JPS615097A - 微生物学的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、不活性化された毒素（トキシン）を含有する
新規ワクチンに関する。

ヒトおよび動物における多くの病気は、病原性細菌によ
る毒素生成の結果であって、これらの毒素が正常な細胞
活動を崩壊させるのである。しかしながら、肉体は免疫
応答の形態で防御糸を有しており、それによって抗原性
蛋白η、例えば細菌の毒素或いは細菌自体の外側に存在
する蛋白質、の導入に応答して抗体分子が産生される。

蛋白質の抗原決定基に応答する特異的抗体が産生され、
血液中に暫時持続することになろう。従って、抗原性蛋
白質が前液或いはリンパ中に表われても既に抗原に曝さ
れた抗体形成細胞は迅速に特異的抗体を産生じてそれを
除去する。この概念が多くのワクチン接種技術の基礎で
ある。すなわち、この技術−よって、少量の比較的害の
ない形態の抗原自体が投与されて細胞が必要抗体を産生
ずるように条件付けられるのである。

病原菌自体は、通常はワクチンに使用するのに適したも
のではない。なぜならば、それらは病気を引きおこす潜
在能力を有するからである。従って、病原菌自体は全規
模の感染が起こらないように例えば加熱などにより殺さ
れるのがふつうである。全細菌を殺す必要があるところ
から、高度の品質管理がワクチンの製造において必要と
される。

ワクチンの製造の際は、また、多量の病原性細菌の生育
が必要であるところ、これはワクチン製造に携わる者に
対する潜在的な感染原であるので、生きた病原菌が周囲
の環境に逃げださないように確実な注意が必要である。

更に、化学的或いは物理的に不活性化された細菌のワク
チンは生きた病原菌或いはそれらの毒素自体と同程度の
保護を与えない可能性もある。

毒素類が使用される場合には、それらもまた、通常ホル
ムアルデヒドの使用により不活性化されて「トキソイド
」を得なければならない。ここでもまた、品質管理の問
題が生ずる。ワクチン中の変性されていない毒素の存在
は深刻な病気および場合によっては死に導く可能性があ
るからである。

本発明は、組み換えＤＮＡ技術を用いたワクチン接種へ
の新しい手法を提供するものである。本発明者等は、毒
素或いは毒素の毒性成分をコードする遺伝子を下記のよ
うに変性することが可能であることを見出した。すなわ
ち、この遺伝子を必要に応じて他の遺伝子物債と共に適
当なベクター中に導入し、これを使用して生物体を形質
転換させたときに、それがトキソイド、すなわち天然の
毒素或いは毒素の素性成分に対して活性な抗体の産生な
刺戟する能力を有すると共に最早前件を有しない変性さ
れた毒素、を産生ずるということである。そのように産
生された遺伝子的に変性された毒素は、単独で或いは他
の抗原と共に、或いは該変異性毒素を含有する形質転換
された非病原性宿主生物体の形態で、ワクチン中に導入
することができる。

本発明によれば、従って、トキソイドが提供される。す
なわち、このトキソイドは、毒素或いは毒素の毒性成分
の不活性形態よりなるものであり、この不活性形態は、
該毒素或いは毒素成分と実質的に相同的（ホモロガス）
のものであり、変異させた遺伝子の発現により生成する
ものであり、しかも実質的に非毒性であると共に却独或
いは１種以上の非毒性成分と組み合わされて該毒素或い
は毒性成分に対する抗体の産生な刺戟する能力を有する
ものである。

的である。すなわちそれは、好ましくは、毒性活性に必
要な部位またはその近傍でのアミノ酸残基の少数が、例
えば１０ｇ未満、好ましくは５個未満、例えば１個或い
は２個が、異なるにすぎないものである。好ましい姿を
具体的にいえば、毒素或いは毒性成分のこの不活性形態
が、活性毒素或いは毒性成分と該不活性形態との両者に
共通なアミノ酸残基の間の空間的関係が保たれて、毒性
活性は除去されるけれどもなるべく多くの元の免疫原性
は保持されろようになっているということである。

本発明は、更に、毒素或いは毒素の毒性成分の不活性化
方法を提供するものである。すなわち、この方法におい
ては、毒素或いは毒素の毒性成分をコードする遺伝子を
下記のように変異させる。

すなわち、変異させた遺伝子を必要に応じて他の遺伝子
と共に宿主生物体において複製能力を有するベクター中
に導入して、該宿主生物体を形質転換するために使用す
るときに、それが上記本発明によるトキソイドを産生ず
るように、である。

本発明はまた、本発明に従った不活性化された毒素或い
は毒素の毒性成分をコードするように変異させた遺伝子
にも及ぶものである。そのような遺伝子は、好ましくは
天然の毒素或いは前非の毒性成分をコードする遺伝子と
実情的に相同的なものである。本発明は、そのような変
異させた遺伝子を含有するプラスミドなどのベクターを
も旬含するものである。

特別の病気の原因となる青紫をコードする遺伝子を変異
させるために有利に使用することのできる二つの突然変
異誘発技術がある。第一のものは、ランダムな突然変異
誘発を利用するものであって、例えは化学的突然変異誘
発剤或いは照射使用いるものである。そのようにして得
られたランダムに変異させた遺伝子は、次いで、遺伝子
について所望特性を有する変性毒素を産生ずるものを求
めてスクリーニングに付されろ。

第二の手法は、毒性活性に必要な対応蛋白質中の部位を
コードする遺伝子の傾城（すなわち、活性領域）を変異
させることによる部位指定突然変異誘発を含むものであ
る。これは、例えば、オリゴヌクレオチド（化学的に合
成されたオリゴヌクレオチドが便利である）をその位置
に導入して、密接に関連した実質的に相同的な蛋白質、
すなわち最早毒性効果を有しないけれども抗体産生は生
じさせる蛋白質、を該遺伝子がコードするようにするこ
とにより達成される。

活性領域のある点において遺伝子を切断する制限エンド
ヌクレアーゼが利用可能である場合のこの技術の一つの
態様に従えば、その点においてオリゴヌクレオチドを挿
入して所望の特性を有する僅かに大きな蛋白質をコード
する遺伝子を生成させることが可能である。

この蛋白質の活性領域をコードする遺伝子のヌクレオチ
ド配列が決定されまたそれが二つの認識部位を含有すれ
ば、その二つの部位の間の配列を除去し、そのように形
成された切断末端を連結するか或いは除去された配列と
僅かに異る選ばれたオリゴヌクレオチドを挿入すること
のいずれかを行う機会も存在する。後者の場合において
は、該オリゴヌクレオチドは除去された配列よりも大き
いか或いは小さく、しかも（あるいは）−個所または二
個所以上の位置において相違するものであろう。

部位指定突然変異誘発のもう一つの方法は、−重鎖ＤＮ
Ａ鋳型を用いるプライマー指定突然変異誘発である。こ
の方法においては、少なくとも拘素の活性領域をコード
する遺伝子の部分のヌクレオチド配列が決定されなけれ
ばならない。この遺伝子の一重鎖形態は、鎖分離或いは
一１鎖フ１−ジへのクローニングのいずれかにより得ら
れる。遺伝子の「活性」領域に相補的である配列を有す
るオリゴヌクレオチド（通常１４〜２０個のヌクレオチ
ドの長さ）を合成することができる。このオリゴヌクレ
オチドを使用して、−重鎖物質を鋳型として用いること
により全相補的鎖の合成な一開始することができる。こ
の突然変異導入方法は、オリゴヌクレオチドプライマー
の構造に依存するものである。若し、このオリゴヌクレ
オチドプライマーが、遺伝子のある領域に相補的である
けれども僅かの変化、好ましくは、変更されるべき塩基
における単一の不適当な組み合わせ（ｍ１、ｓｍａｔｃ
ｈ）を有するように作られるならば、この分子は第二の
鎖の合成を指示するプライマーとして作用する。そのよ
うに形成されたＤＮＡの二重鎖は、二本の鎖、すなわち
その特別の突然変異が指示された点以外においては相補
的であるもの、を有する。１個を越えろ不適当な紹合わ
せも存在し得るが、■−かし、相補的鎖の合成を可能に
するためにはオリゴヌクレオチドプライマーは天然の「
活性」部位と十分に相同的でなければならない。この分
子の複製によって、単一の塩基対合において異なる二つ
の異種の二重鎖ＤＮＡ分子が生じる。この変性ＤＮＡは
、例えば、このオリゴヌクレオチドプライマーが未変性
ＤＮＡよりも変性ＤＮＡにより強く結合することを利用
して、このオリゴヌクレオチドプライマーの標識付きの
ものをプローブとして用いて検出および単離することが
できろ。

あらゆそ）そのような特別の突然変異において。

新たなオリゴヌクレオチド配列は読み出し枠を維持しな
ければならず、停止コドンなどの望ましくないコドンを
含有してはならない。

グラム−陰性細菌により引きおこされる多くの胃腸病は
、急性な下痢により特徴付けられる。この急性な下痢は
、共通して消化管内の流体バランスの崩壊につながる毒
素生成の結果である。伝染性下痢はブタおよびウシにみ
られるそのような病久の一例（特に若い動物に急性下痢
を引きおこす）であるのに対し、コレラはヒトにおける
同様な病気の特によく知られた例である。この病気は、
共通して、伝染性の下痢の場合には大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ａｏ１１／）のおよびコレラの場合には
コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａθ）の腸毒発
生菌株による小腸の汚染および集落形成の結果である。

細菌による小腸の集落形成は＋１１１１菌細胞表面上に
位置する抗原性蛋白質、例えばブタの伝染性下痢の場合
には所謂に８８抗原およびウシの伝染性下痢の場合には
に９９抗原、を介した宿主の腸壁への細菌の付着により
開始されることが示されている。

急性下痢を引きおこす病気に対するワクチン接種への多
くの従来の手法は、これらの表面抗原に対する抗体の開
発を含むものであったが、しかしこれらの手法は細菌の
毒素の不活性化を使用するものではなかった。

本発明は、感染により生じる急性下痢の原因となる毒素
に対する抗体形成を刺戟するワクチンの開発に関するも
のである。コレラにおいては、これはＣＴと呼ばれるの
に対し、ブタの伝染性下痢においては関連した熱に不安
定な毒素（ＬＴ）が急性の下痢および高い死亡率の原因
である。

ブタの伝染性下痢の場合は、ＬＴ毒素は、異った機能を
有する１：５の比率で存在する二つの蛋白質ＬＴＡおよ
びＬＴＢにより構成される。ＬＴＢ蛋白質（外部的に位
置する）によって、この毒素が腸壁に結合し、次いで、
このＬＴＢ蛋白質により取り囲まれているＬＴＡ蛋白質
が分泌されて消化管の上皮膜に侵入し、そこでアデニル
ンクラーゼを刺戟する。この酵素刺戟は、消化管への流
体分群に直接につながって、激しい下痢を発生させる。

同様に、コレラ毒素はアデニルシクラーゼ刺戟の原因と
なる成分ＣＴＡおよび毒素を腸壁に結合させろＣＴＢの
成分よりなるものである。

ブタの伝染性下痢および同様な病気に対する保護につい
ての従来の研究は、細菌の付着装置に集中している他に
、この毒素の外部的非毒性蛋白質成分例えば上記ＬＴＢ
蛋白質のみを含有するワクチンに焦点を合わせていた。

しかしながら、コレラ毒素に対するイヌの保護を含む研
究において、ＬＴＢと類似であるＯＴＢ成分が保護を与
える上において全ＣＴよりも４０倍効率が低いことが示
されているので、ＬＴＡおよびＬＴＢの両者を含有する
ワクチンはＬＴＢ成分のみを含有するものよりも免疫原
性がより大きいものと思われる。

また、その免疫学的特性のいくつかを保持しながらその
毒性活性を除去するために、分子の大部分例えばその長
さの約ｌ／３を除去することによりＬＴＡ　毒素を変性
することが提案されている（　ＥＰＡ００８７７３５　
）。しかしながら、そのようにして形成された変性毒素
はＬＴＢと結合して変性ＬＴ毒素な形成することが出来
ず、必然的にこの毒素の免疫学的特性の原因となる抗原
決定基の多くを失う。本発明者等は、異った手法すなわ
ち前記の手法を採用することが好ましいことを見出した
。この前記の方法によれば毒素は変化が可能な限り少な
くて、天然ＬＴＡ毒素と実質的に相同的に留まり、かよ
うにして、元の分子の実質的に全ての抗原決定基が保持
されろ。

更に、本発明に従えば、急性下痢を引き起こす毒素の毒
性成分の遺伝子的に変異させた形態よりなるトキソイド
が提供される。ここで、このトキソイドは、実質的に該
毒性成分と相同的であり、実質的に非着性であるが、し
かし、単独で或いは非毒性成分と組み合わされて天然の
毒素或いは毒性成分に対して活性な抗体の産生を刺戟す
るもの、である。本発明は、更に、そのような毒性成分
をコードする遺伝子をそれが上記のようなトキソイドを
コードするように変異させる方法を提供するものでもあ
る。

変性された毒性成分を製造するには、その成分をコード
する遺伝子（以下Ａ−遺伝子と称する）（毒素の非毒性
成分をコードする遺伝子（以後Ｂ−遺伝子と称する）と
−緒になっていることがふつうである）を単離すること
が必要である。この遺伝子は、プラスミド、例えばブタ
の伝染性下痢の場合にはＥ；、　ｃｏｌｉ　Ｎ０ＩＢ　
１１９３２　から単離されるＰ２Ｏ３に存在する。遺伝
子の変異は、その大きさおよび認識特性の欠除に鑑みて
元のプラスミドについて行うのは便利ではない。変異遺
伝子を含有するクローンの選択は、それが岸離されてよ
り適”３　ｔｘベクター中に挿入された場合に容易に行
うことができる。

すなわち、ブタの伝染性下痢の場合には、元のプラスば
ドＰ３０７をＲｃｏ　Ｒ工およびＨｐａ、　Ｉで消化し
、消化された断片を以下に記載する特別に開発されたプ
ラスミドｐＡＴＩ５３（予め完全にｋｃＯＲＩで消化さ
れ、Ｈｌｎｃ　ｆｌ　で部分的に消化されたもの）と混
合し、連結を行う。形成されたノ・イブリッドプラスミ
ドを用いて適当な宿主生物体例えばｎ、　ｃｏｌｌＮＯ
ＩＢ　１１９３３の形質転換を行う。成功した形質転換
体の選択はＬＴＡ蛋白質の産生に基づいて行われ、プラ
スミドはゲル電気泳動により単離することができる。こ
のようにして、本発明者等は、ＬＴＡ蛋白質をコードす
るプラスミドＧｐ３ＬＴＡ−６を含有する形質転換体な
同定することができた。

Ｂ−遺伝子もまた即離し、プラスミド中に挿入して、毒
素のＬＴＢ−成分の発現に′可能にすることができる。

ブタの伝染性下痢の場合には、プラスミドｐ３０７をＨ
ｌｎｄ　ｍで消化し、消化された断片をプラスミドｐＡ
Ｔ　１５３　（予めＨｌｎａ　ｍ　で消化された後、脱
ホスホリル化されたもの）と混合し、連結させる。Ｈ，
、ｃｏｌｉ　Ｎ０ＩＢ　１１９３３　　の形質軒換およ
びクローニングによって、ＬＴＢ蛋白質を生成する１以
上の形質転換体が生成する。関与するプラスミドは、ゲ
ル電気泳動により分析される。このようにして、本発明
者等は、ＬＴＢ蛋白質をコードするプラスミドＧｐＫＬ
ＴＢ　−１０を同定した。

次の段階は、Ａ−遺伝子を変異させて、蛋白質生成物が
非毒性でありながら、なお抗体の産生を刺戟する能力が
あるようにすることである。蛋白質生成物は、変異遺伝
子と共にＢ−遺伝子を発現する際に天然毒素と同様にＢ
成分を伴なって〜・ることか望ましい。本発明者等は上
記方法を適用してそのような遺伝子を製造した。

すなわち、第一の技術は、挿入されたＡ−遺伝子を含む
プラスばド（例えばＧｐＲＬＴＡ　−６プラスミド）を
突然変異誘発剤（例えばヒドロキシルアミン或いはバイ
サルファイド（ナトリウム或℃・はカリウムバイサルフ
ァイド））で処理することによる八−遺伝子の変異を含
むものである。次℃・で、突然変異誘発されたプラスミ
ドを使用して非病原性１１Ｃ，ｃｏｌｉ、例えば菌株Ｎ
巾Ｅ　１１９３３　　を形質転換させる。次いで、形質
転換体を選択するのであるが、それにはそれらの細胞不
含抽出液の蛋白質産物を産生ずる能力を利用する。ここ
でいう蛋白質産物とは、Ｂ−遺伝子と共に発現時に天然
毒素と同様な分子量の非毒性免疫原性蛋白質を与える蛋
白質のことである。

Ａ−成分およびＢ−成分の両者を含有する変性毒素を生
成させるためには、Ａ−遺伝子およびＢ−遺伝子を含有
する別々のプラスミドを例えばＢＣａ　Ｒ■などの制限
酵累により切断し結合してハイプリントプラスミドを形
成することができる。

すなわち、本発明者等はＫｃｏＲＩによる消化に引き続
きプラスミドＧｐＥＬＴＡ　−６ｍｉ、−６ｍ２および
一６ｍ３をそれぞれプラスミドＧｐＥＬＴＢ　−１０に
結合させ、これらの三つの生成ハイブリッドプラスミド
を使用してに、、　ｃｏｌｉ　ＮＣＩＢ　１１９３３　
　を形質転換させた。これらの三つの新規のプラスミド
は遺伝子地図により特徴付けられ、ＧｐＥＮＴ　−２ｍ
１、ＧｐＲＮＴ　−２ｍ２およびＧｐＥＮＴ　−２ｍ３
と命名された。更に、元のＧｐＥＬＴＡ　−６プラスミ
ドをＧｐ凡ＬＴＢ　−１０からの同一の断片に結合させ
て、プラスミドＧｐｌｉ、ＮＴ　−２を形成させた。こ
れらの三つの形佃転換されたＮＯより１１９３３株のク
ローニング彼、変性された毒素を次いで単離したところ
、全ての場合において天然ＬＴ毒素に見られる比と同一
である１：５の比率のＬＴＡとＬＴＢよりなることが判
明した。

同一の技術を用いて、本発明者等は、更に、ＬＴＢ毒素
成分に対する遺伝子を有するものと有しないものとにつ
いて変異ＬＴＡ遺伝子含有プラスばドを調製した。上記
命名法に従って、これらをそれぞれＧｐＲＮＴ　−２ｍ
４〜ＧｐＲＮＴ　−２ｍ１ｌおよびＧｐＫＬＴＡ　−５
ｍ４〜ＧｐＲＬＴＡ　−６ｍ１ｌと命名した。

前記天然ＬＴＡ遺伝子の遺伝子配列は添付第１図に示さ
れる。上記ＧｐＫＮＴ　−２Ｈ−ＧｐＢＮＴ　−２ｍ１
１に存在する変異は確認され、対応するアミノ酸配列と
共に表１に示した通りである。

表１ ４　９３　　ＴＯＴ　　ＴＴＴ　　Ｓｅｒ　Ｐｂｏ２　
１３８　０ｃＡ　　ＯＴＡ　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ６　１３
６　　ＧＧＡ　　ＧＡＡ　　Ｇａｙ　Ｇｌｕ７　３９　
　ＧＧＴ　　ＧＡＴ　　Ｇｌｙ　Ａｓｐ１６５　　ＧＡ
ＣＡＡＯＡｓｐ　Ａｓｎ９　１３５　　ＧＧＴ　　ＡＧ
Ｔ　　Ｇａｙ　５ｅｒ１５８　０ＡＴ　　ＴＡＴ　　Ｈ
ｌｓ　ＴｙｒＩＱ　、　　３２　　ＧＡＴ　　ＡＡＴ　
　Ａｓｐ　Ａｓｎ９６　　ＴＣＡ　　Ｔ’ＴＡ　　Ｓｅ
ｒ　Ｌｅｕｌｌ　　　　　　　　　　４４　　　　　　
ＧＧＧ　　　　　　　ＡＧＡ　　　　　　Ｇｌｙ　　　
　　Ａｒｇ全ての突然変異体ＬＴＡ”　％＠、例Ｉ　Ｂ
　（ｖｌ）に示されるように何等の活性も示さない。

トキソイドおよび天然毒素の活性は、関連するプラスミ
ドを含有する細菌菌株の細胞不含抽出液を用いたウサギ
回腸ループ試験によりしらべた。

本発明者等はＧｐＢＮＴ　−２ｍｌ　−３〜ＧｐＢＮＴ
　−２１ｍ＋１１およびＧｐＥＬＴＡ　−６ｍｌ　〜Ｇ
郭ＬＴＡ　−６ｍ１ｌが測定可能な毒性活性を有しない
ことを見出した。

上記のように、遺伝子（この場合においてはＡ−遺伝子
）の不活性化の第二の方法は、成る規定されたオリゴヌ
クレオチドを用いて毒性活性に関与する毒素のＡ−成分
の部分をコードする部位を変異させる特定の突然変異誘
発を含むものである。

このＤＮＡ配列の変異の結果、毒性活性に必要な領域が
変更された蛋白質が得られる。勿論、その領域なコード
する遺伝子の配列における或いは十分に近接した認識部
位を見出すことが好ましい。適当な制限エンドヌクレア
ーゼは、実験により見出すことができる。必要に応じて
、この特別の制限酵素により認識される部位を有しない
プラスばドを特別に選択することが必要な場合がある。

このオリゴヌクレオチドインサートは変異遺伝子を含有
するクローン選択を容易にする認識部位を含有すること
が望ましい。これはプラスミド中にはどこにも存在しな
い制限部位であることが便利である。変異或いは未変異
のプラスミドは次いで制限酵素で処理し、生成物をゲル
電気泳動に付して、線状ＤＮＡと環状Ｄｌとを区別する
ことにより区別することが出来る。オリゴヌクレオチド
は、読み出し枠を維持し、停止コドンを含有しないよう
に選ばなければならない。比較的短い配列が有効である
ので、そのような部位を含有するオリゴヌクレオチドを
化学合成により製造するのが便利である。しかしながら
、必要とされる特性を有する天然に存在する配列が存在
するならば、これを使用することも可能である。

合成オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｍ、　Ｇａ１ｔな
どの確立されたホスホトリエステル法を用いて調製する
ことができる（　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｌｎｚｙ
ｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　ｆｒ
ａｇｍｅｎｔｓ、　Ｅｄ、　Ｈ，Ｇ、　Ｇａ５５ｅｎａ
ｎｄ　Ａ、　Ｌｏｎｇ　；　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉ
ｃ　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　１９８’　）。

短いオリゴヌクレオチド、例えば３〜５個のアミノ酸を
コードするもの、を使用するのが好ましい。

ｐＡＴ　１５３プラスミドを使用する場合には、一つの
可能性のある独特な認識部位は、制限酵素ｓｓｔ　１１
を認識する部位である。

オリゴヌクレオチドは、それらが挿入されるべき遺伝子
の切断末端に対応する粘着末端を有する二量体を形成す
るように相補的であるべきである。

すなわち、例えば、本発明者等は次のダイマーを形成す
るオリゴヌクレオチド（０ＴＡＧＴＣＣＧ（！ＧＧＡ）
を合成した。

５’　　０ＴｊＡＧＴＯＣＧＯＧＧＡ ＡＧＧＯＧＯＯＴＧＡＴＯ５１ 本発明者等は、Ｘｂａ　Ｉを用いてプラスミドＧｐＲＬ
ＴＡ　−６を切断し、５′末端においてホスホリル化さ
れた上記合成オリゴヌクレオチドｄ　（ＯＴＡＧＴＣＣ
ｉＧＯＧＧＡ　）を挿入することができた。この変異プ
ラスミドを次いで使用して、Ｆｊ、、　ｃｏｌｉ　ＮＣ
より１１９３３を形質転換してクローン化した。このプ
ラスミド／オリゴヌクレオチドハイブリッドの分析によ
って、Ｘｂａ　ｌにより認識されたＤＮＡの配列が蕪く
なり、Ｓｓｔ　■により認識される部位を獲得した多く
の突然変異体が存在することが示され、この部位におけ
るオリゴヌクレオチドの挿入の成功が示唆された。これ
らの突然変異体は、Ｚｕｂａ７の１ｎｖｉｔｒｏの転写
／翻訳系により分析された。その結果、変異体の七つ（
ＧｐＥＬＴＡ　６θ１〜７）が変異ＬＴＡ、遺伝子によ
りコードされた蛋白貸を生成したことが判った。

次の段階は、完全なトキソイドをコードするプラスミド
の造成を含むものであった。これは、前記のように、Ｇ
ｐＥＬＴＢ　−１０に由来するＬＴＢ遺伝子を挿入−不
活性化されたＬＴＡを含むプラスミド、例えばＧｐＢＬ
ＴＡ　５Ｅ＋５　　の一つに挿入することにより行われ
た。新しいプラスミドＧｐＥＮＴ　−２ｓ５が形成され
た。

新たに形成されたＧｐＲＮＴ　−２Ｅ１５の蛋白質産物
の試験を行うために、ＧｐＥＮＴ　−２（天然ＬＴＡお
よびＬＴＢ遺伝子を含有）およびａｐｐ＝ＮＴ−２Ｅ１
５　（天然ＬＴＢ遺伝子および変異ＬＴＡ遺伝子を含有
）により形質転換された細菌株の細胞不含抽出液につい
てウサギの回腸ループでの活性の試験を行った。ＧｐＥ
ＮＴ−２８５に対しては何等の応答もなく、この蛋白質
生成物が不活性であることが判明した。従って、ＬＴＡ
　Ｏ）　Ｘｂａ　ｉ部位におけるオリゴヌクレオチド挿
入の結果、最早毒性ではない新たな僅かに大きい蛋白質
の産生が行われると結論付けることができる。

本発明者等はブライマー指定（ｐｒｉｍｅｒ４ｉｒｅｃ
ｔｅｄ）オリゴヌクレオチド突然変異誘発によってＬＴ
トキソイドを製造したが、その場合に上記のようにＬＴ
Ａ遺伝子の所与の傾城に相補的なオリゴヌクレオチドの
構成に基づいているけれども、僅かに変性されているオ
リゴヌクレオチドの造成を利用した（このオリゴヌクレ
オチドが不活性ＬＴＡペプチドをコードするように変更
されている相補的鎖の合成を指定するプライマーとして
作用する）。

合成オリゴヌクレオチドは、上記のように造成すること
が出来る。本発明者等は、例えば、尤の遺伝子中に存在
するオリゴヌクレオチドＴＧＴＴＴＣＣＡＯＴＴＯＴＣ
ＴＴＡＧ　　がら僅かに−っの塩基が異るオリゴヌクレ
オチドＴＧＴＴＴＴＣＡＯＴＴＯＴ、０ＴＴＡＧを合成
した。

この合成オリゴヌクレオチドを次いでホスホリル化し、
ＬＴＡ遺伝子の相補的鎖を担う一重鎖ＤＮＡのプライマ
ーとして使用することができろ。この使用されるＤＮＡ
ベクターは、ファージとして一１鎖の形態で存在するこ
とができると共に、宿主細菌中において二重鎖として複
製する能力を有するものである。そのようなベクターＯ
月例はＭ　１３　ｍｐｌｏである。本発明者等は、かよ
うにして、先ずＭ１３、ｍｐｌｏをＥｃｏ　ＲＩおよび
ＸｂａＩテ消化シ、コレラの同一制限酵素を用いてＧｐ
ＫＬＴＡ　−６を消化し、次いで二つの断片を一緒に連
結することによりＭ１３ｍｐ　１ｏ　／　ＬＴＡハイブ
リッドベクターを調製した。このハイブリッドは、ｎ、
　ｃｏｌｉ、例えばＪＭＩ０３に形質転換した後に同定
することができる。次いで、このハイブリッドを含有す
るＩＥ、　ｃｏｌｉを使用して、ハイブリッドを一重鎖
の形態で含有するファージ粒子を生成させることができ
る。このブライマーオリゴヌクレオチドを次いで一１鎖
鋳型に対してアニーリングさせ、これを使用してＤＮＡ
ポリメラーゼの作用を使用して第二番目の鎖を生成させ
ることができる。この二重鎖分子を次いで連結し、適当
な生物体例えばｎ、　ｃｏｌｉ　：ＪＭ　ＩＯ２中にク
ローン化させる。この二重鎖ＤＮＡの複製時に二つの異
種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　）二重鎖ＤＮＡ分子が
生成するが、その一つは天然毒素をコードし、他方はト
キソイドをコードするものである。トキソイドをコード
化する変異遺伝子を含有する細胞を次いで同定すること
ができる。

上記技術により製造された変異遺伝子を使用して上記の
適当なプラスミドに導入することにより、新宅のトキソ
イドを製造することができる。この方法により、本発明
者等は上記のように変異させた遺伝子を含有するプラス
ξドＧｐ朋Ｔ　３　ＳＤＭ　１を調製した。このプラス
ミドを次いで使用して適当な宿主細胞、例えば五＋　ｃ
ｏｌｉ　Ｎ０ＩＢ　１１９３３　、を形質転換させ、こ
れを次いで通常の発酵技術に付してトキソイドを単離す
ることができる。

すなわち、例えば、形質転換された宿主細胞を、窒素源
、例えば蛋白質加水分解物（例えばペプトン）、或いは
１種以上のアンモニウム塩、炭素およびエネルギー源例
えばＬａｂ　ｌｅｍｃｏ　歳いはグリセロールなど、お
よび微量元素を含有する栄養培地上或いは培地中での発
酵により培養することができる。Ｅ、ｃｏｌｉの場合に
は、液中好気性発酵が好ましく、約３７℃で行うのが有
利である。

トキソイドは、発酵から任意の便利な方法で単離するこ
とができろ。一般的に、形質転換された宿主細胞はトキ
ソイドを細胞外に発現する能力を有しない。従って、細
胞は通常例えば遠心分離により集め、超音波処理或いは
溶解により崩壊させ、細胞破片の除去後抽出液を分別、
例えば分別沈殿或いはクロマトグラフィー、にかける。

すなわち、例えば、ＬＴトキソイドはそのような細胞不
含抽出液をアガロースカラムにかけ、””　（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ　　−ＨＯＩ　　５０　ｍＭ　　ＢＤＴＡ　、
　　　２００　　ｍＭ　　ＮａＯユ　、　　３ｍＭ　ナ
トリウムアジド、ｐＨ７，５）中のガラクトースによる
溶出により精製することができる。

必要に応じて、トキソイドはワクチン配合物に導入する
前に凍結乾燥して保存することができる。

一般的に、遺伝子を２２９番目のヌクレオチド残基（Ｔ
ｙｒをコードするＤＮＡ　）リプレットの開始に対応）
と４５９番目のヌクレオチド残基（Ｖａｌをコードする
ＤＮＡの末端に対応）との間に変異を生ずるように遺伝
子を変異させることが好ましい。ＬＴＡ蛋白質は、この
ようにアミノ酸７７　（Ｔｙｒ）および１５３（Ｖａｌ
）の間で変異させることが好ましい。

遺伝暗号の縮重は特別のアミノ酸に対して１個よりも多
い暗号トリプレットを与、えるものであり、本発明は公
知の縮重側に従った第１図に示されたものと等価な全て
の遺伝子に及ぶものである（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　
Ｃｏｄｅ、　Ｃｏ１ｄ　ｉ３ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｓｙｍｐ＋Ｑｕａｎｔ、　　Ｂｉｏ１、、　　Ｖａｌ
　３１．　１９６６　　）。

従って、本発明は更に、本発明に従ったＬＴＡ　）キソ
イドをコードする変異遺伝子およびより具体的には第１
図に示された変異遺伝子およびそれらの等個物を提供す
るものである。本発明は、また、ブタの伝染性下痢の原
因となるＬＴ毒素のＬＴＡサブユニットをコードする特
定の遺伝子も及ぶものである。ここでこの遺伝子は、７
９番目の位置でセリンをコードヌクレオチドトリプレッ
トがフェニルアラニンをコードするトリプレットに置き
換っており、更に２（１１ｉ１までのトリプレットが異
ったアミノ酸をコードするトリプレットにより置き換っ
ているもの、である。

本発明は、また、そのような変異遺伝子を含有するベク
ターにも及ぶものである。ＬＴＡ遺伝子の場合には、こ
れらは好ましくはＬＴＢ蛋白質をコードする遺伝子と共
にプラスミド中に存在し、かつ一般的に急性下痢を引き
おこす毒素の毒性成分をコードする遺伝子が関連する場
合には、それは完全なトキソイドが発現されるようにプ
ラスミド中に毒素の残りをコードする遺伝子（Ｂ遺伝子
）と共に存在することが好ましい。特に好ましいプラス
ミドは、ｐＡＴ　１５３から得られたもの、特にＧ姪Ｔ
−２ｍ１、ＧｐＦｊＮＴ　−２ｍ２およびＧｐＥＮＴ　
−２ｍ３である。

本発明は、また、そのようなプラスぐドにより形質転換
された宿主細胞、特にＮＣ！ＩＢ　１１９３３のような
Ｌ　ｃｏユ１、にも及ぶものである。細胞がワクチン中
に導入される場合には、それが非病原性であるのみなら
ずそれらは発熱物質を発生すべきでないことが重要であ
る。Ｌ　Ｃ！Ｏ１ｉ　ＮＯより　１１９３３　細胞はこ
の目的のために適当なものである。

本発明は、更に、本発明によるトキソイドを含有するワ
クチン調剤に関するものである。そのようなトキソイド
は精製された或いは部分的に精製された形態で存在して
もよく、或いはそれを製造するために使用した非病原性
宿主細胞中に含有されてもよい。特に、本発明において
は、前記完全なトキソイドを含有する伝染性下痢病に対
するワクチンにおいて、上記のように、非病原性宿主細
胞或いは精製された或いは部分的に精製された形態にお
いて存在してもよいところの変異ＬＴＡ成分がＬＴＢ成
分と天然の毒素における１：５の比率で組み合わされて
いるワクチンが提供される。

ブタの伝染性下痢に対して使用されるワクチンは、トキ
ソイドを含有する非病原性宿主細胞或いは精製された或
いは部分的に精製さ第１たトキソイドをに８８抗原を含
有する全細菌或いは精製された或いは部分的に精製され
たに８８抗原と共に含有することが望ましい。使用され
るに８８抗原をコードするプラスミドすなわちに８８タ
イプａｂ、ａｃおよびａｄ、並びにそれらを含有する形
質転換された細胞は、例えばＢＰ、　００６０１２９に
記載されている。対応する接着因子、例えば、ウシの伝
染性下痢の場合にはに９９をに８８抗原に代えて用いる
ことにより関連した病気に対して有効なワクチンを製造
することができる。

単離されたに８８抗原を使用したい場合には、これらの
抗原はそのような抗原をコードする遺伝子を含有する宿
主細胞をＳｔｉｒｍなどにより記載された方法（：　Ｊ
、ＢａｃｔｅｒｉＯ１、　（１９６７）　９３．７３１
〜７３９）による発酵後に、回収することができる。こ
れらの細胞の熱処理、等電点沈殿および膜濾過は、それ
らの回収において特に有用な技術である。抗原の一部或
いは全部が発酵条件の結果として或いは発酵液を発酵の
終りに加熱することにより培養液中に放出される場合に
は、細胞不含抗原を常法、例えば遠心分離、濾過或いは
限外ｐ過により細胞から分離することができる。抗原は
引き続きＳｔｉｒｍなどにより記載される方法で回収す
ることができる。

ワクチンは、適当なアジュバント中に配合することがで
きる。免疫応答を強化するためのアジュバントとしては
、例えばゲル形成性アルミニウム化合物（例えば、水酸
化アルミニウム或いはリン酸アルミニウム）或いは油中
水エマルジョン、例えば７０インドの完全アジュバント
或いはより好ましくは油封水比が３〜５；１である精製
パラフィン油、油溶性界面活性剤、水および水溶性界面
活性剤を含有するエマルジョンなどが挙げられる。

トキソイドおよび細胞壁抗原の両者が存在すると細菌細
胞壁蛋白質および完全な毒素に対する抗体が生じるので
、伝染色下痢病に対する極めて有効なワクチンが得られ
る。

上記のワクチンは、宿主の有効な免疫化に有用なワクチ
ンを調製するために有効量の抗原性蛋白質を含有すべき
である。ブタの伝染性下痢の場合には、ワクチンの単位
投与量は動物の体重ｋｇ当り２μｇ〜１０μｇのトキソ
イド（蛋白質組成基準）を含有し、Ｋ８８抗原の各々を
５μｇ〜２０μｇ／ｋｇ含有するのが適当である。全細
菌の場合には、ワクチンは精製抗原の投与量をもたらす
に必要な等価の全細胞重量ケ含有することが好ましい。

このワクチンは、１０的、筋肉内、或いは皮下に投与す
ることができる。ブタの伝染性下痢のワクチンの場合に
は、ワクチンは妊娠した雌ブタに分娩前の３〜４週問お
よび６〜８週間前の２回に分けて投与することができる
。ワクチンは、また、伝染性下痢を防止するために若い
動物に投与することもできる。

本発明は、また、毒素により引きおこされる病気に対抗
する方法、すなわちヒト或いは動物の対象に上記のよう
に有効量のワクチンを投与することからなるもの、を提
供するものである。

上記のワクチン、すなわち前記トキソイドを使用して調
製された任意のワクチンは、−弱毒化さても、またワク
チンの発酵の際に使用される細菌が非病原性であるので
安全においても、従来使用されたワクチンに対して相当
な利点を有し、また投与されたワクチン中に未変性の毒
素が存在する危険性も存在しない。

以下の諸例は本発明を限定する趣旨のものではなく、発
酵操作と共に本明細書において記載されろ方法に従った
ＬＴ）キソイドの製造を例示するものである。

本明細書においてｔｍｌという用語はマイクログラムを
示すものである。

」４し ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、スペルごジン、アガ
ロースタイプ１、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｒＸ３）
、−ボネート、ｔＲＮＡ　（Ｉｎｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏユ１）、アミノ酸、ＡＴＰ、　ｃＴＰｌＧＴＰ、
　　ＯＴＰ、　　ｃＡＭＰ、−Ｆ−ミジン、ニコチンア
ミド、ＮＡＩ）＋、クレアチンホスンエート、ウシ崩清
アルプξン、クレアチンホスホキナーゼ、ブリリアント
ブルーＲ２５０，ブロモフェノールブルー、ＲＮａｓｅ
Ａおよびピルベートキナーゼは、Ｓｉｇｍａ　Ｃ！ｈｅ
ｍｉｃａｌ　社（ロンドン）から得られたものである。

。 ｄＡＴＰ、　ｄＯＴＰ、　　ｄＧＴＰ、　　ｄＴＴＰ、
　　（ｉｄＡＴＰ、　（ｌｄＯＴＰ。

ｄｄＧ　ＴＰおよびｄｄＴＴＰはＰｈａｒｍａｃｉａ社
の部門であるＰ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　が
ら得られたものである。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよび制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ　、
　ＲｃＯＲ１、　Ｈｌｎｃ　ＩＩ、Ｈｉｎｄ　ｍ、　Ｐ
ｓｔ　Ｉ、５ａｕ３Ａ、８ｍａＩ、Ｓｓｔ■およびｘｂ
ａ　１は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅθ社（英国）から得られたものである
。仔つソ腸アルカリ性ホスファターゼおよびＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼおよびフレノウラージフラグ）１７
トＤＮＡポリメラーゼＩはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社（ロ
ンドン）から得られたものである。

アガ０−スＡ　−５ｍはＢｉｏ　−Ｒａｄ　Ｌｏｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ社から得られたものである。アクリルア
ミドおよびＮ、Ｎｌ−メチレンビスアクリルアばドは、
　ＢＤＩ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から得られたものであ
った。

（α−３２Ｐ）　ＡＴＰ、　（３Ｈ）　ｃＡＭＰおよび
＜　３５８　）メチオニ７は、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ＋から得られたもので
ある。

（α−チオ−３５８）　ｄＡＴＰは西ドイツのＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから得られたものである
。

Ｐａｒｔｉｓｉユ１０−　ＳＡＸ　Ｂｏｎｄａｐａｋお
よび５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂ５−０．Ｉ）、ｓ、は、Ｒ，
０，Ｄ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄ
ｅから得られたものである。

全ての溶液は、高品質ＨＰＬＯ級の水で作成された。溶
液のｐＨは、必要に応じて適当な酸或いはアルカリを添
加することにより調整された。

プラスミドＰ３０７を含有するＬ　ｃｏユｉ、　Ｎ０Ｉ
Ｂ１１９３２をＬＴＡおよびＬＴＢ遺伝子の源として使
用した。プラスミドｐ３０７は約６０　Ｘ　１０６０分
子量を有し、活性ＬＴをコード化することが知られてい
る［　Ｄａｌｌａｓ　Ｗ、ＳｌＤＡＭ、　Ｇ１１ｌおよ
びＳ、　Ｆａｌｋａｗ　（１９７９）　　：　　Ｊ、　
　Ｂａｃｔｅｒ１ｏユ、　１３９、　８５０−８５８　
〕。

ハイブリッドプラスミドによるクローニングのための受
容体として使用されたＬ　ｃｏユ１菌株は、Ｎ０１Ｂ　
　１１９３３　　（ｐｒｏ”−１１ｅｕ−１ｔｈｉ−１
ユａｃ　　Ｙ−１ｈｓｄＲ−１ｅｎｃｌ　Ａ−１ｒｅｃ
　Ａ″′、ｒｐｓ　Ｌ２ｏ、ａｒａ−１４、ｇａｌＫ２
、ｘｙｌ　−５、ｍｔｌ　−１，５ｕｐＥ５５）　　で
あった。

この研究において使用されたベクターはｐＥＲ３２２の
誘導体であるｐＡＴ１５３であった。ｐＡＴ１５３の誘
導は既に記載されている［　Ｔｗｉｇｇ、　Ａ、Ｊ、お
よびり、５ｈｅｒｒａｔｔ　（１９８０）　：　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　　２８３．２１６〜２１８〕。

Ｍ１３ファージ操作に使用したＢ、　ｃｏユ１菌株はＥ
。

Ｃｏユｉ　　Ｋ１２（ＪＭ　　１０３　　）　　（１ａ
ｃ−１ｐｒｏ−１ｔｈｉ−５ｓｔｒＡ−１ｅｎｃｌ　Ａ
−１ｅｂｃＢＩ５、ｈｓｄ　Ｒ４、ｓｕｐ　Ｅｌｌｆｔ
ｒａＤ３６、ｐｒｏ　Ａ　Ｂ　　ｌａｃ工ｑ、　２６Ｍ
１５）であり、これはＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　社から得られたもの
である。Ｍ　１３　ｍｐ　１０　ＲＦ　ＤＮＡは、Ａｍ
ｅｒｌｌｌｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａユｐｌｃ、
　　から得られたものである。

結果 得られた結果は、添付の図面を参照して説明される。

例１ Ａ）　　Ｉ）ＡＴ　１５３中へのＬＴＢ遺伝子のクロー
ニングＬ　ｃｏユｉ　Ｎ０ＩＢ　１１９３３　（ｐＡＴ
　１５３を含有）を　１リツトルのＬ−プロス（１％ト
リプトン、０．５　％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１）
中において３７℃で振盪しながら生育させた。光学密度
（ＯＤ）５５０が０．６となった時点でクロラムフェニ
コールを添加して１７０μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。

更に、３７℃で１７時間インキュベーション後、培養液
を１０，０００　ｇで１０分間遠心分離した。細菌ベレ
ットをｓＵｍＭＴｒｉｓ　−ＨＯ１、１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　１ｐＨ８，０中の２５０り（Ｗ／ｖ）スクロース溶
液の３Ｑｍｌ中に再懸濁させた。これを氷上に置き、６
．０　ｍｌのりゾチーム溶液（２５゜Ｔｒｉｅ　−ＨＯ
１、ｐＨ８，０中５　ｍｇ　／　ｍｌ　）をゆっくり混
合しながら添加した。氷上５分間インキュベーンコン後
、９．０ｍｌの２５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨｓ、
ｏを再びゆっくり混合しながら添加した。氷上で５分間
インキュベー’／　ラフ後、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＯ１、　６２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，０中
の０．２％（Ｖ／Ｖ）　ＴｒｉｔＯｎＸ−ＩＯｏ　３５
　ｍｌを再びゆっくり混合しながら添加した。

１５分間インキュベーション後、溶解物（ライセード）
を５ｏ、ｏｏｏ　ｇで２０分間遠心分離し、得られた上
澄液を集め、保持した。この上澄液にＩ／ＩＯ容の５　
ｍＭ　ＮａＣユおよび１０　％　（”／ｖ　）　のポリ
エチレングリコール（４０００）を添加してＤＮＡを沈
殿させた。

４℃で４時間放置後、溶液を１０，０００　ｇ、で１０
分間遠心分離させた。得られたベレットを８．（１ｍｌ
の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯ１、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ
　、　ｐＨ８，０中に再懸濁させた。これに７．６ｇの
固体０ｓ０１および０．３１１１１゜０臭化エチジウム
溶液（ｌｏ　ｍｇ／ｍｌ　１を添加した。

この混合物を二本の５℃ユの迅速シール管に分配し、１
５度の高速縦型ローター中において、２５０．００＋ｌ
　ｇで１５時間遠心分離させた。プラスミドバンドは長
波長紫外線照射により観察され、針および注射器を用い
て取り出した。溶液をインアミルアルコールで無色にな
るまで抽出した。この溶液を次いで６５°で１５分間加
熱しく残存ヌクレアーゼを破壊するために）、２　Ｘ　
１００倍容の１０　ｒｒ、Ｍ　−Ｔｒｉｓ　−Ｈの、１
０　ｍＭ　Ｎａ１１、ｏ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　ｐ
Ｈ８，０に対して、４℃において、透析させた。４時間
後、この透析を繰り返した。

プラスミド濃度は、溶液の０Ｄ２６０を測定することに
より求めた、ＮｃＩＢ１の路長におけるｉ、ｏの０Ｄ２
６θ値は、ＤＮＡの５０μｇ／ｍｌに相当する。

＋Ｉ）　　ｐＡＴ　１５３のＨｌｎｄ　ＩＩＩによる消
化５μｇ　Ｏ）　ｐＡＴ　１５３を３ｏμｍの反応緩衝
液中に溶解した（最終濃度ｉ　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
−ＨＯＩ、１０　ｍＭ　ＭｇＯ１□、１ｒｎＭ　ＤＴＴ
、　５０ｍＭ　ＮａＯユ、ｐＨ７，５）。酵素Ｈｉｎｄ
ｍ（５単位／μｍ）を反応混合物（工単位／　μｇ　Ｄ
ＮＡ）に添加し、これを３７℃においてインキュベート
した。反応の進行をアガロースゲル電気泳動を用いて次
のように追跡した。

０．７％アガローススラブゲル（２５〆２ｏｘ（＋、４
ｃｍ）を流動緩衝液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　７セテート
、２　ｍＭＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，８）中において調製
した。５μｍの流動染料（流動緩衝液中３０％グリセロ
ール（Ｖ／ｖ）、０、」％（ｗ／ｖ）ブロモフェノール
ブルー）をＤＮＡ試料（０，２ｇ）に添加し、流動緩衝
液で２５μｍの全容量にした。この試料を１００ｍＡで
４時間運転されたゲル上に付加した。このゲルを臭化エ
チジウムの溶液（０，５μｇ　／＋ｎＬ　）中で３０分
間抜色させ、トランスイルミネーター（Ｃ６３型０．Ｖ
、　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　）で観察し、＋１５および赤色
フィルター（Ｗｒａｔｔｅｎ　）を付したＰｏ１ａｒｏ
ｉｄ　ＭＰ　３ランドカメラ上のタイプ５７ランドフイ
ルムに写真撮影した。

消化混合物は、Ｈｌｎａ　ｍによるｐＡＴ　１５３　　
の消化が完結するまで上記のように２時間毎に追跡を行
った。

１１１）消化ｐＡＴ　１５３の脱ホスホリル化２μｇの
消化ｐＡＴ　１５３　（１２μｍ）を取り出し、１単位
（１μｍ）の仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼを添加
し、インキユベーシヨンを３７℃で６０分間継続した。

この混合物をｏ、１％　（Ｗ／、ｒ　）の８−ヒドロキ
シキノリンを含有する等容のフェノール（全て１０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ　、０．２％２−メルカプトエタ
ノール、ｐＨ８，０よりなる平衡緩衝液下に貯蔵された
）で処理した。水相を取り出し、等容のクロロホルム：
イソアルミルアルコール（２４：１）で抽出し、最後に
等容のクロロホルムで抽出した。

ＤＮＡを水溶液から次の方法により沈殿させた。

ＤＮＡ溶液に乙０容の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，５を
添加した後、２倍容の無水エタノールを添加した。

溶液をよく混合し、ドライアイス／エタノール浴中に３
０分間抜いた。１３，０００　ｇで３分間遠心分離行・
、上澄液を捨て、ＤＮＡベレゾトを真空乾燥した。

沈殿を２μユの１０　ｍ１ＶＩ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯＩ、
ＩＱ　ｍＭ　Ｎａ１１、ｏ＋１　ｍＭ　ＥＪ）ＴＡ　、
　ｐＨ８，（ｌに溶解した。　このＤＮＡは、ＬＴＢ　
’＋Ｐｔ伝子な含有するインサートがクローン化されろ
ベクター分子である。

ｐＡＴ　＋５３を含有するＲ、　ｅｏｌｌ　ＮｃＩＢ　
１１９３３　（７）代りいＰ２Ｏ３を含有する凡、　ｅ
ｏｌｌ　ＮＣＩＢ　１１９３３　を使用するｊν外はＡ
、１）と同様の方法を用いた。更に、１リツトル培養液
中へのクロラムフェニコール０）添加は省略し、培養液
は２．０の０Ｄ５５ｏ　において収穫した。

Ｖ）Ｐ２Ｏ３のＨｌｎｄ　ｍによる消化５μｇ　ｐＡ’
ｌ’　１５３の代りにｌＯμｇ　Ｏ）　ＴＩ　３０７　
ＤＮＡを用いた他はＡ、ｌｌ）と同様の方法Ｚ採用した
。消化ＤＮＡはフェノールで抽出し、Ａ、１ｉｉ）と同
様にしてエタノール中で沈澱させた。

Ｖｌ）　ｐＡＴ　１５３およびＰ２Ｏ３の連結０．５μ
ｇのＡ−１ｉｉ）からの切断ベクターおよび１．５μｇ
のＡ、　ｙ）からの切断インサー）’ｌ＜１ｏｏμｍの
５０ｒｎＭ　　Ｔｒｉｓ　　−Ｈｅユ、　１０　　ＨＩ
Ｍ　　ＭｇＯ１２、０，１７ＡＴＰ、　　２０ｍＭ、　
　ＤＴＴ、　　ｓｏｕ　μｇ／ｍｌウン涌清アルブミン
、ｐＨ７，８を含有する連結混合物に添加した。連結は
１単位のＴ　４　ＤＮＡリガーゼ（１μｍ）の添加によ
り開始し、１２°で１２時間インキュベートした。

ｖｌｌ）細菌の形ｐ転換 工（ＡＩ−Ｖｌ）で説明したようにして得られたＤＮＡ
混合物を使用して、Ｎ０ＩＢ　１１９３３　　を形質転
換した。

Ｂ、　ｅｏｌｌ　ＮＣより　１１９３３　の−昼夜培養
液を新鮮なＬ−グロス（３ｏ　ｍｘ　）中に１００倍に
稀釈した。この培養液を３７℃で激しく娠盪させながら
生育させた。０．４〜０，５のＯＤ＋、５ｏにおいて培
養液を水浴中で５分間冷却した。培養液を６，４１００
　ｇで５分間遠心分離させ、ベレットを２０℃ユの水冷
却０−１５　Ｍ　ＩＪａｏｌで洗浄し、再び６．ｏｏｏ
ｇで５分間遠心分離させた。

ヘ１／、７）を０ａ０１２　（５０ｍＭ　）の水冷却溶
液の１５ｍ１に再懸濁させた。氷上に３０分間放置後、
細胞を再び遠心分離でペレット化し、３ｌユの０ａＯ１
□溶液中に再懸濁させた。この細胞懸濁液の０．２ｌユ
に１００μユのＤＮＡ混合物（５０ｍＭ　Ｃ！ａｏ１２
中１μｇ）全１２ｇた。更に氷上で３０分間インキュベ
ーション後、懸濁液を４３°の水浴に移し、２分間イン
キュベートさせた。この懸濁液を水浴に２０分間戻し、
４．０ｌユのＬ−ブロスを添加した。細胞を３７°で６
０分間インキュベートさせ、逐次稀釈により選択培地上
に培養させた。

選択培地はアンピシリンを１００μｇ　／　ｍｌで含有
するＬ−寒天（１，５％　％寒天を含有するＬ−グロス
）であった。

ｖｉｉｔ）　　ハイブリッドプラスミドの分析小規模プ
ラスミドの調製をアンピシリン耐性形質転換体の各々か
ら下記のように行った□＋、ｏｍユの培養液をＬ−プロ
ス中３７℃で一昼夜生育させた。細胞を１３．００（ｌ
　ｇで２分間遠心分離させてペレット化した。ペレット
を５０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ　−ＨＯ１、５Ｑ　ｍＭ　ＢＤ
ＴＡ　、　ｐＨｓ、ｏ中の８ｑｂ（Ｗ／ｖ）スクロース
、５　％　（Ｍ／ｙ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１０ｇの
溶融２５μユに再懸濁させ、よく混合した。２μユのリ
ゾチーム溶液（２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈの中１０ｍ
ｇ／ｍｌ）を添加し、管を沸騰水浴中に入れた。４０秒
後、管を１３．ＵＵＯｇＡ気 で］００分間遠心離させた。上澄液（２０μｍ）を取り
出し、等容のインプロパツールと混合し、ドライアイス
／エタノール浴中に入れた。１０分後室合物ｔｌ　１ａ
、ｏｏｏ　ｇで１０分間遠心分離させた。

上澄液を捨て、ペレットを２０μｍの］ＯｍＭＴｒｉｓ
−Ｈｏ１、５０　ｍｌｉ！　ＮａＱユ、０．１’　＋ｎ
Ｍ　ＥＤＴＡに再溶解した。

ＤＮＡはこの溶液から上記Ａ、１ｌｉ）において説明し
たエタノール沈澱法を用いて沈澱させた。ペレットを２
０μｍの４Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−アセテート、２　ｍＭ
　ＥＤＴＡ　。

ＩＩＨ７，８中に再懸濁させ、Ａ、ｌｉ）と同様にして
アガロースゲル電気泳動により分析した。

この分析を用いて、ハイブリッドプラスミドすなわちｐ
ＡＴ　１５３ベクター十Ｐ　３０７から得られた挿入フ
ラグメントの組み合わせを含有した多くの形質転換体が
同定された。

ＩＸ）　　ＬＴＢ活性の分析 Ａ、　Ｖｌｌｌ）において同定された単離形質転換体を
各各後期指数期まで生育させ、１０，０００　ｇで５分
間遠心分離して収穫した。ペレットを１００ｍ１５０式
Ｔｒ１Ｂ−Ｈｏ１、ｐＨ７，８中で洗浄し、再びｉｏ、
ｏｏｏｇで５分間遠心分離した。ペレットをＩＱ　ｍｌ
のＴＢＡＮに再懸濁させた。この懸濁液を、全細胞の８
５〜９５チを破壊するに十分な程度に水浴中で冷却しな
がら超音波処理した。細胞破片を３０，０００　ｇで１
時間遠心分離してペレット化し、上澄液を必要とされる
まで４°Ｃで貯蔵した。

各抽出物のＬＴＢ活性の分析をガングリオシド免疫吸着
剤アッセイ（ＧＭ↓−１１ＣＬＩＳＡ　）法を用いて分
析した［　Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ　Ａ、Ｍ、およびＪ
、　Ｈｏｌｍｇｒｅｎ　（１９７８）　　：　　０ｕｒ
ｒ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉａユ、　１　、１９〜２３］　
。　　一つのそのような抽出物は、高いＬＴＢ活性を有
することが判明した。この活性は、ハイブリッドプラス
ミドＧｐＥＬＴＢ　−１０を含有するＮ０１Ｂ　１１９
３３形質転換体によりコード化されたものであった。

１３）　　ＬＴＡ遺伝子のｐＡＴ　１５３中へのクロー
ニングＬＴＡ　３９　伝子ヲ、Ｉ）ＡＴ　１５３　中に
実’Ｊｌ’ｌＫ例ＩＡＩ）〜ｌｘ）の教示内容に従って
クローン化した。

１）　　１ｃｏＲ１およびＨｌｎｃ　ＩＩによるｐＡＴ
　３５３の消化反応緩衝液の最終濃度を２０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＯ１、１０ｍＭ　　ＭｇＯユ２、　　ｌ　
　ｍＭ　　ＤＴＴ　、　　　Ｉｔ）ＯｍＭ　　ＮａＣユ
　、　　ｐＨ７，５にした他はＡ、　ＩＩ）と同様にし
て５μｇのｐＡＴ　１５３を凡Ｃ０ＲＩで完全に消化し
た。Ａ−ｉｉｉ）と同（様にしてエタノールからＤＮＡ
を沈澱させ、２ＱｍＭＴｒｉ日−Ｍｏ１、１０　ｍＭＭ
ｇ０１２、ｌ　ｍＭ　ＤＴＴ　、　、５０　ｒｎＭ　Ｎ
ａ１ｌ　、ｐＨ７，５を含有する３０μユの緩衝液中に
再懸濁させた。

これに０．１単位のＨｌｎｃ　Ｈを添加し、上記ＤＮＡ
　の部分的消化物を得た。これは、ｎ１ｎｅ　ＩＩによ
り一箇所においてのみ切断された分子の最適生成を生じ
るに必要とされた時間を求めるためにアガロースゲル電
気泳動により３０分間隔で反応を追跡することにより達
成された。ＤＮＡはＡ、　１ｉｉ）と同様にしてフェノ
ールで抽出し、エタノールから析出させた。

１１）　　Ｐ２Ｏ３のｋＯＲＩおよびＨ’ｐ＆ｉによる
消化反応緩衝液の最終濃度’１２（２ｏ　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｅ　−ＨＯ１、１０ｍＭ　ＭｇＯ１２，１ｍＭ　ＤＴＴ
　、　ｐＨ７，５にした他はＡ、ｌｌ）と同様にして１
０μｇのＢ３０７をＨｐａ　ｉで完全に消化した。消化
後、ＤＮＡをＡ’、　１ｉｔ）と同様にしてエタノール
から沈澱さぜ、２０　ｍＭ　ＴｒｉＳ−Ｈｅユ、１０ｍ
１ｉ！ＭｇＣ！１２、Ｉ　ｍＭ　ＤＴＴ　、　　１００
　ｍＭ　Ｎａ１１、ｐＨ７，５を含有する３０μｍ緩衝
液に再懸濁させた。これに１０単位のＢａｏＲＩを添加
し、消化を完結するまでアガロースゲル電気泳動により
追跡した（Ａｌｌ）参照）。

ＤＮＡはＡ、１１＋）と同様にしてフェノールで抽出し
、エタノールから沈澱させた。

ｌ１ｌ）　　ｐＡＴ　１５３とＢ３０７の連結Ｂｌ）か
らの切断ベクターＦＡＴ　１５３０．５μｇおよびＢ１
１）からの切断インサート１．５μｇを１００μユの連
結緩衝液に添加し、Ａ　ｉｖ）と同様にして連結させた
。

Ｂｌ）〜１１１）のようにして得られたＤＮＡ混合物を
使用してＮＯより　１１９３３を形質転換した。形質転
換方法は、選択培地がテトラサイクリンを２５μｇ／ｍ
ｌで含有するＬ−寒天である以外はＡ　ＶＨ）と同様に
して行った。成功したテトラサイクリン耐性形質転換体
をアンピシリン１００μｇ　／ｍｌ　含有り一寒天上で
各々培養し、アンピリジンに刻して感受性であることが
判明したものを下記のように試験した。

■）ハイブリッドプラスミドの分析 小規模のプラスミド調製を、Ａ１１ｌ）と同様にしてテ
トラサイクリン耐性、アンピシリン感受性の形質転換体
の各々により行った・ ハイブリッドプラスミドすなわちｐＡＴ　１５３ベクタ
ー＋　Ｐ　３０７からの挿入フラグメントの組み合わせ
を含有する多くの形質転換体ケ単離した。

ｙｌ）　ＬＴＡ活性の分析 Ｂｖ）で同定された各々の形質転換体について、Ａ　ｌ
ｘ）に記載した方法に従って細胞不含抽出液を作製した
。

各抽出液のＬＴＡ活性をアデニルシクラーゼの毒素刺戟
を測定することにより分析したＣ　Ｔａ１ｔ、　Ｒ６Ｍ
、、　Ｂ、Ｒ，ＢｏｏｔｈおよびＰ、Ａ、　Ｌａｍｂｅ
ｒｔ　（１９８０）　：Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｅ、　Ｒｅｓ、Ｏｏｍｕｎ、　９６．１０２４−１０
３１　］。一つのそのような抽出液は、高いＬＴＡ活性
を含有することが判明した。この活性は、ノ・イブリッ
ドプラスミドＧｐＥＬＴＡ　＋　６を含有するＮ０ＩＢ
１１９３３形質転換体によりコード化されたものであっ
た。

ＧｐＥＬＴＡ　−６の大規模プラスミド調製を、ＡＩ）
と同様にして行った。

反応液（４００μユ）は、１００　ｍＭリン酸ナトリウ
ム、ｌ　ｍＭ　ＲＤＴＡ　、　　４００　ｍＭヒドロキ
シルアミン、ｐｌ（ｓ、ｏに６μｇのプラスミドＧｐＥ
ＬＴＡ−６（Ｂ　Ｖｌ）からのもの）を含有するもので
あった。これを鉱物油下に６５℃で４時間インキュベー
トし、次いで４℃で１０倍容の５Ｑ　ｍＭ　（ａｏユ。

に対して透析させた。

４時間後、この透析を繰り返した。

ＩＩ）　突然変異誘発されたＧｐＥＬＴＡ　−６の形質
転換ヒドロキシルアミン突然変異誘発に続き、とのＧｐ
ＢＬＴＡ　−６ＤＮＡを使用してＡ　ｖ＋Ｄと同様にし
てＮＣより１１９３３の培養物を形質転換させた。選択
培地は、２５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬ
−寒天であった。

ＩＩＩ　）　　ＬＴＡ活性の分析 ｅｌｌ）　　において単離された形質転換体の各々につ
いて細胞不含抽出液を作製し、　Ｂ　Ｖｌ）と同様にし
てＬＴＡ活性の分析を行った。活性ＬＴＡを生成しない
多くの形質転換体が単離された。これらの変異体を、更
に下記のように分析した。

ｌｖ）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写／翻訳による突然変異
体の分析ＬＴＡ活性を有し、ない突然変異体の各々（Ｃ
ｊ　ｌｉｉ’）から得られたもの）から、Ａ１）と同様
にして大規模プラスばド調製を行った。これらのプラス
ミドの蛋白質生成物はｉｎ　ｖｉｔｒｏの転写／ｎ訳糸
を用いて分析し、ＣＹａｎｇ、　Ｈ，Ｌ、、　Ｈｅユｌ
ｅｒ、　Ｅ、、、　Ｇｅ１ｌｅｒ。

Ｍ、およびＺｕｂａｙ、　Ｇ＋（１９７９）　：　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、凍　３３０４−３３０８　）　　次
いでＳＤＳポリアクリルアミド（１５％）ゲル電気泳動
［Ｌａｅｍｍｌｌ。

口、に、　（１９７０）　：　Ｎａｔｕｒｅ−２２７，
６８０〜６８５　］　を行った。ゲルを乾燥し、Ｋｏｄ
ａｋ　ＡＲ５のフィルムに一昼夜曝露し、それを現像し
た。

これらの結果から、三つの突然変異種を選んで更に分析
した。これらの突然変異種からのプラスミドは、元のＬ
ＡＴ蛋白質から大ぎさにおいて区別することのできない
ＬＴＡ遺伝子からの蛋白質をコード化すると−とが判明
した。Ｎ０ＩＢ　１１９３３中の突然変異種はＧｐＥＬ
ＴＡ　−６ｍ１、−６ｍ２および一６ｍ３　　と命名さ
れたプラスミドを含有していた。

ＧｐＲＬＴＡ　−６中のＬＴＡ遺伝子および三つの突然
変異したプラスミドＧｐＥＬＴＡ　−６ｍｌ　、　Ｇｐ
ＥＬＴＡ　−６ｍ２およびＧｐＫＬＴＡ　−６ｍ３をジ
デオキシヌクレオチド法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｓ
、　Ｎ１ｃｋｌｅｎおよびＡ、Ｒ８（！ｏｕｌｓｏｎ（
１９７７）　　：　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔユ、　Ａｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ、　　口ＳＡ、７４　５４６３−５４
６７　］或いは化学的切断技術［Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ
。

およびＷ、　Ｇｉｘｂｅｒｔ、　（１９７７）　：　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔユ、ＡＣａｄ＋Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　
７４　５６０〜５６４〕のいずれかを用いて配列決定を
行った。これらの突然変異の配列および位置は第１図に
示した通りである。

全責素／トキンイドをコード化するノ・イブリッドプラ
スミドは、例Ａ　１１〜１×）の教示に従って造成した
。

プラスミドＧｐＥＬＴＡ−６（５μｇ）（ＢＩＶ）から
のもの）をＮ５緩衝液の最終濃度を２０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ　−ＨｏＩ、１０ｍＭＭｇＣ１□、１　ｍＭ　ＤＴＴ
　、　　１００　ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，５とした以
外はＡ１１）と同様にして凡ｃｏＲ■で完全に消化した
。消化ＤＮＡを、Ａｌ１１）と同様にして、脱ホスホリ
ル化し・、フェノールで抽出し、エタノールから沈澱さ
せた。

プラスミドＧｐＫＬＴＡ　−６ｍ１、ＧｐＲＬＴＡ　−
６ｍ２およびＧｐＥＬＴＡ　−６ｍ３　（Ｏｌｖ）から
のもの）の各々の大規模プラスミド調製をＡＩ）と同様
にして行った。

各プラスミドをＤＩ）と同様に１．て脱ホスホリル化し
、フェノールで抽出し、エタノールから沈澱させた。

ＧｐＥＬＴＢ　−］０　（Ａ　ｌｘ）からのもの）の大
規模プラスミド調製をＡＩ）と同様にして行った。この
プラスミドの５μｇをＤＩ）と同様にして凡ｃｏＲＩで
完全に消化し、フェノールで抽出し、エタノールから沈
澱させた。

ｌｖ）　　ＬＴＢコード化断片とＧｐＫＬＴＡ　−６お
よび元の誘導体との連結 ０．５μｇのＤＩ）からの切断ベクターＧｐ凡ＬＴＡ　
−６或いはＤｌｌ）からの三つのＧｐＴＬＴＡ　−６突
然変異種の各々および１．５μｇのＤ　ｌ１ｌ）からの
切断インサートを１００μユの連結緩衝液に添加し、Ａ
　ｖｌ）と同様にして連結させた。

■）細菌の形質転換 Ｄｌｖ）からの四つの連結混合物の各々を使用して、Ａ
ｖｉｉ）と同様にしてＮｏ１Ｂ　１１９３２を形質転換
させた。

選択培地はテトラサイクリンヲ２５μｇ　／ｍユで含有
するＬ−寒天であった。

ｖｌ）ハイブリッドプラスミドの分析 Ａ　ｖｉｉｉ）と同様にしてこれらのテトラサイクリン
耐性形質転換体（四つの連結混合物から得られたもの）
の各々について小規模プラスミド調製を行った。

この分析を用いてハイブリッドプラスミドすなわ％　Ｇ
ｐＥＬＴＡ　−６（或いはその３個の突然変異該導体の
一つ）とＬＴＢ　遺伝子をコード化することが知られて
いるＧｐＲＬＴＢ　−１０からのインサート断片との組
み合わせを含有する多くの形質転換体が同定された。

Ｖｌｌ）　　ＬＴＢ　活性ノ分析 ＬＴＢコード化断片のクローニングは二つの方向のいず
れの方向においても可能であるのでＬＴＢがＬＴＡコー
ド化プラプラスミド中ローン化される際にＬＴＢ　ｆＪ
″−発、現されるということを決定することが各々ＬＴ
Ｂ活性をＡｌｘ）と同様にして分析した。

高いＬＴＢ活性を発現したＧｐ凡ＬＴＡ　−６／　Ｇｐ
ＲＬＴＢ−１０プラスミド連結から得られた形質転換体
を選択した。このハイブリッドプラスばドは、ＧｐｉＮ
Ｔ　−２と命名した。同様に、高いＬＴＢ活性を発現し
た他の連結混合物の各々から形質転換体を単離した。

これらのハイブリッドプラスミドは、それぞれＧｐＫＮ
Ｔ　−２ｍ１、ＧｐｌＮＴ　−２ｍ２およびＧｐＢＮＴ
　−２ｍ３と命名した。

ｖｉｉｉ）　　Ｌ　Ｔ毒素／トキソイドの精製ＧｐＥＮ
Ｔ−２、Ｇ′Ｉｌｌ凡ＮＴ　−２ｍｌ　、　　ＧｐＫＮ
Ｔ　−２ｍ２およびＧｐＲＮＴ　−２ｍ３を含有する細
菌菌株から（Ａｌｘ）と同様にして）細胞不含抽出液を
調製した。各細胞不含抽ｍ液（８ｍｌ　）を４℃でＴＨ
ＡＮ　で平衡化されたアガＯ−スＡ　−５ｍ　（３５Ｘ
　１’、４０ｍ　）のカラムにかけた。

Ｔ凡ＡＮは、流出液の０Ｄ２８ｏが基線水準に戻るまで
適用した。この段階において、カラムに結合されたＬＴ
は、Ｔ箭Ｎ中の０．２　Ｍ　Ｄ　−（＋ｌ−ガラクトー
スを適用することによって溶出した。溶出画分は、ＬＴ
について高度に精製され（通常約９５％）、更に分析す
るまで４℃で貯蔵した。

ＧｐＲＮＴ　−２からの精？春繋およびＧｐｌＴ　−２
ｍ１、ＧｐＥＮＴ　７２ｍ２およびＧｐＥＮＴ　−２ｍ
３からの三つのトキソイドを集め、それらの枳、略の構
造を更に研究した。

ｌｘ）　　毒素／トキソイドの構造 Ｄ　Ｖｌｌ）からの精製青紫／トキソイドを５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル市、気泳動（１５％１により分析
した（　Ｌａｅｍｔｎｌｉ　Ｏ，に、（１９７０）　：
　Ｎ’ａｔｕｒｅ　２２７．６８０〜６８５〕。これら
の結果は、毒素および三つのトキソイドの各々について
ＬＴＡおよびＬＴＢの大きさに対応する二つの蛋白質成
分があることを示している。更に、デンジトメトリによ
るトレー７ングによる分析は、ＬＴＡ対しＴＢ比は毒素
および各々のトキソイドについて同一であることを示し
ている。

これらの結果は、突然変異されたＬＴＡ分子の６各は元
のＬＴＡと区別できないようにＬＴＢ分子と会合するこ
とができることを示している。

この結果は、更にＬＴＢ特異性抗力清を用いたＧｐＭＴ
　−２、ＧｐＥＮＴ　−２ｍ１、ＧｐＥＮＴ　−２ｍ２
およびＧｐＥＮＴ　−２ｍ３を含有する菌株の細胞不含
抽出液からの毒素／トキソイドの免疫沈澱により更に確
認された。

ＧｐＥＮＴ　−２、ＧｐＥＮＴ　−２ｍｌ　、ＧｐＲＮ
Ｔ　−２ｍ２、ＧｐＥＮＴ　−２ｍ３を含有する細菌菌
株の細胞不含抽出液をウサギの回腸ループ試験で試験し
た［　Ｒｖａｎｅ。

Ｄ、Ｇ、、　Ｄ、Ｊ、　Ｅｖａｎｓ、　、Ｔｒ、および
ｎ、　Ｆ、　Ｐｉｅｒｃｅ　（１９７３）　：工ｎｆｅ
ｃｔ、工ｍｍｕｎ、ヱ、　８７３〜８８０　］。

これらの三つの突然変異種は天然毒素に対比して、いず
れも余り活性を有しないことが示された。

事実、陽性応答を生成するために必要な青紫濃度の２０
００倍を越える製電で使用された場合にもＧｐＲＮＴ　
−２ｍｌからの抽出液からは如何なる種類の毒性活性を
も検出することができなかった。

上記技術を用いて更に八つのトキソイドすなわち前記表
に示した４〜１１を調製した。これらもまた、天然前性
成分の毒性を持たないことが示された。

例２ オリゴヌクレオチド挿入によるＬＴ　）キソイドの製造 オリゴヌクレオチド挿入によるＬＴＡ遺伝子の不活性化 ＬＴＡ遺伝子（第４図）中のＸｂａ　Ｉの存在は、この
遺伝子のこの部位におけろ合成オリゴヌクレオチドの挿
入による突然変異を可能にするものである。このＬＴＡ
領域でのヌクレオチド配列および対応する蛋白質配列は
、第７図に示される通りである。１２個のヌクレオチド
の長さの合成オリゴヌクレオチドアダプターは第７図に
示され、同図のこのオリゴヌクレオチドの挿入が如何に
して次の結果が生ずるかが見られる＝ １、変化した遺伝子配列、 ２、対応して変化した蛋白勿配列、 ３、ＸｂａＩ部位の欠失、 ４．５ｓｔｌＩ部位の獲得。

Ａ）オリゴヌクレオチドｃｌ　（０ＴＡ−ＧＴＣ−ＯＧ
Ｏ−ＧＧＡ）の合成。

（１）カラム乾燥 ５Ｉ−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２１−デ
オキシアデノクン（５３，７ｍｇ　）で官能化されたポ
リジメチル−アクリルアミド／珪藻土支持体を小さなガ
ラスカラム中においてピリジンで処理し、短時間攪拌し
て気泡を除去した。この樹脂なピリジンで洗浄した（１
０分、流速約１．ｏｍｌ／分）。

ピリジン流を停正し、ピリジン（ｏ、９ｍ１）中のフェ
ニルイソシアネート（０，１ｍ１）を５分間に亘って注
入し、カラムを次いで４分間放置した。

１１）脱保護およびカップリング反応 上記のように官能化されたポリジメチルアクリルアミド
／珪藻土支持体を逐次ピリジン（５分、流速１　ｍ１７
分）および１，２−ジクロロエタン（３分）で洗浄した
。ジメトキシトリチル基を１゜２−ジクロロエタン中の
１０％トリクロロ酢酸で洗浄して除去した（３分）。こ
の樹脂を更に逐次ジメチルホルムアミド（５分）および
ピリジン（５分）で洗浄した。流れを停止し、１−（メ
シチレン−スルホニル）３−ニトロ−１，２，４−）リ
アゾール（４５ｍｇ）を含有するピリジン（０，４ｍｌ
　）中の５１−ジメトキシトリチル−Ｎ−イソブチル−
２′−チオキシグアノシン−３’−（２−クロロフェニ
ル）ホスフェートトリエチルアンモニウム塩（３７，５
ｍｇ　）を３分間に亘ってカラム中に注入し、次いでＲ
Ｔで４５分間放置した。

この樹脂を逐次ピリジン（５分）、次いで１゜２−ジク
ロロエタン（３分）で洗浄した。ジメトキシトリチル基
は前記のように１，２−ジクロロエタン中の１０％トリ
クロロ酢酸で処理して除去した（３分）。この樹脂を逐
次ジメチルホルムアミド（５分）およびピリジン（５分
）で洗浄した。

１−（メシチレン−スルホニル）−３−ニトロ−１，２
，４−）リアゾール（４５ｍｇ）を含有するピリジン（
０，４ｍｌ　）中の次のヌクレオチド（４０μモル）は
３分間に亘って隔膜入口を介して注入し、ＲＴで放置し
た（４５分）。

この操作を次のいずれかの遣当な保獲ヌクレオチドを用
いて目的配列が絹み立てられるまで繰り返した。

（イ）　５１−ジメトキシトリチル−Ｎ−インブチル−
２′−チオキシグアノシン−３’−（２，クロロフェニ
ル）ホスフェートトリエチルアンモニウム塩或いは （ロ）　５′−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−
２１−チオキンシチジン−３’−（２−クロロフェニル
）ホスフェートトリエチルアンモニウム塩或いは （ハ）　５′−ジメトキントリチルーＮ−ベンジ゛イル
−２′−チオキシアデノシン−３’−（２−、、？ロロ
フェ、：　ル）＊　スフエートトリエチルアンモニウム
塩或いは に）　５１−ジメトキシトリチルチばジン−３１−（２
−クロロフェニル）ホスフェートトリエチルアンモニウ
ム塩。

１１１）脱保護 この胡み立でか完結した時点で樹脂をピリジン（１０分
）および】、２−ジクロロエタン（５分）で洗浄した。

樹脂なカラムから取り出１．、エーテルで洗浄した（５
Ｘ］０ｍ１）。

樹脂を１，１，３．３−テトラメチルグアニジン（ｏ、
＋　ｍｌ）を含有するジオキサン−水（１：１）（２＋
ｎｌ）中のｅｙｎ　−２−二トロベンズアルドキシム（
１４０ｒｎｇ）の溶液で処理した。１８時間後、混合物
を濾過し、残渣を水（２ｍｌ）で洗浄し、ｒ液を蒸発乾
固した。残渣な濃アンモニア溶液（５ｍユ）に溶解し、
６０°Ｃに加熱した。３時間後、溶液を蒸発乾固し、残
渣を酢酸−水（４：１）（ｓｍ＋１）で処理した。３０
分後、溶液を蒸発乾固し、残渣を水（３ｍ１）に溶解し
、ジエチルエーテル（５Ｘ　１０ｍＦ）で抽出した。水
性液を減厚下に蒸発させ、残渣を水（１，２ｍ１）に溶
解した。

ｉｖ）精製 この粗製物質を、（Ａｌホルムアミド−水（６：　４）
、ｐＨ６，３中の０．００１　Ｍ　　リン酸二水素カリ
ウムおよび０．０７係の（Ｂ）ホルムアミド−水（６：
４）ｐＨ６，３中の０．０３リン酸二水素カリウムの勾
配を用いて４５分間に亘って４０℃においてＰａｒｔｉ
ｓｉｌ　ＩＱ−８ＡＸ上のアニオン交換ＨＰＬＯにより
精製した。

典型的な予備実験においては、粗製オリゴヌクレオチド
溶液の試料（１５０μｍ）を注入した。０，７０係溶離
ｉＢの勾配を４５分間に亘って実施した。目的物質（２
７０ｎｍにセットしたＯＶ検出器により示された）を含
有する約４０分後の溶出液な集めた。

残りの物質は同様にして精製した。精製された物質を集
め（１５℃ユ）、二つに分割してＢ１０ｇθユＰ２カラ
ム（空隙体積６０ｍｌ）エタノール−水（１：４）で溶
離して脱塩した。ボイドボリュームの溶出液を合わせ（
４０ｍｌ　）、蒸発乾固した。

残渣を水（０，５ｍｌ）に溶解した。（１（ＯＴＡＧＴ
Ｃ！０ＧＣＧＧＡ）の収率−９０，Ｄ、　（２６０ｎｍ
　）　。

この物質をｐＨ６，３の０．１　Ｍ　酢酸アンモニウム
およびアセトニトリル−水（４：１）ｐＨ６，３の　、
０−１０　％　　ｏ、１Ｍ酢酸アンモニウムの勾配を用
いて２５分間に亘ってＢｏｎａａｐａｋおよび５ｐｈｅ
ｒｉｓｏｒｔ　５゜０、Ｄ、Ｅ！、カラム上で逆相ＨＰ
ＬＯにより分析した。この実験仕様は、更に精製が必要
でなかったので予備実験には使用しなかった。

全容量で５μｍの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯ１、ｐ
Ｈ７，５中の例２Ａからの合成オリゴヌクレオチドｄ（
ＯＴＡＧＴＯＯＧＣＧＧＡ　）の１μｇの試料を６５℃
に５分間加熱した。冷却後、ＤＮＡ溶液を５０　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　−ＨＯ１、５　ｍＭ　ＤＴＴ　、　　ｏ、ｌ
　ｍＭ　Ｘベルミジン、０　、　ｔ　ｍＭ　ＴＭ）ＴＡ
　。

４　ｍＭ　ＡＴＰ、　　ｐＨ７，５を含有する反応緩衝
液の５０μｍに添加した。１０単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（１０単位／μユ）を反応液に添加し、こ
れを３７℃で３０分間インキュベートした。この混合物
をフェノールで例Ｉ　Ａ　１ｉ１）と同様にして抽出し
た。混合物に１　’ｐ１ｔＲＮＡ　（Ｌ　ＱＯｌｌ　）
　（ｌｏｍｇ／ｍｌ　）の溶液を添加し、例Ｉ　Ａ　ｌ
１１）と同様にしてエタノールから沈澱させた。沈澱を
５μユの１０１１ＩＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯＩ、ｇ、１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　ｐＨ７，５に溶解させた。

Ｉｔ）！＋１Ｘｂａ　Ｉ　ＫよるＧｐＫＬＴＡ　−６０
）消化反応緩衝液の最終濃度を２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
−ＨＯＩ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１　ｍＭ　ＤＴＴ、
　　ＩＱＱ　ｍＭ　Ｎａ１１、ｐＨ７，５どした他は例
Ｂ１１）と同様にして５μｇ　ｏ）Ｇｐ凡ＬＴＡ　−６
ｆ、）　Ｘｂａ　Ｉで完全に消化した。このＤＮＡは例
ｌＡ１１１）と同様にしてフェノールで抽出し、エタノ
ールから沈澱させた。

Ｉｌｌ　）　　ＧｐＴＬＴＡ　−６と合成オリゴヌクレ
オチドの連結Ｂｌ）からのホスホリル化オリゴヌクレオ
チド１００ｎｇ（５１００ｎおよびＢ１１）からの消化
ＧｐＨＬＴＡ　−６１μｇを例Ｉ　Ａ　ｖｌ）に記載し
たものと同様な反応緩衝液１００μｍ中で連結させた。

混合物は例Ｉ　Ａ　１ｉ１）と同様にしてフェノールで
抽出し、エタノールから沈澱させた。この沈澱を５μユ
σ月ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ！１．０．１　ｍＭ　Ｉ
ＬＤＴＡ　ｐＨ７，５中に再懸濁させた。

Ｂ１１１）からのＤＮＡを例Ｉ　Ａ　１１）と同様にし
て８ｓｔ■で完全に消化した。この混合物を５０　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　−ＨｏＩ、１０　ｍＭ　ＭｇＣ！１２．２
０　ｍＭ　ＤＴＴ　、　　０．１　ｍＭ　ＡＴＰ　、　
ｐＨ７，８中に平衡された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５ｇ
カラＡ　（０，９ｘ　１５　ｃｍ　）にかけ、ボイドボ
リューム中に溶出されたＤＮ’Ａを１００μユ集めた。

　ウシ抑清アルブミン溶液（１０ｍｇ　／　ｍｌ）を５
μｍ添加後１単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１μｍ）を添加
し、１２℃で１２時間インキュベートした。

■）細菌の形質転換 Ｂ　ＩＶ）からのＤＮＡ混合物を使用してＮ０ＩＢ　１
１９３３を形質転換させた。この形質転換方法は選択培
地がテトラサイクリンを２５μｇ／　ｍｌで含むＬ−寒
天である他は例Ｉ　Ａ　ｖｉｉ）と同様であった。

ｖｌ）ハイブリッドプラスミドの分析 Ｂいから得られたテトラサイクリン耐性形質転換体につ
いて例Ｉ　Ａ　ＶＯＩＤと同様にして小規模プラスミド
調製を行った。しかしながら、エタノール沈澱に続いて
、ＤＮＡを６０μｍの２０　ｍＭ　Ｔｒｉｅ　−ＨＣ！
ｌ　、　１０ｍＭ　ＭｇＣ！１２、ｌ　ｍＭ　ＤＴＴ　
、　５Ｑ　ｍＭ　Ｎａ１１、ｐＨ７，５に再懸濁させた
。このＤＢＩＡ溶液を三つのアリコートに分割した。す
なわち、一つのアリコートは１単位のＸｂａ　Ｉ　（１
単位／μｍ）、第二のアリコートは１単位のＳｓｔ　ｎ
　（１単位／μｍ）で処理したのに対し、第三のものは
未処理であった。これらのＤＮＡ溶液を例ｌＡ１１）と
同様にしてアガロースゲル電気泳動により分析した。Ｘ
ｂａＩ部位はもたないが、単−Ｓｓｔ　］］をその場所
に有するハイブリッドプラスミドを含有する形質転換体
を同定した。このプラスミドはＧｐＥＬＴＡ　−６ｆ＋
５であり、プラスミドＧｐＦｉＬＴＡ　−６のＬＴＡ遺
伝子内の独自のＸ’ｂａ　Ｉ部位中にオリゴヌクレオチ
ドアダプターｄ　（ＣＴＡ−ＧＴＯ−ＯＧＯ−ＧＧＡ）
を挿入して有していた。

たトキソイドの分析 ＧｐＢＬＴＡ　−６８５を有する形質転換体について例
Ｉ　Ａ　ｌｘ）と同様に細胞不含抽出液を作製した。、
この抽出液のＬＴＡ活性を例ＩＢｖｌ）と同様にして分
析した。抽出液は、ＬＴＡ活性のないことが判明した。

ＧｐＥＬＴＡ　−６ｓ５の大規模調製を例ＩＡＩ）　　
と同様にして行った。

ＩＩ）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳によるＧｐ
ＥＬＴＡ　−６ｓ５の分析 ＧｐＦｉＬＴＡ　−６８５を例１０１ｖ）において説明
した１ｎｖｉｔｒｏの転写／翻訳過程の鋳型として使用
した。

Ｅｆｆ）Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオー
トラジオグラフィーに従ってＧｐＥＬＴＡ　−ｔ５８５
　　中にオリゴヌクレオチドインサー）Ｙ有するＬＴＡ
遺伝子は分子量が約５０００）　ＬＴＡより大きい蛋白
質をコード化していることが判明した。これは、挿入さ
れたオリゴヌクレオチド内にコード化されている余分の
４個のアミノ酸により説明することができた。

使用した方法は、ＧｐＥＬＴＡ　−５の代りにＧｐＥＬ
ＴＡ−６１１１５を用いた他は例Ｉ　Ｄ　ｌ）〜ｖＨ）
におけろと同様である。ＬＴＢ　Ｉ伝子およびオリゴヌ
クレオチドインサートを有するＬＴＡ遺伝子の両者を含
有するハイブリッドプラスミドが同定された。このプラ
スミドけＧｐＥＮ’ｌ’　−２ｓ５であった。

１ｖ）トキソイドのｉｎ　ｖｉｖｏ活性の決定例Ｉ　Ａ
　ＩＸ）と同様にして作られたＮ０ＩＢ　１１９３３　
（ＧｐＢＮＴ　−２８５を含有）の細胞不含抽出液を例
ＩＤ×）におけるウサギの回腸−ループ試験で試験した
。

陽性応答を生成するに必要とされる毒素濃度の２０００
倍を越える濃度で使用された場合にも何等の測定可能な
毒性活性は見られなかった。

例１および２のＬＴ　）キソイド生成物を含有する細菌
は、凍結乾燥され貯蔵することができる。

よるＬＴ−トキソイドの製造 突然変異ｉ　ＬＴＡは、フェニルアラニンをコード化す
るＴＴＯのアミノ酸位置７９のセリンをコード化するコ
ドンＴＯＯを変えることにより造成することができる。

Ａ）　　Ｍｔ３ｍｐｘｏ／ＬＴＡハイブリッドファージ
ＤＮＡの造成 １　）　　ｎｃｏＲＩおよびＸｂａ　ＩによるＭ　１３
　ｍｐ　］、０の消化反応緩衝液の最終濃度を２０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯＩ、１０ｒｎＭ　　ＭｇＯユ２　
、　１　　ｍＭ　　ＤＴＴ　、　　　１００　　ｍＭ　
　Ｎａ１ｌ　、　　Ｉ）Ｈ７，５どした以外は例ＩＡＩ
＋）と同様にして５μｇのｌ’１１３ｍｐ　１０をｎｃ
ｏＲＩおよびＸ’ｂａ　ｉ　により完全に消化した。消
化後、ＤＩＩＡを例Ｉ　Ａ　Ｉｌ＋）と同様にしてフェ
ノールで抽出し、エタノールから沈澱させた。

Ｉｔ　）　　ＧｐＲＬＴＡ　−６のＲａｏＲｌおよびＸ
ｂａ　Ｔによる消化例ＩＢｌｖ）からのＧｐＥＬＴＡ　
−６５１１ｇをＡＩ）と同様にしてＦ＝ａｏＲ■および
Ｘｂａ　Ｉで完全に消化した。

ＡＩ）からの切断ベクター０．５μｇとＡ１１）がらの
インサートＤＮＡ　９．５μｇを１００μｍの連結緩衝
液中に添加し、例］Ａｖｌ）と同様にして連結させた。

は例Ｉ　Ａ　ｖｌｌ）と同様にして、Ａ　１１１１から
の連結混合物を使用してＥ、　ｃｏｌｉを形質転換した
。選択培地は０．３ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシドおよび０．０３％（Ｗ／ｙ　）の５
−プロモー４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシドを含有するＬ−寒天であった。形質転換体をプ
レートにしてから、このプレートに予め指数函数的に生
育するＪＭ　１０３　（０Ｄ５５．−０．７　）の培養
液を１０μｍ添加してあろ０−７　％　（’！／ｖ）の
寒天（予め溶融シ、５０°で貯蔵）を含有する３ｍｌの
Ｌ−ブロスを重層させた。形質転換の事実は、ＪＭＩ０
３の「芝生」上にウィルスのプラークが存在することに
より観察することができる。これらのプラークは、選択
培地成分との反応に応じて、青色および無色の二つの種
類がある。

■）ハイブリッド／ファージ造成物の分析者無色プラー
クの細胞外−重鎖ファージＤＮＡの小規模調製を、次の
ようにして行った。プラークを無菌の妻楊子でプレート
からつつき出し、０Ｄ５５０が約０．２のＬ−ブロス（
２＋ｎｌ）中の指数的に生育しているＪＪＩ１１０３の
培養液に添加した。　この培養液を３７°で６〜７時間
生育させた。１　、５　ｍｌの培養液を１０，０００　
ｇで５分間遠心分離によりベレット化させた。上澄液の
２０μｍ試料を４μユのランニング染料と混合し、例ｌ
Ａ１１）と同様にしてアガロースゲル電気泳動により分
析した。

この分析を用いて、ハイブリッドファージすなわちＭ　
１３　ｍｐ　１０とＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａｌ制限部位間
のＬＴＡ遺伝子領域との組み合わせを含有する多くのプ
ラークが同定された。一つのそのような形質転換体を、
Ｍ　１３　ｍｐ　１０−　ＬＴＡと命名した。このハイ
ブリッドのＬＴＡ断片のヌクレオチド配列は、例Ｊｏｙ
）で説明したジデオキシヌクレオチド法により確認した
。

の大規模調製 Ｍ　１３　ｍｐ　１０−　ＬＴＡの無色プラークを無菌
の妻楊子を用いてプレートからつつき出し、１０ｍ１の
、Ｌ−プロスに添加した。１０μｍの指数函数的に生育
する３Ｍ１０３（ＯＤ５５ｏ＝０．７）を添加し、培養
液を３７゜で８〜１２時間インキュベートした。　１．
５ｍｌの培養液を１０，０００　ｇで１０分間遠心分離
してベレット化した。上澄液の頂部の０．８１１１１を
取り出し、これＫ　２００μｍ０２０％（Ｗａｙ　）の
ポリエチレングリコール、２．５Ｍ、ＮａＯ・１を含有
する溶液を添加した。この混合物を２０°で１５分間イ
ンキュベート後、１０．０００ｇで５分間遠心分離した
。上澄液を捨て、ベレットを２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣＩ、５０　ｍＭ　Ｎａ１ｌ　、　０．１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ。

を含有するｐＨ７，５の溶液１００μｍに再懸濁させた
。

得られた溶液を例Ｉ　Ａ　ｌ１１）と同様にしてフェノ
ールで抽出し、エタノールからＤＮＡ　’ｉ沈澱させた
。このＤＮＡを２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯＩ、５０
　ｍＭ　ＮａＯユ、０．１ｍＭ］ｐＤＴＡを含有するｐ
Ｈ７，５の溶液２５μｍに再懸濁させた。

ＴＡＧ　）の合成 例２Ａにお℃・て説明した方法を用いてオリゴヌクレオ
チドプライマーｄ　（ＴＧＴＴＴＴＣＡＯＴＴＯＴＯＴ
ＴＡＧ）を合成し、精製し、分析した。

＋１）　　オリゴヌクレオチドプライマーのホスホリル
化Ｂｌ）から得られた合成プライマーの１Ａｇの試料を
例２Ｂｌ）と同様にしてホスホリル化した。

１１１）細胞外−重＠　Ｍ　１３　ｍｐｌｏ　−ＬＴＡ
　ＤＮＡのＳａｕ　３Ａによる消化 Ａｖｌ）において生成した物質から微量の二重銹ｌを除
去するために、５μｇのこのＤＮＡを例１Ａ１１）と同
様にしてＳａｕ　３Ａにより完全に消化した。

消化彼、ＤＮＡを例］　Ａ　１ｉｔ）と同様にしてフェ
ノールで抽出し、エタノールから沈澱させた。

Ｂ　ｌ１ｌ）からのｓａｕ　３Ａ消化Ｍ　１３　ｍｐｌ
ｏ　−ＬＴＡ鋳型０．５μｇおよびＢ１１）からのホス
ホリル化オリゴヌクレオチドプライ−ｒ　−１０ｎｇを
２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯＩ　。

］ＯｍＭ　Ｍｇの２．５Ｑ　ｍＭ　Ｎａ（！１、１ｍＭ
ＤＴＴ、を含むｐＨ７，５の溶液ｌＯμｍに溶解し、５
分間５５°に加熱した。反応液を５分間２３°に冷却し
た後、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｅ−ＨＯユ　、　　１０　Ｔ
ｎＭ　　ＭｇＯユ２　、　１０　ｍＭ　　ＤＴＴ　、　
　　１　　ｍＭ　　ｄＡＴＰ　。

１　ｍＭ　ｄＯＴＰ、　　ｌ　ｍＭｄＧＴＰ、　　１　
ｍＭ　ＴＴＰ、　　１　ｍＭＡＴＰを含むｐＨ７，５の
溶液１０μユを添加した。この混合物に５単位のＤＮＡ
リガーゼ（１ｏｊ１位／μｍ）および２．５単位の「ラ
ージ・フラグメーントＪ　ＤＮＡポリメラーゼ（５即位
／μユ）を添加し、これを次いで１５゜で１６時間イン
キュベートした。

■）細菌の形質転換 Ｂｉｖ）からの連結混合物な使用して、Ａｉｖ）と同様
にｌ−て３Ｍ１０３を形質転換した。

形質転換体は、選択培地、上に無色のプラー・りとして
観察された。

Ｖｌ）形質転換体の分析 Ｂｖ）からの無色プラークから得られた細胞外−重鎖フ
ァージＤＮＡのヌクレオチド配列の決定を、Ａｙ）と同
様にして行った。　ＬＴＡ遺伝子のアばノ酸７９に対す
るコドンはＴＴＯであり、従ってこの位置においてフェ
ニルアラニンをコード化していて元の蛋白質におけるよ
うにセリンをコード化するＴｏｅではないプラークであ
ると、と同定された。

この変化は、オリゴヌクレオチドの誘発した部位指定突
然変異誘発により行われたものであった。

コドン変化したこの突然変異種は、　Ｍ１３ｍｐ　ｔｏ
　−８ＤＭ　１と命名した。

１ｉ４１３ｍｐｌｏ−ＳＤＭ　ｔ　　の無色プラークを
無菌妻楊子を用いてプレートからつつき出し、１０ｍ１
のＬ−プロスに添加した。１０μｍの指数函数的に生育
するＪＭ　ＩＱ３　（０Ｄ５５０　＝　０．７　）を添
加し、培養液を７時間３７°でインキ−ベートした。細
胞を７，０００ｇで５分間遠心分離して収穫し、上澄液
を捨てた。

ペレットを７０　μｌの２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｍｏ
１、５０　ｍＭ　Ｎａ１１、０．１　ｍＭ　ＦＪ）ＴＡ
　、　　ｐＨ７，５に再撃濁した。１５　μｍの新たな
りゾチーム溶液（５ｍｇ／ｍｌ　）を添加し、溶液を４
°で５分間インキュベートした。次いで、３０μｍの２
０　ｍＭ　Ｔｒｉｅ−ＨＣＩ、５０　ｍＭ　Ｎａ１１、
ｇ、１　ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨＣ５および１．２５μｌ
のＲＮａｓｅ溶液（ＲＮａｅｅ　Ａ　（１０ｍｇ　／　
ｍｌ　）でｌＱｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７，５，２分
間沸騰）を逐次添加した。４°で５分間インキュページ
ａ　７後、２４　（”／／ｖ）　ＴｒｉｔＯｎ　Ｘ−１
００を含有する１２０　ｐｌの２０　ｍＭ　Ｔｒｉｅ　
−Ｈｏ１、　５０ｍＭ　Ｎａ１１、ｏ、ｔ　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　、　ｐＨ７，５を添加し、インキュベーションを
更に１０分間継続した。この溶液を３０，０００　ｇで
３０分間遠心分離に付した。上澄液（約０．１５　ｍｌ
　）を取り出し、例Ｉ　Ａ　１ｌｌ）と同様にしてフェ
ノールで抽出し、エタノールから沈澱させた。

例ｌＡ１１）と同様にして、ＣＩ）からの５μｇＯ）Ｍ
１３　ｍｐ　１０−　ＳＤＭＩ　ＲＦ　ＤＮＡをＰｓｔ
　ＩおよびＢｃｏＲＩを用いて完全に消化した。

ＩＩＩ）　　ｐＡＴ　１５３のＰｓｔ・■およびＥｃｏ
ＲＩによる消化例ＩＡＩＩ）と同様にして、例１Ａｌ）
から得られたｐＡＴ　１５３５μｇをＰｓｔ　Ｉおよび
凡Ｃ０ＲＩを用いて完−全に消化した。

ｌｙ）　　ｐＡＴ１５３とＭＩ３ｍｐｌＯ−ＢＤＭＩ　
ＲＦ　ＤＮＡの連結Ｃ１１１茄）らの切断ベクター０．
５μｇおよびＣ１１）からの切断インサート１．５μｇ
を１００μｍの連結混合物に添加し、例Ｉ　Ａ　Ｖｌ）
と同様にして連結させた。

■）細菌の形質転換 例ＩＡν１１〕と同様にして、ＯＩＶ）からのＤＮＡ混
合物を使用してＮＣＸＢ　１１９３３　を形質転換させ
た。゛選択培地は、テトラサイクリンを２５μｇ　／ｍ
ユ含有するＬ−寒天であった。

ｖＤ　　ハイブリッドプラスミドの分析Ｃｖ）からのテ
トラサイクリン耐性アンピシリン感受性の形質転換体の
各々について小規模プラスミド調製を行い、例］　Ａ　
ｖｌｌｌ）と同様にして分析を行った。一つのそのよう
な形質転換体ＧｐＥＬＴＡ　−８ＤＭＩはＭ　１３　ｍ
ｐ　１０−　ＳＤＭＩ　ＥＬＦからのＰｓｔ　Ｉ　−’
Ｅｃ。

Ｊ断片をｐＡＴ　１５３のＰｅｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲ４部
位に含有するものであることが同定された。ＧｐＥＬＴ
Ａ　−８ＤＭＩの大規模プラスミド調製は、例ＩＡ　Ｉ
）と同様にして行った。

Ｖｉ：）　　５８　’ｂｐ　Ｈｌｎｄ　ｍ断片ｖ）　Ｇ
ｐＥＮＴ　２　カラ０）　除去例Ｉ　Ｄ　Ｖｉｌ）から
のＧｐＲＮＴ　−２からの大規模調製を例ｘＡｌ）と同
様にして行った。５μｇのこのプラスミドをＨｌｎａ　
ｍで消化して例１Ｂ　ｌ）と同様にして部分消化物を得
た。０．５μｇのこの切断プラスミドを例Ｉ　Ａ　ＩＶ
）と同様の条件で連結させ、テトラサイクリンを２５μ
ｇ／］Ｉ１１含有する選択培地上で使用して例Ｉ　Ａ　
Ｖｌ）と例ＩＡ　ｖ＋：）と同様にしてＮ０ＩＢ　１１
９３３を形質転換させた。例Ｉ　Ａ　ｖｉｌＤと同様の
小規模プラスミド調製による分析に従って、５８ｂｐ　
Ｈｌｎｄ　ｍ断片を失った点（および従ってそこにＲｃ
ｏＲ■部位を有する点）以外はＧｐＥＮＴ　−２と同様
な形質転換体を同定した。このプラスミドは、ＧｐｉＮ
Ｔ　−３と命名した。ＧｐＥＮＴ　ｌ　３の大規模プラ
スばド調梨を、例ＩＡＩ）と同様にして行った。

ｖｌｉｉ）　　ＧｐｌＮＴ　−３のｒＬｃｏＲＩおよび
ＸｂａＩによる消化５　ｆｉｇＯ）　Ｏｖｉｉ）からノ
ＧｐＥＮＴ−３を％Ａｌ）と同様にしてＥ、ａｏＲＩお
よびＸｂａ　Ｉで消化した。

ＩＸ）　　消化ＧｐｌＮＴ　−３の脱ホスホリル化２μ
ｇのＯｖｉｉｌ）からの消化ＧｐＥＮＴ　−３を例Ｉ　
Ａ　１ｉｔ）と同様にして脱ホスホリル化した。

Ｘ）　　ＧｐＥＬＴＡ−８ＤＭＩのＥｃｏＲｉおよびＸ
’ｂａ　■による消化５μｇのＯＶｌｌ）からのＧｐＥ
ＬＴＡ−ＳＤＭＩをＡＩ）と同様にしてｋｃｏＲｉおよ
びＸ’ｂａ　Ｉで消化した。

ＸＩ）　　ＧｐＥＮＴ　−３とＧｐＢＬＴＡ　−８ＤＭ
Ｉの連結０．５μｇの１×）からの脱ホスホリル化切断
ベクター　ＧｐＲＮＴ　−３と１．５μｇの切断Ｇｐ瓦
ＬＴＡ　−８ＤＭＩを例Ｉ　Ａ　ｖｌ）の方法に従って
連結した。

ＸＨ）細菌の形質転換 ｘｌ）からの連結混合物を使用して、＃　Ａ　Ｖ＋１）
と同様にしてＮ０ＩＢ　１１９３３を形質転換させた。

選択培地はテトラサイクリンを２５μｇ／　ｍユ含有す
るＬ−寒天であった。

ｘｌｌｌ　）ハイブリッドプラスミドの分析へ形質転換
体について、小規模プラスミド調製を行い、例Ｉ　Ａ　
ｖｉｉｌｌと同様にして分析した。同一分子ｆ’ｔ’Ｌ
有する多くの形質転換体がＧｐＥＮＴ　−３として同定
された。そのような突然変異種の一つについて例ＩＣい
で説明したジテオキンヌクレオチド法によりヌクレオチ
ド配列決定を行ったところ、このＬＴＡ遺伝子は位置７
９においてアばノ酸をコード化するコドンがこの位置に
おけるアミノ酸のセリンからフェニルアラニンへの変化
に対応してＴｏｏからＴＴＯに突然変異していたことが
確認された。この突然変異を含むプラスミドは、ＧｐＥ
ＮＴ　−３８ＤＭ工と命名した。

Ｄ）部位指定突然変異誘導トキソイドの試験ＧｐＫＮＴ
　”’　３　ＳＤＭ工を含有する形質転換体について例
Ｉ　Ａ　ｉｘ）と同様にしてＬＴＢ活性を試験したとこ
ろ。

ＬＴＢを産生ずることが判明した。

同一の形質転換体について例ＩＢ　ｌｖ）と同様にして
ＬＴＡ活性の試験を行った。ＬＴＡ活性は認められなか
った。

この形質転換体によシ産生されるトキソイドを例ＩＤ　
ｖｌｉｌ）と同様にして精製し、５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（１５％）により分析した［Ｌａｅ
ｍｍｌｉ　、　Ｕ、に、（１９７０）　：　Ｎａｔｕｒ
ｅ　２２７６８０−６８５〕。これらの結果により、こ
の突然変異した不活性なＬＴＡ分子は元のＬＴＡから区
別されないようにＬＴＢと会合することができることを
確認した。

このトキソイドについて、例ＩＤｘ）と同様にしてウサ
ギ回腸ループ試験で活性の試験を行った。

部位指定突然変異由来トキソイドを用いて毒性活性は検
出されなかった。

例４ ＬＴ−）キンイド株製造のための発酵 遺伝子工学的に得られたＢ、　ｃｏｌｉ　Ｎｏより　１
１９３３の菌株を上記語例で説明したようにして造成し
、Ｎｏより　１１９３３　／　ＧｐＢＮＴ　−２ｍｌと
命名した。

１）アンプル ＩＩ）スロープ １ｌｌ）　ｍ盪フラスコ／フローレンスフラスコ段階１
）凍結乾燥菌株のアンプルをスロープから調製し、室温
で貯蔵した。

１１）　　スロープ段階−細菌のアンプルにＱ　、　２
　ｍ’ｌの無菌ＬＰ８Ｇ或いは栄養プロス（ＮＢ）培地
を添加した。内容物を２５　ｐＢ　／　ｍｌのテトラサ
イクリンを含有する栄養寒天（ＨＡ）に無菌的に移し、
３７℃で一晩（１６時間）インキュベートした。

５　ｍｌの無菌ＬＰ８Ｇ培地をスロープに添加し、Ｑ、
１ｍｌずつのこの懸濁液を使用して２５μｇ／ｍ１のテ
トラサイクリンを含有するＮＡ寒天培地のスロープに接
種した。これらのスロープを一晩〔１６時間〕３７°で
インキュベートし、次いで１ケ月以内の期間４℃で貯蔵
し、その後この操作を繰り返した。

５　ｍｌ無菌ＬＰＳＧ或いはＮＢ培地をスロープに添加
し、表面生育の懸濁液を作製した。この懸濁液を次いで
使用してフローＶンスフラスコの接種を行った。スロー
プ懸濁液のｓｍｌを使用して２リツトルフローレンスフ
ラスコ内？　４００　ｍｌ　ノＬＰＳＧ或いはグリセｏ
　−Ａ７　Ｈｏ１ｍｅ培地を接種した。このフラスコを
温度を３７°Ｇに調整した２インチ行程の２５０回転／
分のロータリーシェーカー上で一昼夜（１６〜２４時間
）インキュベートした。

発酵段階 フローレンスフラスコ生育培養液を使用して発酵段階へ
の４００　ｍｌ　（１％（ｖ／ｖ））の接種材料を供給
した。これは、１２１８０４５分間予め殺菌された４０
リットルノＬＰＳＧ或いはグリセ０−　ル／　Ｈｏ１ｍ
ｅ培地を含有する７０リツトル容器中で行われた。

培養液は３ｘ６枚羽根の１２　ｃｍ直径タービンインペ
ラーを使用して５００回転／分の速度で攪拌した。３７
℃の一定温度を維持し、無菌空気を４０リットル／分の
速度で供給した。発酵物の収穫は、ＬＰＳＧ培地が使用
された場合には２０時間目に、グリセロール／　Ｈｏ１
ｍｅ培地が使用された場合には４４時間目に、行った。

試料の採取は発酵を通じて一定間隔で乾燥重量測定のた
めに行われ、ＬＴ　）キンイドは例ＩＡ　（ｉｘ）と同
様のｌ１ＬＩＳＡ法を用いて求めた。ｒ過されたプロス
試料を使用してｐＨ１アンモニア、グルコースおよびホ
スフェートなどの発酵パラメーターを求めた。

ＬＰＳＧおよびグリセロール／Ｈｏ１ｍｅ培地を用いた
２　Ｘ　４０１７ツトルの培養の結果は、下記に各々示
す通りである。

例Ａ　　　４０リツトルスケール 時間　　乾燥重量　　グリセロール　　ｐＨＬＴ）キソ
イドラ／１ルトル　　　ｇ／リットル　　　　　　　　
■／リットル０　　　　０．１２　　　　　３５，３　
　　６．８５　　　　　　−３　　　　０．６６　　　
　　３４．５　　　７．０５　　　　　　４６　　　　
５．５６　　　　　３０．４　　　　７．２０　　　　
　２４９　　　　８．８９　　　　　２１．３　　　６
．７０　　　　　９１１２　　　　８．５７　　　　　
１３．０　　　６．７０　　　　　７０２０　　　　８
．５１　　　　　　２．３　　　８．０５　　　　１１
９例Ｂ　　　４Ｑリツトルスケール 時間　　乾燥重量　　グリセロール　　ｐＨＬＴ）キソ
イド＆／リットル　　　ｇ／リットル　　　　　　　　
　　ｍｇ／リットル０　　　　　０．０８　　　　　　
３４．２　　　　６．９　　　　　　　−３　　　　　
０．０３　　　　　　３４．３　　　　６．９　　　　
　　　−６　　　　　０．０９　　　　　　３４．４　
　　　６．８　　　　　　　−９　　　　　０．１２　
　　　　　３３．５　　　　６．７　　　　　　　−１
２　　　　　０．１９　　　　　　３３．２　　　　６
．７　　　　　　３．５２０　　　　　０．６１　　　
　　　３２．１　　　　６．８　　　　　　４．５２３
　　　　　０．８４　　　　　　３４．５　　　　６．
８　　　　　　６２６　　　　　１．２１　　　　　　
３５．３　　　　６．８　　　　　　９２９　　　　　
２．０４　　　　　　３３．０　　　　６．５　　　　
　１６４４　　　　　４．２７　　　　　　１８．９　
　　　６．３４　　　　３３．５使用培地 ＬＰＳＧ　　　　　　　　　　　　　ｇ／リットルＬａ
ｂ　　Ｌｅｍｃｏ　　　　　　　　　　２０４プトン　
　　　　　　４０ Ｍａｉｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　２グリセ
ロール　　　　　３０ ｐＨ’ｙ、ｏに調整 栄養寒天　　　　　　　　ｇ／リットルＬａｂ　　Ｌｅ
ｍｃｏ　　　　　　　　　　　１０ペプトン　　　　　
　　１Ｏ ＮａＣｌ２ 寒天ＮＯ，３１５ 栄養プロス　　　　　　　ｇ／リットルＬａｂ　　Ｌｅ
ｍｃＯ１０ ペプトン　　　　　　　１０ Ｊａ０１５ Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２０３７，５ ＫＨ２ＰＯ４６，０ Ｎａ２Ｓｏ４　　　　　　　　　　０，５ＮＨ４０１３
，０ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２００，２ Ｌ−プロリン　　　　　　　０．４ Ｌ−ロイシン　　　　　　０．４ チアミン　　　　　　　　０．５ｍｇ 微量元素“ ｌ　　　　ｍｌ グリセロール　　　　　３０．０ ｐＨは７．０に調整 冬微量元素溶液（ｇ／ＩＪットル） ＯａＯ１□２Ｈ２０：　０，５　、Ｆｏｏｌ□６Ｈ，、
Ｏ：１６．７、Ｚｎ　ＳＯ４７Ｈ２０＝０．１８、Ｃｏ
ｏｌ□６Ｈ２０；　０．１８、ＮａＥＤＴＡ：２ｏ、１
、ＣｕＳＯ４５Ｈ２ｏ：ｏ、１６、ＭｎＳＯ４４Ｈ２０
：　０．１５゜ 例５ Ａ）ＬＴ）キソイドを含有する全細胞の調製例４と同様
にして生育させたＦｉ、　ｃｏｌｉ　ＮＣより１１９３
３７　ＧｐＦｌｉＮＴ　ｚｍｌ　ヲ遠心分Ｍ＆：ｌ　ヨ
り　収穫シ、細胞ペーストのアリコートをＴＦｔＡＮ緩
衝液に再懸濁させたこの懸濁液を４℃で１０，０００ｇ
にて１５分間遠心分離し、ＴＫＡＮ緩衝液に再懸濁させ
た。ホルマリンを添加して０．５％ＶＯＩ　／　ＶＯＩ
の最終濃度となるようにした。この懸濁液を３７℃で１
６時間インキーベートシ、４℃で１０　、０００　ｇに
て遠心分離を行い、細胞をＴＨＡＮ緩衝液で洗浄した。

懸濁液を４℃において１０，０００ｇで２０分間抜遠心
分離し、ベレットをＴＦＡＮ中に再懸濁させて、ワクチ
ン配合物に適したＬＴ　）キソイド濃度を得た。

Ｂ〕　単離ＬＴ　）キソイドの調製 ワクチンに使用した精製ＬＴ　）キソイドを、例１　ｖ
ｌｉｌ　）と同様にして調製した。

ＬＴ　）キソイド或いは精製ＬＴ　）キソイドを含有す
る全細胞のワクチンを、１０％Ａｒ１ａＣｅ１８Ｑ油（
（”ｌ／ｖｏｗ　）を含有するＤｒａｋｅｏｌ　６　Ｖ
Ｒ油オヨヒ４．２５％ＴＷｅｅｎ　ｓｏ水溶液（ｖｏ１
／ｖｏ１）ヲ油対水ノ比４：１（ｖＯしｖｏｌ　）で含
む液によるアジュバントエマルジョンとして調製した。

このワクチンは、−１だ、０．０２　％　（ｖＯしｖｏ
ｌ）のチオメロザール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ　）　
（ｖＯ１／ｖｏｌ　）を含有していた。

Ｄ）投与 これらのワクチンはブタの右耳の後の筋肉内に２ｍｌ投
与量で投与した。４週間の間隔をあけて２回の投与を行
った。本例は、体ｌｉ　１　ｋｇ当り５μｇ或いは５０
μｇＬＴ）キソイド（単離トキソイド或いは全細胞）を
投与した６匹の未経産雌ブタについての試験を報告する
ものである。

Ｅ）抗体力価の推定のための二重抗体競争１ｉｉＬ工Ｓ
Ａ全ての繰作は、９６ウエルの平底組織培養マイクロプ
レート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｑａｔ
、　Ｎｏ、　７６−００４−０５　）内で行った。各つ
ｚ／ｌｚに５０　ｍＭ　ＴｒｉＢ　−ＨｏＩ　ｐＨ８，
５，０，０２％アジド、ｏ、ｓ％Ｗ／ｖ　Ｎａｌ：ｉｌ
中のガングリオシド（ウシ脳からのタイプ酊、Ｓｉｇｍ
ａ　Ｎｏ、　Ｇ　−２３７５）　（１）　２１Ｍ　／　
ｍ１溶液５０μｌを添加した。プレートを被覆し、３７
℃で１６時間インキュベートした。ウェルの内容物を取
り出し、ウェルを１００μｍの５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ　
、　０．０２　％７　’）　）’　ｐＨ７，２で３回洗
浄した。５０μｍの、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ’１ｐ
ｕｓ、ｓ、０．０２％アジド、０．８％Ｎａ１ｌ緩衝液
中ノ２％ＢＳＡを各ウェルに添加し、プレートを３７℃
で３０分間インキュベートした。ウェル内容物を取り出
し、ウェルを１００μｍ０５０３ＬＭ　ＭＯＰＳ　、　
０．０２　％　７　シト、０．０５％ＴＷｅｅｎ　２０
　ｐＨ７，２テ３回洗浄した。クレメンツおよびフィン
ケルスティン（１９７９）の方法［ｅｌｅｍｅｎｔｓ　
ａｎｄ　Ｆｉｎｋｅｌｅｔｅｉｎ　、　１９７９　、　
　［高い特異的活性を有する均質な熱不安定性超毒素の
Ｅ。

Ｃ０１ｉ培養液からの単離および特徴付けＪ　工ｎｆｅ
ｃｔｉｏｎａｎａ工ｍｍｕｎｉｔｙ　、　２４７６０〜
７６９　］で調製された５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯ’
ｌ　ｐＨＢ、５．０．０２％アジド緩衝液中の０．１Ｌ
ｇ／ｍ’ｌ濃度のＪ　ＣＯ”Ｌｉ熱不安定性腸毒素５０
μｍを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で２時間
インキュベートした。ウェル内容物を取り出し、りｘル
を１００　μｌの５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ　、　０．０２
　％アシド、０，０５　％　Ｔｙｅｅｎ　２０　ｐｇ　
７．２で３回洗浄した。供試ブタの血液から調製された
血清試料を５０ｍＭ　ｒｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨＢ、５
．０．０２　％アジド、０．０５％ＴＷｅｅｎ　２０．
０．５％ＢＳＡ緩ｉｌ中にＮ車通りに稀釈した。これら
の稀釈液の５０μｍを適当なウェルに入れ５０風の緩衝
液を対照ウェルに添加した。これらのプレートを２時間
３７°Ｃでインキ−ベートし、ウェルの内容物を取り出
し、シェルを前記と同様に洗浄した。各ウェルに５０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯＩ　ｐＨ３，５，０，０２％ア
ジド、０．０５％Ｔｙｅｅｎ　２０緩衝液中に”／４（
Ｘ）に稀釈したＬＴ抗血清（つ÷ギ）５０μｍを添加し
、プレートを３７℃で２時間インキュベートし、ウェル
を前記と同様に空にし、洗浄した。５０μｍの５゜ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　−Ｍｏｌ　ｐＨＢ、５．０．０２　％アジ
ド、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０中で１／３ｏｏに稀釈
された抗つサギエρアルカリ性ホスファターゼ結合体（
ヤギで産生されたＳｉｇｍａ　Ａ　−８０２５）を各ウ
ェルに添加した。プレートを被覆し、３７℃で１６時間
インキュベートさせ、前記と同様に空にして洗浄した。

各ウェルニ５０　μ’ｌ　（１’）、５０　ｍＭ　Ｎａ
ＨＯＯ３ｐＨ６，３中１　ｍｇ　／　ｍｌの濃度のｐ−
二トロフェニルホス７エートニナトリウム（５ｉ（ｐａ
　１０４　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｅ３ｕｂｓｔｒａ
ｔｅＴａｂｌｅｔｓ　、　Ｏａｔ、Ｎｏ、１０４−１０
５）を添加した。発色″現像を５０μｍ　１Ｍ　ＮａＯ
Ｈの添加で停［ヒされるまで継続させた。各ウェルの色
強度は、４１２ｎｍ　フィルターを付けたＴｉｔｅｒｔ
ｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　３−チャンネル光度計（Ｆ
ｌｏｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉθｅ　Ｏａｔ、Ｎｏ、　
−７８−５０３−００）を用いて測定した。抗体力価は
陰性対照例と抗体試料の色強度との間の差を求めること
により測定した。

ブタの薄情は、頚静脈出柚により得られた血液から定期
間隔を置いて調製した。第９図は一ヒ記方法により求め
られたＬＴに対する循環抗体力価を示すものである。５
７４ｇ　／　ｋｇの単離されたトキソイドに対するビー
ク抗体力価とＬＴ　）キソイドを含有する全細胞の５〜
５０μｇ　／　ｋｇ　に対するピーク抗体力価とは似た
ようなものであるが、単離されたトキソイドの５０　Ｊ
ｊｌＥ　／　ｋｇ　　に対して得られた力価よりも低い
。単離トキソイドに対する抗体応答は、全細胞に対する
よりも速い。全てのＬＴ　）キソイドワクチン配合物に
対する抗体力価は、第２回の注射後少なくとも８週間高
く留まった。

Ｆ）毒性 上記例１ｖｉｉｉ）の方法により調製された精製ＬＴト
キソイドをマウスの筋肉内に投与したところ、４＃／ｋ
ｇ（これは、治療投与量のはｒ　４００倍である）寸で
非毒性であることが判明した。

ｔｘオ、ＮＣｌＢ１１９３２およびＮＣＩＢ　１１９３
３　は、いずれも１９８３年１２月５日にナショナル・
コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ
リン・／々クチリア・リミテッド、ドーリ−・リサーチ
・ステーション（スコツトランド、アバディーｙ　　Ａ
Ｂ９　８ＤＧ、７ビーーｏ−ド　１３５、ｐ、ｏ。

ゼックス　３１）に寄託された。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２
（ＪＭ　１０３　）は、ペセスダ・リサーチ・ラゼラト
リーから自由に入手できる。ｐＢＲ３２２も自由に入手
できるものであり、Ｍ１３　ｍｐ　１０　ＲＦ　ＤＮＡ
もアマ−ジャム・インターナショナル・リミテッドから
自由に入手できる。

子−１１陰

【図面の簡単な説明】

第１図は、自然のま＼のＬＴＡ遺伝子のヌクレオチド配
列を示す説明図である。 第２図は、部位指定変異種Ｅ３ＤＭＩのＬＴＡ遺伝子ラ
スうドはアンピシリンおよびテトラサイクリンへの耐性
を与え、クローニングに適した多くの独特の制限酵素認
識配列を有する。 第４図は、プラスミド造成物ＧｐＥＬＴＢ　−１０を示
す説明図である。このプラスミドはアンピシリン耐性を
与え、ＬＴＢ蛋白質サブユニットを生成する。 第５図は、プラスミド造成物ＧｐＫＬＴＡ　−６を示す
説明図である。このプラスミドはテトラサイクリンへの
耐性を与え、ＬＴＡサブユニットを生成するＯ 第６図は、プラスミド造成物ＧｐＫＮＴ　−２を示す説
明図である。このプラスミドはテトラサイクリンへの耐
性を与え、ＬＴＡおよびＬＴＢサブユニットの両者を生
成するっ 第７図において、ａ）はＸｂａ　１部位（ＴＯＴ　−Ａ
ＧＡ　）の領域におけるＬＴＡ遺伝子のヌクレオチド配
列を示す説明図であり、ｂ）はａ）におけるヌクレオチ
ド配列に対応する蛋白質配列を示す説明図であり、Ｃ）
は’ＬＴＡ遺伝子中に挿入されるべき二重鎖合成オリゴ
ヌクレオチドを示す説明図であり、（１）　　はＸｂａ
　１部位中へのオリゴヌクレオチドの挿入後のＬＴＡ遺
伝子におけるヌクレオチド配列を示す説明図であり（Ｘ
ｂａ　ｒ部位（ＴＯＴ　−ＡＧＡ　）は二つの未認識配
列（Ｔ（１！Ｔ−ＡＧＴおよびＡＣＴ−ＡＧＡ　）によ
多置換された新たなＳｓｔ　１［部位（ＯＧＧ　−Ｃ１
ＧＧ　）を形成している）、ｅ）はｄ）におけるヌクレ
オチド配列に対応する蛋白質配列を示す説明図である。 第８図は、テトラサイクリ／に耐性を与え、ＬＴＢサブ
ユニットおよびオリゴヌクレオチドａ（０ＴＡ−ＧＴＯ
−ＯＧｃ−ＧＧＡ）　全含有スル変異Ｉ、ＴＡ　サブユ
ニットの両者を生成するプラスミド造成物ＧｐＫＮＴ−
２ｓ５を示す説明図である。 第９図は、二重抗体競争ＦｔＬＩ　８Ａにより求められ
たＨに対する循環抗体力価を示す説明図である。 出願人代理人　　　猪　　股　　　　　清Ａ　−、−、
ｌＩ　Ａ　　ＩＩ　　　　＜ａ＜ｂｃ＞ｈｈ＋＜トｐ＋
　０鴫　トロ　ロ０−ト　ベペ　ペ−ｕ島　　　　　　
−ｈＡ　　　ｍト　　　ト　　　ｏｃＪｃｓｓ＜　　　
　ベ　　　ト　　　　　　　　　　−イ　　　リ　　　
ト　　　−１・　　＜１＋＜　へ　υｈ　　べ２　−・
　　鴫ｐ　　鴫１Ｍ　　　　ｈ　　　　ａ　　　　＠ｓ
　　　　ｓ　　　　１−Ｉ（ｔ、＋１１　　ｏｈｔｓｇ
　　（Ａ、＜＜Ｈｔｓｆ−１ｇ（ｈＨＩＪＩＪ　　　ぺ
ｈ　　ロＣ１ｈｈ　　　　　　　　　　　Ａ　　　　−
ｄ　　　　＠ｕ＜ｈｈ　　　）′　　ｆ″　　ベ　　ペ
　　　　　　ト　　ペ　　１−２０　５　０　４　　°
　　−−０−−。　　−（）″トクーＧｋＬ１６に″　
ａ″′４２　１−（１’　　　　　　ｕｋ　　ｕｈ　　
鴫ｋ　　ペロ　−１−の　ロロ　−Ｆｌ　　−１＋ｌ　
　ｏｐｌ　　　−−０←　　　ロ　　　＜　　　１＋　
　　べ　　　。　　　０　　　ベ　　　ベｕシ　６″　
＜ロ　ベニ　−ミ　−４＜４　　ｕゴ　−２０輔　ト・
　−Φｈ′Ａ（−＋１１＋　　べく　＜−−Ｆ’　　＊
ｕ　　（ＪＥ　　−ｃ＜　　ＩＪＩＪ　　＜＜　　ｓｓ
　　＜ｔ−ｔＦＩｏ　３゜ ＦｔＧ、１、。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、毒素或いは毒素の毒性成分の不活性形態よりなるト
   キソイド。ただし、この不活性形態は、該毒素或いは毒
   性成分と実質的に相同的なものであり、変異させた遺伝
   子の発現により生成させたものであり、実質的に非毒性
   であると共に単独或いは１種以上の非毒性成分と組み合
   わされて該毒素或いは毒性成分に対する抗体の産生を刺
   戟する能力を有するものである。 ２、該不活性形態が、該毒素或いは毒性成分と５個未満
   のアミノ酸残基において異るものである、特許請求の範
   囲第１項記載のトキソイド。 ３、該不活性形態が、該毒素或いは毒性成分と１個また
   は２個のアミノ酸残基においてのみ異るものである、特
   許請求の範囲第２項記載のトキソイド。 ４、該不活性形態が、活性毒素或いは毒性成分と該不活
   性形態との両者に共通したアミノ酸残基の間の空間的関
   係を保つものである、特許請求の範囲第１項〜第３項の
   いずれか１項に記載のトキソイド。 ５、活性毒素或は毒素の毒性成分が、急性下痢の原因と
   なるものである、特許請求の範囲第１項〜第４項のいず
   れか１項に記載のトキソイド。 ６、活性毒性成分がブタの伝染性下痢症の原因となる熱
   に不安定な毒素（ＬＴ）のＡ成分である、特許請求の範
   囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載のトキソイド。 ７、トキソイドがＬＴ毒素のＡ成分の活性形態と７９番
   目の位置のセリンがフェニルアラニンに置き換っている
   点で異るものである、特許請求の範囲第６項記載のトキ
   ソイド。 ８、不活性ＬＴＡ成分がＬＴＢ成分と組み合わされてＬ
   Ｔ毒素の不活性形態を形成している、特許請求の範囲第
   ７項記載のトキソイド。 ９、特許請求の範囲第１項記載のトキソイドを含有する
   ワクチン調剤。 １０、該トキソイドの少なくとも幾らかが、それを産生
   した非病原性宿主細胞中に含有されている、特許請求の
   範囲第９項記載のワクチン調剤。 １１、特許請求の範囲第５項記載のトキソイドを含有す
   る急性下痢に対して活性なワクチン調剤。 １２、特許請求の範囲第６項記載の不活性化ＬＴＡ成分
   を含有するブタの伝染性下痢症に対して活性なワクチン
   調剤。 １３、特許請求の範囲第５項記載のＬＴＡ成分をＬＴＢ
   成分と共に含有するブタの伝染性下痢症に対するワクチ
   ン調剤。 １４、Ｋ８８抗原を更に含み、また必要に応じて該抗原
   よりなる全細胞及び（又は）該トキソイドを含有する全
   細胞を含む、特許請求の範囲第１３項記載のワクチン調
   剤。 １５、特許請求の範囲第１項記載のトキソイドをコード
   する遺伝子。 １６、特許請求の範囲第６項記載のトキソイドをコード
   する遺伝子。 １７、ブタの伝染性下痢症の原因となるＬＴ毒素のＬＴ
   Ａサブユニットをコードする遺伝子。ただし、７９番目
   の位置のセリンをコードするヌクレオチドトリプレット
   がフェニルアラニンをコードするトリプレットに置き換
   っており、更に２個までのトリプレットが異ったアミノ
   酸をコードするトリプレットにより置き換っている。 １８、特許請求の範囲第１４項〜第１７項のいずれか１
   項に記載の遺伝子を含んでなるベクター。 １９、ＧｐＥＮＴ−２ｍ１、ＧｐＥＮＴ−２ｍ２及びＧ
   ｐＥＮＴ−２ｍ３よりなる群から選ばれる、特許請求の
   範囲第１８項記載のベクター。 ２０、特許請求の範囲第１８項または第１９項に記載の
   ベクターを含有する宿主細胞。 ２１、毒素或いは毒素の毒性成分をコードする遺伝子を
   変性して、該変異遺伝子を必要に応じて他の遺伝子と共
   に宿主生物内で複製可能なベクター中に導入してこれを
   該宿主生物を形質転換するために使用したときに該変異
   遺伝子が特許請求の範囲第１項記載のトキソイドを産生
   するものとなるようにすることを特徴とする、毒素或い
   は毒素の毒性成分の不活性化方法。 ２２、毒素により引き起こされた病気に対抗する方法に
   おいて、ヒト或いは動物の対象に有効投与量の特許請求
   の範囲第９項〜第１４項のいずれか１項に記載のワクチ
   ンを投与することを特徴とする方法。 ２３、下痢の原因となるグラム陰性細菌の産生する毒素
   により引き起こされる胃腸病に対抗する方法において、
   ヒト或いは動物の対象に有効投与量の特許請求の範囲第
   ９項〜第１３項のいずれか１項に記載のワクチンを投与
   することを特徴とする方法。