JPS6176500A - 生体膜蛋白質の分離精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、薬学、医学、工学等の各分野において注目さ
れ、有用性が認められつつある生体膜蛋白質を、生体機
能を損うことなく分離精製する方法に関するものである
。

〔従来の技術〕

生体膜は、極性脂質と膜蛋白質を主成分として構成され
るものである。このうち、膜蛋白質が生体機能を維持し
ているが、これは極性脂質、特にその大部分を占めるリ
ン脂質の２重膜中に挿入された状態にある。そこで、生
体膜蛋白質、例えば赤血球膜グリコホリン、大腸菌外膜
ポリン、チトクロムｂｓ　、（Ｎａ”　、Ｋ　”　）Ａ
ＴＰ　ａｓ、、、（Ｃａ２＋）ＡＴＰ　ａｓｅ　、　　
（ｆｌ　”　　）ＡＴＰ　ａｓｅ　などを分離精製する
場合には、これらの多くがそれ自身テ１［水溶性であり
、水溶性球状蛋白質とは異なるので、分離精製の第一段
階として膜蛋白質を可溶化する必要がある。

膜蛋白質の可溶化には、脂質二重層と類似の環境をもつ
媒質が必要であり、各種の有機溶媒、界面活性剤水溶液
が用いられている。有機溶媒の代表例としてはアセトン
、ブタノール、エタノール゛およびピリジン等であり、
界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムに代表さ
れる陰イオン性界面活性剤、トリメチルドデシルアンモ
ニウムクロリド、に代表される陽イオン性界面活性剤、
ポリオキシエチレンドデシルエーテルに代表される非イ
オン性界面活性剤がある。

しかし有゛機溶媒の多くは蛋白質に対して強力な変性剤
として働くために、生体機能を損なうことなく膜蛋白質
を分離精製することが困難になる場合が多い。又、従来
から生化学分野で用いられている陰イオン性界面活性剤
の一つであるドデシル硫酸ナトリウム（以後Ｓ　Ｄ’Ｓ
　、：略称する）は強力な蛋白質変性剤として働くので
、この界面活性剤を用いても生体機能を損なうことなく
膜蛋白質を分離精製するのが困難になる場合が多い。

そこで、蛋白変性能の低い非イオン性界面活性剤を、可
溶化のための媒質として用いることが試みられている。

しかし多くの非イオン性界面活性剤は、臨界ミセル濃度
が低く、分離精製後膜蛋白質に結合した界面活性剤を、
透析によって除去することが困難になるという欠点があ
る。

一方、蛋白質変性能の低いアニオン性界面活性剤として
、胆汁酸塩類を用いることは可能であるが、これらは生
体界面活性物質に属するもので工業的に多量使用できな
いという致命的欠陥がある。

又、カチオン性界面活性剤は、むしろ生体膜を構成する
脂質との結合が他の界面活性剤より強く、蛋白質に対す
る変性作用も弱いので、殺菌剤として用いられることは
多いが、膜蛋白質の分離精製に成功した例は少なく適用
範囲の広い界面活性剤とはいえなかった。

これらに対して、蛋白質自身の物理的化学的特性に着目
した分離精製法として、熱あるいはｐ＋１処理法、分画
沈澱法、吸脱着法、イオン交換体によるクロマトグラフ
ィー法、等電点分画法、密度勾配遠心法、電気泳動法、
アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい法、二
相分配法、結晶化法があるがこれらは、いずれも一長一
短があって満足すべきものではなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、生体膜蛋白質を変性させることなく可溶化し
、生体機能を損うことな（、純度よく分離精製できる方
法を提供するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、イオン種の異なる２種類の界面活性剤の存在
下でゲル電気泳動を行なうと、特有な現象として上記の
問題点を解消できるとの知見に基づくものである。

すなわち、本発明は、（Δ）陰イオン性界面活性剤と（
Ｂ）陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤とから選
ばれる少なくとも１種の界面活性剤の存在下において、
ゲル電気泳動法を用いることを特徴とする生体膜蛋白質
の分離精製法を提供するものである。

本発明の成分（Ａ）である陰イオン性界面活性剤として
は、炭化水素基の炭素数が８〜２２であるアルキル硫酸
塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸塩、ア
ルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン
酸塩、脂肪酸塩などが使用できるが、炭素数１０〜１２
のアルキル硫酸塩、エチレンオキシドの平均付加モル数
が１〜３の範囲にありアルキル基の炭素数が１０〜１４
であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ア
ルキル基の炭素数が１０〜１４のアルキルベンゼンスル
ホン酸塩及び炭素数１０〜１４のα−オレフィンスルホ
ン酸塩の群から選ばれる１種又は２種以上の混合物が好
ましい。　対イオンとしては、アルカリ金属、アルカリ
類金属、アミン、アンモニウムなどが好ましく、特にナ
トリウムが好ましい。これらの界面活性剤として、具体
的にはドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（
平均３モル）ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ＣＩ４
　−α〜オレフィンスルホン酸ナトリウムが例示される
。

一方、成分（Ｂ）の界面活性剤は、陽イオン性界面活性
剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界
面活性剤である。陽イオン性界面活性剤としては、それ
ぞれ炭素数が８〜２２の長鎖アルキル基を有する長鎖ア
ルキルトリ短鎖アルキル第４級アンモニウム塩、長鎖ア
ルキルジ短鎮アルキルベンジル第４級アンモニウム塩な
どの第４級アンモニウム塩類、長鎖アルキルアミン塩、
長鎖アミンオキシドなどが使用される。このうち、長鎖
アルキル基の炭素数が１０〜１４、短鎖アルキル基の炭
素数が１〜３のモノ長鎖アルキル）　ＩＪ短鎮アルキル
第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基の炭素数が１０
〜１８のアミンオキシドが好ましい。第４級アンモニウ
ムの対イオンとしては、ハロゲン、モノアルキル硫酸が
好ましく、特に塩素、臭素が好ましい。これらの界面活
性剤として、具体的には、ドデシルトリメチルアンモニ
ウム塩（クロライド、モノメチル硫酸）、ドデシルジメ
チルアミンオキシド、ヘキサデシルジェタノールアミン
オキシドなどが例示される。

両性界面活性剤としては、長鎖アルキルジアルキルベタ
イン、２−長鎖アルキルイミダゾリン誘導体、長鎖アル
キルジアルキルスルホベタインなどが使用できるが、好
ましくは直鎮アルキル基の炭素数が１０〜１４の長鎖ア
ルキルジアルキルベタインおよび長鎖アルキルジアルキ
ルスルホベタインである。これらに相当するものとして
、例えばドデシルジメチルベタイン、テトラデシルジメ
チルスルホベタインがあげられる。

本発明においては、特に上記の成分（Ａ）及び成分（Ｂ
）からなる混合界面活性剤を用いることが重要である。

これによって、はじめてＳＤＳなどの陰イオン性界面活
性剤、陽イオン性界面活性剤や両性界面活性剤の単独使
用によって生ずる蛋白質の変性等の不利益が解消される
のである。その作用構成の詳細は不明であるが、成分（
Ａ）、（Ｂ）のイオンコンプレックスが何らかの形で関
与しているものと推定される。成分（Ａ）と成分（Ｂ）
との混合比は任意とすることができるが、特定の範囲内
となるようにするのが望ましい。例えば、陰イオン性界
面活性剤と陽イオン性界面活性剤の混合比は、モル比で
９５１５〜５０１５０の範囲とするのが好ましく、特に
９０／１０〜７０／３０の範囲とするのがよい。このう
ちポリオキシエチレン（平均３モル）ドデシルエーテル
硫酸ナトリウムに対してドデシルトリメチルアンモニウ
ムを混合して用いる場合には、９０／１０のモル比が極
めて好ましい。又、陰イオン性界面活性剤と両性界面活
性剤の混合比は、モル比で９５１５〜５０１５０の範囲
とするのが好ましく、特に９０／１０〜６０／４０の範
囲とするのがよい。このうちポリオキシエチレン（平均
２モル）ドデシルエーテル硫酸ナトリウムに対して炭素
数１２〜１４の長鎖アルキルジメチルアミンオキシドを
混合して用いる場合には、７０／３０のモル比が極めて
好ましい。

本発明は、上記の混合界面活性剤の存在下において、ゲ
ル電気泳動法を用いることを特徴とするものである。ゲ
ル電気泳動法としては、公知の方法が使用されるが、次
の方法によるのがよい。

（イ）ゲル電気泳動法の支持体 セルロースアセテート、セファデックス、塩化ビニル−
酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、デンプン粒、デ
ンプンゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル
などが使用できる。ポリアクリルアミドゲルは化学的に
安定なこと、ゲル濃度、架橋度を自由にコントロールす
ることができること、即ちポアサイズ目的に応じて自由
に変えられること、電気浸透性がなくｐ）Ｉ　　および
温度変化による変化も少なく、自、由な型に成型できる
こと及び再現性が非常によいことなど多くの利点を有し
ているので特に好ましい。

（０）装置と器具 ポリアクリルアミドゲルなどのゲルを支持する容器と、
その両端に緩衝液を満たーずための槽を使用するのがよ
く、その容量、長さ等は分離精製する蛋白質の種類、量
により任意に設定することができる。

（ハ）電源装置 直流電流を用い、定電流・定電圧発生装置を用いると分
離精製能および再現性が向上するので特に好ましい。

（ニ）泳動用ポリアクリルアミドゲルの調整アクリルア
ミドを１〜３０重量％、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリ
ルアミドをアクリルアミドに対し０．０５〜１０重量％
および本発明の混合界面活性剤を０．０１〜１重量％含
有する水溶液を調製した後、重合反応により上記水溶液
をゲ／ｌｚ化させて用いるのがよい。好ましいゲル濃度
は、アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリル
アミドの総量が３〜１５重量％（以下、％と略称する）
でしかもＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド′がア
クリルアミドに対して１〜５％の範囲である。

又、混合界面活性剤濃度は０．０５〜０．２％が特に好
ましい。なお上記水溶液に重合用触媒、重合促進剤、ｐ
Ｈ緩衝剤、防腐剤等を混合してゲ７し化することも可能
である。蛍光燈などの光によって重合を開始させる場合
には、重合用触媒としてリボフラビンなどを、又室温で
重合を開始させる場合には、過硫酸アンモニウムなどを
任意の量で、好ましくは０．０４〜０．１２％で使用で
きる。重合促進剤として、例えばＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−
テトラメチルエチレンジアミンを任意の量で、好ましく
は０６１〜０．５％で使用することができる。溶存酸素
がゲル化を阻害する場合があるので、脱気あるいはゲル
化時に水溶液の上層部をさらに水で覆い、空気と水溶液
が接触しないようにするのが望ましい。ｐＨ緩衝剤とし
ては、リン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウ
ム系、炭酸ナトリウム−炭素水素ナトリウム系などが使
用でき、目的とするｐＨでゲル電気泳動をすることがで
きる。ｐＨ緩衝剤濃度は１０〜５　Ｇ　（ＩＱＩＭ、好
ましくは５０〜２００ｍＭ、特に好ましくは１００ｍＭ
に調整さる。

（ホ）分離精製時の温度及びｐｔ＋ 分離精製における温度は、１〜４０℃が好ましく、特に
好ましくは４〜２０℃であり、ｐＨは４〜９が好ましく
、特に好ましくは７である。温度が０℃以下になるとゲ
ル中の水分が凍る場合があり、泳動が出来なくなり、又
４０℃を越えると膜蛋白質が熱変性し機能を損なう場合
があるので好ましくないからである。又、ｐＨが４未満
や９を越えると、酸・アルカリ変性が起きる場合があり
、やはり好ましくないからである。尚、成分（Ｂ）　　
として、アミンオキシドを用いる場合には、ｐＨ９以下
、特に７以下とするのがよい。

（へ）緩（Φ１液槽内の水溶液 泳動用ポリアクリルアミドゲルの両端を緩衝液で満たす
のがよい。この緩衝液は、ポリアクリルアミドゲル作成
用の水溶液に含まれる緩衝剤、界面活性剤および水から
構成される。緩衝剤、界面活性剤濃度は、ポリアクリル
アミドゲル作成用水溶液におけるものと同一であること
が望ましい。

（ト）分離精製される膜蛋白質を含む水溶液本水溶液中
には、膜蛋白質以外に本発明の混合界面活性剤が０．１
〜５％、好ましくは０．２〜３％、特に好ましくは０．
５〜２％含まれる。又、分離精製能を向上させる目的で
グリセリン等の粘稠な液を１〜３０％加えることもでき
るが、好ましくは１０〜２０％である。

又、この水溶液には、ゲルおよび緩衝液中の緩衝剤を含
むことができ、その濃度は、５０　ＱｍＭ以下でしかも
緩衝液中の緩衝剤濃度以下であることが好ましい。特に
好ましくは暖波中の緩衝剤濃度の１／２〜１／２０の濃
度である。

更にこの水溶液には、標準移動度を示す水溶性の陰イオ
ン性染料、色素例えばブロモフェノールブルー等を、又
、界面活性剤ミセルの移動度を示すために、ミセルに可
溶で水不溶性の色素、例えば油溶性色素であるイエロー
ＯＢ等を混合することも可能である。これらの濃度は任
意の範囲で使用できるが、好ましくは前者の場合０．０
０１〜０．０５％、後者の場合０．０１〜０．５％であ
る。

この水溶液を、泳動用ポリアクリルアミドゲル上端部に
置くことにより、電気泳動が開始される。

膜蛋白質はゲル中でディスク状に分離精製される。

ディスク状に分離さた膜蛋白質は染料によって染色され
、着色したバンドとして認められる。ここで用いられる
染料は、例えはアミドブラック、クマシーブリリアント
ブルーなどであり、常法（例えば瓜谷耶三・志村憲助・
中村道徳・船津勝二組集、“生化学実験法−蛋白質の電
気的性質″学会出版センター）に従がって膜蛋白質の分
離精製を確８忍することができる。

（チ）　対　　象　　物 本発明の方法によって分離精製できる対象物は、動物臓
器、培養細胞、微生物細胞、植物細胞等から抽出、可溶
化される生体膜蛋白質すべてを包含する。

（１ハ　分離精製 可溶化された膜蛋白質線分すべてを含む上清を、そのま
ま本発明の方法によって分離精製することができる。ま
た、さらに可溶化液に対して除核酸等の通常行われる処
理を施した溶液あるいはさらに分画沈澱、密度勾配遠心
法等、目的に応じて精製の初期段階を経た溶液を高度に
分離精製することも可能である。この場合、本発明の分
離精製を行う前段階の粗い分離精製においては、膜蛋白
質が生体機能を損なうことなく又たとえ変性が生じても
変性を引き起こす要因を取り除いて可逆的に活性を取り
戻させ得る方法を採用するのが望ましい。以上のように
本発明による生体膜蛋白質の分離精製法は、あらゆる生
体膜蛋白質に対し適用可能であるとともにいずれの精製
段階においても適用可能であるので、商業上有利である
。

〔発明の効果〕

（１）本発明に用いる混合界面活性剤は、蛋白質変性能
が低く、しかも胆汁酸塩類とは異なり、工業的に安価に
かつ容易に合成されるので商業上有利である。

（２）　　上記混合界面活性剤の蛋白質変性能は非イオ
ン性界面活性剤と同等で極めて低いが、前者によって可
溶化された膜蛋白質にはそれぞれ固有量の混合界面活性
剤が結合しており、それぞれ異なる陰電荷数を有する蛋
白質−界面活性剤複合体となる。その結果、これらが電
気泳動支持体中を陽極に向ってそれぞれ固有の速度で移
動し、この際支持体による分子ふるい効果が加わるので
、従来の非イオン性界面活性剤によって可溶化された膜
蛋白質のゲル濾過法に比べて、はるかに分離精製能が向
上する。

（３）非イオーン性活性剤で可溶化された膜蛋白質のゲ
ル濾過法による分離精製では、大量の溶媒が必要である
が、本発明の分離精製法ではその必要がなく有利である
。

（４）非イオン性界面活性剤は臨界ミセル濃度が低いた
めに、膜蛋白質に結合した非イオン性界面活性剤を透析
によって除去することが困難な場合が多いが、本発明の
分離精製法では、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度
が非イオン性界面活性剤に比べて高いので、透析によっ
て容易に界面活性剤の除去がおこなえる。又、非イオン
性界面活性剤と異なり、電気透析によって容易に界面活
性剤が除去できる点でも有利である。

（５）非イオン性界面活性剤と陰イオン性界面活性剤を
混合界面活性剤を用いてゲル電気泳動法を行なうと、膜
蛋白質を分離精製することが可能であるが、界面活性剤
の除去が前述の理由により困難となる。

次に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら
に限定されるものではない。

〔実施例〕

イヌ腎（Ｎ　ａ　＋、Ｋ”　）　Ａ　Ｔ　Ｐａ５ｅ　の
分離精製に関し、参考例、実施例、仕較例をあげて説明
する。尚、分離精製後のＡ　Ｔ　Ｐ、Ｓｅ活性の有無及
び分離精製の度合は、次のようにして測定した。

ＯＡ　Ｔ　Ｐ　ａｓｓ活性の判定 ４ｍＭ　　ΔＴＰ、　１００　ｍＭ　ＮａＣＬ　２５　
ｍＭＫＣβ、３．９　’ｍ　Ｍ　　ＭｇＣｌ２．０．２
ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む３０ｍＭイミダゾール／３０ｍ
Ｍグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ７，２，２０℃）中に
、適量の大豆由来リン脂質を加え、３７℃、２．５〜４
分間処理し、次いで濃度ＳＤＳ水溶液を加えることによ
って反応を修了させた。しかる後、無機リン酸の生成の
有無を、ｌｅｇｙ、ｖａｒｙ　　らの方法［：　Ａｎａ
ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９４　．３９７　４０１　（１９
７９））に準じて判定した。

Ｏ分離精製の度合 本発明におけるゲル電気泳動修了後、ゲルを取り出し、
スラブ式二次元電気泳動装置を用いて、従来行われてい
る５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をすること
により確Ｊ忍した。即ち、（Ｎａ”　１．Ｋ”　）　Ａ
ＴＰａｓｅ　はαとβの分子量の異なるサブユニットか
らなりこれらが数個集合してオリゴマーを形成している
ことが知られており、（Ｙ、　１ｌａｙａｓｈｉ　ｅｔ
ａｌ、、　　Ｂ、　Ｂ、　Ａ、、　　７４８　。

１５３−１６７　（１９８３）：］、純粋な（Ｎａ′″
、Ｋ＋　）ＡＴＰ、、ｓｅに対して５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行うと、αとβに対応する二本
のバンドが得られ、それ以外のバンドば得られない、従
って第三のバンドの有無を、分離精製の度合を調べる指
標として分離精製の度合を調べた。

参　　考　　例 Ｊφｇｅｎｓｅｎの方法ＣＢ、Ｂ、Ａ、、３５６．３６
−５２（１９７４））で精製した（Ｎａ＋、Ｋ＋　）Δ
ＴＰ、Ｓ、を用い、ポリオキシエチレン（平均３モル）
ドデシルエーテル硫酸ナトリウム／ドデシルトリメチル
アンモニウムクロリド（モル比９０／１０）存在下で一
次元目の、従来行われているＳＤＳ存在下で一次元目の
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。

−次元および二次元のポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供したゲル組織、緩衝液組織をそれぞＱ れ下記の表−１、表−２に示す。

表−１ゲル組成 アクリルアミド　　　　　　　　　　　　　　５％Ｎ、
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド　２．７％過過硫酸
モモニウム　　　　　　　　　０．０７％Ｎ、Ｎ、Ｎ’
、Ｎ’−テトラメチレンジアミン０．１５％ リン酸緩衝液（ｐ！（７）　　　　　　　　　１００ｍ
Ｍ界面活性剤　　　　　　　　　　　　　　０．１％水
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　バランス表−
２緩衝液組織 リン酸緩衝液（ｐＨ７＞　　　　　　　　’１０ｍＭ界
面活性剤　　　　　　　　　　　　　０．１　　％水　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　バランスゲル電
気泳動は文献・底置に開示されるＳＤＳｎ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に準じて行った。

〔例えば、Ｊ　、　Ｖ　、　Ｍａｉｚｅｌ、　　Ｊｒ、
。

”Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　”
　　、　　八ｃａｄ’ｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ’。

（１９７１）、Ｐ、１７９：高木俊夫、三宅淳、“新実
験化学講座２０巻　生物化学Ｉ（日本化学全編）”丸蓋
（１９７８）、Ｐ、１０９）但し、本発明による混合界
面活性剤を使用する場合には、Ｓ−８結合解裂剤は加え
ず、ＳＤＳを本発明における界面活性剤に読み替えた。

その結果、明瞭な２本のバンドが得られ、これらをゲル
外に泳動させた後、Ａ　Ｔ　Ｐ、５ｅ　活性の有無を判
定したところ陽性であった。また、同様の操作を行った
ゲルを取り出し、スラブ式二次元電気泳動装置を用いて
、従来行われている５ＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行ったところ、２本のバンドからそれぞれα
とβに対応する２つのスポットが得られ、それ以外のス
ポットは認められなかった。この場合、−次元と二次元
ゲル電気泳動においてバンドの移動度に差が認められた
。

又、このものについてＡＴＰ、、ｅ活性の有無を判定し
たところ陰性であった。これは本発明による混合界面活
性剤とＳＤＳとでは、α、βのサブユニットの流体力学
的体積に及ぼす効果に差があることを示すものである。

即ち、本発明によるポリアクリルアミドゲル電気泳動で
得られた２本のバンドは、αおよびβであり、再構成す
ることにより生体機能を回復することがわかる。

実施例１ イヌ腎から分画したミクロソームを、ポリオキシエチレ
ン（平均３モル）ドデシルエーテル硫酸ナトリウム／ド
デシルトリメチルアンモニウムクロリド（モル比９０／
１０）水溶液（１％）に混合し、超音波照射した後、遠
心分離してよ清をとり、これの分離精製を行った。条件
は参考例と全く同一である。参考例で得られた二本のバ
ンドに対応する移動度を示すゲル部位を切断し、これら
に含まれる膜蛋白質の回収を行った。Ａ　Ｔ　Ｐ、、。

活性は、陽性であった。また分離精製の度合をスラブ式
二次元ゲル電気泳勧装置を用い、５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い確認したところ、二つのバン
ドからそれぞれαとβに対応する明瞭なスポットが得ら
れ、それら以外のスポットは認められなかった。従って
、分離精製の度合は極めて良いといえる。又、−次元ゲ
ル電気泳動と二次元ゲル電気泳動における二つのバンド
の移動度には差が認められた。

実施例２ 実施例１における界面活性剤を、ポリオキシエチレン（
平均２モル）ドデシルエーテル硫酸ナトリウム／ドデシ
ルジメチルアミンオキシド（モル比７０／３０）に置き
換え、同様の操作を行った。

但し、本発明によるポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて（Ｎａ＋、Ｋ”　　）ＡＴＰａｓｅ　の泳動速度
は用いる界面活性剤によって異なるため、あらかじめ参
考例に示した予備試験を、上記界面活性剤に置き換えて
目的とする膜蛋白質の泳動位置を求めておいた。その結
果、Ａ　Ｔ　Ｐ、、ｅ活性は陽性であり、純度は極めて
良好であった。

実施例３ ドデシル硫酸ナトリウム／ドデシルジメチルアミンオキ
シド（モル比６５／３５）を用いて実施例１および２に
記載した操作を行った結果、ＡＴＰい。活性は陽性であ
り純度は極めて良好であった。

実施例４ ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム／ドデシルジメ
チルベタイン（モル比６０／４０）を用いて実施例１及
び２に記載した操作を行った結果、Ａ　Ｔ　Ｐ、、、活
性は陽性であり、純度は極めて良好であった。

比較例 Ｆデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて参考例と同
様の操作を行ったところ、二本のバンドが得られた。こ
れらを切り出した後、再構成してΔＴＰａ５ｅ　活性の
有無を判定したところ、活性は陰性であった。又、スラ
ブ式二次元ゲル電気泳動により純度のｎ　ｉＪをした結
果、明瞭な二本のバンドのうち移動度の大きなものは二
次元電気泳動においても移動度が大きな単一のスポット
になり、もう一方の移動度の比較的小さな明瞭なバンド
は二次元電気泳動においても比較的移動度が小さな単一
のスポットになり、いずれも−次元ゲル電気泳動で得ら
れた移動度とほとんど差がなかった。

即ち、ＳＤＳを用いると、（Ｎａ＋、Ｋ＋　）Ａ　Ｔ　
Ｐａ、ｅ　のαとβのサブユニットは流体力学的体、積
を変化させ、結果として生体機能の回復が不可能になる
まで変性しているといえる。

特許庁長官　志　賀　　　学　殿 ■、事件の表示　　　昭和５９年特許願第１９７３７９
号２、発明の名称　　　生体膜蛋白質の分離精製法３、
補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　　（６７６）ライオン株式会社４、代理人 ５、補正命令の日付　　自　　発 ６、補正の対象　　　　明細書の発明の詳細な説明の欄
（１）　　明細書第２０頁第４行目の“′２．７％゛′
を「２．７％（アクリルアミドに対して）」に訂正する
。

（２）　　同書同頁第１２行目のリン酸緩衝液の添加量
の”　１０　ｍ　Ｍ　”を「１００ｍＭ」に訂正する。

（３）同書第２１頁第１０〜１１行目の′その結果、・
・・・・・・・・・・・泳動させた後、′を下記の通り
訂正する。

［その結果、明瞭な２本のバンドが得られた。

同時にゲル電気泳動を行い、明瞭な２本のバンドに相当
する）■位に含まれる蛋白質（染色処理は施さなかった
）をゲル外に泳動させた後、」

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）（Ａ）陰イオン性界面活性剤と（Ｂ）陽イオン性
   界面活性剤及び両性界面活性剤とから選ばれる少なくと
   も１種の界面活性剤の存在下において、ゲル電気泳動法
   を用いることを特徴とする生体膜蛋白質の分離精製法。
2. （２）成分（Ａ）と成分（Ｂ）とがモル比で（Ａ）／（
   Ｂ）＝９５／５〜５０／５０の範囲にある特許請求の範
   囲第（１）項記載の分離精製法。
3. （３）成分（Ａ）が、炭素数１０〜１２のアルキル硫酸
   塩、エチレンオキシドの平均付加モル数が１〜３の範囲
   にありアルキル基の炭素数が１０〜１４であるポリオキ
   シエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル基の炭素
   数が１０〜１４のアルキルベンゼンスルホン酸塩及び炭
   素数１０〜１４のα−オレフィンスルホン酸塩の群から
   選ばれる少なくとも１種である特許請求の範囲第（１）
   項又は第（２）項記載の分離精製法。