JPS58189197A - 新規ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト免疫インターフェロンポリペプチドをコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡ　、それで形質転換
せしめた宿主および該宿主を用いるヒト免疫インターフ
ェロンの製造法ならびに該製造法で産生じつるインター
フェロンに関する。

インターフェロン（以下Ｉｇと略称することがある。）
は、高等動物の細胞がウィルスや核酸などの刺激によっ
て誘発されて産生ずる蛋白質であり、抗ウィルス作用、
抗腫瘍作用などを有する。

ヒトのＩＰ’には、現在α型、β型およびγ型の３檀の
性状の異なるタイプが存在することが知られており、β
型およびβ型はウィルスや核酸で、γ型はマイト−シェ
フなどで誘発される。

ａ型ｒｒ（以下ＩＦ’−ａと略称する）、β型工Ｆ（以
下工Ｆ−βと略称する）に関する研究は比較的す−んで
おり、その産生機構もかなシ解明されてきている。さら
に遺伝子操作技術の進歩によって、現在はＩＦ’−ａと
ＩＦ−β１が大腸菌を培養することにより、ＩＰ’−β
１が酵母を培養することにより、それぞれ生物学的に活
性な蛋白質として、大量に得られるようになった（　Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ。

ｎ　ｙ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８７．４１１（１９８
０）、Ｙｅｌ　ｖｅｒ−ｔｏｎ、Ｅ、ら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、旦、７３１（１９８１）
、Ｇｏｅｄｄｅｌ　、　ＩＩ　Ｖ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄａＲｅｓ、、８．４０５７（１９８０）、Ｈ
ｌｔｚｅｍａｎ　、　Ｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ％２９３．
７１７（１９８１））。さらに臨床へ応用するための大
量生産が試みられるようになってきた。

ｒ型ＩＦ（以下ＩＦ−ｒと略称することがある。）はリ
ンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起るような状況下
で、免疫担当細胞から産生されるため、免疫インターフ
ェロン（以下Ｉ−ＩＦと略称することがある。）とも呼
ばれている。エーエＦは工Ｆ−ａやＩＦ’−βと比較し
て、抗細胞増殖活性や抗腫瘍活性が高いといわれており
、臨床的応用面からよシ期待されている。しかし、その
産生に新鮮なリンパ球が必要であることなどの制約があ
るため、これまで効率のよい産生系ｒａ確立されていな
い。また、異なる実験系では、異なる細胞種が異なる分
子種のＩ−ＩＦを産生する可能性も示唆されてお９、そ
の構造や性質に関しても不明な点が数多く残されている
。

一方、ＩＦには高い種特異性があるため、ヒトへの応用
にはヒト由来のＩＩ’が使用されなければならない。し
かしながら、ヒト免疫インターフェロンは緻産が困難で
あるために、現時点では臨床への応用が不可能であり、
純度の高いと）Ｉ−ＩＦｌ容易により安価に大量生産で
きる技術の開発が望まれている。

本発明者らは、遺伝子操作技術を利用してヒトのＩ−Ｉ
Ｆ遺伝子をクローニングし、得られた組み換えＤ）１１
分子を宿主に移入してと）Ｉ−ＩＰ”遺伝子を発現させ
、目的とするＩ−ＩＦを得ることのできる技術の開発研
究を行った結果、本発明を完成するにいたった。

すなわち本発明は、ヒト免疫インターフェロンポリペプ
チドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、該Ｄｌｌ
ｉＡで形質転換せしめた宿主、ならびに該ＤＮＡで形質
転換せしめた宿主を培養することによるヒト免疫インタ
ーフェロンまたはそれと等価のポリペプチドの製造法お
よび該製造法で産生しうる新規インターフェロンを提供
するものである。

本発明のＤＮＡは （５’）　ＴＧＴ　ＴＡＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＡＣＣＣＡ
　ＴＡＴ　ＧＴＡＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　Ａ
ＡＣＣＴＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴＴＴＴ　ＡＡＴ　
ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　Ｇ
ＣＧＧＡＴ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＴＴＣ
ＴＴＡ　ＧＧＣＡＴＴＴＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＴ　Ｔ’Ｇ
ＧムムＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣＡＧＡ　　
ＡＡＡ　　ＡＴＡ　　ＡＴＧ　　ＣＡＧ　　ＡＧＣＣＡ
Ａ　　ＡＴＴ　　ＧＴＣＴＣＣＴＴＴ　　ＴＡＣＴＴＣ
ＡＡＡ　　ＣＴＴ　　ＴＴＴ　　ＡＡＡ　　ＡＡＣＴＴ
Ｔ　　ＡＡＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡＣＣＡＧ　　ＡＧＣＡ
ＴＣＣＡＡ　　ＡＡＧＡＧＴ　　ＧＴＧ　　ＧＡＧ　　
ＡＣＣＡＴＣＡＡＧ　　ＧＡＡ　　ＧＡＣＡＴＧＡＡＴ
　　ＧＴＣＡＡＧ　　ＴＴＴ　　ＴＴＣＡＡＴ　　ＡＧ
ＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧ　　ＡＡＡ　　ＣＧＡ　　ＧＡＴ
　　ＧＡＣＴＴＣＧＡＡ　　ＡＡＧ　　ＣＴＧＡＣＴ　
　ＡＡＴ　　ＴＡＴ　　ＴＣＧ　　ＧＴＡ　　ＡＣＴ　
　ＧＡＣＴＴＧ　　ＡＡＴＧＴＣＣＡＡ　　ＣＧＣＡＡ
Ａ　　ＧＣＡ　　ＡＴＡ　　ＣＡＴ　　ＧＡＡ　　ＣＴ
ＣＡＴＣＣＡＡ　　ＧＴＧ　　ＡＴＧ　　ＧＣＴ　　Ｇ
ＡＡ　　ＣＴＧ　　ＴＣＧ　　ＣＣＡＧＣＡ　　ＧＣＴ
　　ＡＡＡ　　ＡＣＡ　　ＧＧＧ　　ＡＡＧ　　ＣＧＡ
　　ＡＡＡ　　ＡＧＧ〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまた
はＴＡＧを示す〕で表わされる塩基配列を含有するＤＮ
Ａである。

式（Ｉ）で示されるＤＮＡは （Ｎ）　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｙｒ　ＶａｎＬｙｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
　Ａｓｎ’Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＬｙＳＴｙｒＰｈｅ　Ａｓ
ｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ
　ＡｌａＡｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｐ
ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｌｌ５Ｌｅｕ　Ｌｙａ　Ａｓｎ
　Ｔｒｐ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＡｓｐＡ
ｒｇ　Ｌｙａ　１１ｅ　　Ｍｅｔ　　Ｇｉｎ　　Ｓｅｒ
　Ｇｌｎ　　ｒｌｅ　　ＶａｌＳｅｒ　　Ｐｈｓ　　Ｔ
ｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙａ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌ
ｙａ　　ＡａｎＰｈｅ　　Ｌｙａ　Ａｓｐ　　ム８ｐ　
　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　　ＬｙｓＳｅ
ｒ　　Ｍａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　ＭｅｔＡａｎ　　Ｖａｌ　
　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　　
Ａａｎ　　ＬｙａＬｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　Ａｓ
ｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙａ　ＬｅｕＴｈ
ｒ　　Ａａｎ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ
　　Ａａｐ　Ｌｅｕ　　ＡｓｎＭａｌ　　Ｇｌｎ　　Ａ
ｒｇ　　Ｌｙａ　Ａｌａ　　工１ｅ　　Ｈｌｓ　　Ｇｌ
ｕ　　ＬｅｕＩｃｅ　　Ｇｌｎ　　Ｍａｌ　　Ｍｅｔ　
　ｋｌａ　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ａｌａ　　Ａｌａ　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　Ｌｙ
ｓ　　Ａｒｇ　　Ｌｙａ　ＡｒｇＳｅｒ　　Ｇｌｎ　Ｍ
ｅｔ　　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　
　ＡｒｇＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　　（ｃ）　　　　　
　　（ＩＩ　）で表わ嘔れるポリペプチドまたはそれと
等価の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチ
ドをコードする。

上記ＤＮＡ（１）は、その５′末端に ダ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＡＣＡ　ＡＧＴ　ＴＡＴ
　ＡＴＣＴＴＧＧＣＴ　　ＴＴＴ　　ＣＡＧ　　ＣＴＣ
ＴＧＣＡＴＣＧＴＴ　　ＴＴＧ　　ＧＧＴＴＣＴ　ＣＴ
Ｔ　ＧＧＣ３’　　（Ｎ）またはＡＴＧ　　（ＩＶ）を
有していてもよい。

ＤＮＡ　（Ｉ　）の５′末端に（ＩＩ）で示されるＤＮ
Ａを有するときにはポリペプチド（Ｉｆ）に加えて（Ｉ
Ｉ）のＮ末端に、Ｍｅｔ　Ｌｙａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　５
ｅｒＴｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ
　Ｌｅｕ　Ｃｙａ　ｌ１ｅＶａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　を有するポリペプチドまたはこ
れと等価の活性を有するポリペプチドをコードし、ＤＮ
Ａ（Ｉ）の５′末端に（ＩＶ）で示されるＤＮＡを有す
るときは、ポリペプチド（ｎ）に加え、（ＩＩ）のＮ末
端にＭｅｔを有するポリペプチドまたはこれと等価の活
性を有するポリペプチドをコードする。

ＤＮＡ（Ｉ）はプロモーターの下流に連結されているこ
とが好ましく、これらのプロモーターとしてトリプトフ
ァン（ｔｒｐ）プロモーター、バクテリオファージ由来
のフムダ（λ）ＰＬ　プロモーター、フクトース（ｌａ
ｃ　）プロモーター、蛋白質鎖伸長因子Ｔｕ　（ｔｕｆ
Ｂ）プロモーターなどが挙げられ、とりわけｔｒｐプロ
モーターおよびＰｒ、プロモーターが好適である。ＰＬ
プロモーターは非常に有効なプロモーターであり、λｏ
Ｉリプレッサーによる調節を効率よくかつ容易に受ける
ことができる。リプレッサーを支配する遺伝子に突然変
異が起ると、たとえばｃｒｔｓ　２もしくはｃＩｔｓ８
５７では、該リプレッサーは温度感受性となり、３゜Ｃ
では活性を示すが、約３７Ｃ〜４２℃では不活性となる
。したがって、３０℃ではλＰＬプロモーターは抑制さ
れており（閉の状態）、４２１Ｅではその抑制が解除さ
れる（開の状祿）。この特色は、遺伝子にかかる産生物
が菌体に有害であったり、その産生物が大厳に生産され
た時に画体増殖に害を及ぼすなどの場合には望ましいも
のである。このＰＬプロモーターの調節機構を利用すれ
ば、約３０℃〜３７℃で遺伝子生産物が発現することな
しに培養することができ、適当な時期に温度を約３７′
Ｃ〜４２℃に変えて目的とする遺伝子生産物乞生産する
ことができる。

一般式（Ｉ）中、Ｘで示されるオリゴＤＮＡのうちでも
ＴＡＡが好ましい。

本願明＃ｌ書９図面および特許請求の範囲で用いる記号
の意義は下記第１表に示すとおりである。

第１表 ＤＮＡ　　　デオキシリポ核酸 Ａ　　　アデニン Ｔ　　　チミン Ｇ　　　グアニン Ｃシトシン ＲＮム　　リボ核酸 ｄＡＴＰ　　　デオキシアデノシン玉リン酸ｄＴＴＰ　
　　デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　デオキシ
グアノンン玉リン酸ｄｃＴＰ　　　デオキシシチジン玉
リン酸ＡＴＰ　　　アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ　　　エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ　　　ド
デシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ　　　グリクン Ａｌａ　　　アラニン Ｖａｌ　　　バリン Ｌｅｕ　　　ロイシン エ１ｅ　　イソロイシン ３ａｒ　　　セリン Ｔｈｒ　　　スレオニン Ｃｙａ　　　システィン Ｍｅｔ　　　メチオニン Ｇｌｕ　　　グルタミン酸 ム８ｐ　　アスパラギン酸 Ｌｙａ　　　リジン Ａｒｇ　　　アルギニン Ｈｌｓ　　　ヒスチジン Ｐｈｅ　　　フェニールアラニン Ｔｙｒ　　　チロシン Ｔｒｐ　　　）リプトファン Ｐｒｏ　　　プロリン Ａｓｎ　　　アスパラギン Ｇｌｎ　　　グルタミン 式（Ｉ）で表わされる塩基配列を含有する本発明のＤＮ
Ａは、たとえば、以下に示す（イ）〜（す）にょ１製造
することができる； 仔）たとえばヒト末梢血リンパ球などのヒトニーＩＰを
分泌する細胞を培養する。

（ロ）その細胞からヒ）Ｉ−ＩＦをコードする伝令ＲＮ
Ａを分離する。

（ハ）その伝令ＲＮＡおよび逆転写酵素を用いて単鎖の
相補ＤＮＡを合成する。

に）その相補ＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換する。

（ホ）得られる二重＠　ＤＮＡをプラスミドに組み込む
。

（へ）この組み換えプラスミドを、たとえば大膳−や枯
草−などの宿主に導入して形質転換させる。

（ト）該宿主を培養して得られる菌体から目的とするＤ
ＮＡを含有するプラスミドを単層する。

例　所望によシ、そのプラスミドから目的とするクロー
ン化ＤＭＡを切シ出す。

（す）所望により、該クローン化ＤＮＡをビークル中の
プロモータの下流に連結させる。

ここで用いられるヒト末梢血リンパ球は非感作細胞、感
作細胞のいずれでもよい。

本発明に使用されるＩ−（Ｆ＠起剤は、ヒトリンパ球細
胞忙Ｉ−ＩＦの産生を誘起させるものであれ　　・・ば
いかなるものであってもよい。例えば、フィトヘマグル
チニン（ＰＨＡ　）、コンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）
、スタヒロコッカル　エンテロトキンンＡ（ＳＥＡ）、
／イラミニダーゼーガフクトース酸化酵素（ＮＡＧＯ）
、１２−０−テトラデカノイμホルボール−１３−アセ
チイト（ＴＰＡ）などが挙けられ、これらを単独または
これらを組合せて使用することができる。

Ｉ−ＩＦの誘起は細胞をＲＰＭニー１６４０培地やＭＥ
Ｍ培地などそれ自体公知の培地で培養して行うこと１が
できるが牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０＠地が好
ましい、培養は、温度３５〜３９℃、望ましくは３６〜
３８℃で、培養時間は１２〜７２時間、望ましくは２２
〜２６時間行われる。細胞はそれ自体公知の方法で集め
、これにＲ，１Ｖａｓｅ阻害剤としｌ　てグアニジンチ
オンアナイド、ベントナイト、ヘパリン、ポリビニ／Ｌ
’硫酸、オーリントリカルボン酸、バナジウム複合体、
ジエチルピロカルボネイ）　（ＤＰＣ）、ドデシル硫酸
ナトリウム（８ＤＳ　）などを加え九のち、Ｎ−ツウロ
イルザルコシン酸ナトリｔ　　ラム、ツイーン８０、ノ
ニデットＰ−４０、などを加えて細胞を溶解させてＲＮ
Ａを抽出する。必要によシ、このＲＮＡを含む抽出液に
フェノ−〜、フェノ−〃−クロロホルムなどを加えて抽
出操作をくシ返し九のち、エタノ−μ沈殿でＲＮＡを集
める。

真被細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３
′末端にボ’ＪＡｇｋ！列をもつことが知られているの
で、つぎにオリゴ（ａで）七〜ロース、ポリ（Ｕ）セフ
ァロースなどを用いて　ポリ（Ａ　）ＲＮＡを集め、こ
れをシ曹糖密度勾配遠心法で分画し、この−分の一部を
アフリカツメガニ／％／（Ｘｅｎｏｐａｓ　１ａｅｖｉ
ｓ）の卵母細胞に注入して翻訳させるＣ　Ｇｕｒｄｏｎ
、　ａＴ、　Ｂ・ら、Ｎａｔｕｒｓ、１主ｌ、１７７（
１９７１））、生じた蛋白質の抗ウイ〜ス作用を検定し
、Ｉ−Ｉ’Ｆの一部を得ることができるａ　ｍＲＨＡは
ホルムアミド−ポリアクリルアミドゲル電気泳動やグリ
オキサールを用い九アガロースゲル電気泳動を用いても
精製することができる。　　　　′ 得られたｍＲＮＡ　ｆｐ型として、九とえば、逆転写酵
素を用い自体公知の方法で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖
を合成し、ｃＤＮＡの二本ｄｌｌ　ＤＮＡへの変換を行
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、Ｃｅ１ｌ、８，１６３
（１９７６））。

このＤＮＡを例えばｄＧ−ｄＣあるいはｄＡ−ｄＴホモ
ポリマー結合法（Ｎｅｌｓｏｎ％Ｔ、　８、Ｍｅｔｈｏ
ｄａ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ％６８．４１　（１９
７９）　、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　　Ｉｎｃ、
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：］で、たとえばプフスミドｐＢＲ
３２２のＰｓｔ工あるいは８ｐｈ　Ｉ制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位に組み込ませる。これを例えば大腸菌１
１７７６株に導入して形質転換させ、１−ＩＦポリペプ
チドのアミノ酸配列に対応すると考えられる塩基配列を
もったオリゴヌクレオタイドを化学合成したのち、これ
を３２ｐでフベ〜してプローグとなしたとえばそれ自体
公知のコロニーハイプリダイゼーＶｇン法〔Ｇｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ％Ｍ−ａｎｄ　　Ｈｏｇｎｅｓａ、　Ｄ＠　Ｓ
、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、８ｃｉ＋　　ＵＳ
Ａ、７２．３９６１（１９７５）］によッテ、すでに得
九テトフサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性のト
ランスホーマントの中から求めるクローンを二次スクリ
ーニングする。

このコロニーハイプリダイゼーＶＷンによって陽性を示
したクローンの塩基配列を、たとえばＭａｚａｍ　−Ｇ
１１ｂｅｒｔ法（ＭａＸａｍｂム、　Ｍ、　＆Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ。

”Ｗ、Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓａｉ、　Ｕ
ＳＡ、７４．５６０（１９７７））あるいは７ア一ジＭ
ｌｌを用いたジヌクレオチド合成鎖停止の方法（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ、　Ｊ、ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｅｅ
ｓ、　９．３０９（１９８１））の方法によって決定し
、Ｉ−ＩＦ遺伝子の存在を確認する。次に、得られたク
ローンからニー■遺伝子の全部あるいは一部をきシ出し
、適当なプロモーター、８Ｄ（シャインアンド　ダルガ
ーノ）配列の下流につないで、これを適当な宿主に導入
することもできる。

プロモーターとしては、前記のプロモーターが挙げられ
、宿主としては、大腸菌や枯草菌などの細菌やビー／Ｉ
／＃／Ｉ母のような他の像化物が挙げられるが、大腸菌
（２９４，Ｗ３１１０など）、と）わけ２９４が好まし
い。

なお、大腸菌２９４は公知の菌（Ｂａｃｋｍａｎ、　Ｋ
。

ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ムｃａｄ−Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ％ｌｌ、　４１７４（１９７６））で財団法人［発酵
研究所（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　Ｆｏｒ　　Ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ−０ｓａｋａ　　）　にＩｌｉ’０−１
４１７１として寄託もされている。

本発明のＤＮＡＫよる宿主の形質転換は、例えば公知の
方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ−Ｎ、ら、Ｐｒｏａ−Ｎａｔｌ−
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９，２１１０（１９７２））によシ
行う。

このようにして得られた宿主をそれ自体公知の培地で培
養し培養物中に一般式 ％式％ ） 〔式中、Ｙは（ａ）水素、　（ｂｊ　Ｍｅｔまたは（ｃ
）　Ｍｅｔ　ＬｙａＴｙｒ　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙ
ｒ　　Ｉｌｅ　　ムｌａ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ
Ｃｙｅ　工ｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｙ　〕で表わされる化合物を生成蓄積せしめ
、これを採取することによシ化合物（■′）を製造する
ことができる。

培地としては、例えばグルコース、カサミノ酸を含むＭ
９培地（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　４３
１−４３　：ａ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈｏｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７
２）〕が挙げられる。ここに、必要によジブロモ−ター
を効率よく働かせるために、九とえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加える゛ことができる。

培養は通常１５〜４３’Ｃで３〜２４時間行ない、必要
によシ、通気や攪拌を加えることもできる。

λｃＩリプレッサーと、ＰＬプロモーターを含有する発
現ベクターとを有する組み□換え体を使用する場合には
、培養は約３０℃〜３６℃の低温で行い、λＣエリプレ
ッサーの不活化は約３７℃〜４２℃で行うのが好ましい
。

墳養後、公知の方法で菌体を集め、緩衝液に懸濁させ先
後、たとえば超音波処理、リゾチームもしくは凍結・融
解またはこれらの組合わせなどの方法〔たとえば、Ｇｕ
ｎｓａｌｕｓ、　”Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆＥｎｚ
ｙｍｅ　ｆｒｏｍ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ“、
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１　、
５１　（１９５５）　）で菌体を破壊し、遠心分離によ
シ上澄みを得る。

該上澄みからのヒ）Ｉ−工Ｆの単離は、通常知られてい
る蛋白質の精製方法にしたがえばよい。

本発明によシ製造されるニーＩＦまたはそれと等価の免
疫学的または生物学的活性を有するポリペプチドは従来
の方法で製造されたＩ−ＩＰと同等の免疫学的ならびに
生物学的活性を示し、これと同様の目的に同様の用法に
よシ使用することができる。

ｌ−１１ｉ’は、抗ウィルス、抗膿逼、細胞増殖阻害。

免疫抑制作用を有する。当該化合物は、滅菌水。

ヒト血清ア〃プミン（）［８Ａ）、生理食塩液など自体
公知の無菌性の製剤学的に許容しうる担体と混合して、
経口投与もしくは局所に適用できる。このＩ−ＩＦの１
日投与量は、静脈注射の場合は成人で約１０ミリオン単
位（Ｍ、　Ｕ、　）〜１００Ｍ、Ｕ、、好ましくは約５
０　Ｍ、　Ｕ、〜６０Ｍ、σ、である。このＩ−ＩＦ製
剤は、塩類、賦形剤、補助剤、上記と異なる担体、緩衝
液、結合剤、界面活性剤、保存剤など製剤学的に許容し
うる添加剤を含有していてもよい。注射剤は、水もしく
はそれ以外の製剤学的に許容しうる液との燕菌性溶液ま
たは懸濁液のアンプルとして使用に供され、また黒画粉
末製剤（エーエＦ溶液を凍結乾燥するのが好ましい。）
をアンプルに充填しておき同時に製剤学的に許容しうる
液で希釈するようにしてもよい。

本発明の製剤は、さらに、リンパ球や線維芽細胞由来の
インターフェロンなどＩ−工Ｆと配合できる作用物質を
ニーＩＦ量のＦＪｌ−９９％の範囲で含有していてもよ
い。

以下に実施例を挙けて本発明をよシ具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ （１）　　ニーＩＦをコードするｍＲＮＡの分離ヒト末
梢血よシ調製したリンパ球を１２−０−テトフデカノイ
〜ホルボー／Ｉ／−１３−アセテート（ＴＰＡ　）　（
１５ｎｇ／ｍｌ　）とコンカナバリンＡ（４０ｔｔｇ、
　７’ｄ　）を含むＲＰＭニー１６４０培地（１０％の
牛胎児血清を含む）で３７℃培養し、Ｉ−ＩＦを誘導さ
せ九、２４時間後、この誘導したＩ　Ｘ　１０”個のヒ
トリンパ球をチオグアニジン変性溶液（５Ｍグアニジン
チオシアネート、５９６メルカブトエタノール、５０　
ｍＭＴｒｉｓ４ｔｃ１ｐＨ７，６、１０ｍＭ口■）中テ
テフロンホモゲナイザーによって破壊変性した後Ｎ−ラ
ウロイリ〜ザｐコシン酸ナトリウムを４５１になるよう
に加え、均質化した混合物を５．７Ｍｊｆｉ化セシウム
溶液（５，７Ｍ塩化セシウム、０．１Ｍエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ　）　）　ＳｓＪ上に重層し、ベッ
クマン８１２７のローターを用いて１５℃で２４００Ｏ
ｒｐｍ３０時間遠心処理を行い、ＲＮＡ沈澱を得九。

このＲＮ＊沈＃ｔＯ，２５＊Ｎ−ラウロイルザルコシン
酸ナトリウム溶液にとかし先後、エタノールで沈澱させ
、８．３岬のＲＮＡを得た。このＲＮＡを高塩溶液（０
，５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌｐＨ７，
６、１ｍＭＥＤＴＡ　、　ＯＪ％ＳＤＳ　）中でオリゴ
（ｄＴ）七μロースカフムに吸着させ、ボ！Ｊ　（Ａ）
を含むｍＲＮＡを低塩溶液（１０ｍＭＴｒｉａ−ＨＣｌ
・ｐＨ７，６、１ｍＭＥＤＴＡ、　０Ｊ９６ＳＤＳ　）
で溶出させることによ）、ボ！Ｊ　（Ａｌを含むｍＲＮ
Ａ　７００μｇを分取した。

このｍＲＮＡを更にエタノ−〜で沈澱させ、０．２１Ｂ
／の溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７，６、２ｍ
ＭＥＤＴＡ　。

０．３％ＳＤＳ　）に溶かし、６５℃で２分間処理して
ｌＯ〜３６％蔗糖密度勾配遠心処理（ペックマン５Ｗ２
７のローターを用いて２０℃、２５０００ｒｐｍで２１
時間遠心分離）することにより分画化して２２分画を得
た。この各分画につきＲＮＡの一部ずつを、アフリカッ
メガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白質中のイ
ンターフェロン活性〔ヒト単膜由来Ｗ工ＳＨ細胞に対す
る水泡性口内炎ウィルス（ｙｓｙ）の細胞変性効果阻止
試験を用いて測定した抗つ４ｙｖス活性（Ｓｔｅｗａｒ
ｔ、Ｗ、　Ｅ、　Ｔｈｅ　Ｉｎ　−ｔｅｒｆｅｒｏｎ　
Ｓｙｓｔｅｍ、　１１−２６　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒ　−１μｇ、ｌｉｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９）　
）を測定し、分画１２（沈降定数Ｓ値は１２−１４８を
示した）に１９５ユニット／μｇＲＮＡ（ユニツ）ハ国
１１１１１Ｆｊ１位）の活性を検出した。このようにし
て得た分画１２のｍＲＮＡは約２０μｇであった。

（１１）単鎖ＤＮＡの合成 上記で得九ｍＲＮムおよび逆転写酵素を用い、ｉｏｏμ
ｌの反応ｆ＆（５μｇのｍＲＮＡ、　５０１１ｇオリゴ
（ｄＴ）ｊ１００ユニットの逆転写酵素、１ｍＭずつの
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ　、　８
ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１ｇ　。

５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭジチオスレイト−〜、６０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，３）中で４２℃、１時１
司インキユベートした＆Ｋ、フェノ−Ｎで除蛋白し、０
．ＩＮのＮａＯＨで７０℃、２０分処理してＲＮＡを分
解除去し九・ （ｉｉｉ）二重ＩＩ　ＤＮＡの合成 ここで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０μｌの反応液
（ｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ反
応液）中で４２℃、２時間反応させることによシニ重鎖
ＤＮＡを合成した。

（ｉＶ）　ｄＣテイルの付加 この二重鎖ＤＮＡにヌクレアーゼ＄１を５０１１１の反
応液（二重ｇＤＮＡ、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４，
５、０，２５Ｍ　ＮａＣ１，１，５ｍＭＺｎＳＯ４，６
０ユニツトのＳｔヌクレアーゼ）中で室温３０分間作用
させ、フェノ−〜で除蛋白し、エタノ−〜でＤＮＡ　全
沈澱すせた後、これにターミナルトフンスフエフーゼを
５０μ４の反応液（二重鎖ＤＮＡ、０．１４Ｍカコジル
酸カリ０．３　ＭＴｒｉａ　（塩基）ｐＨ７，６，２ｍ
Ｍジチオスレイト−／Ｌ’　、　１　ｍＭｃｏ　ｃｌ、
　、　ｏ、　１５　ｍＭｄｃＴＰ。

３０ユニツトターミナ〜トランス７エヲーセ）中で３分
間３７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの３′両端に約２０個
のデオキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反
応で約３００■のデオキシシチジン鎖をもった二重鎖Ｄ
ＮＡを得た。

（Ｖ）　　大−菌プフスミドの開裂ならびにｄＧテイル
の付加 一方、１０〜の大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡに
制限酵素ＰｓｔＩを５０μｍの反応液〔１０μｇｐＢＲ
ａ　２２　ＤＮＡ、５０ｍＭＮａＣ１，６ｍＭＴｒｉｓ
・ＨＣｌ（ｐＨ７、４）　、　６　ｍＭＭｇｃ１２，６
ｍＭ　２−メルカグトエタノール、１００μｇ／ｓｔ牛
血清ア〜グミン、２０ユニツトのＰａｔＩ　）中で３時
間３７℃で作用させて１）ＢＲａ　２２　ＤＮＡ中に１
ケ所存在すルｐｓｔｒＭ織部位を切断し、フェノールで
除蛋白した後、ターミナルトフンスフェヲーゼを５０μ
ｌの反応液（Ｉ）ＮＡ１０μｇ、０．１４Ｍ４Ｍカコジ
ルリ、０．３ＭＴｒｉｓ（塩基）ｐＨ７，６、２ｍＭ　
ジチオスレイトール、１ｍＭｃｏ　Ｃ１２，０，１６ｍ
Ｍ　ｄＧＴＰ、　３０ユニツトターミナ〜トランスフエ
フーゼ）中で３分間３７℃で作用させ上記プラスミドｐ
ＢＲａ　２２　ＤＮＡの３′両端に約８個のデオキシグ
アノシン鎖を延長させた。

（Ｖｉ）　ＣＤＮＡの会合ならびに大腸菌の形質変換こ
のようにして得られた合成二重鎖ＤＮＡ　０．１ｇｇと
上記プラスミドｐＢＲ３２２０，６ｆｉｇを０．１ＭＮ
ａＣ１。

５０　ｍＭＴｒｉｓ・ＨｃｌｐＨ７，６、１ｍＭＥＤＴ
Ａよりなる等液中で６５℃、２分間、４５℃、２時間加
熱しその後除冷して会合させ、　Ｅｎｅａらの方法〔Ｊ
９Ｍ０１゜Ｂｉｏｌ、　９６　、４９５　（１９７５）
　：）に従って大腸菌χ１７７６を形質転換させた。

（Ｖｉｉ）　　ｃＤＩム含有プフスミドの単離こうして
約８５００のテＦフサイクリン耐性株が単離され、これ
ら各々のＤＭＡをニトロセμロースフイｙｐ−上に固定
し＆、　（：　Ｇｒｕｎａｔｅｉｎ＋Ｍ、　ａｎｄ　Ｈ
ｏｇｎｅａｓ＋　Ｄ、Ｓ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ　、
　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７２．３９６１　（１９７５）　
）一方、Ｄ、Ｖ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　　らの報告（Ｎａ
ｔｕｒｅ　＋２９５．５０３（１９８２））のニーＩＦ
のアミノｌをもとにしてアミノ酸Ｎａ１−５　（Ｃｙｓ
・Ｔｙｒ−Ｃｙｓ・Ｇｉｎ−Ａｓｐ　）及びアミノ酸肖
７？−８２（Ｌｙｓ−Ｇｌｎ・ＡＢｐ−Ｍｅｔ−Ａ２Ｂ
・Ｍｏ１）より推測できる塩基配列Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ、Ｕ８Ａａ　７５　＋　５７
６５（１９７８）’）を用いて化学合成した。このオリ
ゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチドカイネー
スを用いて５０μｌの反応液（゛オリゴヌクレオチド０
．２＃ｇ　、５０　ｍＭＴｒｉｓ・Ｈｃｌ　　ｐＨ８，
０、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０　ｍＭメルカプトエタ
ノール、５０μＣ１γ−”２ＦＡＴＰ、　３ユニツトで
４ポリヌクレオチドカイネース）中で１時開３１で反応
させ、５′末端を３２Ｆで標識した。この標識されたオ
リゴヌクレオチドをプローブとしてＬａｗｎらの方法〔
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９．６１０
３　（１９８１））に従って上記のニトロセ〃ロースフ
イμター１に固定したＤＮＡに会合させ、オートラジオ
グツフィーによって上記二種類のオリゴヌクレオチドデ
ローフ′に反応する菌株を４１１単離した。これらの菌
株の各々の菌体から１フスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉ
ｍ、　Ｈ，Ｃ，＆　Ｄｏｌｙ＋　Ｊ、の方法（ｊｌｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、＋１．１５１３　（１
９７９））によって単離し友。次にグラスミドＤＮＡの
挿入部を制限酵素ＰｓｔＩ　Ｋｌや切り出し、分離した
グラスミドのうちでその挿入部の長さの最も長い断片を
含むものをえらび、このグラスミドをｐＨＩＴ　３７０
９　　ト名ずけた。

このグラスミドの制限酵素地図を第１図に示す。

次にこのｐＨＩＴ　３７０９　　グラスミドに挿入され
たｃＤＮＡ配列の一次構造（塩基配列）をジヌクレオチ
ド合成鎖停止法とＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの方法に
よって決定した。その−次構造は第２図の通りであった
。

この−次構造は、Ｇｒ　ａｙ　らによって報告され喪Ｃ
Ｎａｔｕｒｅ、　２９５．５０３−５０８　（１９８２
）　ｌ）■−１１ｉ’ｃＤＮＡの一次構造とは一ケ所、
アミノ１ｌ１４ｘ１４００Ｇｌｎを規定しているＣＡＡ
がＣＧムに変っているがそれ以外は一致し喪。この塩基
配列から規定される蛋白質は蛋白合成の開始信号である
ヌクレオチド陽３０のＡ’Ｌ’Ｇコドンより始って１６
６個のアミノ酸よりなることが推定され、そのうち最初
の２０個は恐らくシグナルペプチドと考えられる。

アミノ酸配列もＧｒａｙらの報告し九Ｉ−ＩＮＦとは１
ケ所違ってお）アミノ酸翫１４０のＧｌｎがＡｒｇに変
っている。

ま九上記−次構造から、このグラスミドはエーエＦ蛋白
質をコードする部分を全部持っていることがわかる。こ
の事実はこのグラスミドに挿入され友ＤＮＡ配列を他の
発現グラスミドに移すことによって、大腸菌などの宿主
に免疫インターフェロンを生産させうろことを示してい
る。

実−例２ ５Ｊ！施例１で得たグラスミドｐＨＩＴ　３７０９の挿
入部をヌクレオチド＆ＩＱＱより制限酵素Ｂｓ　ｔＮＩ
で切り出し、（第２．３図参照）、生じたのりしろ部分
をＩ）ＨＡポリメフーイエラージフフグメント（りＶノ
ーのＤＮＡポリメフーゼエともいう）でうめたのち、前
述したトリエステル法によって化学合成した蛋白合成開
始コドンＡＴＧを含むオリゴヌクレオチドアダプター ＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡ
ＣＡＡＴＧＡＣＧＧ をＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼで結合させた。

一方、発現グラスミドとして大腸菌のトリプトファン合
成のプロモータ一部分（プロモーター、オペレーターを
含むＤＮＡ断片、２７６塩基対）を含むプラスミドｐｔ
ｒｐ　６０１　（ベクターはｐＢＲ３２２）をＢｅｎｎ
ｅｔｔ、　Ｇ、Ｎ、らの方法テＣＪ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ−＋　１２１．１１３　（１９７Ｂ
）　）構築した。

このグラスミドｐｔｒｐ　６０１を制限酵素Ｃ１ａ工で
切断し、上記アダプターを結合させたＸ−ＩＦ遺伝子を
トリプトファンプロモーターの下流に挿入してＴ４ＤＮ
Ａ！Ｊガーゼを用いて結合させ、■−エＦ発現プフスミ
ドｐＨ工Ｔ−ｔｒｐ３０１　　を構築する。（第３図） このプラスミドｐＨＩＴ−ｔｒｐ　３０１を用いてＣｏ
ｈｅｎらの方法〔前出〕に従って、大腸菌２９４を形質
転換させることＫより、このプラスミドを含む菌株を得
ることができる。

実施例３ 実施例２で得られるニー１Ｆ発現デフスミドを含む菌株
を０．５％グルコース、０．５襲カザミノ酸を含むＭ９
培地で３７℃、６時間培養した後、菌体を集め０．０２
Ｍリン酸緩衝液ｐＨｓ、ａ　、　０．１５　ＭＮａＣ１
溶液に懸濁させたのち、超音波処理で菌体を破壊し、遠
心分離により上澄を得る。この上澄液のインターフェロ
ン活性は前記の方法で測定できる。

実施例４ 実施例２で得られたＩ−工Ｆ発現プラスミドｐＨＩＴ　
−ｔｒｐ　３０１を含む菌株を０．５％グルコース。

０．５襲カザミノ酸を含むＭ９培地で３γ℃、６時間攪
拌しながら培養した後、インドールアクリル酸を最終濃
度が２０μｇ／ｄになるように加え、さらに３’１．３
時間攪拌しながら培養を続けたのち１０ＩＩｔを分取し
、この試料を遠心分離にかけて菌体を集め、５０　ｍＭ
　Ｔｒｉｏ　ｐＨ７，６の１０％シヨＩＩ溶［Ｑ、１−
に再懸濁した。これをドライアイス／エタノール浴上で
すばやく凍結させ、次いで２０℃で融解させたのち、水
浴に移して！１ａｃ１　。

ＥＤＴＡ　、スペルミジン、リゾチームをそれぞれ最終
濃度１０（ｌａＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２００μｇ／
ｓ？になるように加え、４５分後に３０℃、２分間イン
キュベートした。懸濁液の粘度が増したことで、溶−が
確認された。次にこの溶１ｌｌＩ液を遠心分離にかけて
菌体残渣を除去し、得られ九上ｆｆ液の工−工Ｆ活性を
前記の方法て゛測定した結果は１２８０ユニット／−一
体抽出漱であった。

下記実施例はλＰＩ、　　プロモーターと本発明の■−
ＩＦをコードするＤＮＡとを用いたエーエＦ＠現を説明
するものである。

実施例５ ＡＰＬプロモーターを含む３５０塩基対（ｂｐ）断片を
単離す逅めに、λＣ工８５７８ａｍ　７ＯＮＡ（Ｍｌｅ
ｓ研究所）２５０μｇをＢａｍＨＩ　およびＢｇｌＩ［
制限エンドヌクレアーゼで消化してアガロ−スゲルミ気
泳動にかけ、ＡＰＬプロモーターを含有する１　２００
　ｂｐ断片を単離した（第４図参照）。

次に１この１２００ｂｐ　断片をＨｐａＩ　　Ｋよる完
全消化およびＨｌ　ｎｆ工による部分消化に付し九のち
５％ポリアクリルアミドゲルで３５０　ｂｐ断片を単離
し友。このＨｐａ　Ｉ消化によシ目的の断片に混入する
おそれのある２個のＨｌｎｆ　Ｉ　部分消化断片（約３
５０ｂｐ）が除去された。

上記３５０ｂｐ断片にはＰＬ−プロモーターおよびλｃ
Ｉ　リグレッサーを結合する○Ｌオペレータ一部位（Ｏ
Ｌ□”　Ｌ２　”　Ｌ３　）が含まれる。

λＮ−遺伝子のＳＤ（シャイン　アンドダルガーノ）配
列とこのに一遺伝子を規定する開始コドンとの間に存在
するＨｉｎｆ工部位（第４図参照）は大ｌ＆ＩＮで異種
遺伝子を発現させる／１イブリッドリボゾーム結合部位
を構築せしめる。このＨｌｎｆ　Ｉ部位をＫｃｏＲ工部
位に変えてもよい。

ＷｃｏＲ工に隣接したＢｇｌｌＩ　部位を含むｐＢＲ３
２２の誘導体であるプラスミドｐＲＣＩ　（第５図参照
）をＷｃｏＲＩおよびＢｇｌ　Ｍで消化し九のち、これ
に上記３５Ｑｂｐ　Ｂｇｌｌ［−Ｈｌｎｆ　Ｉ　ｖ＃片
をクローニングし得られる組み換えプラスミドをｐＲｃ
１４と名すけた。′ｓ！１５図は連結末端の配列、ベク
ターＥｃｏＲＩ末端とＨｌｎｆ　Ｉ断片末端との連結方
法およびＥｃｏＲ工部位の再構築を示す（第５図中の■
は、ｉｎ　ｖｉｖｏでｆｉｌｌ−１ｎされたことを示す
）。

同様にしてＰＬグロモーターを用いて上記以外の数種の
発現ベクターを構築した（第６図、第７図、第８図およ
び第９図）。ｐＲＣ１５は上記の３５０ｂｐ　Ｂｇｌ　
ｌｌ−Ｈ１ｎｆ工断片に加えλ　ｉｎｔ遺伝子のＳＤ配
列を含む５５塩基対断片Ｍｉｎ　ｆ　（−Ｍｂｏ工〕）
を含む（第６図および第７図参照）。発現ベクターｐＲ
ｃ２１およびｐＲＣ２２はそれぞれｐＲｃ１４およびｐ
Ｒｃ１５と類似している。これらのグフスミドは、挿入
されるｐＬ’７’９モーターを含有している断片の向き
、すなわち転写の方向がそれぞれ異なっている（第８図
参照）。ｐＲＣ２３は、′コンセンサス″’ＲＢＳ（リ
ホ゛ンームパインデイングサイト）　（５ｃｈｅｒｅｒ
ら＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
　、　８．３８９５　（１９８０）　）を含有する合成
オリゴヌクレオチドを、ＰＬ　　プロモーターを含む２
５０ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｍ−Ｈａｅ　Ｉ断片に結合させ、次
いでこの結合産物をｐＲ０２に挿入することによシ構築
した。（第９図参照）。

次いで、前記実施例１のブフスミドｐＨＩＴ３Ｔ０９か
ら得られるエーエＦ遺伝子を含有するＰＬ−発現ベクタ
ーが、下記実施例に示されるようにして構築された。

実施例６ ９００　ｂｐ　　ＢｓｔＮ工断片（これにはエーエＦの
Ｖブナμ部分を規定する配列および推定される５Ｂ■■
■蛋白質の最初の３個のアミノ酸を規定するコドンは存
在しない）をエーエＦをコードする４３０ｂｐ　Ｏ配列
およびゴ側の非翻訳領域４７０ｂｐを含むプラスミドｐ
Ｈ工Ｔ　３７０９から単離した３　１ｍの欠損している
コドンを挿入し、絞み始めＭｅｔコドン管付与するため
に、オリゴヌクレオチドを合成し、９００ｂｐ断片じ、
結合させた。（４１０図参照）。

この合成し友断片を用いて両末端のＢａｔＮＩをＥｃｏ
ＲＩに変換し喪。得られた断片をＥｃｏＲＩで消化し九
ベクターｐＲ０２’ｌにクローニングした。挿入断片の
方向性は、３′側の非翻訳領域を切断するＢｇｌ　Ｉを
用いる制限分析によシ決定した。

エーエＦ遺伝子を含むＰＲＣ２２ベクター（ｐＲＣ２２
／ＩＦＩ　９ＱＧと表わす）のプロモーター−遺伝子連
結部位の配列を決定することにより、結合がすべて予想
通）Ｋ行われたことが確認された（第１０図参ｗＡ）。

次にＩ−ＩＦ遺伝子の発現について試験を行った二―株
ＲＲＩ　（ｐＲＫ　２４８ｃ工ｔ８＋　ｐＲＣ２２／Ｉ
Ｆニー９００）をＭ９−グルコース培地で３０しで３−
４×１０　細胞／ｓＺＫなるまで培養した後、グルコー
ス、カザミノ酸を濃度がそれぞれ１．０％、０．５％に
なるように加えて４２０で１時間銹発させ九のち、１０
ｄを分取した。この試料を遠心分離Ｋかけて菌体を集め
、５０　ｍＭ　Ｔｒｉ８（ｐＨ７，４）−１０％シｇ糖
溶液０．１ｍＫ再懸濁させた。これをドライアイス／エ
タノール浴ですば中く凍結させ、次いで２０℃で融解さ
せたのち、水浴に移してＮａＣ１。

ＥＤＴＡ　、スベμミジン、リゾチーふをそれぞれ１０
０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、　　２００μｇ／−にな
るように加え、４５分後に３７℃で２分間インキュベー
トした。次にこの懸濁液を遠心分離にかけて菌体残渣を
除去し、得られた上澄液のエーエＦ活性を前記の方法で
測定したところ、１２８０ユニット／ｄ菌体抽出液であ
った。

誘発のキネティックスをしらべるために、次の誘発条件
で上記の手順をくり返し九。誘発条件は、対照では３０
℃であり、１験系では４２℃で３０分、６０分、９０分
、１２０分および１８０分であつ九。結果はＷＮ２表に
示される通り、３０℃では活性を全く示さず、４２しで
誘発すると活性は９０分付近で量大に達し、その後論々
に減少した。

！２表 ４２°−３０’　　　　　　１２０ ４２°−６０’　　　　　　＋２０ ４２°−９０’　　　　　　３２０ ４ダー１２０’　　　　　　１６０ ４２°−１８０’　　　　　　４０ 寮施例７ ｐＲ０２２／ｒＦＩ−９００ＤＮＡをＥｃｏＲＩでさら
に消化してｌ−４Ｆ　遺伝子を含む９００ｂｐ断片を単
離し、ＥｃｏＲＩで消化したＰＲＣ２３に挿入して（第
１１図参照）、ｐＲＣ２３／工ＦＩ−９００を構築し念
。これは、ｐＢＣ２２／工ＦＩ　中のものとは顕著に異
なるＲＢＳを有している（第１０図と第１１図を比較せ
よ）。■−ＩＦｉＩｌ伝子の発現について試験を行なっ
た；―株ＲＩＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ、ｐＲＣ２３
／ＩＦニー９００）をＭ９−グルコース培地で３０℃で
菌体濃度が３−４Ｘ１０　　細胞／ｄになるまで培養し
た後、グルコース、カザミノ酸を濃度がそれぞれ１．０
％、０．５％になるように加えて４２℃で１時間誘発さ
せたのち、１０ｓ／を分取した。この試料を遠心分離に
かけて菌体を集め、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，
４）のｌ０ＩＶヨ塘溶＊０．１−で再懸濁させた。これ
をドライアイス／エタノール浴ですばやく凍結させ、次
いで２０℃で融解させたのち、水浴に移してＮａＣ１，
ＥＤＴＡ、　　スペルミジン、リゾチームをそれぞれ１
００ａ＋Ｍ、１０ｍＭ。

２０ｍＭ、２００μｇ／ｓｌになるように加え、４５分
後に３７℃で２分間インキュベートした。次にこの懸濁
液を遠心分離にかけて菌体残渣を除去し、得られた上澄
液のエーエＦ活性を前記の方法で測定した。大腸菌株Ｒ
ＲＩを形質転換させた場合、ｐｌ’？　Ｃ２３／工Ｆ工
は、ｐ　ＲＣ２２／　Ｉ　Ｆ工の約４倍のニーＩＦ活性
を発現した（第３表参照）。

ｔＪ！、３表 実施例８ ｐＲＣ２３／工１ｉ’■全１ｉ’■位のうち１部位のみ
を切断するようにＥｃｏＲＩ　で消化し、得られる分子
をＰ　ｏ　１　工“Ｋｌｅｎｏｗ”で処理してＥｃｏＲ
工末端にうめ、ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｓを、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを作用させて連結させたのちＲＲＩ（ｐＲＫ２４
８’ｃ工ｔｓ）を形質転換させ次。エーエＦ遺伝子の開
始部位にあるｇｃｏＲ１部位を欠損している組み換え体
をスクリーニングし、陽性のものが２個得られ友。その
１つをｐＲｃ；Ｊｌ／工Ｆニー９００と名ずけた。これ
は大腸菌菌株ＲＲＩ　を形質転換させ、エーエＦ　を発
現するのに有用である。エーエＦ遺伝子の発現について
試験を行ったｚＩ１株ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ、
ｐＲＣ２３１／ＩＦＩ−９ＱＱ）をＭ９−グルコース培
地で３０℃で菌体濃度が３−４　Ｘ　１０８細胞／ｄに
なるまで培養した後、グルコース、カザミノ酸を濃度が
それぞれ１．０％、０．５５Ｇになるように加えて４２
ｔで１時間誘発させたのち、１〇−を分取した。この試
料を遠心分離にかけて菌体を集め、５０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｏ（ｐＨ７，４）の１０％Ｖヨ糖溶液０．１　ｓ／で再
懸濁させた。これをドライアイス／エタノール浴ですば
やく凍結させ、次いで２（１で融解させたのち、氷浴に
移してＮａＣ１，ＥＤＴＡ。

スペルミジン、リゾチームｔそれ（’れ１００ｍＭ。

１０ｍＭ、２０ｍＭ、２００μｇ／ｄになるように加え
、４５分後に３７ｔで２分間インキュベートした。

次にこの懸濁液を遠心分離にかけて菌体残渣を除去し、
得られた上澄液のエーエＦ活性を前記の方法で測定し−
た。

結果を１訂出の第３表に示す。

上記のｐＲｃ２３／工Ｆ工を改良して、リンカ−領域を
５ｂｐから１０ｂｐ　Ｋ伸長させた。エーエＦの場合に
は、Ｉ−ＩＦの発現には６ｂｐの距離が１０ｂｐよりも
適していると思われる。

実施例９ 本発明により得られるとトエーエ？は、たとえば次に述
べる手段で精製することができる。

精製手段はすべて低温で行うのが好ましく、とくに室温
以ＦさらＫは約４℃で行うのが望ましい。

実施例４で得られる上澄液などのニーＩＦ含育物を３ミ
クロン次いで０．２２ミクロンのＮａ１ｇｅｎｅフィル
ターで連続して濾過できる。次の精製工程は弱陽イオン
交換樹脂を用いる高速液体クロマトグラフィーカラムを
使用して効率よく行うことができる。九とえばＣＭ２Ｏ
０樹脂＋　ｌ　Ｏｍ　　（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ工ｎｄ
ｕｓｔｒｉｅｓ）を２５ａ１１×内径０．４６ｃｍカラ
ムに充填したのち、２ＭＫＣｌで洗浄し、次いで２４ｍ
Ｍリン酸塩緩ｆＩｆＩ液ｐＨ７，５または蒸留、脱イオ
ン水（この手段を行う間中使用される）で半島にし、０
．２２ミクロンのフィルターを通過したか故を等量の水
で希釈し、これを０Ｍカラムにポンプを用いて１．５　
ｗｔ／分で通過させる。ついでカラム流出物中の蛋白質
が、カラムのオート　モニタリングによりフμオレヌカ
ミンで測定されるバックグフウンド濃度まで低下するま
で、カラムを２５ｍＭリン酸カリウふｐＨ７，５で洗浄
したのち、２５ｍＭリン酸カリウＪ−緩衝液ｐＨ７，５
におけるＫＣＩの濃度勾配（０〜１Ｍ）Ｋより０．５　
ｄ　／分で溶出する。

このようＫして０Ｍカラムから得られた活性分画を集め
、前もって洗浄しであるＣＦ２５フイルター　コーン（
Ａｍ１ｃｏｎ　　Ｃｏｒｐ　、　）上で濃縮する。

この濃縮液（Ｑ、！Ｍ以下）を前もって千両にしてに注
入し、次いで０．３　ＭＫＣｌ、　２５　ｍＭリン酸カ
リウムｐＨ７，５で２４ｄ／分で溶出し、１分間隔で分
画を分取する。インターフェロン活性と蛋白質のピーク
は一致する。本処理によシ、１つまたはそれ以上の分Ｉ
１ｍ（出発原料や前段階の手段の効果に依存する）Ｋ単
一なエーエＦが得られる。必要により、不純物を含む一
分は濃縮とＴＳＫもしくは０Ｍカラムによるクロマトグ
ツフィーをくり返すことにより単一化することができる
。

本発明によす、経済的にヒト免疫インターフェロンまた
はそれと等価物を製造することができ、該インターフェ
ロンは抗ウィルス剤や抗腫瘍剤などとして有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１（Ｖｉｉ）で得られたブフスミドｐＨ
ＩＴ３７０９０制限酵素地図を表わし、Ｚ窪Ｚ部分Ｖｉ
シグナルペプチドと考えられるペプチドをコードする部
分を示し、５はＩ−ＩＦポリペプチドをコードする部分
を示す。第２図は実施例２（Ｖｉｉ）で得られたｐＨ工
Ｔ３７０９グフスミドの一次構造（塩基配列）を、第３
図は実施例２の構築図をそれぞれ表わす。第４図はＰＬ
プロモーターを含有する１　２００　ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉ
ｆ−ＢａｍＨ工断片の帳地図である。第５図は３５０ｂ
ｐ上にあるヲムダＰＬプロモーターを含有する発現ベク
ターｐＲＣ１４の構築図である。第６図Ｆｉ発現ベクタ
ーｐＲｃｉ５の構築に使用され九バクテリオファーシフ
ムダ　ｉｎｔ遺伝子のＳＤ配列を含有する８２ｂｐ断片
の単離を示し、第７図は発現ベクターｐＲｃ１５の構築
図である。第８図は発現ベクターｐＲＣ２１およびｐＲ
Ｃ２２の構築を、第９図はｐＬプロモーターと合成′Ｒ
ＢＳからの発現ベクターｐＲＣ２３の構築をそれぞれ示
している。第１０図は免疫インターフェロンをコードす
る遺伝子の発現ベクターｐＲｃ２２への挿入およびＰＬ
プロモーター−遺伝子連結部位の配列を示し、第１１図
は免疫インターフェロンをコードする遺伝子の発現ベク
ターｐＲｃ２３への挿入およびＰＬプロモーター−遺伝
子連結部位の配列およびその改良を示す。 ＋１Ｌ　　　（Ｊｅ　　　　　　　　　ｆｌ（リ　　　
　　　　　　　　　　・０＄５図 各 ロニ：ＴＴＡＡ　　　　″”°”“− ＧＡＧＧＡ　−’Ｌ −＋ＱＪＴＴＣＴＣＣＴ　− −ＣＴＴＡＡＧＡＧＧＡ　−” 竿　６　図 入ｃ１８５７　Ｓａｍ７　ＤＮＡ　［ｄｏｍ−］−４９
０ｏｏ　ｂｐＩｓｏｌａｔｅ　　ｌｓｏ　−２２０ｂｐ
　　ＹＡＫ・り７１１ｓｏｌｏ↑ｅ　　８２ｂｐ　　Ｈ
ｉｎｆ［−１−１ａｅｌＩ　７５７メント↓ ｉｎｆ　Ｔ−ＴＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡ
丁Ｇ　−Ｈｏｅ　ＩＩ第１頁の続き ｏＩｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号（Ｃ
１２Ｎ　１５１００　　　　　　　　　　　　　−Ｃ１
２Ｒ１／１９　）　　　　　　　　　　　６７６０−４
８（ＣＩ２Ｎ　　１１００　　　　　　　　　　　　　
−Ｃ１２Ｒ１／１９　）　　　　　　　　　　　６７６
０−４８（ＣＩ２　Ｐ　２１１０２　　　　　　　　　
　　　　−Ｃ１２Ｒ１／１９　）　　　　　　　　　　
　６７６０−４Ｂ優先権主張　＠１９８２年７月１２日
■米国（ＵＳ）■３９７３８４ ０発　明　者　塚本恭造 豊中市上野東１丁目９番１の４０ ２号 ０発　明　者　黒用勉 川西市水明白１丁目１番地の５０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）一般式 ％式％ （） 〔式中、ＸはＴＡＡ、　ＴＧＡまた１ｉＴＡＧを示す〕
   で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ。 ＋２）　　５’末端に （５’）　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＡＣＡ　ＡＧＴ　
   ＴＡＴ　ＡＴＣＴＴＧＧＣＴ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　ＣＴＣ
   ＴＧＣＡＴＣＧＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＴＴＣＴ　ＣＴＴ　
   ＧＧＣ（３’）を有することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載のＤＮＡ０ （３）　　５’末端にＡＴＧｆ：有することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ０ （４）　　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　
   Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　ＶａｌＬｙｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌ
   ｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙａ　Ｌｙａ　ＴｙｒＰｈｅ　
   Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖ
   ａｌ　ＡｌａＡｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ
   　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｌ１ｅＬｅｕ　Ｌｙｅ　Ａ
   ｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙ８Ｑｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ
   Ａｒｇ　Ｌｙａ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇ
   ｌｎ　Ｉｌｅ　ＶａｌＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ
   　Ｌｙａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙａ　ＡｓｎＰｈｅ　Ｌ
   ｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌ
   ｎ　Ｌｙ８Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　
   Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＭｅｔＡｓｎ　　Ｖａｌ　　
   Ｌｙａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　　Ａａｎ　Ｓｅｒ　　Ａａｎ
   　ＬｙａＬｙ８　Ｌｙｅ　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ａｓ
   ｐ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　ＬｅｕＴｈｒ　
   　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　
   Ａｓｐ　Ｌｅｕ　　ＡｓｎＭａｌ　　Ｇｌｎ　　Ａｒｇ
   　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ｈｌｓ　　Ｇｌｕ
   　　Ｌｅｕｌｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　
   Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。 Ａｌａ　　Ａｌａ　Ｌｙａ　　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙａ
   　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　　ＡｒｇＳｅｒ　　Ｇｌｎ　　Ｍｅ
   ｔ　　Ｌｕｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ
   　　ＡｒｇＡｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ で表わされるポリペプチドをコードすることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜第３項記載のＤＮＡ０ （５）　　免疫インターフェロンポリペプチドと等価の
   免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドをコ
   ードすることを特徴とする特ｉｆＦ請求の範囲第１項〜
   第３項記載のＤＮＡ０ （６１Ｍｅｔ　Ｃｙａ　Ｔｙｒ　Ｃｙａ　Ｇｉｎ　Ａａ
   ｐ　Ｐｒｏ　ＴｙｒＶａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　
   Ｇｌｕ　Ａａｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　ＬｙｓＴｙｒ　Ｐｈ
   ｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌａ　Ｓａｒ　Ａｓｐ
   　ＭａｌＡｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌ
   ａｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＩＩｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ
   Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＡａ
   ｐ　　ｋｒｇ　　Ｌｙａ　１１ｅ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｎ
   　　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　　ｌ１ｅＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ
   　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＬｙｓＡ
   ｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓ
   ｅｒ　　ＩＩｓ　ＧｌｎＬｙｅ　Ｓｅｒ　Ｙａｌ　Ｇｌ
   ｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＭｅｔ　
   　Ａｓｎ　　Ｙａｌ　　Ｌｙａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　　Ａ
   ｓｎ　Ｓｅｒ　ＡｓｎＬｙｓ　　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒ
   ｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＬｅｕ　
   Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｍａｌ　Ｔｈｒ　Ａ
   ｓｐ　ＬｅｕＡｓｎ　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙ
   ｓ　　Ａｌａ　　工１ｅ　Ｈｌｓ　ＧｌｕＬｅｕ　　Ｉ
   ｌｅ　　Ｇｌｎ　　ｌ／ａｌ　　Ｍｅｔ　　Ａｌａ　Ｇ
   ｌｕ　　Ｌｅｕ　　５ａｒＰｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ
   ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙａ　Ａｒｇ　ＬｙａＡｒｇ
   　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　
   Ｇｌｙ　ＡｒｇＡｒｇ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ
   で表わされるポリペプチドをコードするこトラ特徴とす
   る特許請求の範囲第１項、第３項または第５項記載のＤ
   ＮＡ０ （７）　　Ｍｅｔ　Ｌｙａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　
   Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　ＡｌａＰｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　Ｃｙ
   ｓ　、１１ｅ　Ｖｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　５ｅｒＬｅｕ
   　Ｇｌｙ　Ｃｙａ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａａｐ　
   Ｐｒｏ　ＴｙｒＹａｌ　Ｌｙ８Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
   　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＬｙｓＴｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓ
   ｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ａａｐ　Ｍａｌ
   Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐ
   ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇ４ｙ工ｌｅ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　Ａ
   ｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＡｓｐ
   　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　　工ｌｅ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｎ　Ｓ
   ｅｒ　Ｇｌｎ　　ｌ１ｅＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙ
   ｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＬｙｓＡｓｎ　
   Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　　
   ＩＩｓ　ＧｌｎＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
   ｒ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＭｅｔ　　Ａａｎ
   　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ
   　　Ｓｅｒ　　ＡａｎＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙａ　Ａｒｇ
   Ａａｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　ＬｙｅＬｅｕ　Ｔｈ
   ｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｍａｌ　　Ｔｈｒ　Ａｓ
   ｐ　ＬｅｕＡｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　　Ａｒｇ　Ｌ
   ｙｅ　　Ａｌａ　　ＩＩｓ　Ｈｌｓ　　ＧｌｕＬｅｕ　
   　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ｍａｌ　　Ｍｅｔ　　Ａｌａ　
   　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　５ｅｒＰｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ
   　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＬｙｓＡ
   ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒ
   ｇ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＡｒｇ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｇ
   ｌｎで表わされるポリペプチドをコードすること１特徴
   とする特許請求の範囲第１項、第２項または第５項記載
   のＤＮＡ０ （８）　　組み換えＤＮＡ分子の一部であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項〜第７項記載のＤＮＡ０ （９）プロモーターの下流に連結されていることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項〜第８項記載のＤＮＡ０ （Ｉα　以下に記述した（イ）〜（す）ヲ含むことを特
   徴とする一般式 ％式％ ＡＧＴ　　ＣＡＧ　　ＡＴＧ　　ＣＴＧ　　ＴＴＴ　　
   ＣＧＡ　　ＧＧＴ　　ＣＧＡ　　ＡＧＡＧＣＡ　ＴＣＣ
   ＣＡＧ　−Ｘ　　（３’）〔式中、ＸはＴＡＡ　、　Ｔ
   ＧＡまたはＴＡＧを示す〕で表わされる塩基配列を含有
   するＤＮＡの製造法。 （イ）　ヒト免疫インターフェロンを分泌する細胞を培
   貢する。 （ロ）その細胞からヒト免疫インターフェロンをコード
   する伝令ＲＮＡを分離する。 （ハ）その伝令ＲＮＡおよび逆転写酵素を用いて単鎖の
   相補ＤＮＡを合成する。 に）その相補ＤＮＡを二重ｆｉＤＮＡに変換する。 （ホ）得られる二重鎖ＤＮＡをプラスミドに組み込む。 （へ）この組み換えプラスミドを宿主に導入して形質転
   換させる。 （ト）該宿主の培養菌体から目的とするＤＮＡを含有す
   る１フスミドを単離する。 （ト）所望により、そのプラスミドから目的とするクロ
   ーン化ＤＮＡを切り出す。 （す）所望により、該クローン化ＤＮＡをビークル中の
   プロモーターの下流に連結させる。 １１）　　Ｄ　Ｎ　Ａ　１）Ｅ Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａａｐ　Ｐｒｏ　Ｔ
   ｙｒ　Ｖａｌ　ＬｙｓＧｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａａｎ
   　Ｌｓｕ　Ｌｙｅ　Ｌｙ８Ｔｙｒ　ＰｈｅＡａｎ　Ａｌ
   ａ　Ｇｌｙ　Ｈｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ
   　ＡａｐＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
   ｅｕ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　ＬｅｕＬｙａ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ
   　ＬｙｓＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＡｒｇＬｙ
   ｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ
   　Ｍａｌ　５ｅｒＰｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｅ　Ｌ
   ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙａ　Ａｓｎ　ＰｈｅＬｙｓ　Ａｓｐ
   　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙ８Ｓ
   ｅｒＭａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ
   　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　ＡａｎＭａｌ　Ｌｙ８Ｐｈｅ　Ｐｈ
   ｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙ８ＬｙｓＬｙｓ　Ａ
   ｒｇ　Ａａｐ　Ａａｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅ
   ｕ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｍａｌ　Ｔｈｒ　
   Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａａｎ　ＶａｌＧｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙ
   ｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ｌ１ｅ
   Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　（）ｌｕ　Ｌｅｕ　
   Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＡｌａＡｌａ　Ｌｙ８Ｔｈｒ　Ｇｌｙ
   　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙａ　Ａｒｇ　５ｅｒＧｌｎ　Ｍ
   ｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒ
   ｇ　ＡｌａＳｅｒ　　Ｇｉｎ で表わされるポリペプチドをコードするものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡの製
   造法。 （１２Ｄ　Ｎ　Ａカ免＆インターフェロンポリペプチド
   と等価の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプ
   チドをコードするものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第１０項記載のＤＮＡの製造法。 （１３ｊＤＮＡが組み換えＤＮＡ分子の一部であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１０項〜第１２項記載の
   ＤＮＡの製造法。 α菊　一般式 ％式％ （） 〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す〕で表
   わされる塩基配列を含有するＤＮＡで形質転換せしめた
   宿主。 （へ）ＤＮＡがプロモーターの下流に連結せしめた当該
   塩基配列を有するものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第１４項記載の宿主。 −大ｍ菌もしくは枯草菌であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１４項または第１５項記載の宿主。 １７）一般式 ％式％ Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｈｌｓ　　Ｓｅｒ　　
   Ａａｐ　Ｍａｌ　　Ａｌａ　　ＡｓｐＡａｎ　Ｇｌｙ　
   　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　　Ｉ
   ｌｅ　　ＬｅｕＬｙｅ　　Ａａｎ　　Ｔｒｐ　　Ｌｙａ
   　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　ＡｒｇＬｙ８１
   １ｅ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ　　Ｉ
   ｌｅ　　Ｍａｌ　　５ｅｒＰｈｅ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ
   　　Ｌｙａ　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　Ｌｙａ　Ａａｎ　Ｐｈ
   ｅＬｙ８　Ａａｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ
   　Ｇｌｎ　　Ｌｙａ　　５ｅｒＶａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｔ
   ｈｒ　　Ｉｌｅ　Ｌｙｅ　　Ｇｌｕ　　Ａａｐ　Ｍｅｔ
   　　ＡｓｎＶａｌ　　Ｌｙｅ　　Ｐｈａ　　Ｐｈｅ　　
   Ａａｎ　　Ｓｅｒ　　Ａａｎ　Ｌｙｓ　ＬｙａＬｙｅ　
   　Ａｒｇ　　ムｏｐ　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　　Ｌ
   ｙｅ　　Ｌｅｕ　　ＴｈｒＡａｎ　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　
   　Ｍａｌ　　Ｔｈｒ　　Ａａｐ　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　
   ＭａｌＧｌｎ　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　ＩＩｓ
   　Ｈｌｓ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　ｌ１ｅＧｌｎ　　Ｖ
   ａｌ　　Ｍｅｔ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓ
   ｅｒ　　Ｐｒｏ　　ＡｌａＡｌａ　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　
   Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　　Ａｒｇ　　５ｅ
   ｒＧｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　Ｇｌｙ
   　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＡｌａＳｅｒ　　Ｇｌｎ 〔式中、Ｙは（ａ）水素、（ｂ）Ｍｅｔまたは（ｃ）Ｍ
   ｅｔ　ＬｙａＴｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　
   　Ｉｌｅ　　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　　ＬｅｕＣｙｓ
   　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　
   Ｇａｙである〕で表わされる化合物。 （ホ）一般式 ％式％ （） 〔式中、ＸはＴＡＡ　、　ＴＧＡまたはＴＡＧＱ示す〕
   で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡで形質転換せし
   めた宿主を＠餐し、培養物中に一般式％式％ 〔式中、Ｙは（ａ）水素、（ｂ）Ｍｅｔまたは（ｃ）Ｍ
   ｅｔ　ＬｙｅＴｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　　
   Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　ＬｅｕＣｙｓ　ＩＩ
   ｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
   である〕で表わされる化合物を生成蓄積せしめ、これを
   採取することを特徴とする該化合物の製造法。 −一般式 ％式％ 〔式中、Ｙは（ａｌ水素、（ｂｌＭｅｔまたは（ｃ）Ｍ
   ｅｔ　ＬｙｓＴｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　
   　Ｉｌｅ　　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　ＬｅｕＣｙｓ　
   Ｉｌｅ　Ｍａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇ
   ｌｙ　である〕で表わされる化合物および製剤学的に許
   容しうる担体からなることを特徴とする無菌性製剤学的
   組成物。 （至）Ｙが水素であり、製剤学的に許容しうる担体が滅
   菌水、生理食塩液もしくはヒト血清アルブミンであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１９項の製剤学的組成
   物。