JPS63196293A - 融合蛋白 - Google Patents

融合蛋白

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JPS63196293A
JPS63196293A JP62052828A JP5282887A JPS63196293A JP S63196293 A JPS63196293 A JP S63196293A JP 62052828 A JP62052828 A JP 62052828A JP 5282887 A JP5282887 A JP 5282887A JP S63196293 A JPS63196293 A JP S63196293A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は融合蛋白の構築に関する。
近年、ワクシニアウィルス蛋白を用いて、口蹄疫ウィル
ス（ＦＭＤＶ）の免疫原性エピトープを発現させる試み
として、β−ガララストシダーゼに融合させることが行
なわれた。そしてこの場合、高レベルの融合蛋白が合成
された。しかしながら、組換えワクシニアウィルスを接
種した動物は、中和抗体を産生じなかった（　Ｎ０Ｗｔ
Ｏｎら、（１９８６）ＶａＣＣｉｎｅＳ８６　：免疫へ
の新たなアプローチ、Ｃｏ１ｄＳＤｒｉｎｌｌｌ　ｔｌ
ａｒｂｏｒ　ｔａｂｏｒａｔｏｒｙ、　３０３−３０９
　）。
接種動物で低い免疫応答しか現われなかった原因として
、β−ガラクトシダーゼが細胞質内で発現したことが考
えられる。そこで本発明者らは、細胞の表面上で発現す
る抗原が、より高い免疫応答を誘発するか否かを調べる
ため研究を行なった。
そこで、インフルエンザウィルス赤血球凝集素蛋白（Ｈ
Ａ）及び該ＨＡの抗原性部位八に存在へるＦＭＤＶ抗原
性部位の一部のエピトープからなる融合蛋白をコードす
る、いくつかのＤＮＡ配列を構築した。そしてこのＤＮ
Ａ配列をワクシニアウィルスのゲノムに挿入した。かく
して得られる組換えウィルスで感染した細胞は融合蛋白
を発現し、更には抗ＦＭＤＶ血清によりそのＦＭＤＶエ
ピトープが検出された。また、この感染細胞はボリク０
−ナル抗ＨＡ＊？Ｗとよく反応した。従ってこれらの研
究から、インフルエンザＨＡの膜付着特性を維持しつつ
、インフルエンザＨＡの配列を換えることが可能である
ことが判った。
免疫システムに抗原性エピトープを導入するこの試みは
、一般的に他の抗原性エピトープの場合にも適用可能で
あることが判った。
従って本発明によれば、インフルエンザウィルスＨＡで
あってその抗原性エピトープの部位に他の抗原性エピト
ープが存在しているインフルエンザウィルスＨＡからな
る融合蛋白をコードするＤＮＡ配列が提供される。換言
すれば、本発明においては、ＨＡの抗原性エピトープの
一部又は全部が、他の抗原性エピトープで置換されてい
る。
融合蛋白を発現せしめるために、ＤＮＡ配列は発現ベク
ターに挿入される。真核生物宿主に導入された時に融合
蛋白の発現が可能となるように、ＤＮＡ配列はベクター
に挿入される。真核生物宿主は、ＨＡを正しくグリコジ
ル化することが必要である。融合蛋白が細胞内で発現し
得るようにＤＮＡ配列が挿入されるベクターとしては、
ウィルスベクターでもよい。このようなウィルスベクタ
ーと生理学的に許容し得る担体又は希釈剤とからワクチ
ンが得られる。このような例としては、ウィルスベクタ
ーは、ＤＮＡ配列が組み込まれた組換えワクシニアウィ
ルスが好ましい。他方、融合蛋白と生理学的に許容し得
る担体又は希釈剤とからワクチンを得ることもできる。
インフルエンザウィルスＨＡは、最もよく研究された膜
内孔性タンパク質であり、その三次元構造（Ｉｌｌｉｌ
ｓｏｎら、　　（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２８９．３６
６−３７３）あるいはその抗原性（１４ｉ１ｅｙら。
（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２８９，３７３−３７８）に
ついて多くの詳細な報告がある。いくつかのインフルエ
ンザサブタイプのＨＡ遺伝子が、多種の特異的ベクター
を用いて多くの真核細胞内で発現されている（Ｓｍｉｔ
ｈら、（１９８３）ＰＮＡＳ８０．７１５５−５９　：
ＧｅｔｈｉｎｇとＳａｍｂｒｏｏｋ、　　（１９８２）
Ｎａｔｕｒｅ３００．５９８−６２５）、組換えワクシ
ニアウィルスで感染した細胞内で発現される場合には、
ＨＡは通常のグリコジル化を受け、そして細胞表面に運
ばれ、細胞表面で血清学的手法により検出することがで
きる。
抗原性部位Ａは、ＨＡ衣表面らループとして突出してい
る。この部位は、エビトープマツビツングにより検出す
ることが可能である。典型的には、この部位は、ＨＡア
ミノ酸残基１４０から１４６に対応している。このトＩ
Ａ部位は、いずれのインフルエンザウィルスあるいはそ
のサブタイプであっても同様である。かくして、この部
位は、例えば融合蛋白用の抗原性エピトープが導入され
る部位であってＨＡ抗原性部位八へある。部位Ａのすべ
て又は一部を、抗原性エピトープと置換することができ
る。典型的には、エピトープは、ＨＡアミノ酸残Ｍ１４
２又は１４３とアミノ酸残基１４６の間に挿入すること
ができ、中間に介在するＨＡアミノ酸残基を除去するこ
とができる。しかしながら、抗原性エピトープは、ＨＡ
の他の抗原性エピトープ部位Ｂ、Ｃ，Ｄ又はＥのいずれ
に挿入してもよい。
いずれの抗原性エピトープを、ＨＡの抗原性エピトープ
に挿入してもよい。かかるエピトープとしては、異なる
タイプのインフルエンザウィルスあるいはそのサブタイ
プのエピトープが挙げられる。他方あるいはこれらとと
もに、同じタイプあるいは異なるタイプ又はサブタイプ
の他のｌ−Ｉ　Ａ抗原性エピトープを挿入することもで
きる。この場合には、多価インフルエンザワクチンが得
られる。
しかしながら、通常は異種抗原性エピトープが挿入され
る。ここで異種とは、インフルエンザウィルスのエピト
ープではないエピトープを意味する。異種エピトープは
、通常それで置換されるＨＡの部位Ａの部分より大きい
。また異種エピトープは、より長いアミノ酸配列の一部
を形成していてもよい。この場合挿入部分は、４ないし
２６個のアミノ酸残基からなる。異種抗原性エピトープ
は、インフルエンザウィルスエピトープから提供するこ
ともできる。二つ又はそれ以上の異種抗原性エピトープ
を挿入してもよい。この場合、多価ワクチンが得られる
。
異種抗原性エピトープは、ウィルス、バクテリア又はプ
ロトシアのエピトープであってもよい。
ウィルスエピトープの例としては、ＦＭＤＶ、ポリオウ
ィルス、ヒトライノウィルス又はＢ型肝炎ウィルスのエ
ピトープが挙げられる。またマラリア寄生菌Ｐｌａｓｍ
ｏｄｉｕｇｉ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍなどのプロトシア
のエピトープを挙げることもできる。
ＦＭＤＶの抗原性主要部位は、ＶＰ１キャプシド蛋白の
アミノ酸残基１４１から１６０及び２００から２１３に
対応している。従って、これらアミノ酸残基のいずれか
又は両者を、例えば部位へに挿入することができる。他
方、これらの配列の一部、例えばアミノ酸残基１４２か
ら１４５．１４６から１５１又は１４２から１５１を挿
入することもできる。ＦＭＤＶ型０１にａｕｒｂｅｕｒ
ｅｎノ主要抗原性部位の一部を挿入したＤＮＡ構築体、
及び１文字コードで表わしたそれらに対応するアミノ酸
配列を、ＨＡのＤＮＡ及びアミノ酸配列とともに以下に
示す。
ＨＡ　　　　　　　ＡＡＡ　ＡＧＧ　　ＧＧＡ　　ＣＣ
’Ｌ’　　ＧＯ’Ｘ’　ＡＧＣＧＧ’ｌ’　　ＴＴＴ　
　テτＣＡＧＴ　ＡＧＡ）Ｃ！ｔＧＰＧ８ＧｒＦｓＲ ＨＡ−ｒＭＤＶ　　ＡＡＡ　ＡＧＧ　　ＧＧＡ　ＣＣＧ
　ＡＡＣＣＴＧ　　ＣＧ’ｌ”！”ｒ’ｒ　Ｔ’Ｃ’Ｃ
ＡＧＴ　ＡＧＡ１４２−１４５　　ＩＣＲＧ　　Ｐ　　
Ｎ　　Ｌ　　ＲＦ　　ｔ’　　Ｓ　　Ｒ［１４２ｒＭＤ
Ｖ　　１４５３ ｕ−ＦＭＤＶ　　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＧＧＡ　ＣＣＧ　Ｇ
ＧＴ　ＧＡＣＣ’ｌ’Ｇ　ＣＡＧ　ＧＴ？　ＣＴＧ　’
ｒ’ｒ’！”１４６−１５１　　Ｋ　　Ｎ　　Ｇ　　Ｐ
　　Ｇ　　Ｄ　　Ｉ、　　Ｑ　　Ｖ　　Ｌ　　！’［１
４６ｒＭＤＶ　　　１５１］ ＴＴＣＡＧＴ　ＡＧＡ ＩＲ ｎＡ−ｒＭｏｖ　　　ｐｗ　ＡＧＧ　　ＧＧＡ　ＣＣＧ
　ＡＡＣＣＴＧ　　ＣＧＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＴＧ　Ｃ
ＡＧ１４２−１５１　　Ｋ　　ＲＧ　　Ｐ　　Ｎ　　Ｌ
　　ＲＧ　　Ｄ　　Ｌ　　Ｑｔ１４２　　　　　　　ｒ
ＭＤＶ Ｇ’！”！’　ＣＧＴ　ＧＯＴ　Ｔ？’！’　Ｔ’Ｊ”
ＣＡＧ’ｌ’ＬＧＦＦＳ 融合蛋白をコードするＤＮＡ配列は次のようにして１１
１１することができる。即ち、−例えばプラスミドとし
てＨＡをコードするＤＮＡ配列を得、そして該ＤＮＡ配
列における、ＨＡの抗原性エピトープをコードするＤＮ
Ａの部位の正しいフレーム内に、融合蛋白に組み込もう
とする目的の抗原性エピトープをコードするＤＮＡ配列
を挿入することによってＳｇＪ製することができる。融
合蛋白を発現し得るベクターは次のようにして調製する
ことができる。即ち、真核生物宿主に導入するのに好適
なベクター内の翻訳開始シグナルと終止シグナルの間に
、融合蛋白をコードするＤＮＡ配列を挿入し、更に該配
列用のプロモーターを導入することによってａｌｌする
ことができる。真核生物宿主細胞を、かくして得られる
発現ベクターで形質転換することによって融合蛋白を産
生ずることができる。
従って、ワクチン用のウィルスベクターは、ウィルスゲ
ノム中の翻訳開始シグナルと終止シグナルの間に、融合
蛋白をコードするＤＮＡ配列を挿入し、更に該配列用の
プロモーターを導入することにより調製することができ
る。典型的には、これらは次のようにして達成すること
ができる。即ち、（ｉ）プロモーターによる転写支配下
に、翻訳開始シグナルと終止シグナルの間にＨＡをコー
ドするＤＮＡ配列が挿入されたシャトルベクターを構築
し：　１ｉｉ）　ＨＡの抗原性エピトープをコードする
ＤＮＡの部位の正しいフレーム内に、融合蛋白に組み込
もうとする他の抗原性エピトープをコードするＤＮＡ配
列を導入することによって、シャトルベクターのＤＮＡ
配列を修正し：　（ｉｉ）次いでシャトルベクターでト
ランスフェクトし、そしてかくして得られた修正ＤＮＡ
配列とプロモーターとがウィルスゲノム中に組み込まれ
るように、ウィルスで哺乳動物細胞を感染する。
ＤＮＡ配列及びプロモーターは、異種組換え法により、
ウィルスゲノム中に組み込むことができる。従って、ウ
ィルスＤＮＡの適当なフランキング配列を、シャトルベ
クター中のＤＮＡ配列あるいはプロモーターのいずれか
の側に導入することができる。融合蛋白は、かくして得
られる組換えウィルスで感染した細胞により発現される
。
典型的には、シャトルベクターはプラスミドである。そ
してこのプラスミドは、バクテリア特にＥ、ｃｏ１＋中
で、前記ステップ（Ｄ及び（１１）を可能にするバクテ
リアの複製起点を含んでいる。プロモーターは、典型的
にはウィルスブロモ−ターであり、より好ましくは、融
合蛋白をコードするＤＮＡ配列が挿入されるゲノムのウ
ィルスに内因性のプロモーターである。抗原性エピトー
プは、一般的には化学合成及び／又はクローニングによ
りＩＩＶすることができる。ＨＡ抗原性エピトープのコ
ドンのいくつか又は全部は、融合蛋白に組み込もうとす
るエピトープをコードするＤＮＡ配列を挿入する前に、
シャトルベクターから除くことができる。
ワタシニアウイルスシステムを使用することもできる。
ＨＡ遺伝子が、ワクシニアプロモーターによる転写支配
下に組み込まれたシャトルベクターを構築することもで
きる。好適なプロモーターは、ワクシニアｐ１１にプロ
モーターである。プロモーター及びＨＡＩｔ伝子は、ウ
ィルスの複製に必須でないワクシニアウィルスＤＮＡと
隣接している。典型的には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）
ワクシニア遺伝子のフランキングセグメントが使用され
る。ＨＡ３！！伝子は、融合蛋白を得るために目的とす
る抗原性エピトープをコードするＤＮＡ配列を挿入する
ことにより修正される。
ワタシニアウイルスプロモーター及び融合蛋白が、異種
組換え法によりワクシニアゲノムに挿入される。典型的
には、この挿入は、Ｗｙｅｔｈ　　（Ｕ　Ｓワクチン）
株のようなワクシニアゲノムで哺乳動物細胞を感染させ
るか、あるいはシャトルベクターで細胞を形質転換せし
めることにより達成される。挿入部位は、シャトルベク
ターのフランキングワクシニアＤＮＡセグメントによっ
て決定することができる。異種組換え法により、野生型
ウィルスの機能的ＴＫ遺伝子を、融合蛋白遺伝子を含ん
でいる非機能的ＴＫ遺伝子で置換することができる。得
られる組換えウィルスはＴＫ−であり、従ってこれによ
って選択することが可能である。
抗原性エピトープが挿入された融合蛋白は、組換えウィ
ルスベクターが感染した細胞内で発現される。融合蛋白
は、通常のＨＡと同様にして細胞膜から出て来るものと
考えられる。このため、ＨＡの表面上に出た抗原性エピ
トープは、免疫システムによってよ＜ａＸされて、好ま
しい免疫応答がより高められるものと考えられる。従っ
てウィルスベクターはワクチンとして用いることもでき
る。
また他方、融合蛋白それ自身をワクチンとして製剤化す
ることもできる。かかる融合蛋白は宿主により産生され
、そして回収することができる。
を椎動物又は無を椎動物の細胞好ましくは哺乳動物細胞
が、宿主セルラインとして使用される。
ＶＥＲＯ，ＨｅＬａ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター
の卵巣）、Ｗ１３８．８ＨＫ、Ｃ０８−７゜ＭＤＣＫ、
ＣＶ−１などのセルラインを使用することもできる。こ
のような細胞での発現ベクターには、一般的に複製起点
１発現遺伝子の前に位置するプロモーター、必要なりボ
ゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル
化部位及び転写終結配列が含まれる。好ましくはウィル
スプロモーターが使用される。バキュロウィルス発現シ
ステムの如きウィルスベクターを使用することもできる
。
他方、酵母のような真核微生物を宿主細胞として用いる
こともできる。従ってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅを使用することが可能である。典型的
には、このような宿主を形質転換するにはプラスミドＹ
Ｒｐ７の如きプラスミドベクターを利用できる。Ｗ＃母
適合性プロモーター、複製起点及び終結配列を含むプラ
スミドベクターであれば、いかなるものであってもよい
。
ワクチンは、適当な形態でヒト又は動物に投与すること
ができる。経口投与あるいは皮下、静脈内、筋肉内等の
非経口投与のいずれを選択するかは、接種の目的及び接
種対象が動物又はヒトのいずれであるかに依っている。
同様の基準によって、ワクチンの製剤化及び服用に用い
る、生理学的に許容し得る担体又は希釈剤も選択される
。
担体又は希釈剤を用いた組換えウィルスワクチンの製剤
化方法および服用方法としては、通常のウィルスをワク
チンとして使用する際に採用される慣用的手法をそのま
ま使用することができる。
例えば組換えワクシニアウィルスを、経皮投与すること
もできる。組換えワクシニアウィルスのようなウィルス
ベクターは、典型的には、すべての投与経路に関して１
回当り１０−１０００μグの量で投与される。より好ま
しくは、ウィルスの１ｏ−ｉｏｏμり量が投与される。
また融合蛋白それ自身を、免疫機能へ進複合体又はクリ
コシド・クライル（Ｑ　ｕ　ｉ　Ｉ　Ａ　）　（Ｈｏｒ
ｅｉｎら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３０８　、４５７
−４６０　）であるイスコム（ｉｓｃＯｍ）のマトリッ
クスを持った“イスコム”として、ワクチンに使用する
ことができる。
融合蛋白は、すべての投与経路に関して、−回当り１０
−１０００μり好ましくは１０−１００μ９の量で投与
される。
１凰１ 旦込ｐ監！ インフルエンザＡ／＾１ｃｈｉ　／２／６Ｂ　（Ｘ３１
　）（Ｖｅｒｈｏｌｙｅｎら、　　（１９８０）　Ｎａ
ｔｕｒｅ２８６　、７７１−７７６、）から得たもので
あってＭ１３ｍｐ８　（Ｈｅｓｓｉｎｌ）とＶｉｅｉｒ
ａ、　　（９８２）　Ｇｅｎｅｌ　９　、　２６９−２
７６）でクローン化したＨＡ遺伝子の完全なＣＤＮＡコ
ピーを、Ｏｒ、　Ｊｏｈｎ　５ｋｅｈｅｌ　　（旧ＨＲ
。
ＬＯｎｄＯｎ）から手に入れたく第１図参照）。
ＨＡｉｌ伝子の、ワクシニアウィルス（ＶＶ）シャトル
ベクターへの導入を容易にするために、上記プラスミド
を、ｍｐ８ポリリンカー内のＳｍａ工部位で切断し、Ｐ
ＳｔＩリンカ−をこの部位に挿入し、ｆｆ１ＨＡＸ３１
クローンを得た。
これにより、完全なＨＡ遺伝子を、ＰＳｔＩ断片として
単離することが可能になった。
用いたシャトルベクターは、１）Ｖｐｊｊｋであり（第
１図参照）、これはベクター ｐＨ３ＪΔＲＩ　Ａ　（Ｎｅｗｔｏｎら、　　（１９８
６）Ｖａｃｃｉｎｅｓ８６　：免疫への新たなアプロー
チ、　Ｃｏｌｄｓｐｒａｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　３０３−３０９　）　から無関係な
りＶ配列を除去することによって得た。
シャトルベクターは、Ｖｖチミジンキナーゼ（ＴＫ）！
伝子中に挿入された■■ブＯモーター（この場合ＤＪ１
ｋ）を有している。このベクターは、ＶＶｐｊ！ｊ！に
プロモーターとＡｔＪＧの直ぐ後に、非反復ＥＣＯＲ１
部位を有している（　Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔら、（１９８
５）ＰＮＡＳ８２．２０９６）。
このベクターにＨＡ遺伝子を挿入するため、プラスミド
をＥｃｏＲ１部位で切断し、付着末端をＤＮＡポリメラ
ーゼ■のクレノー断片で充填し、次いで１）ｓＬＩリン
カ−を挿入して、ＤＶｐｊ１７！に−ＰＳｔを得た。
ＨＡ遺伝子は、ＰｓｔＩ断片として、脱リン酸化された
ｐＶｐＪｌに−ＰＳｔのＰｓｔＩ切断部位に挿入された
。ｐｌｌにプロモーターに対して正しい方向でＨＡ遺伝
子が挿入されたりＯ−ンを、制限酵素地図により同定し
た。このクローンをｐｖＨＡＸ３１と命名した（第１図
参照）。この構築体においては、天然のＨＡのＡＵＧは
、ｐｊ　１　ｋＡＵＧと同じリーディングフレーム内に
ある。従って、ＨＡの非翻訳リーダー配列のフェーズ内
に終止コドンがないので発現ＨＡは、そのＮ末端にＸア
ミノ酸が付加されて合成される。そしてこれらは、ＨＡ
シグナルペプチドによるＨへの移動及びブ０セツシング
の過程で除かれる。
付加的な配列の存在が、ＨＡの成熟化に有害な場合には
、更に構築体を：ｇＪ製した。ＤＶＨＡＸ３１をＰｓｔ
Ｉで部分消化し、付着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（
ホロエンザイム）で除いた。
線状のバンドをアガロースゲルで精製し、次いで再連結
せしめた。クローンについて、正しくＰｓｔＩ部位が除
かれているかを制限酵素地図によりスクリーニングし、
正しいクローンをｐｖＨＡＸ３１　Ｐと命名した。この
修正体は、Ｅ）Ｊ　１　ｋＡＵＧが存在する相に終止コ
ドンを有しており、ＨＡのＡＵＧにおいて再開始が可能
である。
これら両者のＨＡ構築体を、フランキングＴＫ配ダ１を
用いた異種組換え法（ＨａＣｋｅｔｔら、（１９８５）
ＤＮＡクローニング、Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒ
ｏａｃｈ（ｅｄ、　Ｄ、　Ｈ，Ｇｌｏｖｅｒ）　２．１
９１　１ＲＬｐｒｅｓｓ　ｏｘｒｏｒｄ：　Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ−ｉｎ　ｃｅｎｅ　Ｃｌ０ｎｉｎＯＶｏｌ。
２）により、ＶＶｐＪｌにプロモーター支配下にｖＶの
−ｙｅｔｈ（ＵＳワクチン）株のゲノムに挿入した。Ｔ
Ｋ−表現型の個々のプラークについて、以下の方法によ
りそのＨＡ発現を調べた。即ち、メタノールあるいはグ
ルタルアルデヒドでプラークを固化せしめ、これをｉｎ
　５ｉｔｔｔでウサギ抗ＨＡポリクローナル血清と反応
せしめ、次いでホースラディツシュパーオキシダーゼ結
合ヤギ抗ウサギ抗体と反応せしめて、基質として４−ク
ロｏ−１−ナフトールを用いて発色せしめることにより
（Ｎｅｗｔｏｎら、　　（１９８６）　Ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ８６　：免疫への新たなアプローチ、Ｃｏ１ｄ　５ｐ
ｒｉｎｏ　１ｌａｒｂｏｒｔａｂＯｒａｔｏｒｙ、　３
０３−３０９　）　（“ブラック・プラーク”アッセイ
）、ＨＡ発現を調べた。ＨＡ及び余分なアミノ酸を発現
するプラーク（ｖＨＡＸ３１−Ｊ３４Ｇ）あるいは天然
のＨＡを発現するプラーク（Ｖ）ｌＡＸ３１ΔＰ−に３
）を精製して生育せしめた。
両者の構築体において、ＨＡの発現レベルは同じであり
（ラフな評価による）、従って、ｖＨＡＸ３１Ｐにおい
て、再開始が有効に行なわれたことが判る。また、余分
なＮ−末端アミノ酸を有するＨＡは、ＶＨＡＸ３１が導
入された細胞の表面にお、いて発現されたため、この日
Ａの移動は、シグナル配列のＮ−末端の“ジャンク（ｊ
ｕｎｋ）”配列によっては影響を受けないことが判る。
ＨＡ　　　　　−（Ｆ）ＦＭＤＶ　　　４Ｃよるすべて
の実験において、部位Ａのｌａ換は、゛ｐｖＨＡＸ３１
構築体（即ち、Ｎ−末端のジャンクアミノ酸を有する）
を用いて行なった。このプラスミドを、）（ｉｎｄＩ［
［で部分消化し、上述した如くして、付着末端を充填し
た。線状プラスミドを単離し、再連結した。クロー、ン
について、ｖ■ＴＫ遺伝子の５′末端のＨｉ　ｎｄＩ［
１部位が除かれているか否かをスクリーニングした。正
しいクローンを、ｐＶＨＡΔＨと命名した。このクロー
ンは、部位ＡのＨＡＶ遺伝子の５′側に非反復Ｈｉ　ｎ
　ｄ　ｍ部位を有している。
部位Ａの増幅を促進するために、ｐｖＨＡΔＨから非反
復Ｈｉ　ｎｄＩ［［及びＨｉ　ｎｃ１１部位を切り出し
、部位Ａを含む１８０ｂｐ断片を、Ｍ１３１１）１１に
サブクローンした。大きな断片は、後に使用するために
単離した。正しいクローンを、プラークのシーフェンシ
ングにより同定した。この正しいクローンをｍｐｓｉｔ
ｅＡ　（第２図参照）と命名した。
Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＡＣＣＩで切断することにより１ｐ
ｓｉｔｅＡからＲＦＤＮＡを切り出しくＭ１３ポリリン
カーＡｃｃＩ部位は、上記構築体においては除かれてお
り、部位への３′側のＨＡＡｃｃ１部位のみが残ってい
る）、アガロースゲルにより１６５ｂｐ断片をＷ！ｉ製
した。大きな断片は、後に使用するために単離した。次
いでこの断片を、ＡＶａｌＩで切断し、１４５ｂＤ　　
Ｍｉｎｄｆｕｌ−ＡｖａＩＩ断片をアクリルアミドゲル
で精製した。
これは）ＩＡの部位Ａ配列が除かれたものである（第３
図参照）。
ＦＭＤＶ配列をコードする相補的合成オリゴヌクレオチ
ドを調製した。これらは、アニーリングした時、Ａｖａ
ｌＩ突出部位が５′末端に残りＡＣＣＩ突出部位が３′
末端に残るように構築された。これらのアニール化オリ
ゴヌクレオチド。
ＨＡのト１ｉ　ｎｄＩ［［−ＡｖａＩＩ断片及びｍｐｓ
ｉｔｅＡの大きなＨｉｎｄＩ［［−Ｉ断片を連結した。
Ｍ１３プラークについて、その配列を調べＦＭＰＶ配列
を持つクローンを同定し、オリゴヌクレオチド合成の正
確さをチェックし、次いでＦＭＤＶ配列が両端にＨＡ配
列を有する正しいリーディングフレーム内にあることを
確認するためクローニングした。
各種修正ｍｐＨＡｐＨ−ンからのＲＦＤＮＡをト１ｉｎ
ｄｌ［Ｉ及びＨｔ　ｎｃｕで切断し、修正１８０−２０
０ｂｐ断片を精製した。次いでこれらの断片を、上述し
た如きｐｖＨＡΔＨのｌ−４ｉｎｄｌｌ−Ｈｔ　ｎｃｍ
切断ｍ製物に再クローンした。ＨＡの部位へに挿入され
たＦＭＤＶ免疫原性部位の部分は第４図に示されている
。
修正ＨＡΔ（ｐｖＨＡ−８０／８１．ｐｖＨＡ−８２／
８３．ｐｖＨＡ−１２２／１２４）を、フランキングＴ
Ｋ配列を用いた異種組換え法によりｖ■ゲノムに導入し
た。そしてＴＫ−ウィルスプラークを分析した。ウィル
スについては最初は、メタノール及びグルタルアルデヒ
ド固化プラークのブラックプラークアッセイにより、ポ
リクローナル抗ＨＡ血清との反応能力をスクリーニング
した。三つのすべての修正ＨＡは、ポリクローナル抗１
ｆ１１清と反応し、感染細胞の表面上に発現された。
次いで組換え■■については、グルタルアルデヒド固化
プラークを用いて抗■Ｐ１１４１−１６０抗血清との反
応能力をスクリーニングした。これについても、三つの
修正ＨＡは、抗ペプチド血清に対し陽性を示した。他方
、非修正組換え体（ｖ　ｌ−Ｉ　Ａ　Ｘ３ｌ−Ｊ３４ｃ
）は陽性を示さなかった。
ＶＨＡＸ３１　　　（Ｊ３４Ｃ）　　　、　　ｖ　　ト
ｌＡ３０／８１（Ｑ３／１　）　、ｖＨＡ８２／８３　
（８６／１　）。
ｖＨＡｌ　２２／１２４　（Ｔ３／１　）が感染したｃ
ｖ−ｉｓｍでの合成蛋白種を調べた。感染細胞を３５８
−メチオニンでラベル化し、細１１１１質抽出物を調製
した。抽出物を、ポリクロナール抗ＨＡ血清及びブ０テ
ィンＡを用いて免疫沈降せしめ、沈降物ヲ５Ｄｓ−ＰＡ
ＧＥ　（Ｌａｅｍｎ＋ｌｉ　、　　（１９７０）Ｎａｔ
ｕｒｅ２２７　、６８０−６８５　）により調べた。
すべての場合に、ＨＡｏ　（非開裂ＨＡ）に対応する蛋
白種が観察された。この蛋白種はすべての場合同じ大き
さであったが、時としてわずかに大きい分子量のバンド
が観察された。これは、余分な“ジャンク”アミノ酸に
よって引き起こされる、シグナルペプチドの不充分な除
去によるものである。長い間ラベル化したいくつかの実
験では、ＨＡｌ及びＨＡ２へのＨＡｏのプロセッシング
が観察された。これらトＩＡ１及び１」Ａ２は、ＩＩＪ
Ｘ３１ウィルス粒子から抽出した蛋白種と一緒にマイグ
レート（＋１ａｒａｔｅ　）　した。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐＶ）−ＩＡＸ３１及びＤＶＨＡＸ
３１ΔＦの構築を示し、 第２図はプラスミド■ＤＳｉｔｅＡを示し、１文字コー
ドでアミノ酸が表わされており、 第３図はＦＭＤＶΔＶＰ１配列によるＨＡ遺伝子の部位
Ａの置換を示し、 第４図はＨＡ遺伝子の部位への位置に挿入されたＦＭＤ
ＶΔＶＰ１配列を示す。

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）、インフルエンザウィルスＨＡであつてその抗原
    性エピトープの部位に他の抗原性エピトープが存在して
    いるインフルエンザウィルスＨＡからなる融合蛋白をコ
    ードするＤＮＡ配列。
  2. （２）、インフルエンザウィルスＨＡの抗原性部位Ａの
    一部又は全部が、他の抗原性エピトープで置換されてい
    る特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
  3. （３）、他の抗原性エピトープが、異種の抗原性エピト
    ープであつて該異種の抗原性エピトープがウィルス、バ
    クテリア又はプロトゾアの抗原性エピトープである特許
    請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
  4. （４）、異種の抗原性エピトープが、口蹄疫ウィルス、
    ポリオウィルス、ヒトライノウィルス又はＢ型肝炎ウィ
    ルスの抗原性エピトープである特許請求の範囲第３項記
    載のＤＮＡ配列。
  5. （５）、異種の抗原性エピトープが、Ｐｌａｓｍｏｄｉ
    ｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍの抗原性エピトープである特
    許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。
  6. （６）、他の抗原性エピトープが、他のインフルエンザ
    ウィルスエピトープである特許請求の範囲第１項記載の
    ＤＮＡ配列。
  7. （７）、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列が挿入
    されたベクターであつて、真核生物宿主に導入された場
    合該融合蛋白を発現することができるベクター。
  8. （８）、ウィルスベクターである特許請求の範囲第７項
    記載のベクター。
  9. （９）、該ＤＮＡ配列が挿入された組換えワクニシアウ
    ィルスである特許請求の範囲第８項記載のベクター。
  10. （１０）、酵母宿主に適合性を有するプラスミドベクタ
    ーである特許請求の範囲第７項記載のベクター。
  11. （１１）、特許請求の範囲第７項記載のベクターが導入
    された真核生物宿主。
  12. （１２）、哺乳動物セルラインである特許請求の範囲第
    １１項記載の宿主。
  13. （１３）、酵母株である特許請求の範囲第１１項記載の
    宿主。
  14. （１４）、インフルエンザウィルスＨＡであつてその抗
    原性エピトープの部位に他の抗原性エピトープが存在し
    ているインフルエンザウィルスＨＡからなる融合蛋白。
  15. （１５）、特許請求の範囲第８項記載のウィルスベクタ
    ーの有効量と生理学的に許容し得る担体又は希釈剤とか
    らなるワクチン。
  16. （１６）、ウィルスベクターが、該ＤＮＡ配列が挿入さ
    れた組換えワクシニアウィルスである特許請求の範囲第
    １５項記載のワクチン。
  17. （１７）、特許請求の範囲第１４項記載の融合蛋白と生
    理学的に許容し得る担体又は希釈剤とからなるワクチン
    。
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