JPS6169731A - ワクチン用ポリペプチド - Google Patents
ワクチン用ポリペプチドInfo
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- JPS6169731A JPS6169731A JP60193013A JP19301385A JPS6169731A JP S6169731 A JPS6169731 A JP S6169731A JP 60193013 A JP60193013 A JP 60193013A JP 19301385 A JP19301385 A JP 19301385A JP S6169731 A JPS6169731 A JP S6169731A
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- Japan
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- protein
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はワクチンの調製１こ関し、ざらに詳しくは、組
換型ＤＮＡ技術によるワクチン用インフルエンザウィル
ス・ポリペプチドの調製に関する。
換型ＤＮＡ技術によるワクチン用インフルエンザウィル
ス・ポリペプチドの調製に関する。
発明の背景
インフルエンザウィルス感染は、時々、世界的規模でヒ
ト、豚、馬および鶏に急性呼吸器疾患を引き起こす。イ
ンフルエンザウィルスはオルソミクンウイルスであり、
それ自体は直径８０〜１２０ｎｍのピリオンを包含し、
２つの異なる糖タンパク質スパイクを有する。３つの型
Ａ、Ｂ、およびＣがヒトに感染する。時おりＢ型の感染
の流行もあるが、Ａ型ウィルスは、近年のヒトにおける
流行の大部分の原因である。既知の豚、馬、および鶏ウ
ィルスは全てＡ型である。
ト、豚、馬および鶏に急性呼吸器疾患を引き起こす。イ
ンフルエンザウィルスはオルソミクンウイルスであり、
それ自体は直径８０〜１２０ｎｍのピリオンを包含し、
２つの異なる糖タンパク質スパイクを有する。３つの型
Ａ、Ｂ、およびＣがヒトに感染する。時おりＢ型の感染
の流行もあるが、Ａ型ウィルスは、近年のヒトにおける
流行の大部分の原因である。既知の豚、馬、および鶏ウ
ィルスは全てＡ型である。
Ａ型ウィルスは、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニ
ダーゼ（ＮＡ）表面糖タンパク質についての抗原特性に
基づいて亜型に分けられる。
ダーゼ（ＮＡ）表面糖タンパク質についての抗原特性に
基づいて亜型に分けられる。
Ａ型の中で亜型Ｈ１（豚インフルエンザ）、Ｈ２（アジ
アインフルエンザ）およびＨ３（香港インフルエンザ）
がヒト感染において優勢である。
アインフルエンザ）およびＨ３（香港インフルエンザ）
がヒト感染において優勢である。
１−Ｉ ＡおよびＮＡタンパク質中の抗原決定因子に影
響をおよばずおよそ１年間隔での遺伝的変動のために
通常の死菌または弱毒ウィルスを使って、「万能の」イ
ンフルエンザウィルス・ワクチン、すなわち、株非特異
性ワクチンを調製Ｔることは不可能であった。最近、異
なる株を交差Ｔることにより調製した再配列ウィルスか
らのような万能、または半万能ワクチンを調製する試み
がなされている、ごく最近、そのような試み（こ、主と
してＨＡタンパク質に焦点を合わせた組換型ＤＮＡ技術
か包含されるようになっている。
響をおよばずおよそ１年間隔での遺伝的変動のために
通常の死菌または弱毒ウィルスを使って、「万能の」イ
ンフルエンザウィルス・ワクチン、すなわち、株非特異
性ワクチンを調製Ｔることは不可能であった。最近、異
なる株を交差Ｔることにより調製した再配列ウィルスか
らのような万能、または半万能ワクチンを調製する試み
がなされている、ごく最近、そのような試み（こ、主と
してＨＡタンパク質に焦点を合わせた組換型ＤＮＡ技術
か包含されるようになっている。
ウィンターら（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ、）はＡ／Ｐ
Ｂ４７３４株（１■ＩＮＩ）のＨＡのＤＮＡコーディン
グ配列を報告している〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
２９２巻、７２〜７５頁（１９８１）］。本株のＩ−Ｉ
Ａ ＩおよびＨＡ２サブユニットのアミノ酸およびヌ
クレオチド配列の相同チを亜型Ｈ２、Ｈ３、およびＨ７
の代表的な株のそれらと比較した。
Ｂ４７３４株（１■ＩＮＩ）のＨＡのＤＮＡコーディン
グ配列を報告している〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
２９２巻、７２〜７５頁（１９８１）］。本株のＩ−Ｉ
Ａ ＩおよびＨＡ２サブユニットのアミノ酸およびヌ
クレオチド配列の相同チを亜型Ｈ２、Ｈ３、およびＨ７
の代表的な株のそれらと比較した。
・ハエズら（Ｂａｅｚ ｅｔ ａｌ、）は〜’ＰＲ／８
／３４株の非構ｍ（Ｎ” ）タンパク質のＤＮＡコーデ
ィング配列を報告している〔ニュークレイツク・アシッ
ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ 、 Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、）
、８巻、５８４５〜５８５７頁（１９８０）］。
／３４株の非構ｍ（Ｎ” ）タンパク質のＤＮＡコーデ
ィング配列を報告している〔ニュークレイツク・アシッ
ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ 、 Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、）
、８巻、５８４５〜５８５７頁（１９８０）］。
ヤングら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ、）はジ・オリジン
・オブ・パンデミツク・インフルエンザ・バイラシーズ
（Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉ −ｒｕｓｅｓ）、１９８３、
ダブリュー・ジー・レイパー編、エルスヴイール・サイ
エンス・パフリッシング・カンパニー（ｅｄｉｔ、ｂｙ
Ｗ、Ｇ、 Ｌａｖｅｒ、 Ｅｌ ｓ −ｅｖｉｅｒ
５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、）、お
よびプロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・
スティソ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ 、Ｎａ Ｌｌ
。
・オブ・パンデミツク・インフルエンザ・バイラシーズ
（Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉ −ｒｕｓｅｓ）、１９８３、
ダブリュー・ジー・レイパー編、エルスヴイール・サイ
エンス・パフリッシング・カンパニー（ｅｄｉｔ、ｂｙ
Ｗ、Ｇ、 Ｌａｖｅｒ、 Ｅｌ ｓ −ｅｖｉｅｒ
５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、）、お
よびプロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・
スティソ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ 、Ｎａ Ｌｌ
。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８０巻、６１０５〜６１
０９頁（１９８３）において、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）のＡ／ＰＲ／８／３４株からの８個のＲＮＡセグメ
ント全てのｃＤＮＡのクローニング、およびイー・コリ
のＮＳＩタンパク質の高レベル発現を報告している。
０９頁（１９８３）において、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）のＡ／ＰＲ／８／３４株からの８個のＲＮＡセグメ
ント全てのｃＤＮＡのクローニング、およびイー・コリ
のＮＳＩタンパク質の高レベル発現を報告している。
エムティジら（Ｅｍｔａｇｅ ｅｔ ａｌ、）の米国特
許第４３５７４２１号はインフルエンザウィルスＨＡ遺
伝子のコーディング配列のクローニングおよび発現を開
示し、ｆ−Ｉ Ａポリペプチドがワクチン目的で投与で
きる抗原であることを開示している。
許第４３５７４２１号はインフルエンザウィルスＨＡ遺
伝子のコーディング配列のクローニングおよび発現を開
示し、ｆ−Ｉ Ａポリペプチドがワクチン目的で投与で
きる抗原であることを開示している。
ザ・モービデイテイ・アンド・モータリテイ・ウィーク
リー・レポート（Ｔｈｅ Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ
Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒす、３
３巻、１９号、２５３〜２６１頁には、ＨＡタンパク質
金含有ヒトワクチン投与量および投与方法を含む最も最
近のインフルエンザウィルスの予防および抑制計画か論
評されている。
リー・レポート（Ｔｈｅ Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ
Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒす、３
３巻、１９号、２５３〜２６１頁には、ＨＡタンパク質
金含有ヒトワクチン投与量および投与方法を含む最も最
近のインフルエンザウィルスの予防および抑制計画か論
評されている。
デービスら（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ、）のジー７（Ｇ
ｅｎｅ）、２１巻、２７３〜２８４頁（１９８３）はＨ
Ａ由来ポリペプチドに対するマウスにおける免疫応答を
報告している。
ｅｎｅ）、２１巻、２７３〜２８４頁（１９８３）はＨ
Ａ由来ポリペプチドに対するマウスにおける免疫応答を
報告している。
さらにいくつかの文献がＡ／ＰＲ／８／３４ および他
の株のＨＡ、ＮＳ、および他のインフルエンザウィルス
遺伝子のクロー二゛ングおよび発現を報告している。そ
のような文献のいくつかは以下ｔこ引用している。
の株のＨＡ、ＮＳ、および他のインフルエンザウィルス
遺伝子のクロー二゛ングおよび発現を報告している。そ
のような文献のいくつかは以下ｔこ引用している。
発明の要約
一つの態様において、本発明は、ＨＡタンパク質のＨＡ
２サブユニットの免疫原決定因子を有する、ＨＡタンパ
ク質以外のペプチドからなるインフルエンザウィルスに
よる感染に対して動物における防御を刺激するワクチン
である。
２サブユニットの免疫原決定因子を有する、ＨＡタンパ
ク質以外のペプチドからなるインフルエンザウィルスに
よる感染に対して動物における防御を刺激するワクチン
である。
他の態様において、本発明は、ＨＡ２サブユニットの免
疫原決定因子からなり、本発明のワクチンに使用できる
、ＨＡタンパク質以外のポリペプチドである。本発明の
この態様の好ましい具体例を本明細書ではＣ１３タンパ
ク質と称する。
疫原決定因子からなり、本発明のワクチンに使用できる
、ＨＡタンパク質以外のポリペプチドである。本発明の
この態様の好ましい具体例を本明細書ではＣ１３タンパ
ク質と称する。
他の態様において、本発明は、コーディング配列のみ、
またはＤＮＡクローニングまたは発現ベクターのような
より大きな分子への取り込みを含め、本発明のワクチン
用ポリペプチドのコーディング配列を含むＤＮＡ分子、
およびそのようなりＮＡ分子で形質転換した微生物また
は細胞である。
またはＤＮＡクローニングまたは発現ベクターのような
より大きな分子への取り込みを含め、本発明のワクチン
用ポリペプチドのコーディング配列を含むＤＮＡ分子、
およびそのようなりＮＡ分子で形質転換した微生物また
は細胞である。
発明の詳説
しばしば、免疫原決定因子は、免疫防御応答を刺激しな
い。これは、大部分、宿主の身体防御系（こついての決
定因子か適当な配置で存在していないためであると考え
られる。
い。これは、大部分、宿主の身体防御系（こついての決
定因子か適当な配置で存在していないためであると考え
られる。
以下に開示するように、ＨＡタンパク質のＨＡ２サブユ
ニットの免疫原決定因子（１つまたはそれ以北の隣接し
た、または分離したハプテンからなってよい）は、驚く
べきことに、もとの亜型中の種々の株に対して細胞毒性
Ｔ細胞応答を誘発する。したかって、ｌＩ Ａ ２免疫
原決定因子は、免疫原配置で存在する場合、株特異的で
あるよりもむしろ亜を特異的である防御免疫応答を誘発
できる。
ニットの免疫原決定因子（１つまたはそれ以北の隣接し
た、または分離したハプテンからなってよい）は、驚く
べきことに、もとの亜型中の種々の株に対して細胞毒性
Ｔ細胞応答を誘発する。したかって、ｌＩ Ａ ２免疫
原決定因子は、免疫原配置で存在する場合、株特異的で
あるよりもむしろ亜を特異的である防御免疫応答を誘発
できる。
例えば、ｌｌＡ２決定因子を、１ｌＡ２サブユニツトに
免疫原配置？とらせることによって免疫原決定因子（こ
免疫応答をさせる第２のポリペプチドに融合した１−Ｉ
Ａ ２サブユニツト、すなわち、実質的：こＨＡタン
パク質のＨＡ２サブユニット全体からなるワクチン用ポ
リペプチド中に存在させることができる。
免疫原配置？とらせることによって免疫原決定因子（こ
免疫応答をさせる第２のポリペプチドに融合した１−Ｉ
Ａ ２サブユニツト、すなわち、実質的：こＨＡタン
パク質のＨＡ２サブユニット全体からなるワクチン用ポ
リペプチド中に存在させることができる。
好ましくは、ＨＡ２免疫原決定因子（こ対しそのような
免疫応答をさせるポリペプチドは、原核生物または真核
生物の組換型宿主により高レベルで発現される、実質的
にＨＡ２サブユニット全体のＮ末端に融合したアミノ酸
配列からなる。特に好ましくは、インフルエンザウィル
スタンパク質由来のポリペプチドである。ｆ（Ａタンパ
ク質の免疫防御応答は、株特異性であると考えられるた
め、ワクチン用ポリペプチドはＨＡタンパク質ではない
。
免疫応答をさせるポリペプチドは、原核生物または真核
生物の組換型宿主により高レベルで発現される、実質的
にＨＡ２サブユニット全体のＮ末端に融合したアミノ酸
配列からなる。特に好ましくは、インフルエンザウィル
スタンパク質由来のポリペプチドである。ｆ（Ａタンパ
ク質の免疫防御応答は、株特異性であると考えられるた
め、ワクチン用ポリペプチドはＨＡタンパク質ではない
。
イー・コリ中のｌ−Ｉ Ａ ２免疫原決定因子をもつそ
のようなワクチン用ポリペプチドを発現させるためには
、ＨＡ２決定因子に免疫応答を可能にさせるポリペプチ
ドは、好ましくは、ＮＳ１インフルエンザウイルス・タ
ンパク質のＮ末端である。その代表的かつ好ましい具体
例は、本明細訂てＣ１３と称するタンパク質である。０
１３タンパク質は、ｌＩ Ａ １複製開始点のセリンお
よびアルギニンを介して、ＨＡ ２サブユニット全体に
融合したＮＳＩタンパク質の最初の８１個のアミノ酸を
有する。
のようなワクチン用ポリペプチドを発現させるためには
、ＨＡ２決定因子に免疫応答を可能にさせるポリペプチ
ドは、好ましくは、ＮＳ１インフルエンザウイルス・タ
ンパク質のＮ末端である。その代表的かつ好ましい具体
例は、本明細訂てＣ１３と称するタンパク質である。０
１３タンパク質は、ｌＩ Ａ １複製開始点のセリンお
よびアルギニンを介して、ＨＡ ２サブユニット全体に
融合したＮＳＩタンパク質の最初の８１個のアミノ酸を
有する。
本発明のワクチン用ポリペプチドは化学的合成技術（こ
より調製できる。しかし、好ましくは、宿主微生物また
は細胞内で該ポリペプチドのコーディング配列もつＤＮ
Ａフラグメントをクローニングおよび発現することによ
り、公知の組換型ＤＮ°Ａ技術で調製する。多量の所望
のタンパク質を安全かつ安１面に生産するために使用で
きるので、宿主は、イー・コリか好ましい。
より調製できる。しかし、好ましくは、宿主微生物また
は細胞内で該ポリペプチドのコーディング配列もつＤＮ
Ａフラグメントをクローニングおよび発現することによ
り、公知の組換型ＤＮ°Ａ技術で調製する。多量の所望
のタンパク質を安全かつ安１面に生産するために使用で
きるので、宿主は、イー・コリか好ましい。
インフルエンザウィルスのＨＡ ２％ＮＳ１、および池
のウィルス性タンパク質のコーディング配列は１合成的
に調製でき、また、公知の技術によりウィルスＲＮＡか
ら誘導することができ、また、入手可能なｃＤＮＡ含を
プラスミドから誘導Ｔることができる。例えば前記文献
に加え、ゲシングら（Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ、
） はＡ／ジャパン／３０５１５７株からのＨＡのＤ
ＮＡコーディング配列をクローンし、配列したことを報
告しており〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、８７巻、３
０１〜３０６頁（１９８０〕〕、スリーら（Ｓｌｅｉｇ
ｈ ｅｔ ａｌ、）およびボ’７スら（Ｂｏｔｈ ｅｔ
ａｌ、）は、共に、 Ａ／ＮＴ／６０／６８株のＨＡ
ココ−ィング配列をクローンしたことを報告してオリ〔
デイベロップメンツ・イン・セル・バイオロジー、エル
スヴイール・サイエンス・ハフリッシング・カンパニー
（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ＣｅｌｌＢｉｏｌ
ｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ。
のウィルス性タンパク質のコーディング配列は１合成的
に調製でき、また、公知の技術によりウィルスＲＮＡか
ら誘導することができ、また、入手可能なｃＤＮＡ含を
プラスミドから誘導Ｔることができる。例えば前記文献
に加え、ゲシングら（Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ、
） はＡ／ジャパン／３０５１５７株からのＨＡのＤ
ＮＡコーディング配列をクローンし、配列したことを報
告しており〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、８７巻、３
０１〜３０６頁（１９８０〕〕、スリーら（Ｓｌｅｉｇ
ｈ ｅｔ ａｌ、）およびボ’７スら（Ｂｏｔｈ ｅｔ
ａｌ、）は、共に、 Ａ／ＮＴ／６０／６８株のＨＡ
ココ−ィング配列をクローンしたことを報告してオリ〔
デイベロップメンツ・イン・セル・バイオロジー、エル
スヴイール・サイエンス・ハフリッシング・カンパニー
（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ＣｅｌｌＢｉｏｌ
ｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ。
）６９〜７９頁および８１〜８９頁（１９８０）〕、デ
デースら（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ、）およびヒチら（
Ｈｉｔｉ ｅｔ ａｌ、）はＡ／ＶＶ Ｓ Ｎ／ ３３
株のＨＡココ−ィング配列をクローンしたことを報告し
ている〔ジー７ （Ｇｅｎｅ）、１０巻、２０５−２１
８頁（１９８０）およびパイロｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇ
Ｙ）、１１１巻、１１３〜１２４頁（１９８１）］。ポ
ーターら（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ、）およびエムテ
ィジら（Ｅｍ ｔ −ａｇｅ ｅｔ ａｌ、）は、共に
、鶏ペストウィルスのＨＡココ−ィング配列をクローン
したことを報告していル（デイベロツプメンツ・イン・
セル・バイオロジー（１）ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉ
ｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）＋前記、３９〜４９頁
および１５７〜１６８頁〕。
デースら（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ、）およびヒチら（
Ｈｉｔｉ ｅｔ ａｌ、）はＡ／ＶＶ Ｓ Ｎ／ ３３
株のＨＡココ−ィング配列をクローンしたことを報告し
ている〔ジー７ （Ｇｅｎｅ）、１０巻、２０５−２１
８頁（１９８０）およびパイロｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇ
Ｙ）、１１１巻、１１３〜１２４頁（１９８１）］。ポ
ーターら（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ、）およびエムテ
ィジら（Ｅｍ ｔ −ａｇｅ ｅｔ ａｌ、）は、共に
、鶏ペストウィルスのＨＡココ−ィング配列をクローン
したことを報告していル（デイベロツプメンツ・イン・
セル・バイオロジー（１）ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉ
ｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）＋前記、３９〜４９頁
および１５７〜１６８頁〕。
また、他の株、亜型、および型を含むインフルエンザウ
ィルスは、臨床試料および米国、メリーランド州、ロッ
クビレ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ。
ィルスは、臨床試料および米国、メリーランド州、ロッ
クビレ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ。
Ｓ、Ａ、）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ンヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ ｃｕｒ
ｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）のような公的寄託機関から
入手できる。
ンヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ ｃｕｒ
ｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）のような公的寄託機関から
入手できる。
例えば、イー・コリ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サツ
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ）および哺乳
類ならびに昆虫細胞を含む種々の微生物および細胞中で
ワクチン用ポリペプチドをクローニングおよび発現する
ための系が知られており、私的および公的研究所および
寄託機関、および商業的販売者から入手できる。
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サツ
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ）および哺乳
類ならびに昆虫細胞を含む種々の微生物および細胞中で
ワクチン用ポリペプチドをクローニングおよび発現する
ための系が知られており、私的および公的研究所および
寄託機関、および商業的販売者から入手できる。
本発明のワクチンは、１またはそれ以上の本発明のワク
チン用ポリペプチドおよび担体または希釈剤からなる。
チン用ポリペプチドおよび担体または希釈剤からなる。
例えば、そのようなワクチンは、実質的に、いくつかの
亜型の各々がらのＨＡ２サブユニット全体からなること
ができ、各々は、生理食塩水または他の生理溶液中で高
度に保存されたＮＳ１タンパク質のＮ末端アミノ酸に融
合している。水酸化アルミニウムのようなアジュバント
の使用も好ましい。好ましいワクチンは２３つのワクチ
ン用ポリペプチドからなり、各々は実質的に、Ｃ１３タ
ンパク質の場合と同様、いずれかのＮＳＩタンパク質の
最初の８０アミノ酸の周囲に融合したｔｔ １、Ｈ２お
よびＨ３亜型の１つからのＨＡ２サブユニット全体から
なっている。また、多価ワクチンが、サブユニットまた
はポリペプチド抗原または死菌ウィルスもしくは細菌の
ようなインフルエンザウィルスまたは他の病ＩＪＨ８に
由来する追加免疫原と結合した本発明の１つまたはそれ
以上のポリペプチドから調製でき、インフルエンザウィ
ルスと、他の侵入生物またはウィルスに対する防御を刺
激できるワクチンを生産する。
亜型の各々がらのＨＡ２サブユニット全体からなること
ができ、各々は、生理食塩水または他の生理溶液中で高
度に保存されたＮＳ１タンパク質のＮ末端アミノ酸に融
合している。水酸化アルミニウムのようなアジュバント
の使用も好ましい。好ましいワクチンは２３つのワクチ
ン用ポリペプチドからなり、各々は実質的に、Ｃ１３タ
ンパク質の場合と同様、いずれかのＮＳＩタンパク質の
最初の８０アミノ酸の周囲に融合したｔｔ １、Ｈ２お
よびＨ３亜型の１つからのＨＡ２サブユニット全体から
なっている。また、多価ワクチンが、サブユニットまた
はポリペプチド抗原または死菌ウィルスもしくは細菌の
ようなインフルエンザウィルスまたは他の病ＩＪＨ８に
由来する追加免疫原と結合した本発明の１つまたはそれ
以上のポリペプチドから調製でき、インフルエンザウィ
ルスと、他の侵入生物またはウィルスに対する防御を刺
激できるワクチンを生産する。
そのようなワクチンの処方技術は公知である。例えば、
ワクチン用ポリペプチドおよび複合ワクチンの場合の他
の免疫原は凍結乾燥でき、後に生理食塩水または他の生
理溶液で再水和てきる。
ワクチン用ポリペプチドおよび複合ワクチンの場合の他
の免疫原は凍結乾燥でき、後に生理食塩水または他の生
理溶液で再水和てきる。
投与量および投与方法は標準的なワクチン接種法により
最適比できる。経口、眼球内および鼻腔内投与のような
他の投与経路を使用できるが、典型的）こは、該ワクチ
ンは筋肉内に投与する。他のポリペプチドワクチンに関
する公知事実に基いて。
最適比できる。経口、眼球内および鼻腔内投与のような
他の投与経路を使用できるが、典型的）こは、該ワクチ
ンは筋肉内に投与する。他のポリペプチドワクチンに関
する公知事実に基いて。
平均成人に対する一回有効投与量は１．５〜１５０μｇ
、好ましくは１０〜１００μｇであると考えられるっ該
ワクチンは、最初は、晩夏または初秋に投与でき、所望
ならば２〜６週間後に、または免疫が弱まる毎に定期的
に、例えば２〜５年毎に再投与できる。
、好ましくは１０〜１００μｇであると考えられるっ該
ワクチンは、最初は、晩夏または初秋に投与でき、所望
ならば２〜６週間後に、または免疫が弱まる毎に定期的
に、例えば２〜５年毎に再投与できる。
久１こ実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。
、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．プラスミドｐＭ３０
プラスミドＰＡＰＲ７０１は、ＭｌおよびＭ２インフル
エンザウィルス・タンハク質（Ａ／ ＰＲ／８／３４）
のコーディング領域をもつＰ ＢＲ３２２由来のクロー
ニング・ベクターである。ヤングら（ｙｏｕｎｇ ｅｔ
ａｌ 、）ジ・オリジン・オブ・パンデミツク・イン
フルエンザ・バイラシーズ（Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ｏ
［ＰａｎｄａｎｉｃＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ）、１９８３、ダブリユウ・シイ・レイバー（Ｗ−Ｇ
−Ｌａｖｅｒ ） 、エルスヴイール・サイエンス・パ
ブリイシング・カンパニー（Ｅｌ ｓ −ｅｖｉｅｒ
５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、）に記
載されている。
エンザウィルス・タンハク質（Ａ／ ＰＲ／８／３４）
のコーディング領域をもつＰ ＢＲ３２２由来のクロー
ニング・ベクターである。ヤングら（ｙｏｕｎｇ ｅｔ
ａｌ 、）ジ・オリジン・オブ・パンデミツク・イン
フルエンザ・バイラシーズ（Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ｏ
［ＰａｎｄａｎｉｃＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ）、１９８３、ダブリユウ・シイ・レイバー（Ｗ−Ｇ
−Ｌａｖｅｒ ） 、エルスヴイール・サイエンス・パ
ブリイシング・カンパニー（Ｅｌ ｓ −ｅｖｉｅｒ
５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、）に記
載されている。
プラスミドｐＡＰＲ８０１は、ＮＳＩコーディング領域
をもつｐＢＲ３２２由来のクローニング・ベクターであ
る前記ヤングら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ、）に記載さ
れている。
をもつｐＢＲ３２２由来のクローニング・ベクターであ
る前記ヤングら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ、）に記載さ
れている。
プラスミドｐＡｓｌは、ＰＬプロモーター、Ｎ利用部位
（Ｎタンパク質の存在下で転写極性効果を緩和するため
）および直接ＢａｍＨＩ部位！？−ｖＣ＜ Ｃ■翻訳開
始コドンを含むＣ■リポソーム結合部位を含むｐ ＢＲ
３２２由来の発現ベクターである。ローゼンハークら（
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、）＋メソツズーイン
・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ
、）、１０１巻、１２３〜１３８頁（１９８３）に記載
されている。
（Ｎタンパク質の存在下で転写極性効果を緩和するため
）および直接ＢａｍＨＩ部位！？−ｖＣ＜ Ｃ■翻訳開
始コドンを含むＣ■リポソーム結合部位を含むｐ ＢＲ
３２２由来の発現ベクターである。ローゼンハークら（
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、）＋メソツズーイン
・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ
、）、１０１巻、１２３〜１３８頁（１９８３）に記載
されている。
プラスミドｐＡｓ ｌΔＥｌｌは、 ｐＡｓｌからの
ｐ ＢＲ３２２複製開始点の非必須Ｅｃｏ Ｒ１−［−
１ｉ ｎ ｄｌ［領域を欠失させることによって調製す
る。ウィルスの複製開始点の８６１塩基対およびｐＢＲ
３２２の複製開始点の３７５塩基対中のＮＳ１コーデイ
ング領域を含んているｐＡ ＰＲ８０１の１２３６塩基
対ＢａｍＨＩフラグメントをｐＡｓｌΔＥＨのＢａｍＨ
Ｉ部位に挿入する。得られたプラスミドｐＡｓｌΔＥＨ
／８０１ は標品のＮ５Ｉ（２３０アミノ酸）を発現
Ｔる。このプラスミドは、アミノ酸８１および８２につ
いてのコドン間にＮｃｏ １部位、およびＮＳ配列に対
するＮｒｕ１部位３′を有している。アミノ酸１および
２間のＢａｍ １−１１部位は保持されている。
ｐ ＢＲ３２２複製開始点の非必須Ｅｃｏ Ｒ１−［−
１ｉ ｎ ｄｌ［領域を欠失させることによって調製す
る。ウィルスの複製開始点の８６１塩基対およびｐＢＲ
３２２の複製開始点の３７５塩基対中のＮＳ１コーデイ
ング領域を含んているｐＡ ＰＲ８０１の１２３６塩基
対ＢａｍＨＩフラグメントをｐＡｓｌΔＥＨのＢａｍＨ
Ｉ部位に挿入する。得られたプラスミドｐＡｓｌΔＥＨ
／８０１ は標品のＮ５Ｉ（２３０アミノ酸）を発現
Ｔる。このプラスミドは、アミノ酸８１および８２につ
いてのコドン間にＮｃｏ １部位、およびＮＳ配列に対
するＮｒｕ１部位３′を有している。アミノ酸１および
２間のＢａｍ １−１１部位は保持されている。
Ｍ１タンパク質のＣ末端の５０個のアミノ酸のコーディ
ング配列をもつ５７１塩基対フラグメントは、ＮｃｏＩ
およびＥｃｏ Ｒ５でのｐＡＰＲ７０１の制限によって
得られる。このフラグメントを該プラスミドからそのフ
ラグメントの欠失後のｐＡｓ ｌΔＥ１７８０１中のＮ
ｃｏｌおよびＮｒｕ Ｉ部位間に挿入する。
ング配列をもつ５７１塩基対フラグメントは、ＮｃｏＩ
およびＥｃｏ Ｒ５でのｐＡＰＲ７０１の制限によって
得られる。このフラグメントを該プラスミドからそのフ
ラグメントの欠失後のｐＡｓ ｌΔＥ１７８０１中のＮ
ｃｏｌおよびＮｒｕ Ｉ部位間に挿入する。
得られたプラスミドｐＭ３０は、Ｍｌの最後の５０個の
アミノ酸に融合したＮＳ１の最初の８１個のアミノ酸で
ある融合タンパク質をコードする。
アミノ酸に融合したＮＳ１の最初の８１個のアミノ酸で
ある融合タンパク質をコードする。
ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位は保持されている。
実施例２ プラスミドｐｃ１３
プラスミドＰＪＺ１０２ は、全ＨＡタンパク質（Ａ／
ＰＲ／８／３４）のコーディング領域をもつｐＢＲ３２
２由来のクローニング・ベクターである。実施例１で引
用した一ＩＦ７グら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ、）
に記載されている。
ＰＲ／８／３４）のコーディング領域をもつｐＢＲ３２
２由来のクローニング・ベクターである。実施例１で引
用した一ＩＦ７グら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ、）
に記載されている。
プラスミドＰＢｇｌ■はＰＢＲ３２２中のＮｒｕ１部位
においてＢｇｌＩＩＩＪンカーをもつｐＢＲ３２２由来
のクローニング・ベクターである。
においてＢｇｌＩＩＩＪンカーをもつｐＢＲ３２２由来
のクローニング・ベクターである。
ｐＪＺ１０２ はＭｎ１Ｉ で切断サレる。３ｇｌｎリ
ンカ−を全末端に連結し、ＨＡ２含有フラグメントを再
挿入する。得られたプラスミドｐＢｇｌ ｕ／ＨＡＺ中
の５′末端は次のように配列している。
ンカ−を全末端に連結し、ＨＡ２含有フラグメントを再
挿入する。得られたプラスミドｐＢｇｌ ｕ／ＨＡＺ中
の５′末端は次のように配列している。
領域１はＢｇｌ ｎリンカ−に由来し、アスパラギンお
よびロイシンをコードする。領域２はＨＡＩに由来し、
セリンおよびアルギニンをコードする。
よびロイシンをコードする。領域２はＨＡＩに由来し、
セリンおよびアルギニンをコードする。
領域３はＩ−［Ａ ２に由来し、ｌ−ｌＡ２サブユニッ
トの全アミノ酸をコードする。
トの全アミノ酸をコードする。
３′末端は次のよう１こ配列している。
領域４は１−Ｉ Ａ ２停止コドンである。領域５はウ
ィルス複製開始点の３′非コ一デイング配列である。
ィルス複製開始点の３′非コ一デイング配列である。
領域６はＢｇｌ ＩＩ ＩＪンカーに由来する。
１−１ Ａ ２コ一デイング配列をもつ６９１塩基対フ
ラグメントはＢｇｌ ＩＩ によるｐＢｇｌ ＩＩ／
ＨＡ２の制限（こよって得られる。該フラグメントの末
端をＤＮΔｐｏｌｌ（クレノー）でふさぎ、ＮｃｏＩて
切断し、同様に末端をふさいだ（クレノー） ｐＡｓｌ
デルタＥｌ−１／８０１ に連結させる。得られたプラ
スミドはｐｃ１３である。Ｎ５Ｉ−ＨＡ２平滑末端は次
のように配列している。
ラグメントはＢｇｌ ＩＩ によるｐＢｇｌ ＩＩ／
ＨＡ２の制限（こよって得られる。該フラグメントの末
端をＤＮΔｐｏｌｌ（クレノー）でふさぎ、ＮｃｏＩて
切断し、同様に末端をふさいだ（クレノー） ｐＡｓｌ
デルタＥｌ−１／８０１ に連結させる。得られたプラ
スミドはｐｃ１３である。Ｎ５Ｉ−ＨＡ２平滑末端は次
のように配列している。
領域７はＮＳＩ遺伝子に由来する。領域１．２および３
は前記と同様である。
は前記と同様である。
実施例３．Ｃ：１３タンパク質の生産
イー・コリ宿主Ｎ５１５１株である温度感受性ラムダ溶
原（ｃＩ８５７）をｐ（：１３を用いて形質転換する。
原（ｃＩ８５７）をｐ（：１３を用いて形質転換する。
形質転換体を１００μｇ／Ｒｅ のアンピシリンを補足
したＬＢジブロス中３２℃で中央対数期（Ａ２６ｏ＝０
．６）まで増殖させる。次いて、培養物を４２℃に移し
、ｃｌを不活化してＣ１３タンパク質の合成を促す。４
２℃で２時間後、遠心分離して（３５００ｒｐｍ、２０
分間）菌体を集め、菌体ペレットを一２０℃で凍結させ
る。
したＬＢジブロス中３２℃で中央対数期（Ａ２６ｏ＝０
．６）まで増殖させる。次いて、培養物を４２℃に移し
、ｃｌを不活化してＣ１３タンパク質の合成を促す。４
２℃で２時間後、遠心分離して（３５００ｒｐｍ、２０
分間）菌体を集め、菌体ペレットを一２０℃で凍結させ
る。
ペレットを解凍し、緩衝液Ａ （５Ｑ ｍ Ｍ ） Ｉ
Ｊス−ＨＣ４、ｐＨ３，０，２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジ
チオトレイトール、５％（ｖ／ｖ〕グリセロール〕中で
再懸濁させる。リゾチームを最終濃度が０．２■／尻ｇ
になるまで加え、混合物を氷上で２０分間インキュベー
トする。欠いで、混合物をワーリング・ブレングー中、
高速で、１５秒間ずつ６回処理する。
Ｊス−ＨＣ４、ｐＨ３，０，２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジ
チオトレイトール、５％（ｖ／ｖ〕グリセロール〕中で
再懸濁させる。リゾチームを最終濃度が０．２■／尻ｇ
になるまで加え、混合物を氷上で２０分間インキュベー
トする。欠いで、混合物をワーリング・ブレングー中、
高速で、１５秒間ずつ６回処理する。
次いで、ブランソン・プローブ・ソニファイアを用いて
懸濁液を１分間超音波処理する。次いで、混合物を遠心
分離する（１ｓｏｏｏｒｐｍ、３０分間）。
懸濁液を１分間超音波処理する。次いで、混合物を遠心
分離する（１ｓｏｏｏｒｐｍ、３０分間）。
緩画液Ａ中で、ペレットを超音波処理して再懸濁させる
（１５秒間×４回）。次いで、混合物を０．１％デオキ
シコール酸処理し、４℃で１時間撹拌する。混合物を遠
心分離しく１５０００ｒｐｍ、３０分間）、タンパク質
を沈殿、ペレット化させる。
（１５秒間×４回）。次いで、混合物を０．１％デオキ
シコール酸処理し、４℃で１時間撹拌する。混合物を遠
心分離しく１５０００ｒｐｍ、３０分間）、タンパク質
を沈殿、ペレット化させる。
デオキンコール酸処理を繰り返し、次いで、得られたペ
レットを緩衝ＩＡ中で超音波処理して再懸濁させる。次
いで、懸濁液を１％トリトンＸ−１００で処理し、４℃
で１時間撹拌する。混合物を再び遠心分離しく１５００
０ｒｐｍ、３０分間）、り／バク質ペレットを集める。
レットを緩衝ＩＡ中で超音波処理して再懸濁させる。次
いで、懸濁液を１％トリトンＸ−１００で処理し、４℃
で１時間撹拌する。混合物を再び遠心分離しく１５００
０ｒｐｍ、３０分間）、り／バク質ペレットを集める。
タンパク質を超音波処理して再懸濁し、尿素で安定比さ
せる（最終濃度４ Ｍ ）。この溶液を遠心分離してい
ずれの粒状物質をも除去しく１５０００ｒｐｍ、３０分
間）、上清を集め、１ｅの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７゜５、ｌ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ に対して３回透析
し、尿素を除去する。タンパク質溶液を再び遠心分離し
いずれの粒状物質も除去しく１５０００ｒｐｍ、３０分
間）、Ｃ１３タンパク質を含む上清を集め、検定に使用
する。
せる（最終濃度４ Ｍ ）。この溶液を遠心分離してい
ずれの粒状物質をも除去しく１５０００ｒｐｍ、３０分
間）、上清を集め、１ｅの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７゜５、ｌ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ に対して３回透析
し、尿素を除去する。タンパク質溶液を再び遠心分離し
いずれの粒状物質も除去しく１５０００ｒｐｍ、３０分
間）、Ｃ１３タンパク質を含む上清を集め、検定に使用
する。
実施例４ Ｔ細胞検定
ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定で細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する
Ｃ１３タンパク質の能力を、Ａ／Ｉ’Ｒ／８／３４起源
の他のタンパク質のそれと比較する。他のタンパク質は
本明細書で次のとおり称している。
Ｃ１３タンパク質の能力を、Ａ／Ｉ’Ｒ／８／３４起源
の他のタンパク質のそれと比較する。他のタンパク質は
本明細書で次のとおり称している。
Ｃ７（完全ＨＡ）
デルタ７ （ＨＡｌ、およびＨＡ２の８ＯＮ末
端浅基）Ｃ３６（ＨＡ２） デルタ１３ （ＮＳＩの８ＯＮ末端残基およびｌ
−ｌＡ２の８ＯＮ末端残基） ＮＳＩ （ＮＳＩ） ＮＳ２ （ＮＳ２） Ｍ３Ｑ （ＮＳＩおよびＭ）（実施例１参照）
これらの分子を構成する各コーディング配列は、ヤング
ら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ、）ジ・オリジン・オブ・
パンデミツク・インフルエンザ轡バイラシーズ（ｔｈｅ
Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ）、１９８３、ダブリュ９・
シイ・レイバー（Ｗ。
端浅基）Ｃ３６（ＨＡ２） デルタ１３ （ＮＳＩの８ＯＮ末端残基およびｌ
−ｌＡ２の８ＯＮ末端残基） ＮＳＩ （ＮＳＩ） ＮＳ２ （ＮＳ２） Ｍ３Ｑ （ＮＳＩおよびＭ）（実施例１参照）
これらの分子を構成する各コーディング配列は、ヤング
ら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ、）ジ・オリジン・オブ・
パンデミツク・インフルエンザ轡バイラシーズ（ｔｈｅ
Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ）、１９８３、ダブリュ９・
シイ・レイバー（Ｗ。
Ｇ、Ｌａｖｅｒ）［％、エルスヴイール・サイエンス・
パブリッジング・カンパ＝ −（Ｅｌ ｓ ｅｖ ｉｅ
ｒ ５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、）
の記載に従って誘導され、実質的に前記のようなＰＡＳ
ＩΔＥＨ中で発現される。
パブリッジング・カンパ＝ −（Ｅｌ ｓ ｅｖ ｉｅ
ｒ ５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、）
の記載に従って誘導され、実質的に前記のようなＰＡＳ
ＩΔＥＨ中で発現される。
該タンパク質は、その後の菌体ペレットの再懸濁、リゾ
チーム処理、超音波処理、および遠心分離を除いて実質
的に前記と同様にして生産され、ＮＳ１タンパク質は上
清中に含まれている。
チーム処理、超音波処理、および遠心分離を除いて実質
的に前記と同様にして生産され、ＮＳ１タンパク質は上
清中に含まれている。
上清を１００ ｍ Ｍ Ｍｇ（４２で処理し、４℃で１
時間撹拌する。久いで、溶液を遠心分離しα５０００ｒ
ｐｍ、３０分間）、ＮＳ１を沈殿、ペレット比すせる。
時間撹拌する。久いで、溶液を遠心分離しα５０００ｒ
ｐｍ、３０分間）、ＮＳ１を沈殿、ペレット比すせる。
ペレットを緩衝液Ａ中で再懸濁し、再び１００ ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ テ処理してＮＳ１タンパク質を再沈殿させ
る。再遠心分離後、ペレット緩衝液Ａ中で再懸濁し、Ｈ
の１０ｍＭトリフ、−ＨＣｌ、ｐｌ−１７，５，１ｍＭ
ＥＤＴＡに対して３回透析する。欠いて、溶液を再び遠
心分離しいずれの粒状物質をも除去し、Ｎ５１タンパク
質を含む上清を集め、検定に使用する。
ＭｇＣ１ｚ テ処理してＮＳ１タンパク質を再沈殿させ
る。再遠心分離後、ペレット緩衝液Ａ中で再懸濁し、Ｈ
の１０ｍＭトリフ、−ＨＣｌ、ｐｌ−１７，５，１ｍＭ
ＥＤＴＡに対して３回透析する。欠いて、溶液を再び遠
心分離しいずれの粒状物質をも除去し、Ｎ５１タンパク
質を含む上清を集め、検定に使用する。
細胞毒性Ｔ細胞検定は実質的に次のようにして実施する
。ウィルス免疫および非免疫マウスから肺臓を摘出し、
ｉｎ ｖｉｔｒ６で培養する。細胞を細く分けて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで９０分間種々の抗原に暴露させる。欠い
て、細胞を繰り返し洗浄して抗原を除去し、細胞を５日
間培養して刺激された個体数を増大させる。刺激された
細胞、すなわちエフエフター細胞を、 Ｃｒ を予
め負荷したウィルス感染または非感染Ｐ８１５標的細胞
と混合する。
。ウィルス免疫および非免疫マウスから肺臓を摘出し、
ｉｎ ｖｉｔｒ６で培養する。細胞を細く分けて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで９０分間種々の抗原に暴露させる。欠い
て、細胞を繰り返し洗浄して抗原を除去し、細胞を５日
間培養して刺激された個体数を増大させる。刺激された
細胞、すなわちエフエフター細胞を、 Ｃｒ を予
め負荷したウィルス感染または非感染Ｐ８１５標的細胞
と混合する。
培養培地中へ５１Ｃｒが有意に放出されるということは
、２次細胞毒性Ｔ細胞（２°ＧＴ Ｌ ）が存在するこ
とを示しており、それらは抗原による１ｎｖｉｔｒｏ刺
激で生じる。殺細胞の特異性を２つの方法で調べる。（
υ種々の抗原に感染した標的細胞の殺細胞を試験する。
、２次細胞毒性Ｔ細胞（２°ＧＴ Ｌ ）が存在するこ
とを示しており、それらは抗原による１ｎｖｉｔｒｏ刺
激で生じる。殺細胞の特異性を２つの方法で調べる。（
υ種々の抗原に感染した標的細胞の殺細胞を試験する。
（２）種々のウィルスで免疫されたマウスから肝臓細胞
を取り出ずつ結果を以下の表に示す。また、表中）こ示
すごとく、種々の標的：エフェクター細胞比および種々
の抗原量を用いて。
を取り出ずつ結果を以下の表に示す。また、表中）こ示
すごとく、種々の標的：エフェクター細胞比および種々
の抗原量を用いて。
本検定の直線性も調べた。以下に示す結果はエフエクタ
ー二標的細胞比は３０：１および１０：１である。
ー二標的細胞比は３０：１および１０：１である。
表中の値は、細胞の洗浄剤可溶（ヒで測定した細胞中の
５１Ｃｒの全量と比較した時の培地中に放出された５１
に、の比率を表わしている。有意な陽性結果は線で囲っ
ている。本検定で使用したウィルスは次のものである。
５１Ｃｒの全量と比較した時の培地中に放出された５１
に、の比率を表わしている。有意な陽性結果は線で囲っ
ている。本検定で使用したウィルスは次のものである。
Ａ／ＰＲ／８／３４ （ＨＩＮＩ ）
（”ＰＲ８″）へ／ポート・カルマース／１７４（Ｈ３
Ｎ２）（“Ａ／ＰＣ” ）へ／ブラジル／１７８（８２
Ｎ１） 、 （“Ａ／Ｂ２）つへ／レンガポ
ール／１５フ（Ｈ２Ｎ２） （″Ａ／シング〕
第１表 イー・コリ由来ポリペプチドによる２°ＣＴＬ応答の刺
激 第２表 イー・コリ由来ポリペプチド８による２°ＣＴＬ応答の
刺激 ＰＲ８° 区■［＝這圓 ５．７ ２．６Ｎ
Ｓ１ ５．２ ８．７ ４．３ ０．
０Ｃ１３［］−１，１ｏ、ｓ −０，５４１３−８
，６−１０，１−１，３０，０Δ ７ −３．
２ −７．４ ２．９ −０．９Ｎｏ
−５，４−２，０１，９３，２本ＰＲ８−免疫マウスか
ら摘出した肝臓細胞をｉｎ ｖｉ【ｒｏ で抗原（５μ
！／ｒｒｔｌ ）を用イテ刺激。
（”ＰＲ８″）へ／ポート・カルマース／１７４（Ｈ３
Ｎ２）（“Ａ／ＰＣ” ）へ／ブラジル／１７８（８２
Ｎ１） 、 （“Ａ／Ｂ２）つへ／レンガポ
ール／１５フ（Ｈ２Ｎ２） （″Ａ／シング〕
第１表 イー・コリ由来ポリペプチドによる２°ＣＴＬ応答の刺
激 第２表 イー・コリ由来ポリペプチド８による２°ＣＴＬ応答の
刺激 ＰＲ８° 区■［＝這圓 ５．７ ２．６Ｎ
Ｓ１ ５．２ ８．７ ４．３ ０．
０Ｃ１３［］−１，１ｏ、ｓ −０，５４１３−８
，６−１０，１−１，３０，０Δ ７ −３．
２ −７．４ ２．９ −０．９Ｎｏ
−５，４−２，０１，９３，２本ＰＲ８−免疫マウスか
ら摘出した肝臓細胞をｉｎ ｖｉ【ｒｏ で抗原（５μ
！／ｒｒｔｌ ）を用イテ刺激。
本草Ｉ’Ｒ１３−感染同系遺伝子的胛臓細胞。
以上の表に示したように、致死量下のＰＲ８ウィルスで
予め感染させたマウスからの免疫肝臓細胞を使った場合
、Ｃ１３は２次細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する。ＮＳ
ｌ、デルタ７、デルタ１３゜Ｍ３Ｑ−ＮＳ２．およびＣ
３６を含む試験した他の全ペプチド誘導体は、ある種の
血球凝集素構成物が有するような応答を誘発しない。Ｃ
１３ペプチドに対Ｔる応答は投与量に依存し、５μｆ／
ａｌｌ〜２４μｆ／ｒｕｇのレベルが２次細胞毒性Ｔ細
胞応答を誘発する。
予め感染させたマウスからの免疫肝臓細胞を使った場合
、Ｃ１３は２次細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する。ＮＳ
ｌ、デルタ７、デルタ１３゜Ｍ３Ｑ−ＮＳ２．およびＣ
３６を含む試験した他の全ペプチド誘導体は、ある種の
血球凝集素構成物が有するような応答を誘発しない。Ｃ
１３ペプチドに対Ｔる応答は投与量に依存し、５μｆ／
ａｌｌ〜２４μｆ／ｒｕｇのレベルが２次細胞毒性Ｔ細
胞応答を誘発する。
観察した応答のウィルス特異性は、Ｃ１３がｔ−ｒ Ｉ
Ｎ １ウイルスに予め感染させたマウスがらの免疫肝
臓細胞を刺激するが、１−１３ Ｎ ２ウイルス（Ａ／
Ｐ（：〕に予め感染させたマウスからの免疫陣臓細胞を
刺激しないということを示している。これは、少なくと
も部分的に、交差反応性内部抗原によって。
Ｎ １ウイルスに予め感染させたマウスがらの免疫肝
臓細胞を刺激するが、１−１３ Ｎ ２ウイルス（Ａ／
Ｐ（：〕に予め感染させたマウスからの免疫陣臓細胞を
刺激しないということを示している。これは、少なくと
も部分的に、交差反応性内部抗原によって。
生きているウィルスで同じ１１キ臓細胞を刺激した時観
察される亜型交差反応性細胞毒性１９７２球応答と異な
る。ざらに、Ｃ１３による刺激はＨＩＮＩ亜型のウィル
ス株の間で交差反応性であり、１ｎｖｉｔｒｏでＣ１３
により刺激したＰＲＢ免疫胛臓訓胞は、ＰＮ２（１９３
４からのＨＩＮ１株〕に感染させた標的細胞ならびに１
２μｙ〜４８μダの投与量範囲にわたる高度の細胞毒性
活性でＡ／ブラジル（１９７８のＨＩＮＩ株〕に感染さ
せた標的細胞を認識し、死滅させることができる。
察される亜型交差反応性細胞毒性１９７２球応答と異な
る。ざらに、Ｃ１３による刺激はＨＩＮＩ亜型のウィル
ス株の間で交差反応性であり、１ｎｖｉｔｒｏでＣ１３
により刺激したＰＲＢ免疫胛臓訓胞は、ＰＮ２（１９３
４からのＨＩＮ１株〕に感染させた標的細胞ならびに１
２μｙ〜４８μダの投与量範囲にわたる高度の細胞毒性
活性でＡ／ブラジル（１９７８のＨＩＮＩ株〕に感染さ
せた標的細胞を認識し、死滅させることができる。
細胞毒性１９７３球はマウス系においてインフルエンザ
ウィルス感染からの回復に寄与Ｔることが明らかで、そ
のようなリンパ球応答は免疫マウスおよびヒトの両者に
認められる〔エニスら（Ｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ、）
、 ？イクロバイオロジー（Ｍｉｃｒ−ｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ） −１９８４，４２７〜４３０頁、アメリカン・ソ
サイエティ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒ
、Ｓｏｃ １Ｍｉ （ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）：ｌという
ことを示している実質的なデータに基づくと、そのよう
な株交差細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発Ｔる０１３タンパク
質の能力はそれ自体の有用性およびインフルエンザウィ
ルス感染に抵抗する免疫応答を誘発するＨＡ２免疫原決
定因子の有用性を示しており、該応答は亜型特異的であ
り、株特異的でないという点て半万能である。
ウィルス感染からの回復に寄与Ｔることが明らかで、そ
のようなリンパ球応答は免疫マウスおよびヒトの両者に
認められる〔エニスら（Ｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ、）
、 ？イクロバイオロジー（Ｍｉｃｒ−ｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ） −１９８４，４２７〜４３０頁、アメリカン・ソ
サイエティ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒ
、Ｓｏｃ １Ｍｉ （ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）：ｌという
ことを示している実質的なデータに基づくと、そのよう
な株交差細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発Ｔる０１３タンパク
質の能力はそれ自体の有用性およびインフルエンザウィ
ルス感染に抵抗する免疫応答を誘発するＨＡ２免疫原決
定因子の有用性を示しており、該応答は亜型特異的であ
り、株特異的でないという点て半万能である。
本発明およびその好ましい具体例を開示したが。
本発明はこれらに限定されるものではなく１本発明の範
囲内の全ての修飾も包含する。
囲内の全ての修飾も包含する。
特肝出ｍ人 スミスクツイン・ベックマン・コーポレイ
ション 代 理 人 弁理士 青 山 葆 はが２名
ション 代 理 人 弁理士 青 山 葆 はが２名
Claims (22)
- （１）ＨＡタンパク質のＨＡ２サブユニットの免疫原決
定因子を有する、ＨＡタンパク質以外のペプチドからな
ることを特徴とするインフルエンザウイルスによる感染
に対して動物の防御を刺激するワクチン。 - （２）ワクチンが、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１
、Ｈ２およびＨ３亜型の１つまたはそれ以上のＨＡタン
パク質のＨＡ２サブユニットの免疫原決定因子からなる
ことを特徴とする前記第（１）項のワクチン。 - （３）ＨＡ２サブユニットに免疫原配置をとらせるポリ
ペプチドに融合したＨＡ２サブユニットを有する融合タ
ンパク質に抗原決定因子が担持される前記第（１）項の
ワクチン。 - （４）ＨＡ２サブユニットに融合したポリペプチドがＮ
Ｓ１タンパク質のＮ末端アミノ酸からなり、該Ｎ末端ア
ミノ酸がＨＡ２サブユニットのＮ末端に融合している前
記第（３）項のワクチン。 - （５）ＨＡ２サブユニットに融合したポリペプチドがＮ
Ｓ１タンパク質の約８０個のＮ末端アミノ酸を含むこと
を特徴とする前記第（４）項のワクチン。 - （６）ＨＡ２サブユニットがＡ型インフルエンザウイル
スのＨ１、Ｈ２、またはＨ３亜型に由来する前記第（５
）項のワクチン。 - （７）免疫原決定因子がＣ１３タンパク質に担持される
前記第（５）項のワクチン。 - （８）ＨＡ２サブユニットの免疫原決定因子からなるこ
とを特徴とするＨＡタンパク質以外のポリペプチド。 - （９）ＨＡ２サブユニットに免疫原配置をとらせるポリ
ペプチドに融合したＨＡ２サブユニットを有する融合タ
ンパク質である前記第（８）項のポリペプチド。 - （１０）ＨＡ２サブユニットに融合したポリペプチドが
ＮＳ１タンパク質のＮ末端アミノ酸からなり、該Ｎ末端
アミノ酸がＨＡ２サブユニットのＮ末端に融合している
前記第（８）項のポリペプチド。 - （１１）ＨＡ２サブユニットに融合したポリペプチドが
ＮＳ１タンパク質の約８０個のＮ末端アミノ酸を含む前
記第（１０）項のポリペプチド。 - （１２）ＨＡ２サブユニットがＡ型インフルエンザウイ
ルスのＨ１、Ｈ２、またはＨ３亜型に由来する前記第（
１１）項のポリペプチド。 - （１３）Ｃ１３タンパク質。
- （１４）前記第（８）項のポリペプチドのコーディング
配列からなることを特徴とするＤＮＡ分子。 - （１５）前記第（９）項のポリペプチドのコーディング
配列からなることを特徴とするＤＮＡ分子。 - （１６）前記第（１０）項のポリペプチドのコーディン
グ配列からなることを特徴とするＤＮＢ分子。 - （１７）前記第（１１）項のポリペプチドのコーディン
グ配列からなることを特徴とするＤＮＡ分子。 - （１８）前記第（１２）項のポリペプチドのコーディン
グ配列からなることを特徴とするＤＮＡ分子。 - （１９）前記第（１３）項のポリペプチドのコーディン
グ配列からなることを特徴とするＤＮＡ分子。 - （２０）プラスミドｐＣ１３
- （２１）前記第（１４）項のＤＮＡ分子で形質転換した
微生物または細胞。 - （２２）微生物がイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である前
記第（２１）項の微生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64573284A | 1984-08-30 | 1984-08-30 | |
| US645732 | 1984-08-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6169731A true JPS6169731A (ja) | 1986-04-10 |
Family
ID=24590246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60193013A Pending JPS6169731A (ja) | 1984-08-30 | 1985-08-30 | ワクチン用ポリペプチド |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0176493B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6169731A (ja) |
| KR (1) | KR860001882A (ja) |
| AR (1) | AR241713A1 (ja) |
| AT (1) | ATE63462T1 (ja) |
| AU (1) | AU592954B2 (ja) |
| DE (1) | DE3582843D1 (ja) |
| DK (1) | DK389085A (ja) |
| ES (1) | ES8800358A1 (ja) |
| FI (1) | FI85811C (ja) |
| GR (1) | GR852079B (ja) |
| HU (1) | HU196131B (ja) |
| IE (1) | IE58488B1 (ja) |
| IL (1) | IL76236A0 (ja) |
| NO (1) | NO169819C (ja) |
| NZ (1) | NZ213249A (ja) |
| PH (1) | PH27147A (ja) |
| PT (1) | PT81061B (ja) |
| ZA (1) | ZA856467B (ja) |
| ZW (1) | ZW13485A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63196293A (ja) * | 1987-02-10 | 1988-08-15 | ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド | 融合蛋白 |
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|---|---|---|---|---|
| US4803072A (en) * | 1986-09-10 | 1989-02-07 | Smithkline Beckman Corporation | Immunomodulation |
| DK425789A (da) * | 1988-08-31 | 1990-03-01 | Smithkline Beecham Corp | Vaccinale polypeptider |
| AU640348B2 (en) * | 1988-08-31 | 1993-08-26 | Smithkline Beecham Corporation | Vaccinal Polypeptides |
| ZA896625B (en) * | 1988-08-31 | 1990-09-26 | Smithkline Beecham Corp | Vaccinal polypeptides |
| US5766601A (en) * | 1990-08-08 | 1998-06-16 | University Of Massachusetts Medical Center | Cross-reactive influenza a immunization |
| DK0542895T3 (da) * | 1990-08-08 | 1997-05-12 | Univ Massachusetts Medical | Krydsreaktiv influenza A immunisering |
| WO1994022917A1 (en) * | 1993-04-05 | 1994-10-13 | University Of Massachusetts Medical Center | Cross-reactive influenza a immunization |
| CZ298364B6 (cs) | 1998-02-05 | 2007-09-05 | Smithkline Beecham Biologicals S. A. | Deriváty antigenu asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro prípravu fúzních proteinu a prostredku pro vakcinaci |
| RU2164148C1 (ru) * | 2000-08-09 | 2001-03-20 | Петров Рэм Викторович | Вакцина против вируса гриппа и способ ее получения |
Family Cites Families (4)
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|---|---|---|---|---|
| US4357421A (en) | 1979-04-02 | 1982-11-02 | G. D. Searle & Co. | Synthetic gene coding for influenza hemagglutinin |
| IL61904A (en) * | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
| ZA836080B (en) * | 1982-08-23 | 1984-04-25 | Scripps Clinic Res | Broad spectrum influenza antisera |
| CA1340372C (en) * | 1984-07-09 | 1999-02-02 | John D. Clements | Production of e. coli lt-b enterotoxin subunit |
-
1985
- 1985-08-08 AR AR85301435A patent/AR241713A1/es active
- 1985-08-20 ZW ZW134/85A patent/ZW13485A1/xx unknown
- 1985-08-26 ZA ZA856467A patent/ZA856467B/xx unknown
- 1985-08-26 PH PH32694A patent/PH27147A/en unknown
- 1985-08-27 AU AU46685/85A patent/AU592954B2/en not_active Ceased
- 1985-08-27 NZ NZ213249A patent/NZ213249A/xx unknown
- 1985-08-27 DK DK389085A patent/DK389085A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-08-27 IE IE210385A patent/IE58488B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-08-28 GR GR852079A patent/GR852079B/el unknown
- 1985-08-28 EP EP85870120A patent/EP0176493B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-28 AT AT85870120T patent/ATE63462T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-28 IL IL76236A patent/IL76236A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-08-28 DE DE8585870120T patent/DE3582843D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-29 FI FI853320A patent/FI85811C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-08-29 ES ES546530A patent/ES8800358A1/es not_active Expired
- 1985-08-29 NO NO853400A patent/NO169819C/no unknown
- 1985-08-29 HU HU853286A patent/HU196131B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-08-30 KR KR1019850006284A patent/KR860001882A/ko not_active Ceased
- 1985-08-30 PT PT81061A patent/PT81061B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-08-30 JP JP60193013A patent/JPS6169731A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63196293A (ja) * | 1987-02-10 | 1988-08-15 | ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド | 融合蛋白 |
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| NZ213249A (en) | 1989-03-29 |
| AR241713A1 (es) | 1992-11-30 |
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| DK389085D0 (da) | 1985-08-27 |
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| EP0176493B1 (en) | 1991-05-15 |
| PH27147A (en) | 1993-04-02 |
| HU196131B (en) | 1988-10-28 |
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| AU4668585A (en) | 1986-03-06 |
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| ATE63462T1 (de) | 1991-06-15 |
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| PT81061A (en) | 1985-09-01 |
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