応ブロック研究において用いうる。
ポリペプチド99b及び100bのアミノ酸残基配列は、左
から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に下
記の式により示される。
ポリペプチド99b:Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-
Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp、 ポリペプチド100b:Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-GLu-Leu
-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val、 a.トランスフェクトされた細胞中のＸ蛋白質 複合体としてキイホールリンペットヘモシアニン（KL
H）担体に結合されたポリペプチド99、100又は142によ
り免疫化されたラビットは、抗体（各々抗99、抗100及
び抗142）を作り、これらSVHBV−３によりトランスフェ
クトされたBSC−１細胞中で発現されたHBxAgポリペプチ
ドと免疫反応し、それによりこれら又は任意の細胞にお
けるHBxAgポリペプチドの発現を初めて実証した。これ
ら抗ポリペプチド抗体は、トランスフェクトされていな
いBSC−１細胞すなわち野性型（wt）SV40で感染された
細胞中に見られるどのポリペプチドとも免疫反応しなか
った。
また、HBxAgポリペプチドを発現した抗ポリペプチド
抗体の免疫反応性は、抗体とそれらの相補的（対応す
る）ポリペプチドすなわちそれらが生じられた相手であ
るポリペプチド抗原とのプレインキュベーションによっ
て禁止された即ちブロックされた。このブロッキング
は、抗体が、HBxAgであると予告されるポリペプチドの
抗原決定基を特異的に認識したこと、及び合成ポリペプ
チドが、予告されたHBxAg蛋白質の抗原決定基にアミノ
酸残基配列において対応したことを示す。これらのブロ
ッキング結果は、ウェスターンブロット法（材料及び方
法の部）及び続く125Iラベルした黄色ブドウ球菌蛋白質
Ａによる結合された抗体の位置決め及び続く評価のオー
トラジオグラフ現像によって得られた。
これら結果は、ポリペプチド99及び142に対する抗血
清について第10図に示される。第10図のレーン１は、抗
99と、SVHBV−３感染細胞リセートとの免疫反応を示
し、一方、レーン２はポリペプチド99での抗血清のプレ
インキュベーションによるこの免疫反応のブロックを示
す。同様に、抗142はレーン３において細胞リセート蛋
白質と免疫反応し、この免疫反応はポリペプチド142で
のこの抗血清のプレインキュベーションによりブロック
された。レーン５と６は、対照細胞からのリセートとの
免疫反応が起きなかったことを示す。
第10図に示されるようにポリペプチド99及び142に対
する抗血清により特異的に同定されたSVHBV−３トラン
スフェクトされた細胞のポリペプチド発現生成物は、約
24,000ダルトンの分子量を持った。後述のように、約2
8,000ダルトンの分子量を持つポリペプチドが、ヒト肝
癌由来細胞系統PLC/PRF/5からのリセート中で同定され
た。二つの細胞系統により発現されたポリペプチド（蛋
白質）における分子量の違いは、発現されたポリペプチ
ドが別の蛋白質又はポリペプチドとのＸ蛋白質の融合か
ら得られるという事実による。
すなわち、すでに述べたようにSVHBV−３は、完全な
Ｘをコードするゲノムの一部を欠く。第６図は、SVHBV
−３に含まれるＸ遺伝子の一部がメチオニン開始コドン
ATGを含むと推定されるＸ蛋白質の初めの22のアミノ酸
残基のためのコドンを含まないことを示している。
従って、SVHBV−３によりトランスフェクトされた細
胞により発現されたポリペプチドは、ベクター中に存在
するSV40構造蛋白質VP2配列との融合生成物であろうこ
とが予言された。融合蛋白質（ポリペプチド）の予言さ
れたサイズは、24,500ダルトと予言された。悪24,000ダ
ルトンの分子量を持つ発現されたポリペプチドの発見
は、この予言と一致する。28,000ダルトン融合蛋白質
（ポリペプチド）は、下で検討される。
b.肝臓癌細胞において発現されたＸ蛋白質 BHxAgの発現はまた、いくつかのHBV疾病状態の機能で
あると考えられる。たとえば、ポリペプチド99に対する
抗体（抗99）は、ヒト肝臓癌由来細胞系統PLC/PRF/5（A
TCC CRL8024）で発現された28,000ダルトン蛋白質を特
異的に認識した。正常なラビットの血清は、この蛋白質
を認識せず、抗99認識はポリペプチド99でのプレインキ
ュベーションによりブロックされた。この細胞系統は、
組込まれたHBV DNAを含むと知られる。チャクラバティ
（Chakraborty）ら、（1980）、ネイチア、286:531−53
3、エドマン（Edman）ら、（1980）、ネイチア、286:53
5−538、及びマリオン（Marion）ら、（1980）、Viro
l.,33:795−806。HBsAgがこの腎臓癌細胞系統において
検出され〔マクナブ（McNab）ら、（1976）、キャンサ
ー（Cancer）、34:509−515、及びアデンら、（197
9）、ネイチア、282:615−616〕、一方、HBcAg及びHBeA
gのための総ての標準的評価は陰性であった。HepG2（AT
CC CCL23）と呼ばれる細胞系統はまた、ヒト肝臓細胞系
統であるが、しかし組込まれたHBV DNA配列を含まな
い。アデンら（前出）。
これらの結果は、PLC/PRF/5細胞蛋白質を放射能ラベ
ルし、抗99及び黄色ブドウ球菌蛋白質Ａを用いて繰返し
免疫沈降させ、そして回収された沈降物の電気泳動によ
って得られた。28、000ダルトン蛋白質が次に、オート
ラジオグラフィにより同定された。この手順はまた、材
料及び方法の部でも述べられる。
PLC/PRF/5及びHepG2細胞からのリセートを用いる同様
の研究からの結果を第７図に示す。第７図は、28,000ダ
ルトンのＸ特異的蛋白質がPLC/PRF/5細胞（レーン５）
において検出されたことを示す。免疫反応性は、抗体が
ポリペプチド99でプレインキュベートされたとき（レー
ン６）失われ、しかし関連ないポリペプチドでプレイン
キュベートされたとき（レーン７）は失われない。対照
HepG2リセート（レーン１〜４）では、Ｘ特異的反応性
は検出されなかった。これらの結果は、Ｘ遺伝子生成物
が、組込まれたHBV DNA配列を含む肝臓癌細胞系統にお
いて発現されることを確認した。
c.肝臓細胞におけるＸ蛋白質発現 また、HBV感染の履歴あり又はなしの、ヒト及びチン
パンジーからの四つの肝臓サンプルが、抗Ｘポリペプチ
ド抗体を用いるＸ関連蛋白質の存在についてのウエスタ
ーンブロット評価において検査された。これら検査の結
果を第８図に示す。一つのヒトサンプル（Ｈ）は、慢性
的にHBV感染された肝臓癌肝臓からであり、他は急性相H
BV感染（Ｈ）からであった。非感染チンパンジー（Ｃ）
及びHBVで慢性的に感染されたもの（Ｃ）がともに、抗
Ｘポリペプチド抗体に対して反応する肝臓細胞リセート
を得るために用いられた。
抗99抗体は、45,000及び28,000（左余白矢印、右余白
p28）ダルトン蛋白質の両者に対して反応した。両反応
性とも、これら抗体がポリペプチド99でプレインキュベ
ートされたとき、ブロックされた。抗142抗体がこれら
同じ細胞リセートに対して反応したとき、40,000（p4
0）、28,000（p28）及び17,000（p17）の特異的バンド
が検出された。これら蛋白質に対する反応性は、それら
が、抗142抗体がポリペプチド142でプレインキュベート
されるとき、除かれるので、特異的であると考えられ
る。
対照サンプル、即ち感染されていないチンパンジー肝
臓（総てのパネルのレーン３）は、抗99の抗体での約4
5、000ダルトン蛋白質（p45）、及び杭142抗体でのp40
及びp17を示した。蛋白質28は、HBV感染された組織での
み発現された（レーン細胞（レーン５））。免疫反応性
は、抗体がポリペプチド99（レーン６）でプレインキュ
ベートされたとき失われたが、関連ないポリペプチドで
は失われない（レーン７）。免疫前血清対照は、免疫反
応しなかった（レーン８）。対照HepG2リセート（レー
ン１〜４）中でＸ特異的反応性が検出されなかった。こ
れら結果は、Ｘ遺伝子生成物が、組込まれたHBV DNA配
列を含むヒト肝臓細胞系統において発現されることを確
認した。
45,000ダルトン蛋白質の存在は、第７図に示すPLC/PR
F/5細胞からのリセート中にも比較的少量で観察され
た。杭99抗体と45,000ダルトン蛋白質の間の免疫反応は
また、免疫化ポリペプチド99による抗体のプレインキュ
ベーションによりブロックされた。これは、第７図のレ
ーン６に示される。
正常なヒト肝臓細胞抽出物（HBV血清陰性）は、抗99
を用いるウエスターンブロット評価において45,000ダル
トン蛋白質のみを発現することが見い出された。また、
HBs、HBc、及びHBeに対して生じた市販入手できる抗体
（アボット ラボラトリーズ、ノース シカゴ、イリノ
イ）を用いて行われた対照評価は、本発明の抗体により
位置決めされるどの蛋白質をも同定するのに失敗した。
この証拠はやはり、45,000ダルトン蛋白質がHBxAgに相
同な抗原決定基を持つこと、しかし抗99で認識された2
8,000ダルトン蛋白質はHBV疾病状態に特異的であり、HB
sAg、HBeAg及びHBcAgとは異なることを示唆する。
d.肝臓細胞中のＸ遺伝子 PLC/PRF/5細胞におけるp28の発現は、宿主DNA中に組
込まれたHBV DNAからであった。これが、Ｘ蛋白質が発
現されうる唯一の方法であったことを知ることは興味深
かった。
従って、Ｘ蛋白質を示すこれらチンパンジー及びヒト
肝臓DNAを、HBV DNAでプローベした（第９図）。全DNA
を、第８図に示される肝臓組織から単離し、HBV−DNA配
列の存在について分析した。28,000ダルトン蛋白質を含
むチンパンジーからのDNAは、BamHI、EcoRIで開裂され
るとき又は消化されないとき（第９図、各々レーン１、
２及び３）相同なバンドを現わした。Bam HIは、環状の
HBV DNAを二つのフラグメントに開裂し〔1850及び1350b
p〕、5.8kbでのバンド（レーン１）は、ゲノムサイズよ
り大きな組込まれた配列を示す。高分子量DNAバンドよ
り下にバンドは見られないので（レーン３）、HBVの組
込まれた配列のみがこのDNA中に存在すると結論され
る。
また、HBcAg陽性ヒト肝臓からのDNAが調製され、HBV
DNAでプローベされた。HindIII、Bam HI、Eco RIによる
制限酵素開裂又は未消化DNAは（各々、第９図のレーン
７〜10）は、ゲノムサイズと同じ又はより小さい相互の
配列を現わし、それによりこれらヒトDNAサンプルが組
込まれた配列を含むことの何らかの証拠を除去する。2
8,000ダルトン蛋白質を欠くチンパンジー及びヒト肝臓
組織はまた、HBV DNA配列に対して陰性であった（第９
図、レーン４〜６及び11〜14）。第９図に示すデータ
は、Ｘ蛋白質がHBVゲノムの状態に無関係にHBV感染した
組織において発現されることを確認し、従って、Ｘ発現
のためのHBV DNA組込みの前提条件を除去する。
e.結果のまとめ 上述の結果は、HBV感染したヒト及びチンパンジー肝
臓組織における従来同定されていない、ウィルスでコー
ドされる蛋白質の存在を示す。この28,000ダルトン蛋白
質（p28）は、それが染色体外の形で遊離に存在するか
又は細胞DNA中に集積されて見い出されるかに拘らず、H
BVゲノムによりコードされる。
28,000ダルトン蛋白質（p28）は、Ｘ領域の単独の生
成物でなく、さらにHBV配列を含む。ギルバートら（前
出）により報告された配列に基づくＸ蛋白質の予測され
るサイズは約17,000ダルトン（第６図）である。しか
し、PLC/PRF/5細胞ならびにチンパンジー及びヒトHBV感
染された組織において抗Ｘペプチド抗体により検出され
たＸ蛋白質の分子量は、28,000ダルトンである。サイズ
の食い違いは、Ｘ遺伝子と細胞配列との融合によるので
はない。なぜなら、p28を発現するヒト組織における組
込まれたHBV DNAの欠除（第９図、レーン７〜10）は、
Ｘ蛋白質（p28）がHBVゲノムのみから翻訳されることを
示すからである。
Ｘ蛋白質のサイズの増大は、もし蛋白質がHBsAg−Ｘ
又はＸ−HBcAg融合であれば説明できる。そのような融
合の可能性は、ゲノム上でのこれらHBV遺伝子相互の近
さによって示唆される。
RNAレベルでのそのような融合の存在を確かめようと
する試みは、Ｘ配列を含むと判ったPLC/PRF/5細胞にお
いて得られた転写物（トランスクリプト）がまた表面又
はコア配列ならびにＸを示す（データは省略）という事
実の故に不成功であった。同様の結果がゴウ（Goug
h），（1983）,J.Mol.Biol.,165:683−699、により報告
されている。Ｘ−コア融合の証拠は、ヘパドナウイルス
族の別の一員、アヒルＢ型肝炎ウイルス（DHBV）のDNA
配列（そこでは両遺伝子は、単一蛋白質として翻訳され
る〔マンダート（Mandart）ら（1984）,J.Virol.,49:78
2−792〕から及びフェイテルソン（Feitelson）ら、（1
982）,J.Virol.,43:687−696、の研究から得られる。
HBVのＸ領域が発現されるという事実が確認された。
しかし、この遺伝子生成物の機能は未知である。Ｘ領域
の翻訳生成物であると示唆された蛋白質分子は、HBVゲ
ノムと関連すると見い出され、又はより詳しくはＬ鎖の
５′ニック（nick）に共有結合される〔ゲルリッチ（Ge
rlich）ら、（1980）、セル、21:801−809〕。DNA結合
蛋白質を表わすＸ蛋白質のアイデアは、PLC/PRF/5細胞
又はHBV感染した組織のDNAアーゼ処理がp28活性を除去
する又は変えることに失敗した（データは省略）ときに
排除された。
現在、HBV感染の生物学又はHBV感染及び続く肝細胞癌
腫の開始の間の関連に関してはほとんど知られていな
い。この目的のために、HBV感染のための又はHBV配列の
存在のための何らかの付加的マーカーは、極めて重要で
ある。ヒト血清は現在、抗Ｘ抗体及びＸ蛋白質の存在に
ついて検査されている。
本明細書及び請求の範囲において、「対応する」とい
う言葉が、種々の文法形で、ポリペプチド配列に関連し
て、記述されるポリペプチド配列±（アミノ及びカルボ
キシ末端の一方又は両方における三つまでのアミノ酸残
基）及びポリペプチド配列に沿う特定のアミノ酸残基に
おける保守的置換のみの含有を意味して用いられる。
上述で用いられたような「保守的置換」という言葉
は、一つのアミノ酸残基が別の生物学的に類似の残基に
より置き代えられていることを意味するために用いられ
る。保守的置換の例としては、Ile,Val,Leu又はMetのよ
うな疏水性残基同志の置換、又はArgとLys,GluとAsp又
はGlnとAsn等々のような極性基間の置換があげられる。
いくつかの例では、一つのイオン性残基を反対に荷電
されたイオン残基により置換すること、たとえばAspのL
ysによる置換が、これらイオン性基が単に溶解性補助を
与えるだけであると考えられて保守的と呼ばれてきた。
しかし一般に、本明細書で述べる置換が全蛋白質に比べ
て比較的短い合成ポリペプチド抗体上でのことであるの
で、イオン性残基を反対電荷の別のイオン性残基で置換
することは、非イオン性残基とイオン性残基の間の置
換、及び嵩ばった残基たとえばPhe,Tyr又はTrpと嵩ばら
ない残基Gly,Ile及びValの間の置換と同様に「根本的置
換」であると考えられる。
「非イオン性」及び「イオン性」残基という言葉は、
生理学的pH値で、各々、電荷を通常持たない又は電荷を
通常持つアミノ酸残基を指す通常の意味で用いられる。
非イオン性残基の例としては、Thr及びGlnが挙げられ、
イオン性残基の例としてはArg及びAspが挙げられる。
「抗原」という言葉は歴史的に、抗体により結合され
るものを指すため、及び抗体の生産を誘発するものを指
すために用いられてきた。より最近の用法は、抗原の意
味を抗体により結合されるものに限定し、一方、「免疫
原」という言葉が抗体生産を誘発するものに対して用い
られる。
いくつかの例では、抗原と免疫原は同じものであり、
たとえば合成ポリペプチドが、このポリペプチドに結合
する抗体の生産を誘発するために用いられる場合であ
る。しかし、同じポリペプチド（99、100又は142）が全
蛋白質たとえばHBxAgに結合する抗体をも誘発し、この
場合にポリペプチドは免疫原かつ抗原であり、一方、HB
xAgは抗原である。本明細書で述べるものが免疫原的か
つ抗原的である場合、それは一般には抗原と云われる。
5.評価系及び方法 上述の結果は、SVHBV−３が発現ベクターとして用い
られうることを示す。それは、HBxAg遺伝子から下流で
読み枠に挿入された異種DNA配列のための発現制御要素
を与える。
結果はまた、合成ポリペプチド99、100及び142、及び
これらに対するアンチペプチド抗体が、評価されるべき
体サンプルたとえばHBxAgを持つと疑われる動物宿主か
らの肝臓癌細胞又は肝臓細胞におけるHBxAgの存在を検
出するための評価系又は方法の一部として、SNHBV−３
によるトランスフェクションの成功を検出するため及び
SNHBV−３が発現ベクターとして用いられるときに発現
をモニターするために用いられることを示している。
そのような系は、抗体、ほぼ完全な抗体又は周知のFa
b及びＦ（ab′）2抗体部分のような抗体結合部位を含
み、本発明の合成ポリペプチドと免疫反応できる即ち本
発明の合成ポリペプチドに対して生じられた受容体分子
を含む少くとも一つの第一の反応剤を含む。第一の反応
剤の受容体と発現特異的HBxAgとの免疫反応をシグナル
するための指示手段、たとえばフルオレセイン又はロー
ダミンのような螢光染料、Ｉ−125又はＣ−14のような
放射性元素又は第一の反応剤の受容体に対して生じられ
た酵素結合抗体（たとえばペルオキシダーゼ結合ヤギ抗
ラビットIgG）もまた備えられる。指示手段は当初、第
一の剤と結合されていても又は別々になっていてもよ
い。そのようなHBxAg評価反応剤系の典型的使用として
は、酵素結合免疫吸収評価（ELISA）、ラジオイムノア
ッセイ及び免疫螢光アッセイ（IF）が挙げられる。本発
明のポリペプチド及びその抗ポリペプチド抗体を利用す
る、体サンプル中のHBxAgの存在を測定する診断評価
は、すでに幅広く記述した。そのような診断評価の商業
的実施態様では、診断評価系が考えられる。
そのような系の一つは、第一の反応剤として抗99又は
抗142のような抗ポリペプチド受容体を持つ少くとも一
つの容器を備える。それに対して抗ポリペプチド抗体が
生じられたところのポリペプチドたとえばポリペプチド
99又は142のある量を持つ第二の容器もまた、第二の反
応剤を備えるために提供されるであろう。上述の指示手
段、一以上の緩衝剤及び他の周知のもの等を持つ別の追
加的容器もまた、診断系に備えられうる。
HBxAgの検出しうる量の存在を評価する方法はまた、
上で幅広く記述した。簡単に云えば、この方法は、評価
されるべき体サンプルたとえば肝臓癌細胞又は肝臓細胞
からの蛋白質を、本発明の合成ポリペプチドと及びHBxA
gと免疫反応できる抗体結合部位を含む受容体たとえば
抗99又は抗142又はそのFab又はＦ（ab′）2部分とを、H
BxAgと受容体の間の免疫反応をシグナルする指示手段た
とえばＩ−125ラベルした黄色ブドウ球菌蛋白質Ａ又は
酵素ラベルたとえば上述の受容体の一つに結合されるホ
ースラディッシュペルオキシダーゼの存在下で混合する
ことを含む。この混合は、免疫反応が起ったことを指示
手段がシグナルするのに十分な時間維持され、シグナル
の存在はたとえばオートラジオグラムにより確認され
る。体サンプル又はそれからの蛋白質は好ましくは、受
容体と混合される前に固体マトリックスたとえばニトロ
セルロースシート又はガラススライドに吸着又はさもな
うば固定（結合）される。
指示手段が独立した別途の分子たとえば放射能ラベル
された黄色ブドウ球菌蛋白質Ａである場合、結合された
体サンプルと受容体分子はまず指示手段の不存在下で混
合され、この混合は結合した免疫反応生成物の形成のた
めに十分な時間維持される。次に、結合した免疫生成物
がすすがれる。独立した分子である指示手段が次に、結
合した免疫反応生成物と混合され、この混合は結合され
た第二の反応生成物が形成されるのに十分な時間維持さ
れる。結合された第二の反応生成物は次にすすがれ、指
示手段からのシグナルの存在が確かめられる。
指示手段が本発明の受容体の一部である場合、このラ
ベルされた受容体は、評価されるべき結合された体サン
プルと混合され、この混合は免疫反応生成物が形成され
るに十分な時間維持される。結合された免疫反応生成物
は次にすすがれ、指示手段からのシグナルの存在が確か
められる。
上述の第二の反応剤たとえばポリペプチド99及び142
は、非特異的よりも特異的免疫結合が起ったことを検証
するために免疫反応ブロッキング研究において対照剤と
して用いうる。このようなブロッキングの研究は、第
７、８及び10図に示される。
発現ベクターとしてSNHBV−３を用いるために、異種D
NAがHBxAg遺伝子から下流に、好ましくはそのユニークB
am HI制限部位に挿入され、そのように作った新しいベ
クターは細胞をトランスフェクトするために用いられ
る。トランスフェクトされた細胞におけるHBxAgの発現
は、SNHBV−３に挿入された異種DNAの発現の仮定的証拠
である。上述のHBxAg発現評価系により検出されるHBxAg
の発現は、SNHBV−３に挿入された異種DNAの発現を示
す。
すなわち、上述の評価系を用いる、トランスフェクシ
ョンの試みの後に作られた細胞コロニーの検査は、トラ
ンスフェクションが成功したコロニーの選択のために利
用できる。たとえば、真核細胞へのベクターの導入の試
みから得たコロニーからの細胞が回収され、分解され、
細胞蛋白質が抽出される。抽出された細胞蛋白質はその
後、電気泳動によりSDS−ポリアクリルアミドゲル上で
分離され、分離された蛋白質はニトロセルロース上にブ
ロットされる。異種遺伝子によりコードされるポリペプ
チドに融合された発現されたHBxAg部分の存在を示すオ
ートラジオグラフを作るために、ブロットした蛋白質を
過剰の受容体及び上述した評価系のラベルたとえば合成
ポリペプチド99又は142に対するＩ−125ラベルした抗体
と接触させ、次に免疫反応しなかった抗体（受容体）を
除くためにすすぐことが行われうる。
上述の評価法及び系は、体サンプルとくに組織サンプ
ルたとえば肝臓生検からの細胞中に存在するかも知れな
いＸ蛋白質又はその実質的部分を同定するために特に有
用である。後述の診断評価及び方法は、体サンプルたと
えば全血、血清又は血漿中に存在するかも知れないＸ蛋
白質の測定のために特に有用である。そのような診断法
の例として、ウエスターンブロット分析が用いられよ
う。しかし、本方法を利用する産業的実施態様の一つは
ELISA診断系である。
ここで、SNHBV−３ベクターをトランスフェクトされ
た細胞からの発現生成物、たとえば第10図に関連して述
べられるBSC−１細胞で発現された約24,000ダルトン蛋
白質（ポリペプチド）が、抗原として好ましく用いら
れ、しかし本発明の好ましいポリペプチドたとえばポリ
ペプチド99又は142もまた抗原として用いうる。すなわ
ち、後述するような親和性クロマトグラフィにより得ら
れるような本質的に精製された形で用いられるHBxAg分
子自体、SNHBV−３トランスフェクトされたBSC−１細胞
により発現されるようなHBxAg分子の実質的部分（24,00
0ダルトンポリペプチド）、又はアミノ酸残基配列にお
いてHBxAgの抗原決定基に対応するポリペプチドが抗原
として使用できる。
抗原は好ましくは、固体支持物を形成するために固体
マトリックス、たとえば架橋デキストラン（ファーマシ
ア ファイン ケミカルズ社、ピスカタウエイ、ニュー
ジャージィから商標SEPHADEXとして入手できる）、アガ
ロース、ガラスビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレ
ン、架橋アクリルアミド、ニトロセルロース、又は微小
力価プレートのくぼみに結合される（吸着される）又は
さもなくば固定される。
好ましくは固体支持物の一部としての固体マトリック
スに結合された抗原は、評価されるべき液状体サンプル
と混合されて、固−液相混合物を形成する。混合は、体
サンプル中に存在する抗Ｘ蛋白質（抗HBxAg）抗体が抗
原と免疫反応するのに十分な時間維持される。次に免疫
反応の存在が、評価される体サンプル中の抗Ｘ蛋白質抗
体の存在をシグナルする指示手段などによって決定され
る。
たとえば一つの研究において、SNHBV−３ベクタート
ランスフェクトされたBSC−１細胞リセートが調製さ
れ、電気泳動的に分離され、そして固相を形成するため
に、第10図に関連して述べたとほぼ同様にして固体マト
リックスとしてのニトロセルロースに移され結合され
た。種々の肝臓病を持つ６人の患者からの1:50希釈血清
を別々に、ニトロセルロースに結合されたトランスフェ
クトされたBSC−１細胞蛋白質と混合して、固−液相混
合物を形成した。これらの混合物を、血清中に存在する
抗Ｘ抗体が結合された抗原と免疫反応するに十分な時間
（２時間）維持した。
固相と液相を分けるためにすすいだ後に、上の段階で
得た固相を別々に、指示手段としてのホースラディッシ
ュペルオキシダーゼに複合されたヤギ抗ヒト又は抗ラビ
ット抗体の1:200希釈を含む液体溶液と混合して、第二
の固−液相混合物を形成した。第二の固−液相混合物の
各々を、ラベルした抗体が、マトリックスに結合された
抗原と免疫反応したヒト抗Ｘ抗体と反応するに十分な時
間（１時間）維持した。ラビット抗ポリペプチド抗体
が、ヤギ抗ラビット抗体の対照として用いられた。得た
固−液相混合物を再び分け、そしてすすいだ。得た固相
を次に、第８図について述べたように４−クロル−１−
ナフトールを含む溶液を用いて現像した。
この研究の結果は、肝細胞癌腫を持つと診断された患
者からの血清はトランスフェクトされたBSC−１細胞中
でSNHBV−３ベクターにより発現されたポリペプチドに
結合した抗体を含んだことを示す。従ってこれら抗体は
抗Ｘ抗体であり、その存在はHBV感染のある段階におけ
る真正の抗原としてのＸ遺伝子生成物を確認する。
上述のウエスターンブロット評価で用いられた約24,0
00ダルトンポリペプチド発現生成物が後述のようなELIS
Aで又は他の類似の評価で抗原として用いられる場合、
このポリペプチドは好ましくはそのような使用の前に精
製され単離される。この精製及び単離は、周知の方法で
行える。
たとえば抗99又は抗142抗体又はこれらの抗体結合部
位は、本明細書で述べるようにして作られ、固体マトリ
ックスたとえばアガロース及び架橋アガロース誘導体
（ファーマシア ファイン ケミカルズ社から商標SEPH
AROSE 6B,CL6B,4B及びCL4Bとして、又はバイオ−ラド
ラボトリーズ社、リッチモンド、カリフォールニアから
商標Bio−GelA−0.5M、Ａ−1.5M及びＡ−50Mとして市販
されている）に結合されうる。前述の架橋デキストラン
（商標SEPHADEX）及びポリアクリルアミドビーズ（バイ
オ−ラド ラボラトリーズから商標Bio−GelP−２、Ｐ
−30、Ｐ−100及びＰ−300として市販）もまた、有用な
固体マトリックスである。アガロース誘導体より成るマ
トリックスの使用が、例として下記で述べられる。
アガロースマトリックスは典型的には、シアノゲンブ
ロマイドを用いて結合のために活性化される。活性化さ
れたマトリックスは次に洗われ、活性マトリックスを乾
燥することなく、望む抗体（受容体）分子に結合され
る。マトリックス結合抗体は次に洗われ、使用準備がと
とのう。マトリックス上の反応しなかった反応性基は、
もし望むならアミンたとえばエタノールアミン又はTris
と反応させることができるが、しかしこれら反応性基は
迅速に崩壊する。
親和性吸着剤は、たとえばビーカー又はフラスコ中で
ルーズな状態で使用でき、又はそれはカラムに詰めるこ
とができる。使用前に、親和性吸着剤を、緩衝剤、又は
約24,000ダルトンポリペプチドを含む細胞リセートの精
製のために用いられた他の水性媒体中で洗って、非特異
的に結合した蛋白質又は支持体に不安定に結合された抗
体を除去することが好ましい。
SVHBV−３ベクターでトランスフェクトされた細胞リ
セートを含む水性組成物を用意し、次に親和性吸着剤と
混合する。この混合物は、結合された抗体（受容体）と
約24,000ダルトンポリペプチド（抗原）の間の可逆的
な、結合抗体−抗原（受容体−リガンド）複合体を形成
する。
結合抗体−リガンド複合体は次に、複合化されなかっ
た水性組成物の残部と分けられ、それにより親和性吸着
剤に結合された精製された形のポリペプチド抗原を得
る。混合がビーカー又はフラスコで行われる場合、この
分離は濾過及び洗滌により行うことができる。吸着剤が
カラムに詰められる場合、分離は、複合化されなかった
水性媒体の溶出及び好ましくは続く洗滌段階により行え
る。
精製されたポリペプチド抗原が親和性吸着剤を含まな
いことが望まれる場合、それは典型的には種々の手順で
得られる。これら手順のいずれにおいても、可逆的な結
合受容体−リガンド複合体は、そのマトリックスに結合
した受容体とポリペプチド抗体リガンドの成分へと解離
され、次にポリペプチド抗体リガンドを結合された受容
体から分けて、親和性吸着剤を含まない精製されたポリ
ペプチド抗原リガンドの溶液が得られる。溶液はそのま
ま用いることができ、又はそれは使用前に望むように濃
縮され又は乾燥しうる。ある例では、使用前に溶液を公
知のように脱塩することが望ましい。
可逆的複合体の解離は、多数の方法で行える。約2.5
のpH値の0.2Mグリシン塩酸塩溶液が典型的に用いられ
る。あるいは、結合されたポリペプチド抗原リガンド
は、抗体を生じるために用いられた過剰の免疫原ポリペ
プチドたとえば抗99抗体がマトリックスに結合される場
合のポリペプチド99との可逆的複合体の混合により、結
合された受容体から競争させられることができる。その
ような競争は、ポリペプチド抗原の起りうる変性を避け
る。解離されたポリペプチドの親和性吸着剤からの分離
は上述のようにして行いうる。
親和性吸着剤の調製及びその使用は広く知られてい
る。しかし、本発明の抗体及び抗原分子を組込んだ物質
及び使用は、従来なかった。抗原がマトリックスに結合
されている。親和性吸着剤、その調製法及び使用は、
「アンチボディ アズ ア ツール」、マーカロニス
（Marchalonis）及びワール（Warr）編、ジョーンワイ
リーアンドサンズ、ニューヨーク，第64〜67及び76〜96
頁（1982）、に記載される。
上述の方法を利用するELISAの例は、固体支持物を形
成するために、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル製の20
〜96個のくぼみの微小力価プレートの壁より成る固体マ
トリックスに吸着された又は固定された本発明の前述の
抗原から成る固体支持物を用いる。微小力価くぼみの壁
上の非特異的結合部位は、その後典型的には蛋白質たと
えばウシ血清アルブミン（BSA）によりブロックされ
る。結合されなかった抗原及びBSAは、たとえばすすぐ
ことにより微小力価くぼみから除去される。
ヒト血清、血液又は血漿のような体サンプルの一部
は、上述の抗原結合固体支持物と混合されて、固体及び
液体用を含む混合物を形成する。固−液相混合物は、体
サンプル中の抗Ｘ蛋白質抗体が抗原と免疫反応するのに
十分な時間たとえば約30分間〜約２時間維持される。固
及び液相は、その後に一般に分離される。
第二の、ラベルされた、指示手段を含む抗体、抗体部
位、又は初めに挙げた抗体と免疫する黄色ブドウ球菌蛋
白質Ａの液状溶液が次に固相と混合されて、別の固−液
相混合物を形成する。第二の抗体の例は、初めに挙げた
抗体がヒト体サンプルからである場合のペルオキシダー
ゼでラベルしたヤギ抗ヒトIg抗体である。他の有用な酵
素ラベルとしては、アルカリ性ホスファーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼが挙げら
れる。
固相（固体マトリックスに結合した抗原−抗体反応生
成物）と第二のラベルした抗体溶液から形成された混合
物は、結合された初めに挙げた抗体と指示手段の間の反
応生成物たとえば二つの抗体の間の免疫反応を形成する
のに十分な時間（たとえば約１時間）維持される（イン
キュベートされる）。固体及び液体相は、その後分離さ
れる。
上述の第二の抗体はまた、免疫グロブリンのクラスの
唯一つ（たとえばIgG、IgM、IgE、IgA又はIgD）に対し
て特異的であり、免疫反応してもよい。そのような抗体
は、体サンプル中に存在する抗Ｘ蛋白質抗体の免疫グロ
ブリンクラスを同定する能力を与える。また、第二の抗
体又は抗体結合部位は、免疫グロブリンＬ鎖二つのタイ
プの唯一つ（たとえばカッパ又はラムダ）に対して特異
的であり、免疫反応してもよい。これら抗体は、体サン
プル中に存在する免疫グロブリン分子のイソタイプを同
定する能力を与え、周知である。
次に酵素ラベルのための培養基たとえばペルオキシダ
ーゼのための過酸化水素、及び色形成性染料前駆体たと
えばｏ−フェニレンジアミン又は４−クロル−１−ナフ
トール、又はアルカリ性ホスファターゼのためのｐ−ニ
トロフェニルホスフェートを含む溶液が、固相と混合さ
れる。次に、予め選んだ波長（たとえば各々490又は409
nm）での光学的濃度が、十分な時間（たとえば60分間）
の経過後に測定され、抗Ｘ蛋白質抗体が体サンプル中に
存在したかどうか決定するために対照の光学的濃度と比
較される。
本発明の別の実施態様は、固体マトリックスたとえば
ポリスチレンの20個のくぼみの微小力価ストリップ及び
この固体マトリックスに吸着（結合）又は固定されて固
体支持物を形成する本発明の前述の抗原より成る固体支
持物を含むキットの形の診断系を包含する。この系は好
ましくはまた、結合された指示手段たとえばペルオキダ
ーゼラベルされたヤギ抗ヒトIg抗体を持つ別に包装され
た抗ヒトIg抗体を含む。またこれは、結合された指示手
段のための培養基たとえば過酸化水素、及び色形成性染
料前駆体たとえばｏ−フェニレンジアミンを更に別の包
装として含むことができる。過酸化水素は典型的には、
その比較的不安定さの故にキットに含められず、典型的
には最終ユーザーにより供給されるが、しかし過酸化水
素の容器が診断系の一要素であることができる。この系
を利用する評価において有用な緩衝塩はまた、乾燥した
又は液体の形で一以上の別の包装に含められうる。本発
明の好ましいポリペプチドたとえばポリペプチド99はま
た、対照として競争結合研究で用いられる別の包装に含
められることができる。体サンプルたとえば血清中の抗
Ｘ蛋白質抗体の存在についての評価は、上述の方法を用
いてこの診断系により実施できる。
6.ポリマーの調製 本発明のポリペプチドは、多数のポリペプチド繰返し
単位を含む水溶性又は水分散性抗原ポリマーを形成する
ために、互に接続されうる。そのようなポリマーは、免
疫学的反応の増加という利点を持つ。ポリマーを構成す
るために種々のポリペプチドが用いられる場合、そのよ
うなポリマーは多数のHBxAgの抗原決定基と免疫反応す
る抗体を誘発する追加的能力を持つ。
ポリマーは、二つのシスティン残基を含むように、後
述するようにポリペプチドを合成することにより作るこ
とができる。二つのシスティン残基は、一つの末端とポ
リペプチド鎖内に、又はアミノ末端とカルボキシ末端の
両者に存在することができる。二つのシスティンを含む
ポリペプチドは、本明細書で一般に、di Cysポリペプチ
ドと云われ、一方、二つの末端システィン残基を含むポ
リペプチドは、di Cys末端ポリペプチドと云われる。ポ
リペプチド鎖内又はポリペプチド鎖末端のそのようなシ
スティン残基は、ポリペプチドが対応するところのHBxA
g配列中に存在することができ、たとえばポリペプチド1
42の中央システィン（カルボキシ末端アラニン（Ala）
から第７番目の残基）、ポリペプチド99のカルボキシ末
端システィン（Cys）である。又は末端システィン残基
は、ポリマー作成のために加えられることができる。
有用なdi Cysポリペプチドの例は、左から右へかつア
ミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて下記の式に
より示されるものである。
ポリペプチド99a:Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-
Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys、 ポリペプチド100a:Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu
-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys、及び ポリペプチド142a:R1‐Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe
-Phe-Thr-Ser-Ala-R2 ここでR1及びR2は各々、システィン残基であり、但
し、R1とR2の一方のみが存在する。
第６図に示すように、ポリペプチド99、100各々104の
各々は、翻訳されたＸゲノムのアミノ酸残基配列に存在
する一つのシスティン残基を含む。ポリペプチド99及び
100のアミノ酸残基配列（末端システィン残基を除き）
を持つポリペプチドが本明細書において免疫反応ブロッ
キング研究で有用であり、また後述するようにMBS以外
の手段により担体に結合されて用いられることを繰返し
述べておく。
一つ又は二つの末端システィン残基が、ポリマー製造
のために加えられ、残りのアミノ酸残基配列はHBxAgの
抗原決定基に対応し、ポリペプチド繰返し単位はまだHB
xAgの抗原決定基に対応すると考えられる。
典型的な実験室製造において、di Cysポリペプチド
（非酸化形のシスティンを含む）の10mgが、約８のpHを
持つ0.1M重炭酸アンモニウムの250mlに溶解される。溶
解されたdi Cys末端ポリペプチドは次に、得た溶液をゆ
っくり約18時間又はエルマンテストにより遊離メルカプ
タンが検出されなくなるまでゆっくり攪拌することによ
り空気酸化される。〔エルマン（Ellman），（1959）,A
rch.Biochem.Biophys.,82:70−77〕 このようにして作られたポリマーは、繰返し単位とし
て多数の本発明のポリペプチドを含む。これらポリペプ
チド繰返し単位は、酸化されたシスティン残基により互
に結合される。
多数の本発明のポリペプチドを含むそのようなポリマ
ーは、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の
方向に書いて下記式により表わされうる。
（Ａ）a,（Ｂ）ｂ ここでＡ及びＢは、異るポリペプチド繰返し単位たと
えばポリペプチド99、100及び142である。下付き文字ａ
及びｂは整数であり、各々０〜約2000の平均値を持ち、
但しａとｂの平均値の合計は少くとも２であり、従って
ポリマー中に少くとも二つのポリペプチド繰返し単位が
存在する。
下付き文字ａ及びｂの平均値の合計は典型的には、得
られたポリマーが、約5,000,000ダルトンの平均分子量
を持つように、約2000より大きくない。好ましい態様で
は、ポリマーの平均分子量は、約50,000〜約1,000,000
ダルトンである。
上述の式は、ポリマーの繰返し単位及び存在する各繰
返し単位の平均数の一般化した表示であることを意図さ
れる。二つの異る繰返し単位を含む本発明のポリマー
は、典型的にはランダムコポリマーである。すなわち、
上述の式は、ポリペプチド繰返し単位がポリマーたとえ
ばブロックコポリマー中に存在する順序を表わすことを
意図するものではない。
本発明の上述の水溶性又は水分散性ポリマーは、免疫
原性かつ抗原性であり、従って前述したように本明細書
では抗原性と記述される。そのような抗原性ポリマー
は、生理学的に許容される希釈剤中に分散され、たとえ
ばラビット一匹当り400μｇのポリマーの量で免疫化注
射により導入されるとき、HBxAgと免疫反応するニュー
ジランドレッドラビットにおいて抗体の産生を誘発でき
る。生理学的に許容される希釈剤の例は、免疫学で周知
であり、下記に更に詳しく述べられる。
7.蛋白質担体へのポリペプチドの結合 ここで用いられる合成ポリペプチドは、下記の周知の
方法を用いてキイホールリンペットヘモシアニン（KL
H）に結合された。KLH担体はまず、ｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性
化され、次にポリペプチドアミノ末端（ポリペプチド10
0）、カルボキシ末端（ポリペプチド99）に存在するシ
スティン残基を介して、又はポリペプチド142の中央シ
スティンを用いて、リウ（Liu）ら、（1979）、バイオ
ケミストリー、80、690、記載のようなミカエル付加反
応によりポリペプチドに結合された。
本発明のポリペプチドはまた、種々の手段で担体に結
合でき、またKLH以外の担体に結合できる。たとえばポ
リペプチド99bのようなポリペプチドは、周知のように
0.04％グルタルアルデヒド溶液を用いて、遊離アミノ基
を介して破傷風トキソイド担体に結合されうる。たとえ
ばクリプスティン（Klipstein）ら、（1983）、J.Infec
t.Disc.,147:318参照。
合成ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端又は中
央部分に存在するシステイン残基は、ジスルフィド結合
及びミハエル付加反応生成物を介して接合体を形式する
ために特に有用であることが見い出された。しかし、接
合体を作るために従来周知のの他の方法もまた用いう
る。追加的結合（リンキング）手順の例は、ジアルデヒ
ドたとえばグルタルアルデヒド（上述）などの使用、担
体とポリペプチドの間のアミド結合を形成するための水
溶性カルボジイミドたとえば１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミドの使用を包含す
る。
有用な担体は当該分野で周知であり、一般に蛋白質そ
のものである。そのような担体の例は、キイホールリン
ペット ヘモシアニン（KLH）、エデスチン、チロクロ
ブリン、アルブミンたとえばウシ血清アルブミン又はヒ
ト血清アルブミン（各々BSA又はHSA）、赤血細胞たとえ
ばヒツジ赤血球（SRBC）、破傷風トキソイド、コレラト
キソイドならびにポリアミノ酸たとえばポリ（Ｄ−リシ
ン:D−グルタミン酸）などである。
また周知のように、合成ポリペプチドをその担体に中
間の結合基により結合することがしばしば有利である。
上述のように、グルタルアルデヒドは、そのような結合
基の一つである。
しかし、システインが用いられるとき、中間結合基は
好ましくは、やはり上述したｍ−マレイミドベンゾイル
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（MBS）で
ある。MBSは典型的にはまず、エステル−アミド交換反
応により担体に付加される。その後に、上述のミハエル
反応が続き、又はMBS付加の次に、ブロックされたメル
カプト基たとえばチオール酢酸（CH3COSH）のマレイミ
ド二重結合を横切るミハエル付加が行われうる。アシル
ブロッキング基解離の後に、ブロックを解かれた結合基
メルカプタンと合成ポリペプチドの加えられたシステイ
ン残基のメルカプタンの間にジスルフィド結合が形成さ
れる。
担体の選択は、抗原の決定基部分によりも、抗原の意
図される最終用途に依存し、本発明に特に含まれない判
断基準に基づく。たとえば、もし、HBxAgの存在の評価
のために用いられる抗ポリペプチド抗体の生産に関して
接種物が動物で用いられるのであれば、特定の動物で不
都合な反応を起さない担体が選ばれるべきである。もし
接種物たとえばHBxAgに対するワクチンがヒトで用いら
れるなら担体及び／又は得られる抗原の免疫化学的又は
他の副反応のないこと、安全性又は効率（つまりヒトで
の使用を意図されるすべてのワクチンに妥当する同じ配
慮）に最大の考慮が払われる。
8.免疫化手順 免疫化のために用いられる接種物は、酸化されたシス
テイン残基を介して互に結合された個々のポリペプチド
のポリマーとして、又は担体に結合されたポリペプチド
の接合体として、ポリペプチドの有効量を含む。一接種
当りのポリペプチドの有効量は、なかんずく接種される
動物種、動物体重及び選ばれた接種部分に周知のように
依存する。接種物は典型的には、乾燥した固体のポリペ
プチド接合体又はポリペプチドポリマーから、ポリペプ
チド接合体又はポリペプチドポリマーを水、食塩水又は
アジュバントに懸濁することにより調製される。
これら接種物は典型的には、一接種当り約20μｇ〜約
500mgの濃度のポリペプチドを含む。述べたポリペプチ
ド量は、担体が用いられる場合、担体重量を除くポリペ
プチドの重量を指す。
接種物はまた、生理学的に許容される希釈剤たとえば
水、リン酸塩緩衝される食塩水、又は食塩水を含み、更
に典型的には希釈剤の一部としてアジュバントを含む。
完全フロイントのアジュバント（CFA）、不完全フロイ
ントのアジュバント（IFA）及び明ばんのようなアジュ
バントは、当該分野で周知の物質であり、いくつかの供
給源から市販入手できる。
接種物貯蔵溶液は、CFA、IFA又は明ばんから下記のよ
うに作られる：一接種当り望む量のポリペプチドを与え
るのに十分な量の合成ポリペプチド接合体又はポリマー
状ポリペプチドが7.2のpH値でリン酸塩緩衝された食塩
水（PBS）に溶解される。次に等量のCFA、IFA又は明ば
んをポリペプチド溶液と混合して、水：オイル比が約1:
1である、ポリペプチド、水及びアジュバントを含む接
種物を得る。混合物を次にホモゲナイズして、接種物貯
蔵溶液を得る。
接ポリペプチド抗体を生じるためにここで用いられる
ラビットは、完全フロイントのアジュバント（CFA）に
乳化されたポリペプチド接合体（ポリペプチド＋担体）
の200μg;不完全フロイントのアジュバント（IFA）中の
ポリペプチド接合体の200μg;及びポリペプチド接合体
の200μｇ（腹膜内注射される4mgの明ばんを伴い）を含
む接種物を皮下注射で、各々第０、14及び20日の免疫化
スケジュールで与えられた。各接種は、接種物の四回の
注射により成った。マウスは、一注射当り上述の投与量
の約10分の１を用いて同じ方法で免疫化されうる。
動物は、典型的には第一回注射の後第４及び第15週に
採血される。対照免疫化前血清は、各動物から最初の免
疫化の直前に採血して得られた。
対照接種物貯蔵溶液はまた、キイホールリンペット
ペモシアニン（KLH）、IFA（不完全なフロイントのアジ
ュバント）中のKLH、KLH−明ばん吸収、KLH−明ばん吸
収−百日ぜき、エデスチン、チログロブリン、破傷風ト
キソイド、IFA中の破傷風トキソイド、コレラトキソイ
ド、及びIFA中のコレラトキソイドを用いて作ることが
できる。
宿主動物に抗原又は接種物の注射又は他の導入をする
と、動物の免疫系は大量の抗体を作ることによって抗原
に応答する。製造された抗原、すなわち担体に結合され
た合成ポリペプチド又はポリマーから形成された抗原の
特異的抗原決定基は興味の天然の抗体の決定基に対応す
るので、宿主動物は、合成ポリペプチドに対するのみで
なく、合成ポリペプチド抗原が対応する蛋白質又はポリ
ペプチド即ちHBxAgに対する抗体を作る。
9.寄託 下記の物質が1984年３月８日にアメリカン タイプ
カルチャー コレクション（ATCC）に寄託され、各々、
表示する寄託番号を持つ。文字「ATCC」と続く数字及び
／又は文字と数字を含む、細胞系統、ベクター等に対す
る総ての表記は、上述のアメリカン タイプ カルチャ
ー コレクション 12301 パークロン ドライブ、ロ
ックビル、MD20852に寄託された物質を云う。
物 質 ATCC寄託番号 ビールスSVHBV−３と VR2084 SV40tsA239ヘルパー ウィルスの混合物ベクターDNA SVHBV−３ 40102 AM6 40101 SVAM191 40103 大腸菌 EC−AM6 39630 EC−AM1 39629 EC−SVAM191 39631 本発明者によりATCCに寄託された上述の物質に加え
て、他の人により作られ、ここで用いられた物質もまた
ATCCに寄託された。これら物質のリストを下記に示す。
B.材料及び方法 1.HBV DNA単離及び調製 領HBV DNAは、ロビンソンの方法（Am.J.Med.Sci.,（1
975）270:151−159）に従ってHBsAg陽性ヒト提供者の血
漿からのデーン粒子、サブタイプadw〔ナショナル イ
ンティチュート オブ ヘルス＃737139〕から単離され
た。簡単に云えば、血漿の1.0mlを、0.001MのTris-HCl
（pH7.4）及び0.5MのHClを含むTN緩衝液で3.0mlに希釈
した。希釈した血漿を10,000xgで10分間遠心分離して大
きなデブリスを除き、次にTN、0.001MED TA〔0.1％２−
メルカプトエタノール及び1mg/mlのウシ血清アルブミン
（BSA）（これは沈澱したBSAを除くために予め10,000xg
で10分間遠心分離されている）〕を含む30％（w/v）蔗
糖の2.5ml上に層状にした。Spinco SW−65ローター（商
標：ベックマンインストルメンツ社）で４℃で50,000rp
mで４時間遠心分離の後に、上澄を注意深く除き、ペレ
ットを、１％Nonidet P−40（商標：ポリオキシエチレ
ン（９）オクチルフェニルエーテル；シグマ ケミカル
社、セントルイス、MO）及び0.1％２−メルカプトエタ
ノールを含むTN緩衝液の50μｌに懸濁した。
上述で単離されたHBV DNAの一本鎖部分は、25μｌの
mix E〔0.2M Tris-HCl pH7.4）、0.08M MgCl2、0.24 NH
4Cl、各々1.0mMのdaTP、dTTP、dGTP及びdCTP〕を再懸濁
したHBV DNAの50μｌに加え、37℃で３時間インキュベ
ートすることにより二本鎖にされた。ロビンソン（197
5）、Am.J.Med.Sci.,270:151−159。
ゲノムプローベとして用いられる放射性ラベルされた
HBV DNAは、dCTP及びdGTPの代りに各々0.25μｌの3HdcT
P及び3HdGTP（両者とも21キューリー/mM）を用いること
により、上述の埋め込み（フィリングイン）法を用いて
作られた。
2.HBxAgクローニング HBxAgをコードするDNA配列を含むHBVゲノムの部分
は、大腸菌に導入されたプラスミドpBR322を用いてクロ
ーンされた。上で単離された二本鎖のラベルされていな
いHBV DNAを、制限エンドヌクレアーゼBam HI〔50mM Na
Cl、10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl、1mMジチオス
レイトール〕で分解された。反応混合物を0.6％アガロ
ース水平スラブゲルで100アンペアで２時間電気泳動し
た（0.04Tris−アセテート、0.002M EDTA）。
１％エチジウムブロマイドでの着色により三つのHBV
DNAフラグメントが現われ、これはゲノム中の二つのBam
HI制限部位の存在を示す。3200bpフラグメントは、Bam
HI部位の唯一ケ所で切断された結果として線形の全HBV
ゲノムを表わした。1850bp及び1350bpフラグメントは、
完全なBam HI分解の結果として二つのフラグメントに切
断されたゲノムを表わした。
上で単離された三つのBam HI HBV DNA制限フラグメン
トのコピーが、プラスミドpBR322（ATCC 37017）〔サッ
トクリフェ（1978）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、75:373
7−3791〕でのクローニングにより得られた。HBV DNA B
am HIフラグメントをpBR322に挿入するために、プラス
ミドは、Bam HI〔50mM NaCl、10mM Tris-HCl（pH7.
5）、10mM MgCl、1mMジチオスレイトール〕で分解して
線形化されて、HBVフラグメントの末端に対し相補的な
末端を形成した。三つのHBV DNAフラグメントとpBRフラ
グメントを混合し、T4 DNAリガーゼ〔66mM Tris-HCl（p
H7.6）、66mM MgCl2、10mM ジチオスレイトール及び0.4
mM ATP〕によるDNAリゲーションに付した。上の反応で
得られたリゲーション反応生成物は、線形化pBR322及び
HBVフラグメントからの、相補性末端で結合された環状D
NAである。
この環状組換えプラスミドは、コーエンら、（197
2）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、69:2110−2114の方法に
従って大腸菌株HB101〔ATCC33694;ナショナル キャン
サー インスティチュート、NIH、ベセスダ、MD、のデ
ィーン・ハンター博士により提供〕に導入された。簡単
に云えば、大腸菌HB101株は、0.03M CaCl2溶液中で０℃
で20分間インキュベートされた。組換えプラスミドの10
0ngが加えられた同じ溶液の0.3mlに約５×109バクテリ
ア細胞が加えられた。この形質転換反応混合物は、０℃
で60分間インキュベートされた。
プラスミドpBR322は、アンピシリン及びテトラサイク
リン耐性授与遺伝子を含む。このプラスミドで形質転換
された薬品感受性バクテリア細胞は、アンピシリン及び
テトラサイクルリン耐性を示す。pBR322DNAは、テトラ
サイクリン耐性遺伝子上にある唯一つのBam HI開裂部位
を持つので、Bam HI部位でのHBVフラグメントの挿入は
この遺伝子を崩壊する。Bam HI部位に挿入されたHBV DN
Aフラグメントを持つpBR322から導かれたプラスミド
（クローニングベクター）により形質転換された薬品感
受性大腸菌HB101は、従ってアンピシリン耐性及びテト
ラサイクリン感受性を示す。
形質転換された大腸菌、すなわちプラスミドアンピシ
リン耐性授与遺伝子を含むものは、形質転換反応混合物
を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB肉汁寒天培養基
〔１当り10gバクトアガー、10gバクトリプトン、5gバ
クト酵母エキス（各々ディフコ ラブズ、デイロイト、
ミシガン、から入手）及び5g NaClを含む増殖培養基〕
上に塗付することにより選択された。塗付された大腸菌
は、37℃で２日間インキュベートされた。
上述の手順による形質転換後にアンピシリン耐性を示
したコロニーのうちから、テトラサイクリン耐性コロニ
ーが、アンピシリンの代りに50μg/mlのテトラサイクリ
ンを含むLB肉汁（上述）上にコロニーに塗付することに
より選択された。この塗付されたコロニーはまた、37℃
で２日間インキュベートされた。テトラサイクルリン耐
性遺伝子中のBam HI開裂部位に挿入されたHBV DNAフラ
グメントを持つpBR322を含む大腸菌HB101株が、かくし
て得られた。
3.プラスミドDNA抽出 上のように分離された組換えDNA含有大腸菌HB101細胞
は、20μg/mlのアンピシリンを含むLB肉汁培養基中で、
対数成長期に170μg/mlの濃度にクロラムフェニコール
を加えて、増殖された。プラスミドDNAを増やすため
に、培養を数時間続けた。
次に細胞を、500mlの細胞に50mM Tris-HCl（pH8.0）
溶液中25％蔗糖の5mlを加えることにより分解した。０
℃で10分間インキュベート後に、0.25M Tris-HCl（pH7.
5）中の１％リゾチームの1ml加え混合した。０℃で10分
間のインキュベーション後に、25M EDTA（pH8.0）の2ml
をゆっくり添加混合した。０℃で10分間のインキュベー
ション後に、0.15M Tris-HCl（pH8.0）、0.2M EDTA（pH
8.0）中の１％ Triton X-100〔ポリオキシエチレン
（９）オクチルフェニルエーテル〕の8mlを添加混合
し、再び０℃で10分間インキュベートした。
得たリセートをSpinco SW−65ローター（ベックマン
インストルメンツ）で30,000rpmで遠心分離して、変
性蛋白質及び細胞デブリスを除去した。DNAは、明澄な
リセートから、2M酢酸ナトリウムの1/10体積及び99％エ
タノールの2.5体積を添加混合し、−20℃で30分間イン
キュベートすることによって沈降された。DNA沈降物
は、10,000xgで30分間の遠心分離によりペレット化され
た。
蛋白質除去は、0.01M Tris-HCl（pH7.6）、0.1M NaCl
及び0.0012M EDTAを飽和されたフエノールの1mlを用い
て二度行われた。ランダーズ（Landers）ら、（197
9）、J.Viral.,23:368−376。上述の手順から水性層を
取り出し、これから2M酢酸ナトリウムの1/10体積及び99
％エタノールの2.5体積を加え、−20℃で20分間インキ
ュベートすることによりDNAを沈降した。10,000xgで10
分間の遠心分離は、HBxAgをコードする遺伝子を含む完
全に二本鎖のDNAのペレットを与えた。
4.プラスミドDNA分析 クローン中のHBV DNAの存在は、サザーン移動及びハ
イブリダイゼーション法を用いて確認された。サザーン
（1975）、Mol.Bial.,98:503。上述のように分離された
各クローンからのプラスミドDNAの10mgをBam HI〔50mM
NaCl、10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、1mM ジ
チオスレイトール〕で分解した。反応混合物を0.6％ア
ガロース水平スラブゲルで100アンペアで２時間電気泳
動した（0.04M Tris-酢酸塩、0.002M EDTA）。
ゲル中のDNAは、ゲルを1.5M NaCl及び0.5M NaOHの数
倍体積中に室温で１時間、一定攪拌又は振とう下に浸す
ことによって変性された。ある例では、ゲル中のDNA
は、アルカリ変性の前にゲルを0.25M HCl中に15分間ず
つ２回室温で浸することによって酸脱プリンにより加水
分解された。変性後に、ゲルは、1M Tris-HCl（pH8.0）
及び1.5M NaClの溶液の数倍体積中に室温で１時間、一
定振とう下に浸すことによって中和された。
ゲル中のDNAは、マニアチスら（1982）、ジャーナル
オブ モレキュラー クローニング（J.Molecular Cl
oning）、コールド スプリング ハーバー、に記載さ
れるとほぼ同様にしてニトロセルロースに移された。簡
単に云えば、ニトロセルロース（カタログNo.BA85、シ
ュライヒャー アンド シュエル社、オハイオ）がゲル
の上に置かれ、ワットマン（Whatman）3MN紙の数層がニ
トロセルロース上に置かれた。このサンドイッチは次
に、その端が0.9M NaCl及び0.09Mクエン酸ナトリウムを
含む緩衝液にひたされるところのワットマン3MN芯上に
ゲル端を下げて落かれた。これによる緩衝液の毛管移動
がDNAをゲルからセルロースに移した。DNAは、真空下で
80℃で２時間焼くことによってニトロセルロースに固定
された。
上のようにして調製されたニトロセルロース上のプラ
スミドDNA（サザーン フィルター）は、マニアチスら
（前出）の方法でHBV DNAフラグメントの存在について
プローベされた。
簡単に云えば、サザーンフィルターは、プレハイブリ
ダイゼーション液0.9M NaCl、0.09クエン酸ナトリウ
ム、５％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、100mg/ml変
性サケ精液DNA及び5Xデンハルトの溶液（１当り1gフ
イコル、1gポリビニルピロリドン、及び1g BSAフラクシ
ョンＶを含む）に68℃で４時間浸すことによってプレハ
イブリッドされた。
ハイブリダイゼーションは、サザーンフィルターを湿
らせておくのに丁度十分なハイブリダイゼーション溶液
（50μl/フィルターcm2）を入れた熱密閉できるバック
中で行われた。ハイブリダイゼーション溶液は、0.9M N
aCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.01M EDTA、5Xデンハ
ルトの溶液、0.5％SDS、100μg/ml変性サケ精液DNA及び
５×107cmpの上述で調製した放射性ラベルされたHBV DN
Aを含んだ。サザーンフィルターは、ハイブリダイゼー
ション溶液中で68℃で12時間インキュベートされた。
フィルターを２時間洗った（0.3M NaCl、0.03Mクエン
酸ナトリウム）後に、フィルターにＸ線フィルム（XRP-
1、コダック）を露出して、オートラジオグラフイメー
ジを得た。
上の手順を用いて三つの組換えプラスミドが単離さ
れ、AM6、AM7及びAM1と名付けられた。AM6は、pBR322DN
A及び全HBVゲノムを含んだ。AM1は、pBR322DNA及びHBxA
gをコードする遺伝子を含む1850bp HBV DNAフラグメン
トを含んだ。
5.SV40/HBxAg発現ベクターDNAを含む複製プラスミドの
構築 ディーン ハマー（前出）から得られた欠陥SV40ウイ
ルスは、50mM NaCl、10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM Mg
Cl2及び1mM ジチオスレイトールを含む緩衝液中でBam
HI及びEco RI開裂に付された。プラスミドpBR322DNA
は、かく開裂されたSV40DNAに対し相補的な末端を形成
すべく、前述の二重消化（分解）に付された。この消化
の各々の開裂生成物を分離し、塩化セシウム密度勾配遠
心分離により精製した。タナカら（1975）、J.Bact.,12
1:354−362。かく単離した4492bp SV40フラグメント及
び3987bp pBR322フラグメントを、66mM Tris-HCl（pH
7.6）、6.6mM MgCl2、10mM ジチオスレイトール、及び
0.4mM ATPを含む緩衝液中でT4 DNAリガーゼによるDNAリ
ゲーションに付してpBRSV（第４図）を形成した。
上述の反応で得たリゲーション反応生成物は、線形化
pBR322 3987bp及びSV40 4492bpフラグメントから導かれ
た、それらの相補性Eco RI及びBam HI末端で結合した環
状DNAである。この環状プラスミドは次に、リゲーショ
ンの間に形成されたBam HI制限部位での開裂により線形
化されて、各端にBam HI粘性末端を作る。
HBxAgをコードする遺伝子を含む1850bp HBV DNAフラ
グメントは、上述で単離されあプラスミドAM6を、50mM
NaCl、10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl2及び1mM
ジチオスレイトールを含む緩衝液中でのBam HIによる
分解に付すことにより単離された。反応混合物を、0.8
％、アガロースを用いて100アンペアで２時間電気泳動
に付し、1850bp バンドを切り出し、68℃で15分間融解
した。1/10体積の3M酢酸ナトリウムを加え、得た溶液を
上述の蛋白質除去手順に付した。
かく単離したHBxAg遺伝子含有HBV DNAフラグメント
は、Bam HI相補性末端を持った。このDNAフラグメント
は次に、上で作ったpBR−SVに、66mM Tris-HCl（pH7.
6）、mM MgCl2、10mM ジチオスレイトール及び0.4mM A
TPを含む緩衝液中でT4DNAリガーゼを用いてリゲートさ
れた。
上のリゲーション反応の生成物は、環状プラスミドDN
Aであり、SVAM191と名付けられた。それは、時計方向順
に、塩基位置2468のBam HI部位から塩基位置1717のEco
RI部位までの4492bp SV40DNAフラグメント、塩基位置０
のEco RI部位から塩基位置375のBam HI部位までの3987b
p pBR322 DNAフラグメント、及び塩基位置1400のBam HI
部位から塩基位置28のBam HI部位までの1850bp HBV DNA
フラグメントを含んだ。プラスミドSVAM191は、第４図
に図式的に示される。
SVAM191は、前述の形質転換法を用いて大腸菌HB101に
導入された。この形質転換大腸菌はまた、アンピシリン
耐性かつテトラサイクリン感受性なので、それらは大腸
菌クローニングベクターのために前述したのと同じ分離
手順に付された。上述した製造、分離、精製及び分析の
ための手順が、実質上純粋なSVAM191 DNAのmg量を得る
ために用いられた。
6.SV40/HBxAg発現ベクターの構築 真核細胞におけるHBxAgの産生を誘発できるベクター
が、SVAM191 DNAの一部を切断することによって作られ
た。このことは、SVAM191 DNAを、10mM Tris-HCl（pH7.
5）、10mM MgCl2及び1mMジチオスレイトールを含む緩衝
液中でのHae IIエンドヌクレアーゼにより分解して、SV
40 DNA領域の塩基位置767及びHBV DNA領域の塩基位置14
37のHae II部位でSVAM191を開裂することによって達成
された。
上の反応から得た二つのDNAフラグメントは、前述の
アガロースゲル電気泳動によって分離された。SV40及び
HBV DNAのみを含む、かく単離された比較的大きなフラ
グメントは、そのHae II相補性末端を前述のT4 DNAリゲ
ーション手順に付して環化された。
上で形成された環状DNA発現ベクターは、SVHBV−３と
名付けられた（第４及び５図）。それは、SV40からの発
現制御要素、及びHBVからのHBxAgをコードする遺伝子を
含む。
7.SVHBV−３による真核宿主細胞のトランスフェクショ
ン SV40のための許容される宿主であるBSC−１アフリカ
グリーンモンキー腎臓細胞系統（ATCC CCL26;ソーント
ン博士、ジョーンソン アンド ジョーンソン バイオ
テクノロジー センター社、ラ ジョラ、カリフォルニ
アから得た）が、SVHBV−３によるトランスフェクショ
ンのために選ばれた。約107細胞の集合単層が、10％胎
児ウシ血清、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレ
プトマイシン及び3mM L−グルタミンを補われたイーグ
ルの最小必須培養基（EMEM）で37℃で培養することによ
って得られた。この単層は、ガネム（Ganem）ら（197
6）、J.Mol.Biol.,101:57−83、記載のようにDEAE−デ
キストランの存在下でベクターSVHBV−3 DNAにより感染
された。
一つのフラスコは、ヘルパーとしてのSV40 tsA239 DN
Aの0.05μｇと共に1.6μｇの組換えSVHBV−３により感
染された。対照品は、同じ量のベクターヘルパーDNAの
みを与えられた。培養物は40℃で12日間インキュベート
され、次に凍結−解凍により分解され、そして−70℃で
貯蔵された。
細胞蛋白質は、上で得た凍結−解凍された細胞粉末か
ら、先ず2mgの細胞粉末を1mlの蛋白質抽出緩衝液〔２％
SDS、10％グリセロール、0.08M Tris-HCl（pH6.8）、2m
Mフェニル メチル スルホニル フルオライド、0.1M
ジチオスレイトール、0.001％ ブロム フェノール
ブルー〕に加えることにより抽出された。この溶液は
次に、５分間沸騰され、15、000rpmで10分間遠心分離さ
れ、そしてこれから上澄みが集められる。
100μｇのサンプル蛋白質を与えるのに十分な量の上
澄みを次に、後記のウェスターンブロット法でSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に付した。
8.ポリペプチド合成 本発明のポリペプチドは、メリフィールド（Merrifie
ld）ら（1963）、J.Am.Chem.Soc.,85:2149;メリフィー
ルドら（1970）、A.Rev.Biochem.,39:841−866及びホウ
テン（Houghten）ら（1980）、Int.J.Reptide Prot.Re
s.,16:311−320、記載の固相法により化学的に合成され
た。ここで用いられる比較的短いポリペプチドは、HBxA
gの抗原決定基に対応する。
第６図は、HBxAgの154アミノ酸残基配列を示す。ここ
で述べる好ましい合成ポリペプチド（99、100及び142）
のアミノ酸残基配列がまた、第６図に示される。二つの
合成ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析により確認さ
れた。
一般に、免疫原つまり合成ポリペプチドは、HBxAgの
抗原決定基領域のアミノ酸残基に対応する適当に保護さ
れた多数のアミノ酸を用意すること、及びこれらアミノ
酸を、該抗原決定基のポリペプチドアミノ酸残基配列に
対応するアミノ酸残基配列を持つポリペプチドへと合成
することの段階により作られる。作られた合成ポリペプ
チドは、通常これを担体に結合して接合体を作り、そし
て有効量の接合体を生理学的に許容される希釈剤に分散
することにより接種物を作るために用いることができ
る。
ポリペプチドは好ましくは、システイン樹脂を用いて
上述の固相法によって合成される。この方法を用いて、
加えられる各アミノ酸のαアミノ基は典型的には、アミ
ノ酸が成長するポリペプチド鎖に加えられる前に、第三
ブトキシカルボニル（ｔ−BOC）基により保護される。
次にｔ−BOC基は、成長するポリペプチド鎖への次のア
ミノ酸の付加の前に除去される。個々のアミノ酸の鎖鎖
は、下記のように保護される:Arg−トシル;Ser−、Thr
−,Glu−及びAsp−Ｏ−ベンジル;Tyr−Ｏ−ブロモベン
ジロキシカルバミル;Trp−Ｎ−ホルミル；システインの
ためにＳ−メトキシベンジル；リジンのために２−クロ
ルベンゾキシカルボニル；及びヒスチジンのためのジニ
トロフェニル。アスパラギンが用いられるとき、等モル
量のＮ−ヒドロキシ−ベンズトリアゾールに保護された
アミノ酸が加えられ、ジメチルホルムアミド（DMF）が
カップリング溶媒として用いられる。Trp残基上のＮ−
ホルミル基は、樹脂支持物からのポリペプチドの解離後
に、1.0mg/mlのポリペプチド濃度で1.0M重炭酸ナトリウ
ムアンモニウムによる室温16時間の処理により除去され
る。ヤマシロら（1973）、J.Org.Chem.,38:2954−259
7。各段階でのカップリングの効率は、ニンヒドリン又
はピクリン酸によりモニターされ、好ましくは総ての場
合に99％より大きい。ギシン（Gisin）（1972）、Anal.
Chem.Acta.,58:248−249;及びカイザー（Kaiser）（198
0）、Anal.Biochem.,34:595−598。
望むポリペプチドの調製後に、得た保護されたポリペ
プチドの一部（約1g）は、2mlのアニソール及び約20ml
の無水フッ化水素で処理され、ドライアイス温度で反応
容器中に凝縮される。得た混合物を約４℃で約１時間攪
拌して、保護基を解離しかつ樹脂からポリペプチドを離
す。４℃でN2流を用いてフッ化水素を気化させた後に、
残渣を無水ジエチルエーテルで三度抽出してアニソール
を除き、残査を減圧乾燥する。
減圧乾燥された物質を５％酢酸水溶液で抽出して（３
回50ml）、樹脂から遊離のポリペプチドを分離させる。
抽出物含有溶液を真空凍結乾燥して、モノマー状の非酸
化ポリペプチドを得る。
簡単に云えば、各ポリペプチドのための一般化した手
順として、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）の0.2
5ml中の4mgのKLHが、DMFに溶解したMBSの0.7mgと反応さ
せられ、得た混合物は室温で30分攪拌される。KLHは約3
0％以上のDMF濃度で不溶なので、DMFの局部的濃度が高
すぎないようにMBS溶液が滴加される。反応生成物KLH−
MBは、遊離のMBSを除くために、50mMリン酸ナトリウム
緩衝液（pH6.0）で平衡化されたSephadex G−25（ファ
ーマシア ファイン ケミカルズ、ピスカタウェイ、ニ
ュージャージー）を備えられたクロマトグラフィーカラ
ムに通される。280nmでモニターされる。カラム溶出物
のピーク分画からのKLH回収率は、典型的には約80％で
ある。
かく作られたKLH−MBは次に、1mlの緩衝液中に溶解さ
れた5mgのポリペプチドと反応される。得た反応組成物
のpH値が７〜7.5に調節され、そして反応組成物は室温
で３時間攪拌されて、ポリペプチド−担体複合体を与え
る。
9.ウエスターンブロット 抗ポリペプチド抗体（抗99、抗100及び抗142）は、HB
xAgに関するその予定された特異性を確認するため、及
びトランスフェクトされた細胞におけるHBxAgの実質的
ポリペプチド部分の発現を確認するために、ウエスター
ンブロット法を用いて調べられた。HBxAgを含む細胞蛋
白質は、12.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離された。ラエムリ（Laemmli）（1970）、ネ
イチア、277:680−685;及びトウビンら（1979）、Proc.
Natl.Acad.Sci.,USA、76:4350−4354参照。
蛋白質は、25mM Tris-Base、192mMグリシン、20％メ
タノール及び0.1％SDS（pH8.3）より成る緩衝液を用い
てエレクトロブロット装置（E.C.アパレイタス社、ジャ
クソンビル、フロリダ）でトウビンら（前出）記載のよ
うにニトロセルロース（シュライヒャー アンド シュ
エル、カタログNo.BA85）に電気泳動的に移された。移
動に続いて、ニトロセルロースは、非特異的結合を低減
するためにBLOTTO〔ボビン ラクト トランスファー
テクニック オプチマイザー、ジョーンソンら（198
3）、J.Exp.Med.,159:1751−1756;5％（w/v無脂乾燥マ
ルク;0.01％消泡剤Ａ（シグマ社、カタログNo.A5758）
及び0.0001％メルチオレート（シグマ社、カタログNo.5
215）、pH7.2のPSB中〕でブロックされた。ブロット
は、10mlのBLOTTO中で３時間抗ペプチド抗体の100μｌ
と反応させられ、次に新鮮なBLOTTOの50mlで１時間三度
洗われた。
ベクター特異的蛋白質に結合した抗ポリペプチド抗体
はブロットを10mlのBLOTTO中のＩ−125ラベルした黄色
ブドウ球菌蛋白質Ａの25μｌと１時間反応させることに
よって検出された。次にブロットは、新鮮なBLOTTOの50
mlで15分間五度洗われ、そして流水中で20分間洗われ
た。
10.肝臓癌細胞抽出物のＩ−125ラベル印加 HBVの組込まれた（integrated）配列を含むと知られ
るヒト肝臓癌由来細胞系統PLC/PRF/5〔アレキサンダー
ら（1976）、African Med.J.,50:21−24;ATCC CRL802
4〕の単層を真空凍結乾燥した。細胞粉を、1mg/mlの蛋
白質濃度となるように、リン酸塩緩衝される食塩水（PB
S）に溶解した。細胞デブリスを除くために10、000xgで
遠心分離後に、上述の溶液50μｌに、75μｌのRIPA〔0.
15M NaCl、10mMリン酸ナトリウム（pH7.5）、１％ Noni
det p−40、0.5％ナトリウムデオキシコレート、0.1％S
DS〕及び20μｌの0.2Mリン酸ナトリウム（pH7.5）を添
加混合した。一つの研究では、かく可溶化された細胞蛋
白質は、クロラミンＴ反応を用いて５ミリキューリーの
125Iでラベルされた。第７図に示す研究では、細胞リセ
ートは、同じ反応を用いて３マイクロキューリーの125I
でラベルされた。
上述の反応混合物を、PBSで洗われたSephadex G−25
（ファーマシア ファイン ケミカルズ社、ピスカタウ
ェイ、NJ）カラムに通した。得られる放射性ラベルされ
たピーク分画（９×106cpm/ml）は、非特異性結合を除
くために、正常ラビット血清でプレインキュベートされ
た。簡単に云えば、ピク分画の20μｌを1.0mlのRIPA、2
0μl Trasylol（プロチニンの商標；シグマ社、1984年
２月カタログ第163頁）及び100μlNRSと混合した。０℃
で１時間のインキュベーション後に、ホルマリン固定し
た黄色ブドウ球菌（Staph A;カルバイオケム、ラ ジョ
ラ、CA）細胞の500μｌを添加混合し、混合物を０℃で3
0分間インキュベートした。Staph A沈降物を10、000xg
で10分間の遠心分離により除き、上澄みを回収した。
11.免疫沈降（IP） ポリペプチド99に対するラビット抗ポリペプチド血清
（抗99）を、上で得た放射性ヨウ素ラベルした細胞蛋白
質と反応させた。簡単に云えば、10μｌの抗99を２×10
6cpmのラベルされた抽出物と混合し、０℃で１時間イン
キュベートした。次に40μｌのStaph Aを加え、０℃で3
0分間インキュベートした。Staph A沈降物を10,000xgで
10分間の遠心分離により除き、ペレットを回収した。ペ
レットを1mlのRIPAに再懸濁し、上のように遠心分離し
た。得たペレットを1.0ml LiCl溶液（100mM Tris-HCl、
500mM LiCl）に再懸濁し、再び遠心分離した。LiCl溶液
処理を繰返して、ペレットを回収した。
上で得たペレットをサンプル緩衝液の50μｌに再懸濁
し、３分間沸騰した。混合物を10、000xgで１分間遠心
分離し、上澄みを回収し、12.5％SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に付した。上述のゲルをXRP−1X線フ
ィルムに露出して、オートラジオグラフを得た。
12.チンパンジー及びヒト肝臓細胞抽出物の調製及び評
価 二つのHBV慢性的感染チンパンジー及びヒト肝臓、及
び正常チンパンジー及びヒト（HBV血清陰性）肝臓から
の肝臓サンプルを液体窒素中で急速凍結し、粉末へと挽
いた。粉末をサンプル緩衝液〔0.0625M Tris-HCl（pH6.
8）、２％ SDS、10％グリセロール、５％２−メルカプ
トエタノール及び0.001％ブロムフェノールブルー〕に
添加混合し、５分間沸騰した。混合物を10,000xgで遠心
分離して細胞デブリスを除いた。サンプルを次に、75μ
ｇ蛋白質／ゲルレーンを用いて前述のようなウエスター
ンブロット分析に付した。
13.ヒト血清における抗HBxAg抗体の同定 20μg/レーンのSVHBV−３トランスフェクションされ
たBSC−１細胞抽出物を、12％アクリルアミドゲルでSDS
−PAGEに付し、分離された蛋白質を前述のようにニトロ
セルロースシートに電気泳動的に移した。得たニトロセ
ルロースシートを、HBVに関連する感染を持つと診断さ
れた６人（微候のキャリア及び肝臓細胞癌腫患者を含め
て）からの血清の1:50希釈物と混合した。対照シート
は、本発明のラビット抗ポリペプチド抗体と混合され
た。
ニトロセルロース−蛋白質血清混合物を室温に２時間
維持した。次にシートをすすぎ、ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ヒト又は抗ラビット
抗体の1:200希釈と適当に混合した。この混合物を、結
合された抗Ｘ抗体を適当な抗体と反応させるために１時
間維持した。シートを洗い、そして前述のように４−ク
ロル−１−ナフトールで現像した。肝臓細胞癌腫患者か
らの血清は、SVHBV−３トランスフェクションされた細
胞により発現された約24,000ダルトンポリペプチドとの
強い免疫反応を示した。
14.細胞系統及び組織サンプル PLC/PRF/5及びHepG2細胞は、D.ミリヒ（Milich）博
士、基礎及び治療研究部門、スクリップス クリニック
アンド リサーチ ファンデーション（Scripps）、
ラ ジョラ、カリフォルニア、により提供された。チン
パンジー肝臓組織サンプルは、R.パーセル（Purcell）
及びP.カプラン（Kaplan）両博士、各々、National Ins
titute of Allergy and Infections Diseases、Bethesd
a MP、及びOrtho Diagnostics Inc.,Raritan NJ、から
提供された。ヒト肝臓組織サンプルは、F.キサリ（Chis
ari）、J.ディーンスタグ（Dienstag）及びA.ユ（Yu）
博士、各々、Scripps、ハーバード大学薬学部、ボスト
ン、カリフォルニア大学−サンジェゴ小児科、から提供
された。
上記は本発明を例示するためのものであって、限定す
るものではない。多数の変更及び修正が、本発明の新規
な概念の真の精神及び範囲を離れることなく行われう
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/29 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９６３１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１０１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１０２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０１０３ (72)発明者 ラーナー リチヤード エイ アメリカ合衆国 カリフオルニア州 92037 ラ ジヨラ ローズランド スト リート 7750 (56)参考文献 ・Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．１（1970) Ｐ．695−698

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】左から右へかつアミノ末端からカルボキシ
    末端の方向に書いて下記の式 （ｉ）Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-
    Tyr-Phe-Lys-Asp; （ii）Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-
    Ile-Arg-Leu-Lys-Val; 及び （iii）Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala により表わされるポリペプチド配列の群から選ばれるア
    ミノ酸残基配列に対応する６〜40のアミノ酸残基を含む
    抗原性合成ポリペプチド。
  2. 【請求項２】酸化されたシステイン残基により互いに結
    合された多数の合体された合成ポリペプチド繰返し単位
    を含む水溶性又は水分散性抗原性ポリマーであって、上
    記繰返し単位は、左から右へかつアミノ末端からカルボ
    キシ末端の方向に書いて Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Ty
    r-Phe-Lys-Asp-Cys; Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Il
    e-Arg-Leu-Lys-Val-Cys;及び R1‐Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R2 （ここでR1及びR2の各々はシステイン残基であり、但
    し、R1とR2の一方のみが存在すること）より成る群から
    選ばれる式により表わされるところの抗原性ポリマー。
  3. 【請求項３】体サンプル中のHBxAgの存在を検出するた
    めのキットであって、第一の反応剤の容器の少なくとも
    一つを含み、該第一の反応剤はHBxAgと免疫反応するこ
    とができ、かつ、下記の抗原性合成ポリペプチドと免疫
    反応することができる抗原結合部位を含む抗体を含んで
    おり、該抗原性合成ポリペプチドは、左から右へかつア
    ミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式 （ｉ）Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-
    Tyr-Phe-Lys-Asp; （ii）Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-
    Ile-Arg-Leu-Lys-Val 及び （iii）Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala により表わされるポリペプチド配列の群から選ばれるア
    ミノ酸残基配列に対応する６〜40のアミノ酸残基を含む
    ものであることを特徴とする、体サンプル中のHBxAgの
    存在を検出するためのキット。
  4. 【請求項４】更に第二の容器中に第二の反応剤を含み、
    該第二の反応剤が、該抗体と免疫反応する前記抗原性ポ
    リペプチドである請求の範囲第３項記載のキット。
  5. 【請求項５】下記の工程を含む、体サンプル中に存在す
    る抗HBxAg抗体の存在を検出する方法： （ａ）固体支持物を形成するために固体マトリックスに
    固定された抗原を用意する工程、 ここで抗原は、左から右へかつアミノ末端からカルボキ
    シ末端の方向に書いて下記の式 （ｉ）Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-
    Tyr-Phe-Lys-Asp; （ii）Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-
    Ile-Arg-Leu-Lys-Val; 及び （iii）Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala により表わされるポリペプチド配列の群から選ばれるア
    ミノ酸残基配列に対応する６〜40のアミノ酸残基を含む
    抗原性合成ポリペプチドである； （ｂ）該固体支持物を、評価されるべき液状体サンプル
    と混合して固液相を形成する工程； （ｃ）該混合物を、体サンプル中に存在する抗HBxAg抗
    体が該固体支持物の抗原と免疫反応するのに十分な時間
    維持する工程；及び （ｄ）該免疫反応の存在を指示手段により決定する工
    程。
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