JPS6162862A - 細胞内にとり込まれる蛍光剤を使用する検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背４１（］ （発明の分野） 試ネ１中に含まれろ分析物を検出］゛ろ検定方法の改良
（Ｊ、常に必要である。分析物と（コ、一般にリカンド
とその同種受容体から成る特異的結合対の構成要素であ
る。特異的結合対の代表例は抗原と抗体である。

吐乳動物の赤血球細胞は数多くの抗原を何し、そのうＩ
しあるものは輸１１１を等の医療手段に際し、小者と供
血者の双方について正確に同定しな（」ればならない。

Ａ、Ｂ、Ａｌ１．０およびＤ（ＩＮｈｏ）の血液型を正
確に決定することは非常に重要である。

また、血中に存在しているこれら抗原の抗体ら診断学的
興味の対象となる。

通常、顕微鏡スライドガラスまたは試験管内におＩＪる
凝集法が用いられている。試験しな１ノれげならない多
数の試料がある場合においては、迅速で、目、つ正確な
血液スクリーニングの改良方法が望まれる。

（先行技術の説明） 凝集法による赤血球細胞抗原の同定カリ古本である〔例
えば、ハドソンおよびヘイ、プラクティカルｅイムノロ
ノー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
）、第２版、ブラックウェル、ザイエンテイフイソク、
パブリケーノヨンズ（＋３１ａｃｋｗｅｌｌ　　５ｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃＰ　ｕｈ　ｌ　１ｃａｔ　１ｏｎｓ）、
オツクスホード（ＯｘｆｏｒｄＸ　Ｉ　９８０年）、１
３９頁〕。米国性３′［第３，８６２，９０３号は、ラ
テックス・ビーズ等を担体粒子として使用する血清学的
因子の免疫学的検出法お、１び同定法の代表例である。

スミス〔エフイーピーニス・レターズＣＦ１℃ｒ３ｓ、
ｌ、ｃｔｔｅｒｓ）、７７巻、２５Ｑ（１９７７年）〕
は１１を光色疫学的Ａ１１１定法を記載している。米国
特許用）頭番壮第４３４，７［ｉ１号（ｌＱ　Ｆｉ　２
＜Ｉ’、ｌ　ＯＪＩ　ｌ　５０提出）は、血液型の蛍光
スクリーニング法に関４−ろちのである。

比較的多ｎｋの試Ｆｌ晴に、１３いては、蛍光変動と相
関オろ杓、子の相対的τｊ法によりｉζｉ了を分別′４
−ろために、レーザー光束および細隙灯を使用４−ろこ
とが、ブリッゲスら〔ザイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２１２右、Ｉ　２　［’ｉ　［’＋〜１２６７頁（１９
８１年）〕およびニコリら、プ［ｌンーンングズ・オブ
・ナノヨナル・アカデミ−・オブ・ザイエンンズ、ＵＳ
Ａ（１］ｒｎｃ、　Ｎａ１ｌ　　Δｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ）により記載されている。

多くのスフアレ−１・染ネ」が論じられている〔スプレ
ンカーら、アンケハンテ・ヘミ（ＡｎｇｐｙＣｈｅｍ、
　）、８０巻、５４１頁（１９（ｉ８年）、スプレンカ
ーら、アンゲハンテ・ヘミ−（Δｎｇ、　　Ｃｈｅｍ）
、７９巻、５８１頁（１９６７年）、スプレンガ−ら、
アンゲバンテ・ヘミ−、インターナショナル・エノソヨ
ン・イン・インフリランっ、　（Ａ　ｎｇ（！ｗＣｈｅ
ｍ、　１ｎｔｅｒｎａ１．　Ｅｄｉｔ、　）、第５巻、
８９４頁（１９６６年）およびマークスら、同誌、第５
巻、８８８頁（１９６６年）〕。

悪性白血球細胞の検出しメ［ｌンアニン染別を使用オろ
ことか米国特許第４，４２４．２０１号に記載されてい
る。

米国特許第３，８５３，９８７号は免疫学的試薬と放射
線免疫検定を開示している。この特許は、試薬の凝集を
検出する好ましい方法として、反応混合物浮遊液を希釈
し、これを蛍光分光光度３１のフロー・セルへかける態
様を示している。

［発明の要旨］ この発明は、試料中に存在するリガントと、その同種受
容体から成る特異的結合対の構成要素（「ｓｂｐ構成要
素」）を検出する方法を提供するしのである。水性媒質
中で、（１）少なくとｔ）ｓｂｐ構成要素または相捕的
ｓｂｐ構成要素が細胞表面と結合している、相捕的ｓｂ
ｐ構成要素および（２）細胞内にとり込み可能なス１を
光剤を、試別と合イつ且る。ｓｂｐ構成要素の存？「（
」、細胞凝集の結果、分離されていない細胞浮遊〆ｆり
の蛍光変化によ−・て示されろ。

この発明（」、特に、例えば、Δ、Ｂ、Ａｒｌ、０およ
びＤ　（Ｉｔ　１１０）曲’ｔイン型決定抗原、および
それに利応−４−ろ抗体ノｌｉてなく、Ｍ、Ｎ、　Ｓ、
ｓ、ルイス、ラセラン、ケル、ダフィー、ギッドブ；の
各種抗原にχ・［セろ抗体の（１在を測定１１−ろ、＋
ＩｎＩｎ判型判定用されろ。

［実施態揉の説明］ この発明（」、分離段階を行わずに、試１′：１中の分
（バ物、通常Ｓ　Ｉｔ　ｐ　ｊｌ−１成要素の存在を測
定オろ新規方法を提供する１、ごの方法はｓｂｐ構成要
素または（■補的ｓｌ中構成要素の少なくとしい「れか
一方が、細胞表面と結合している場合のｓｂｐ構成要素
を使１Ｆ１１〜ろ。また、この方法で（Ｊ細胞内にとり
込まれろ蛍光剤を使用４−る。試別中のｓｂｐ構成要素
が細胞表面に結合していない場合、蛍光剤（」、好まし
くはよ４″′（［Ｉ補的ｓｂｐ構成要素と結合した細胞
内にとり込ませ、ついでその結合体を試料と合わ什るこ
とによって、試料と結合する。試別」−のｓｂｐ要素が
細胞表面と結合している場合は、蛍光剤（ｊ、一般に相
補的ｓｂｐ要素を試別と合わ１１ろ前に、試￥：、１に
加えられる。したがって、「試別と結合オろ（合わ什る
）」の語は、上記の２つまたはそれ以−１−の試薬と合
わせてから残りの試薬と合わ且ろことを包含する。「試
薬」の語は、試別、相補的ｓｂｐ構成要素および細胞内
にとりこまれる蛍光剤を含み、さらにこの方法を有効に
操作するのに要するすべての添加物を包含オろ。

この発明の１態様を実施するには、試１Ｎ、ＩＩ　１ｌ
ｌｉ的ｓｂｐ構成要素および細胞内にとり込まれろ蛍光
剤を水性検定媒質中で合わＵ、ついで細胞凝集の結果と
して起きる混合物の蛍光変化を測定する。

試料中にｓｂｐ構成要素が存在している場合は、この蛍
光変化によって示される。

この発明方法は、多様なｓｂｐ構成要素分析物の多様な
検定方法に適合できろ。８１中構成要素および相補的ｓ
ｂｐ構成要素の少なくとも一方が、細胞表面の正規成分
である場合は特に興味深い。細胞表面ｓｂｐ構成要素に
（」、抗原、細胞壁抗原、特に細菌細胞壁、活性化因子
、成長因子および阻害因子等の諸因ｒ−受容体を含む細
胞表面受容体類、抗体、ＨＬΔ抗片、Ｆｃ受容体、ホル
モン受容体、イオンヂャンネル、糖脂質、リポタンパク
質、補体成分、ウィルス性抗原、膜結合酵素、ペプチド
グリカン、真菌性抗原、イデオタイプ抗原等の自然産生
型膜成分を包含オろ。興味深い細胞型は、白面法、細菌
、真菌細胞、赤＋１ＴＬ球、網状赤血球、中球、マク［
ｌファージ、■（細胞、′１゛細胞、好酸球等を含むリ
ンパ球等である。特に、この方法が適合するの（」血ｌ
ｆν型判定の分野である。血液型決定抗原およびその抗
体は、１−記の方法を用いて確かめろことができろ。

この発明は新規方法を提供し、特に赤血球細胞を負荷蛍
光体のギヤリアーとして使用し、検定方法の間に細胞を
凝集させることによって、赤血球細胞の型判定、また（
」赤血球細胞抗原およびその抗体の同定を行うのに有用
である。凝集の結果生じる蛍光変化を測定し、特定の赤
血球細胞抗原またはその抗体の存在の指標とする。赤血
球細胞抗原に結合する物質、通常、抗体また（」レクチ
ン（Ｊ細胞凝集を生じるのに必要である。血液型抗原を
測定するこの発明の１＠様では、水性媒質、例えば好適
な緩衝液中で、全面を細胞中にとり込まれろ蛍光剤およ
び目標とする抗原の受容体と合わせろ。目標とする抗原
が血中赤血球細胞表面に存（［するなら、凝集が起こり
、目標抗原（Ｔ−在の指標として蛍光変化が観察される
。

使用する受容体は、目標とする＋ｍ液型表面抗原と優先
的に結合する。したがって、！ｊえられた赤血球試料に
該抗原が存在する場合の変化を、抗原が存在しない場合
と比較して、蛍光分光学的に測定できる変化が起こる。

例えばＡ、Ｂ、０式において抗Ａ抗体を使用した場合、
分析物がＢまたＯの血液型の場合と異なってＡまたはＡ
Ｂの血液型のＡ抗原を含有しているならば、凝集が起こ
り蛍光変化を示すはずである。

抗体だＣづではなく、ある種のレクチンも種々の程度で
赤血球細胞表面抗原に結合することが知られて、１３す
、ごれららこの検定に都合のよい受容体として使用され
ろ。

Ｊ：八この方法は、赤血球抗原に対づろ抗体の仔（［：
の測定にら使用できろ。この「１的のたｙ）には、問題
の抗体と同種の表面抗原を（Ｔセろ赤血球細胞を使用・
１ろ３、」：４−抗原保有細胞と蛍光剤を合わ■ろのが
好よ１．＜、ついで、これを水＋１１媒質中にあろ試１
′１と合わ４」ろ。乙し問題の抗体か試Ｆｌ中にｒ、′
−？「４′ろならけ、凝集の結果として蛍光変化が起こ
ろ（」４−であろ１、ごの場合には、蛍光変化（」問題
の抗体の（ｆＪｌを表１１−６ またごの方法は、交差適合試験に乙干要てある。

ごの測定ては、ｆＪｌ、面者の＋ｆｎ液と予定受血者の
面液を混合し、この混合面液をこの発明の方法にしたが
って処理する。好ましくは、供面者から得られた細胞（
」、まオ蛍光剤と合わせ、それから患音の試１′１と合
わＵろ。一般に、陽性の徴候が見られれ（」試験の結果
（」不適合である。

この方法はｊｐ純であり、はどよい短時間内に遂行でき
ろ。（Ｊとんどの場合、試薬は同時に添加できる。遊離
の蛍光剤および試料中に共存する内因性物質から生じる
盲蛍光干渉はごく僅かである。

一定の対照にかさねて、蛍光変化を読めとることができ
ろ。この方法の特にすぐれている点は、分離または洗浄
段階をなんら必要としないことである。検定媒質または
混合液から、蛍光変化を直接細胞凝固の結果として観察
することができろ。

さらに説明を進める前に、いくつかの用語を定義づける
。

「分析物（ａｎａｌｙｔｅ）Ｊ−測定ずへき化合物また
は組成物であって、ｓｂｐ構成要素であり、１価よたは
多価リガンドであってらよい。ごれらは１個または複数
個のハプテン性および抗原性決定部位を有し、９１数化
合物、または少なくとも１個の共通した抗原決定基また
は決定部位を共有し合う複数の化合物群、または受容体
である。

「ｓｈｐ構成要素」−２個の異なる分子から成り、それ
ら分子のうちの一方は、他方の分子の特定の空間的極性
構造と特異的に結合し得る表面部分または凹陥部分を有
している特異的結合対の構成要素１．特異的結合対の２
つの構成要素はりガントと受容体（抗リガント）として
示され、また同時に、同種として示されろ。

「リカント」−自然に存ｒｒ、する受容体、また（Ｊ調
製し１１．１ろ受容体を（ｆオろ任音の１つの打上（化
合物。

「受容体」（抗リガンド）−あろ分子の特殊な空間的お
よび極性的構造、即ちエピト−プ性部位または決定」７
１部位を認識可能な（強い結合親和性を（ｊする）任意
の１つの巨人分子化合物、」：たは組成物。受容体を例
示すれば、自然に存在上る受容体、ｆ！ｌ］　１３、ヂ
「１ギノン結合性グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂ画分
、レクチン等が挙げられろ。この場合、抗体なる用語は
受容体を例示的に、そしてさらにに一般的に表示するた
めに使用する。

「ｆＪｌ　ｈｌｉ的ｓｂｐ構成要素」−ｓ　ｂ　ｐ構成
要素が分析物である場合の特５′１Ｍ的結合対の同種構
成要素。

「細胞」−核をムぢ、および核をもたない小室とオルガ
ネラをｒ了し、膜に囲まれている原形質構」２から成り
、組織構造を構築している微小原形質集合体の１単位。

「細胞内にとり込まれろ蛍光剤」−細胞内にとり込まれ
、それによって細胞に蛍光をＩ−ｊえろことが可能な分
子ｔｉ２０００より小さい化合物、例えば細胞脱易溶性
染月、ＤＮＡ染色染料、生体染色染料等。

細胞内にとり込まれる蛍光剤は、細胞内にとり込まれて
からさらに蛍光を増すことが望よしい。

そのような蛍光剤は細胞膜に溶解し、または細胞膜を通
過し、細胞外への搬出を阻止する化学反応を起こすこと
によって細胞内摂取か可能となる。

タンパク質または炭化水素と高親和性を示す蛍光剤は、
この発明においてｒ１用である。デオキノリボ核酸（Ｄ
ＮＡ）を有する細胞では、ＤＮＡＦ（１和性を有する蛍
光剤も使用できる。細胞内にとり込よれる蛍光剤は疎水
性染１４である場合が多いので、水と相溶性を示オギレ
ート剤でキレ−１・化することにより水溶性とする。

、生物学的干渉を最大限に消去４′ろため、細胞内にと
り込まれろ蛍光剤は好ましく　ｉＪ：　４５０　ｎｍ、
Ｉ−リ大きい吸収極太、さらに好ましくけ５４０ｎｍよ
り大きい吸収極大をｂつへきである。多くの場合、吸収
波長の極太（Ｊ３２０〜Ｉ０００ｎｍ、好ま１−＜ｔ：
Ｉ：　Ｇ　（］　０〜８　（］　（ｌ　ｎｍであろべき
てある。

細胞内にとり込まれろ蛍光剤の励起波長にお（Ｊろモル
吸）１′：係数（」、てきろた（ｊ高くあろべきてあり
、１．Ｏｎ［１１モル／ｃｍより高く、好よしくけＩｎ
、００［１１モル／　ａｍより１・、−６＜あるべきで
ある、。

細胞内にとり込まれろ蛍光剤には高い呈了−収帛をイ］
°オムのを選択し、細胞内に摂取さ相へ場合、その値が
、通常００５より高く、＆Ｔましくけ０３より高い乙の
とｄ−ろ。励起波長を選択オろに当へ−・て（」、試１
：１からの前型光を最小限に、染色細胞の蛍）ＶをＪｉ
Ｓ犬に、土た光源およびフィルターの強度５１３よひ相
対強度を最大にオろことを基塾とオろ。

勅に都合よい波長は、そのθ・ν長が、アルゴン、アル
ゴンおよびヘリウノ、／ネオン（＋−１Ｆ！／　Ｎ　＋
りレー→Ｊ１−からそイ１ぞＡ１容易に入手しｉ−Ｉろ
との理由により、４８８ｎｍ、　　５　Ｉ　５ｎｍ、お
よび６３３ｎｍである。一般に長ρ・Ｖ長側になるはと
、前型）旨」少なくなる。

特にｔｌ　ｅ／　Ｎ　ｅレーザーは好ましく、したがっ
て６３３ｎｍて高い量子収量と、高いモル吸光係数を示
す染ネー１が好ましい。

また細胞内にとり込まれる蛍光剤（」、幅広いストーク
ソフト、好ましくは１５ｎｍより広い、ざらに好ましく
は３０ｎｍより広いスト−クンストを示すことが好まし
い。即ち、そのような蛍光剤で（」、吸収極大と発光極
大との波長間の記載のような幅、即ち差があることが好
ましい。

検定を行っている間、特にそのような蛍光剤を含んでい
る細胞が、そうでない細胞を含んでいる試料とまざって
いる場合では、細胞内に蛍光剤がとりこまれ残留してい
るべきである。また蛍光剤は、細胞内にとりこまれてい
るときの方が水性環境のなかにあるよりもはるかに強い
蛍光を示すことが好ましい。はるかに蛍光が強いという
ことは、蛍光剤が細胞内にとり込まれているときの方が
そうでないときよりも、はるかに一定励起波長におけろ
吸光係数と量子収量を多く生じるということを色味して
いる。蛍光の増大を必要とはしないが、細胞にとり込ま
イ１ている蛍光剤の方が、そうでない蛍光剤上りら少な
くと０３倍、特に少なくと６１０倍、蛍）しを示すこと
か好ましい。

細胞内にとり込まれろ蛍光剤のらう１つの特徴（」、５
ｌｌｌ’１ｉ１１１成・周索、例えば抗原および抗体等
の結合に、］、−・て［渉されないことである。また細
胞内にとりこまれろ蛍光剤（ｊ細胞に対して高い親和性
を示す。

細胞内にとり込まれろ蛍光剤の細胞１個当たりの分子数
（」、有への検定を実施し得るに足るものであるべきで
、一般に、約１註２〜１０７細胞、好ましくけ１０′〜
１０６分子数／細胞であるべきである。

−１−述のように、細胞内にとり込まれろ蛍光剤の好ま
しい部類（」細胞膜に可溶性である蛍光十１４であり、
このこと（Ｊこれらの染ｆ：１が疎水性であり、通常、
１１１村ＩＬ媒性となって、好適な時間内に薬剤を細胞
内にとり込Ｊ＊　ｔ’．−）ろに足る水溶性を提供する
ことを色味している。膜可溶性染訓の好ましい部類は６
００ｎｍ．ｌ−り大きい吸収極大を有し、好適なモル吸
光係数おにびスト−クノフトを示オある種のスクアレー
ト染１看である。

限定されるものではないが、代表例として、これらの染
料を例示すると、式・ 〇− （式中、Ｒ１、Ｒ２、１１３およびｎ，は、そイ１ぞメ
１独立して炭素原子数２〜１６個のアルギル、好ましく
は２〜６個の低級アルギル、および炭素原子数２〜１６
個、好ましく（１２〜６個のアラルギルから成る群から
選ばれ、この場合こメ１らの基ＩＪ、同じであっても、
または異なってδよく、またＯ　ｌ−１、Ｃ０ＮＨＲ’
，ＳＲ’、ＯＲ’て置換さ〕１ていることもてき、ここ
においてｎ．ｔＪ炭素原了数１〜６個の低級アルキル、
ｒ゛、Ｃρ、１３＋’．　　ｌ，　ＮＯ２、オキソカル
ボ゛ニル、ＯＮであり、Ｒ２およびＲ．　ａは、独立し
て、水素、メトギノ、すたはヒドロキソから成る１！Ｔ
から選ばれる） で示される。これらの染料の幾つかは、スプレンガーら
〔アンケバンテ・ヘミ−、インターナショナル・エジン
ヨン・イン・イングリノノユ（ΔｎｇｅｗＣｈｅｍ、　
１ｎｔｅｒｎａｔ、　Ｅｄｉｔ、　）、５巻、８９４頁
（１９６６年）〕に開示されている。

また、下式 （式中、Ｉｔ１、Ｒ７およびＲ３は前記と同倉入である
）で示されるスクアレート染１：」も、この発明にお（
づろ細胞内にとり込まメ１−ろ’ｌ’：’ｉ別の蛍光剤
の代表例である。これらの染料ユ１の幾つか（」、スプ
レンカーら〔アンケバンテ・ヘミ−、インターナショナ
ル・Ｊ、ジンヨン・イン・インクリッノコ（Δｎｇｅｗ
。

Ｃｉｅｍ、　　１ｎｔｅｒｎａ１．　　Ｅｄｉｔ、　　
）、　　６巻、　　５　５　３−５５４頁（１９６７年
）〕に開示さイ１ている。

細胞内にとり込まれろ蛍光剤に関して、先に示した好適
な特徴を有する他のスクアレート東１；１が、当該技術
の当業者にＪ−り示唆さイ１ている。

例えば、キンスラントら〔ジャーナル・オシ・バイオケ
ミカル・アント・バイオフィンカル・メソッズ（，１、
１１１ｏｐｂｙｓ、　Ｍｅｔｈｏ＋Ｉｓ）、（１９，８
／Ｉ年）、９巻、８１〜８３頁〕の教示４−るように、
例えばノクロデギストリン等の水溶性を増大する化合物
をＮ＞　１１と混和することによって、東１′−１の水
溶性を向」ニオろことができる。

この発明において使用てきろ細胞内にとり込よれろ染１
′」のもう１つの部類は、［−生体十色染１′１１であ
る。これらの染オ′、−１は蛍光染Ｈの誘導体てあ−）
で、膜に可溶性で常に弱い蛍光を発するが、細胞膜を通
過して輸送されたあと（」、膜に対して不溶性とｔ」゛
す、ＩＢＪ４ｉい蛍光性をｉＵろことかできろ。こ相ら
の誘導体かい−・八ん細胞内へ入ると、細胞内にＡろ、
例えば、細胞内て酵累が蛍光リボＩ誘桿体に作用して、
入ろとき（」容易に通過した細胞から、これか１般出さ
Ａ１ろのをｌ／ｊ止オろ。ごのような染１、ｌ調心（（
（の例ｔｊ、３　、　Ｇ−ジヒドロキノー９−フエニル
ギザントヒトロールから誘導されたフルオレセイン類お
よび３．６−シアミノ−９−フーｒニルギ→）゛ンテン
から誘導された１ノ−ザミン３〔’Ｉおよびｃｙ−クミ
ン類を包含オろギザンテン染事１のような蛍光化合物の
、アセテート類等のエステルｌ；’ｎである。ローグミ
ン類およびフルオレセイン類ｉ」：　９−０−カルボ゛
ギノフェニル基をイ了し、９−０−カルボ゛ギソフゴニ
ールギ→）゛ンテンの誘導（本である。これらの化合物
の）ｊニル基に置換基を何し、または有しない化合物（
」商業的に入ｆできる。

他の蛍）し化合物の例は、アミノ括をα位また（１８位
に有し、通例α位に何するナフチルアミン類である。包
含されろナフチルアミノ化合物は、１−ンメヂルアミノ
ナフチルー５−スルホン酸塩、１−アニリノ−８−ナフ
タレンスルホン酸塩および２−ｐ−１−ルイジニルー６
−ナフタレンスルホン酸塩である。他の興味深い蛍光化
合物（」クマリン類、例えばウンヘリフ、ＩＴ、　ｒＪ
ンてある。

この発明に使用できる細胞内にとり込まれろ染Ｈのもう
１つの部類は、ＤＮＡまたｔｊ：　Ｉｔ　Ｎ　Ａに７μ
相性を有する染Ｎｉｌである。前記のとおり、これらの
染料はＤＮＡを有する細胞が含まれろ検定に使用できる
。このような染１．ｔの例ｉ、Ｉ：　Ｉ）　Ｎ　Ａ挿入
剤であって、これらは一般によく知られた化合物であり
、またその大部分は商業的に入手できる。このような薬
剤の代表例は、アクリフラビン、アクリフラビン塩酸塩
、および類仰のアクリフラビン誘導体、およびエチジウ
ム・プロミド等のエチジウム・ハライド類である。

細胞内にとり込まれる蛍光剤のもう１つの部類は、タン
パク質または炭化水素類に高いｉＪｌ和セＩを有する染
ＩＩ　、即ちスティン類である。そのＪ−うな薬剤を例
示ずれば、ピレンおよびナフタレンのスルホン酸塩、ス
ヂルヘンのシマレインイミド、ザリヂル酸マレインイミ
ド、ピレンおよびタンリンのイソヂオソ）７ネート、グ
ンンルアジト等のタンノル化合物、アントラセンカルボ
ギソアルテヒドのカルホヒトラゾン、一般細菌染１′・
１等てあろが、こ２１．に限定されるしのではない。上
記薬〜１の例は、モレキュ、シー９プ〔１−ブズｉｌ：
（Ｍ（市：ｃｕｌａｒ　ｒ’ｒｏｈ（：ｓ。

Ｉｎｃ、Ｃジャンタノヨン市（，１ｕｎｃｔｉｏｎ　　
Ｃｉｔｙ’）、オレイン（Ｏｒｅｇｏｎ）　）の１９８
１年３月のカタ［ｚヶお上ひコダック・バイオ〔！ジカ
ル・ステインス゛・アント・リレーテイット・プロダク
ツ（Ｋｏｄａｋｌｌｉ（由）ｇｉｃａｌ　５ｔａｉｎｓ
　　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（
発行番別１．１．１−２８　Ｉ−５１）に見いたされろ
。

次にこの発明を、面液試ネ゛１を検定状］１゛１の例と
し、その１ｆｌｌ　ｉｆ目°１１）口らｔＪ：）こ（」
抗体を、この方法によ−）で測定できろｓｌ中構成要素
の例として用いて、詳細に記述オろ２．この説明は？１
′ｌに例示的説明の１段であ−・て、この発明の範囲を
何ら限定オろ音図はない。

この発明にしたがい、血液型抗原の検定を実施゛４′ろ
八め、所望に、１−〇曲液試１１を５％」−〇大きく、
好ましくは２０％より大きく、さらに好ましくは５０％
より大きい血液容量から成る緩衝液水性媒質を使用する
。緩衝液水性媒質のｐ　Ｔ−１は通常約５〜９、好まし
くは約６〜８とオろ。試料を好適ｍの蛍光剤および相捕
的ｓｈｐ構成要素と混合する。

相補的ｓｂｐ構成要素の爪は、一般にイ丁音な検定結果
を得るに足る十分量を使用ずべきである。細胞内にとり
込まれる蛍光剤の量（Ｊ、細胞の性質と薬剤の性質によ
って変化する。通常、蛍光剤は、血液１肩ρ当たり約０
．１−］０００７１ｇ好ましくは約ｌ〜ＩＯ７ｚｇを使
用する。相補的ｓｂｐ構成要素の使用量は実験に基づい
て決定し、通常、ｓｈｐ構成要素量の０．０１〜１００
０倍、好ｉ：　Ｉ、　＜　ｌｊ：ｓｔ＋ｐ１７η成要素
量のｏ、ｔ−ｔｏｏ倍の範囲とする。

細胞内にとり込まれる蛍光剤の水溶性が低い場合、蛍光
剤が細胞内にとり込まれ易くするため、好適な有機極性
溶媒に溶解した蛍光剤と血液試１：２１を、まず最初に
混合することができろ。有機溶媒は、一般に１〜６個の
炭素原子と、酸素、窒素および硫黄から成る群から選ば
れる１〜３個のヘテ［！原子をｒｒ　４’ろらのと４−
ろ。このような溶媒の例（」、ツメーｒ−ルホルムアミ
ト、ンメチルスルホギノＩ・、ｌ＼ギ−＋１°メチルポ
スホルアミト等である。次に、ご（］）山１１合物を−
Ｉｆ　＋補的Ｓ　ＩＩ　ｒｌ　Ｉ’７１’ｌ成要讃と合
わ且ろ。

試１’ｌ　、１．１．ひ細胞内にとり込よイ１ろ蛍光剤
、（１捕的５１１１’ｌ＋Ｍ成要素をｊ′１′１合さ１
Ｊ、［］（ザと１４−ろｓ　ｂ　ｐ　ｉ１１η成要素か
（ｆ（１′、すれば細胞凝集か起ころ条ｆ’ｌドでイン
キ１．べ−トオろ。加温時間ｉｊ：　ｓｂ＋＋＋１１＃
成要素の表面密度、細胞１３よひ相補的５ｌａｐ構成要
素の濃度、およびポリブレン、デギストランまノニはデ
ギストリン誘導（４＼、低イオン・；う］度媒質、血清
アルフミン、）ｊ４１−ひポリエチ１ノンクリー１−ル
等のｆｖｌ集（Ｈ，Ｈ１任剤を添加−セろこと等を含む
反応条件によ−て、大きく変化オろ１、望ましい加〆晶
時間（」、通例的１０〜３７℃の緩和な心１１度で約１
０〜６００秒、好ましくけ約１０〜２００秒である。

特殊な血液型抗原に対する全血試１′ｉ中の抗体をＡ１
１１定”・１′ろ〕φの血液型”Ｉ’ｌｌ定では、氷（
１１−緩衝液痔、質中て１．拭１′ｌを１目票と′七ろ
Δまた（」Ｉ３の財１々の型の赤血球細１１（１と合イ
・）１」ろ。赤１０［球試丁１に蛍光剤をとり込ませる
前記記載と同様の方法および量を用いて、好ましくは蛍
光剤をあらかじめ細胞にとりこま１１でから、これを試
料と結合させる。ついて前記の同士ηの時間および温度
に、媒質を保つ。

１−記のインギコヘート処理後、媒質の測定を行い、細
胞凝集の結果を蛍光変化から読めとる。

この目的のため、非フロ一式血球計算法を用いろことが
できろ。これは、細隙灯、また（Ｊ好ましくはレーザー
により得られる径の小さい光束を使用し、相対的粒子ザ
イズに基づいて粒子を分別する方法である。この手法は
、１１′ｉ光パルス強度分析または蛍光変動の相関を利
用して行う〔ブリックスら、「ホモジニアス・フルオレ
ッセンス・イムノアッセイ（ｒ（ｏｍｏｇｅｎＯｏｕｓ
　　Ｆ　ＩｕｏｒＯｓｃｅｎｔ　　Ｉ　ｍｍｕｎｏ−ａ
ｓｓａｙ）Ｊ、ザイユ、ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１
２巻、１２６６〜１２６７頁（１９８１年）、およびニ
コリら、「フルオレッセンス・イムノアッセイ・ベース
）・・オン・ロング、タイツ、・コレレイソヨンス・オ
ン・ナンバー・フラクチｊエーンコンズ（Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　ｎａｓｅ（
ｌ　　ｏｎ　ＬｏｎｇＴｉｍｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏ
ｎｓ　ｏｆ　　Ｎｕｍｂｅｒ　　Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏ
ｎｓ）１、（プロノーフーイノグス・オフ・ザ・ナノヨ
ナル・アカテミー・オフ・ザイエンンズ、ｔＪｓΔ（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａ１１．Δｃａｄ　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、
７７Ｇ（８）、４９０４〜４９０８百（１４１８０年）
〕。

この発明にお（）ろ好よしい蛍光変化の測定力法（」、
米国特許出願番は第３　り　７，２８５弓（１９８２年
７月１２１１出願）に記載のファイバー、オプティック
曲球訓算器を使用オろことを包含しているので、こごに
引用して記：１夕の一部とオろ。この４旨′１（」、１
１標物＋Ｃ１のγ」・（１または惜を検出正ろごとに関
して、分散中に（Ｈ［オろ粒子を測定４〜ろ方法と装置
を提（〕１、オろ。蛍光を’＋ｉｌ取り、そイ１を計数
オろごとかできろ光学的ファイバーを使用し、こ相によ
ってかなり小さい容積を明らかにする。該容積と（」、
予定されている変動（「１ｕｃｌｕａｔｉｏｎ）を牛じ
る中−の粒子た（］が存在しているど思わイ１ろ容積の
ことてある。試料中にｒＴ在オろ分析物弔に比例して蛍
光変動を変化させろ種々の手法を駆使オろことにより、
γｒ在オろ分析物の債が′ｆｊｉ数容積全容積から採る
ことにより観察する。得られノこ結果を、既知量の分析
物を含んでいろ溶液から得られた成績と非核することに
より、分析物の量を定量的に測定する。

対照として、問題の面液型抗原または抗体の既知量を好
適な媒質に加え、未知分析物を含有している試料に対し
て行った前記の処置を行う。当該面液型抗原または抗体
の存在を指標として、対照品の蛍光変化を未知試Ｆｌの
蛍光変化と比較オろ。

［実施例］ 以下に示す実施例によって、この発明をＪ−り詳細に説
明する。

実施例１ ２−（ｐ−ジエチルアミノ−ｍ−ヒト［１ギノフエニル
）−４−（４−ジエチルイン上ニオ−２−ヒドロキシ−
２，５−シクロへギザジＪ、ニリデン）−３−オキソ−
１−ツクロブ゛テル−ト（ＤＥＡＳ）の製造 ＤＥＡＳを下記のとおり製造した。スタアリン酸（７４
１ｍｇ、６５ミリモル）をｎ−ブタノール　１・ルエン
（２：Ｉ）９０屑夕中に入れた３−Ｎ、Ｎ−ノエチルア
ミノフー「ノール（２，１６ｇ、１３ミリモル）と１（
１拌下に混合した。）（沸により水を除去しなから、混
合物を１夜還流し７だ。反応の進行（」、メタノール、
トルエン（１９）を使用する薄層クロマトクラフィーに
より追跡した。つきに反応混合物を蒸留してトルエン約
４０ｍ０を除去した後、この反応混合物を室温に冷却し
た。結晶性の生成物を濾過して分ば１し、室温で乾燥し
て生成物２５９を１１，１ノこ。　［ＪＶ（ＤＭＦ）　
λｍａｘＧ５０ｎｍ、　　ε　＝２４　０，０００、蛍
光（ＤＭＦ）６５０／　６６　Ｇｎｍ０実施例２ Ｄ（Ｐｈｏ）血液型抗原判定の検定 ＤＥＡＳのジエチルポルムアミド（ＤＭＦ）飽和溶液を
調製し、さらにこれをＤＭＦで１１０（容用比）に希釈
した。Ｏ（ｒ？　ｈｏ）陽性仝面試料１１１ρにＤ　Ｅ
Ａ　Ｓ希釈液５０ＩＩＱを、絶え４゛激しく攪拌しなが
ら滴下して混合した。この混合物１Ｏｌｌｒ：！を、Ｄ
　（１’Ｚ　ｈｏ）面液型抗原の特異的抗体（商業的に
入手可能な型判定用試薬）１０７１と混合した。この混
＝３２− 合物を１分間環境温度に保ち、ついでこれを、血清アル
ブミンおよびスクロース含有リン酸緩衝液１．５＋Ｑで
希釈した。

米国特許出願番号第３９７．２８５号（１９８２年７月
１２目出願）に記載の粒子計測用限界容積法および装置
を用いて、細胞凝集によって生じろ蛍光変化を分析した
。

カプト［１ノ社（Ｋａｐｔｒｏｎ、　Ｉ　ｎｃ、　）　
［パロ・アルド、カリホルニア（Ｐａｌｏ　　Ａｌｔｏ
、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）：１から入手したＹ字型ファ
イバーオフティクス・カプラー〔スプリッター、モニタ
ー（Ｓｐｌｉｔｔｃｒ−Ｍｏｎｉｔｏｒ）、ＦＯＭＳ−
８５０−Ｐ型〕のファイバーの１本の端を媒質中に浸漬
した。ファイバーの直径は５０ミクロンで、半角１２°
の励起光円錐およびＩ　Ｘ　］　０−７ｍρの有効ザン
プル容積を生した。Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３２，９ｎ
ｍ）から得られる励起光を、分岐した２本のファイバー
の一方へ加えた。細胞から放射され、浸漬したファイバ
ー末端へ入って来る蛍光部分を、ファイバー接合部で２
等分し、２本の分岐ファイバーへ送り返１．た。

２番「１の分岐ファイバーを通って来る部分を、フィル
ターにか（ｊて［渉を除き、高感度ゴベ（ＥＭＩ）光電
増倍管を１１目）、１ミリセコンドのゲート時間内て、
０１秒ｆｉｊｆ、二１回の割合で５０〜５００秒［１眠
読み取っ）こ１．−）いで、１ゲー）・時間当たりα）
蛍光パルスの・１；、均値を＝１ノピクータで算定した
。。

漂ｉ（／（放射＋ｌ（べｌｉを僅ヴ４°るため２−］の
ス・１照実験を１１　つ　ノニ１、 （ａ）通常の型判定によ−）てＤ’（ＲＩＩＯ）陰性と
判定された試１’ｌを同し方法で検定した。

（１＋）　Ｉ）　（Ｅｌ　ｌ＋ｏ）ノ’；’！　’Ｆ’
ｌ定試薬のうら抗体以外の一４′へての要素を含む商業
的に入手可能な［１’ｊ　ｈ対照−１試（１１を、−１
−記の検定の抗体試薬の代わりに使用した。

陽性５名、および陰性５名の対象から、それぞれ採取し
た試１′ｌで得られノコ成精を、第１表にまとめろ。

第１表 ＋０８ Ｄ（Ｒｈｏ）陽性　　　　　　　７２ Ｄ（Ｒｈｏ）陰性　　　　　　　２２ 対照　　　　　１９ ＊シグナルは、上記の説明に示した変動分析によって得
た。シグナルが４０より大きい場合を陽性と判定した。

実施例３ Ａ血液型抗原特異性抗体判定の検定 Δ型仝１１１扉ヤを２８０Ｏｒｐｍで遠心し、１−清お
よび白面法の（ゆ４層を吸引除去した１、固まっている
細胞を血清かム゛くなろまて等張生理食塩液で洗浄し、
５０％ヘマトクリット メｒ’Ｔアルブミン含有緩衝液にｌ′？．遊させた。

１）　ＩＣ〕ΔＳのＤ　Ｍ　Ｆ飽和溶液を．ｙ．ｉ＋　
ＩＩＩソし、これをＤＭｌ”で１　１０（容１７を比）
に吊釈した。上記のΔ型細胞ｌ′？．逆液ＩＲθニＩ）
　Ｅ　Ａ　Ｓ　Ｓ釈液５ｏＩＩＱを、絶えオ激しく１（
繁拌しながら滴下して混合した。

１、記”）　ｌ”ｌ　、ｉｆｒｓ液！’ｉ０）ｔ９を、
仝面状１ｔ’１２０／ｌＱと混合した。この混合物を１
分間環境ｌＡ！を度に保ち、面清アルブミンおよびデギ
ストランを含Ｔｉする緩衝ｌＯｊ　３ｍ（Ｉて希釈し、
実施例２に記載の粒子計測用限界容積法および装置を用
いて分析した。得られたｌ戊？青を第２表にまとめろ。

Ａ　　　　　　　　　　　　　　　２５＋１２ ＋１０ Ｂ　　　　、　　　　　　　　　　　　　９１Ａ８　　
　　　　　　　　　　　　１ｇ対照＊＊＊　　　　　　
　　　、　８ ＊各血液型毎に１群５名づつの対象からそれぞれ採取し
た試料を試験した。

＊＊ツクナルは、前記の説明に示した変動分析によって
得た。シグナルが４０より大きい場合を陽性と判定した
。

＊＊＊対照ツクナルは、Ａ細胞をΔＢ型と判っている対
象から１１１られた血液と反応させて得た。

実施例４ Δ（αΔ）およびＢ（αＢ）血液型抗原特異性抗体、お
よび０型対象（αＡ、Ｂ）から得られた抗体を使用し、
血液型ＡＳＢおよび０に対し、それぞれ実施例２の検定
を行った。キンスラント（前出）の教示にしたがい、Ｄ
　Ｅ　Ａ　Ｓをβ−シクロデキストリンと混合した。得
られた成績を第３表にまとめろ。

−一一見３表　　　　　　−−− Ａ　　　　αΔ　　　　　　　　　　　　　９８α１３
　　　　　　　　　　　　　　＋３αＡ、Ｂ２５２ 対県ニース栗ゑ挿迦刃づ−、！　Ｉ− Ｂ　　　　αＡ　　　　　　　　　　　　　１０α１３
　　　　　　　　　　　　　６５αＡ、Ｂ　　　　　　
　　　　２７２ 対照−試薬を添加せず　　１６ ０　　　αＡ　　　　　　　　　　　＋８αＩ３　　　
　　　　　　　２０ αＡ、Ｉ’３　　　　　　　　　３４ 対照−試薬を添加せず　　１３ ＊シグナルは、前記の説明に示した変動分析によって得
た。シグナルが４０より大きい場合を陽性と判定した。

以」−の事実から、この発明の方法が各種の分析物の検
定に幅広い有用性を有し、特に血液型の判定に有用であ
ることが判明する。この方法（Ｊ筒中。

て、温血である。一般に、この方法を１段階で遂（ｊて
きる。試１′１の他の要素によって、検定感度に生しろ
ト／〕１メ効果は最小限に抑えられろ。分離段階また（
ｊ洗どｆ１段階を行うことなく、検定結果を得ろことが
できろ。

ごの発明の内容を明示し、理解を得ろために、以上、？
（−）かの例を挙げて詳細に記載したが、この発明の・
ｆｎｎ円内、な才３若干の変更または修前１を実施でき
ろことは言うまでもない。

特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド 代理　人　弁理士青　山　葆　他１名 −４〇−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中に存在するリガンドおよびその同種受容体か
   ら成る特異的結合対の構成要素（「ｓｂｐ構成要素」）
   を測定する方法において、 （ａ）水性媒質中で、（１）上記試料、（２）相補的ｓ
   ｂｐ構成要素であって、上記ｓｂｐ構成要素または上記
   相補的ｓｂｐ構成要素の少なくとも一方が細胞表面と結
   合しているものおよび（３）上記細胞内にとり込み可能
   な蛍光剤を合わせ、 （ｂ）上記細胞を水性媒質から分離することなく、上記
   細胞の凝集の結果生じる蛍光変化を測定し、この蛍光変
   化を指標として上記ｓｂｐ構成要素の存在を知る ことからなる方法。 ２、ｓｂｐ構成要素が細胞表面構成要素である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３、相補的ｓｂｐ構成要素が表面抗原の受容体である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、細胞が赤血球である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ５、蛍光変化を非フロー式血球計算法、好ましくはファ
   イバー・オプティック血球計算器によって測定する特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ６、蛍光剤が膜易溶性染料、好ましくはスクアレート染
   料である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、全血試料中の特異的結合対構成要素（「ｓｈｐ構成
   要素」）を測定する方法において、 （ａ）水性媒質中で、（１）上記試料、（２）相補的ｓ
   ｂｐ構成要素であって、上記ｓｈｐ構成要素または上記
   相補的ｓｂｐ構成要素の少なくとも一方が細胞表面と結
   合しているものおよび（３）上記細胞内にとり込み可能
   な蛍光剤を合わせ、 （ｂ）上記細胞を水性媒質から分離することなく、上記
   ｓｂｐ構成要素の存在の指標として蛍光変化を測定する ことからなる方法。 ８、蛍光変化を非フロー式血球計算法、好ましくはファ
   イバー、オプティック血球計算器によって測定する特許
   請求の範囲第７項記載の方法。 ９、蛍光剤が膜易溶性染料、好ましくはスクアレート染
   料である特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、細胞が赤血球であり、ｓｂｐ構成要素が表面抗原
   である特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１、表面抗原がＡ、Ｂ、Ｄおよび免疫グロブリンから
   なる抗原群から選ばれる特許請求の範囲第１０項記載の
   方法。 １２、蛍光変化が、細胞凝集の結果生じる特許請求の範
   囲第７項記載の方法。 １３、蛍光剤が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３およびＲ＿４は、それ
   ぞれ独立して炭素原子数２〜１６個のアルキルおよび炭
   素原子数２〜１６個のアラルキルおよび原子数２〜１６
   個のアラルキルから成る群から選ばれ、ここで上記の基
   は、同じ基であってもまたは異なった基であってもよく
   、また、ＯＨ、ＣＯＮＨＲ＾１、ＳＲ＾１、ＯＲ＾１か
   ら成る群から選ばれる置換基で置換されていることもで
   き、ここにおいてＲ＿１は、炭素原子数１〜６個の低級
   アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ＿２、オキソカル
   ボニル、ＣＮであり、Ｒ＿５およびＲ＿６は、それぞれ
   独立して水素、メトキシおよびヒドロキシから成る群か
   ら選ばれる）または、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２およびＲ＿３は、それぞれ独立
   して炭素原子数２〜１６個のアルキルおよび炭素原子数
   ２〜１６個のアラルキルから成る群から選ばれ、ここで
   上記の基は、同じ基であってもまたは異なった基であっ
   てもよく、また、ＯＨ、ＣＯＮＨＲ＾１、ＳＲ＾１、Ｏ
   Ｒ＾１から成る群から選ばれる置換基で置換されている
   こともでき、ここにおいてＲ＾１は、炭素原子数１〜６
   個の低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ＿２、オ
   キソカルボニルおよびＣＮである） から成る群から選ばれる式で示されるスクアレート染料
   である特許請求の範囲第７項記載の方法。 １４、赤血球細胞凝集反応を用いる赤血球型判定方法に
   おいて、上記細胞を、細胞内にとり込み可能な蛍光剤と
   合わせることから成る改良方法。 １５、蛍光剤が、６００ナノメーターより大きい吸収波
   長を有するスクアレート染料であり、好ましくは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３およびＲ＿４は、それ
   ぞれ独立して炭素原子数２〜１６個のアルキルおよび炭
   素原子数２〜１６個のアラルキルおよび原子数２〜１６
   個のアラルキルから成る群から選ばれ、ここで上記の基
   は、同じ基であってもまたは異なった基であってもよく
   、また、ＯＨ、ＣＯＮＨＲ＾１、ＳＲ＾１、ＯＲ＾１か
   ら成る群から選ばれる置換基で置換されていることもで
   き、ここにおいてＲ＾１は、低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、
   Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ＿２、オキソカルボニル、ＣＮであり、
   Ｒ＿５およびＲ＿６は、それぞれ独立して水素、メトキ
   シおよびヒドロキシから成る群から選ばれる） または、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２およびＲ＿３は、それぞれ独立
   して炭素原子数２〜１６個のアルキルおよび炭素原子数
   ２〜１６個のアラルキルから成る群から選ばれ、ここで
   上記の基は、同じ基であってもまたは異なった基であっ
   てもよく、また、ＯＨ、ＣＯＮＨＲ＾１、ＳＲ＾１、Ｏ
   Ｒ＾１から成る群から選ばれる置換基で置換されている
   こともでき、ここにおいてＲ＾１は、炭素原子数１〜６
   個の低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ＿２、オ
   キソカルボニルおよびＣＮである） から成る群から選ばれる式で示されるスクアレート染料
   である特許請求の範囲第１４項記載の方法。