JPS6181798A

JPS6181798A - 細胞リセプタ−の回収

Info

Publication number: JPS6181798A
Application number: JP60162784A
Authority: JP
Inventors: フランセス・エム・ブロツドスキー
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1984-07-23
Filing date: 1985-07-23
Publication date: 1986-04-25
Also published as: EP0169729A2; EP0169729A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は総括的には特定リガンドのための細胞表面リセ
プターを回収する方法に関する。更に詳細には、本発明
は、モノクローナル抗体の調製のための抗原としての使
用のため、および細胞表面リセプターを経由する医薬の
受渡し効果を試験するための特定の細胞表面リセプター
の回収に関する０発明の背景インスリンのようなホルモン、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ
）のような栄養物質、アデノウィルスのようなウィルス
、ジフテリア毒素およびリチンのような毒素、ポリクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体を含む免疫グロブ
リン等の種々のリガンドが細胞表面上の特定リセプター
に結合することが知られている。これらの細胞表面リセ
プターは、しばしば特定タイプの細胞または機能リンパ
球サブセットのマーカーである。例えば、アシアログリ
コ蛋白リセプターは肝の実質細胞上にのみ見出され、ま
た、トランスフエリンリセプターはリコグニション・シ
ステム響オブ・マンマリアン働リバー；リセプター・デ
ィストリビューション・オン・ザ・ヘハトサイトセル・
サーフェス（（）ａｌａｃｔｏｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｏｆ　Ｍａｍ
ｍａｌｌａｎ　Ｌｌ’Ｖｅｒ：　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｄ
ｌｓｔｒｌｂｕ−ｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｈｅｐａｔ
ｏｃｙｔｅ　ｃｅｌｌ　ｓ’ｕｒｆａｃｅ）　；ジャー
ナル拳オフ゛・セル・バイオロジー（Ｊ、　ｃｅｌｌＢ
ｉｏｌ）９０：６８７　６９６、およびドロウブリッジ
（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ）、Ｉ　、Ｓ、等（１９８１）
　　ヒユーマン−セル０サーフエス・クリコブロチイン
・リレイテツド・トウ・セル・プロリフアレージョンｅ
イズーザ・リセブターーフオー・トランスフェリン（Ｈ
ｕｍａｎ　ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｇｌｙｃｏｐｒ
ｏｔｅｉｎｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌ
ｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒ　
ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）：プロシーデイング
ス・ナショナル・アカデミ−・オブ會サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ’ｔＡｃａｄ、　ｏｆ　５ｉｃｅｎｃｅ
）ＵＳＡ７８．３０３９−３０４３゜このようなリセプターと反応するモノクローナル抗体は
、組織特異プローブとリンパ球サブポピユレーション（
副集団）の程度を分析する道具（切ｏ１）との両者を与
える。

組織特異モノクローナル抗体は転移細胞の組織由来を同
定し、特定組織を医薬の標的にするのに使用できる。リ
ンパ球サブセットを検知できるモノクローナル抗体は免
疫症状の診断に、および悪性細胞側集団を医薬の標的に
するのに有用である。

これまで、ある種の細胞表面リセプターに特異なモノク
ローナル抗体が調製されてきた。このようなモノクロー
ナル抗体の調製のための現在の技術では、全細胞によっ
てマウスを免疫している。勿論、全細胞は目的のリセプ
ター以外のリセプターも含んでいる。これは目的の細胞
表面リセプターに特異なモノクロ−ナル抗体を回収する
ためのスクリーニング方法を複雑にしている。目的の細
胞表面リセプターは細胞表面蛋白の全免疫源のうちの僅
かな成分である。マウスを免疫するのに使用される精製
または部分精製したリセプメーを得て、所望の細胞表面
リセプターに特異なモノクローナル抗体を調製する方法
を簡素化することは望ましいことであろう。最近、いく
つかの細胞表面リセプターが、そのリセプターを認識す
るリガンドと組合されて細胞中に実際に入ることが発見
された。

イン・アンド・パーティクルズ・イントウー拳セルズ（
Ｈｏｗ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　Ｂｒｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ　ａｎｄＰａｒｔｉｃｌｅｓ　　　Ｉｎｔｏ　　
Ｃｅ１ｌｓ）、　　　Ａ、　　　ド　ウ　ト　Ｉノ　−
　−ノ（−サット（Ｄａｕｔｒｙ−Ｖａｒｓａｔ　）等
、ｖｏＬ、２５０＋煮５　　ｐｐ５２−５８．１９８４
年５月。例えば、イ／スリンリセプターおよびインスリ
ンは細胞内に一緒に入る（内在化という）ことが知られ
ている。リセブターを細胞内に内在化させる方法も最近
発見された。いくつかのリセプターは被覆ビットと呼ば
れる細胞表面上の位置に配置されており、それによって
ＬＤＬのようなりガントに結合する。

他のリセプターはインスリンのようなリガンドと結合し
、次いで被弾ビットに移動する０リセブターおよびその
リガンドは次いで細胞により被覆小胞と呼ばれる膜体サ
ック内に内在化される。被覆小胞は、エンドソームまた
はリセプトソームとして知られる、細胞内サック中に融
合、集積される。

被覆小胞は、エンドンームが形成される際に解離する蛋
白質の被覆を有する。エンドソームはＣＵＲＬ（非カッ
プリングのリセプターおよびリガンドのための小室）と
称される形態に転化する。

このＣＵＲＬは酸浴を含有し、ここでリガンドはリセプ
ターから遊離される。多くの場合、リガンドはリンシー
ムへ移行し、ここで消化される。リセプターは多くの場
合細胞表面に戻る。

上記のように、適当なリガンド（ホルモン、抗体または
栄養素）がその細胞表面リセプターと結合する際、これ
らリセプターは膜内に集合し、リガンドと共に内在化さ
れる。この過程はリセプター媒介エンドサイトシ’、１
．（ＲＭＦ、）と呼ばれる。この内在化により、細胞内
で被覆小胞を形成し、この小胞は細胞表面で生じるより
も非常に高濃度でリセプター／リガンド複合体を含んで
いる。被覆小胞はクラスリンと呼ばれる蛋白によって覆
われている。これは多分りセブタ−／リガンド内在化の
機構に関与しているであろう０ノ（−ス（Ｐｅａｒｓｅ
）。

ＢＭＦ（１９７５）　ｒコーテッド・ベシクル・フロム
・ピッグ・プレイン：ピューリフイケーション働アンド
ーバイオケミカル・キャラクタライゼーション（Ｃｏａ
ｔ、ｅｄ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐｉｇ　ｂｒ
ａｉｎ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）　
：ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　９７：本発明により、細
胞分析および抗体生産に使用する細胞表面レセプターの
精製方法を提供する。

発明の要約本発明は特定のリガンド用の細胞表面リセブターの回収
方法を提供する。本発明の方法において、細胞はリガン
ドの存在下で、リガンドが細胞膜表面上でリセブターと
結合し、そして、リガント°とリセプターの複合体を生
成するのに十分な時間にわたってインキュベートされる
。インキュベートは複合体が、被覆小胞の形で細胞中に
内在されるようになるのに十分な時間にわたって継続さ
れる。

次いで細胞膜を破壊し、その後、細胞中の被覆小胞から
複合体を放出させ、細胞断片と被覆小胞の分散体を得る
。次いで、被覆小胞のタンパク質被覆に対して特異なモ
ノクローナル抗体と分散体とを接触させ、特定のリガン
ドに対する細胞表面リセプター含有被覆小胞を回収する
。

図面第１図は細胞表面リセプターを回収するための本発明の
方法における様々な工程を示す模式図である。

発明の開示本発明の方法において、目的とする細胞の生存培養物が
準備される。本明細書において使用される、「細胞培養
物」という用語は細胞の生存培養物および生存細胞を含
有する新鮮組織サンプルを意味する。細胞培養物は適当
な方法、例えば、フレッシュ＝　−（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ
）　、　Ｒ，１，（１９８３）「動物細胞の培養二基本
操作マニュアル」（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　　＝ニ
ーヨーク）に開示されたような方法により調製できる。

次いで、目的のリガンドを細胞培養物に添加する。好ま
しくは、リガンドはリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７，４）
のような適当な溶媒中に分散する。リガンドは約０．１
〜約１ｍｇ／−の濃度で添加されるが、好ましくは、細
胞１ｍｇあたり、０．００１〜約０．０１！のリガンド
を添加する。

細胞およびリガンドを次いで、約り℃〜約６℃、好まし
くは約４℃で、約４０〜約６０分間インキュベートし、
続いて、約り２℃〜約４２℃、好ましくは３７℃で約６
〜５分間インキュベートする。

前記のインキュベート時間およびインキュベート温度は
リガンドをリセプタ一部位と反応させ、そして、該部位
に結合させて細胞膜の表面上に複合体を生成させ、更に
、生成複合体を被覆小胞の形で細胞中に内在させるよう
にするのに十分である。

しかし、インキュベートの条件の選択は、被覆小胞が細
胞内で破壊されることを防止し、それによって、リガン
ドおよびリセプターが放出できる条件を選択すべきであ
る。低い温度でインキュベートすると、リガンドをリセ
ブターに結合せて複合体を生成することはできるが、複
合体の細胞中への内在化は阻害される。高い温度で、前
記のインキュベート時間にわたってインキュベートする
と、複合体を内在化させて被覆小胞を生成することはで
きるが、被覆小胞をエンドソームに進化させることはで
きない。

次いで、適当な方法により細胞膜を破壊し、細胞断片と
被覆小胞の分散体を得る。細胞膜を破壊し、そして、被
覆小胞を放出させるための好適な方法の一例は次のとう
りである。

１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，２）　、０．１５　
Ｍ　　ＮａＣｔ。

１　ｍＭ　　Ｅ（）ＴＡ　、　０．５　ｍＭ　ＭｇＣ４
２，、０，０２％Ｎ　ａＮ　３および０．２ｍＭ　ＰＭ
ＳＦからなる溶液中の細胞を約２バールの空気圧でスタ
ンステッド細胞破砕器（Ｓｔａｎｓｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　
Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）から押し出し、そして、１２．５
ｐＳｉの背圧にさらす。破壊されなかった細胞および核
を次いで、遠心分離することによって除去する。

細胞源として組織を使用する場合、前記と同じ濃度、時
間および温度条件で、組織をリガンドで−面におおう。

全面被覆技法はウオール（Ｗａ　１１　）　＋Ｄ、　Ａ
、う（１９８１）の「哺乳動物肝臓のガラクトース−特
異性識別系：ヘパトサイト細胞表面上のリセプター分布
」、ジャーナル・オブ・セルｅバイオロジー（Ｊ、　Ｃ
ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　）：　９０　：　６８７−６９６
に開示されている。培養組織はワーリングプレンダーの
ような高スピードの剪断型プレンダー中で破壊される。

次いで、細胞断片と被覆小胞からなる分散体を、被覆小
胞を覆うタンパク質に特異なモノクローナル抗体と接触
させることによって、前記分散体から被覆小胞を回収す
る。このタンパク質は主に、クラスリン、即ち、英国の
分子生物学の医学研究院ラボラトリ−のバーバラ（Ｂａ
ｒｂａｒａ）　Ｍ、　Ｆ。

ピアス（Ｐｅａｒｓｅ）により同定された線維状タンパ
ク質である。好適なりラスリン特異モノクローナル抗体
はスタンフォード大学医学部によりマウス中で発生され
た。この抗体はＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔ、ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から、ＡＴ
ＣＣＴｌＢ１３７　　ｅｖＣ，４（マウス−マウスバイ
ブリド−−マ）の寄託番号で入手できる。

分離の容易さのため、モノクローナル抗体はセファロー
ス２　Ｂ　（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　２Ｂ　）のようなア
ガロースのカラムのような基体に連結されることが好ま
しい。細胞フラグメンドおよびエンドシームの分散体は
それからその方ラムを通って流れ、そのカラムでその被
覆小胞のたん白質は反応し、そしてそのモノクローナル
抗体と結合し、その間その細胞フラグメンドはそのカラ
ムを通る。抗体を基体に付着又は連結させるための適当
な手段は十分に公知であり、そして本明細書でさらに詳
しく記載しない。１つの適当な方法はマーチ・ニス・シ
ーの、バリツク嘩アイ（Ｍａｒｃｈ　Ｓ、　Ｃ，Ｐａｒ
ｉｋｈ。

１、）カトレカサス、ビー（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ　
、Ｐ　、　）による「親和性クロマトグラフのためアガ
ロースの臭化シアン活性化のための単純化方法」アナリ
テイカルバイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、）６０：　１４９−１５２（１９７４）に記載さ
れている。

その被覆小胞はそれから適当な薬品でそのカラムから除
去される。その除去条件は、被覆小胞を同時に破砕させ
リガンドおよびリセプターの分散体を作ジ、そしてその
カラムに結合したクラスリン（ＣＩＡｔｈｒｉｎ）　ｆ
残すようにその除去条件が選択されることが好ましい。

適当な薬品は５０ｍＭトリス−ＨＣｔ（Ｔｒ　ｉ　５−
ＨＣｔ）　　のようなオクチ／ｌｚ　ｍグルコサイド洗
剤約１％を含む８．０のｐＨの水溶液である。本明細書
において使用されたパーセントすべては特にことわりが
なければ重量による。

リガンドおよびリセプターの分散体は、初期細胞と比較
してリセプターが高度に濃縮されている状態にあり、そ
してそのリセプターのために特別なモノクローナル抗体
製造のだめの免疫原として有用である。これは引続いて
の精製方法の経験上の決定を含み、それは各々個々のリ
セプターにとって変化するだろう。コンブ等による米国
特許第４．３６４，９３６　（第５欄４６行〜第６欄６
９行）は免疫原でのマウスの免疫化およびこのような免
疫化の後のモノクローナル抗体を製造する方法を示して
いる。

本発明の方法は薬あるいは毒素又は薬あるいは毒素に結
合した抗体のような或種のリガンドの細胞中への内在（
取り込み）の効率を分析するために又使用できる。抗体
−毒素結合物又は抗体−薬物結合物がシーぺ等（Ｔｈｏ
ｒｐｅ）　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）による「抗体−毒
素結合物の製造および細胞毒性」イムツル、レプ、　（
Ｉｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、）　　３２　：１９９−１１
８に記載されている。本発明の方法を用いれば、薬、毒
素または抗体結合物を細胞とインキュベートする。その
細胞は破砕され、そしてその被覆小胞体は回収される。

その被覆小胞はそれから薬、毒物又は抗体の存在に対し
て分析できる。

下記の実施例は本発明の各種の特徴を明らかにするが、
しかし本発明の範囲を限定するものではない。　゛実施例１および２で使用された略語を次の通りである：ＨｇＰＥ５：　　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ７
Ｎ／　−２−エタンスルホン酸ＭＥＳ　　：　　２−［Ｎ−モルホリノ〕エタンースル
ホン酸ＥＤＴＡ　　：　　エチレンジアミン四酢酸ＥＧＴＡ　
　：　　エチレングリコール−ビス（Ｂ−アミノエチル
エーテル）　　Ｎ　、Ｎ、Ｎ’　）　Ｎ−四酢酸ＰＭＳＦ　　：　　−ｙエニルメチルスルホニルフルオ
ライド実施例１インスリン　リセプターの回収１、　１０９　　個のリンホブラストイド株化細胞は４
℃でインスリ７１ｍｇ／−を含むＺ４のｐＨのリン酸塩
緩衝塩水１０−に懸濁される。

２、細胞は氷上に１時間放置され、それから遠心分離に
より除去される。

３、細胞は３７℃まで予め暖められた緩衝液Ａ（７，２
ｐＨのＨＥＰＥＳ　１０　ｍＭ、　Ｎａ１ｌ　Ｏ，１５
Ｍ　。

ＥＧＴＡ　１　ｍＭ、　ＭｇＣｔ２ｏ、　５　ｍＭ、　
ＮａＮ３　ｏ、　０２％。

ＰＭＳＦＣｌ、２ｍＭ）５０−中に再懸濁化される。

４．６分後（その間細胞は３７℃温水中のチューブの中
へガーゼヲ通して濾過される）その細胞懸濁液は室温で
１２．５ｐｓｉの背圧のもとて２バールの空気圧でスタ
ンステッド細胞破砕器（Ｓｔａｎｓ−ｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ
　Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）’）通される。

５、破壊された細胞は集められ、そして６０分間４℃で
３８−３４回転子で１２５０　Ｏｒｐｍで遠心分離され
る。

６、上澄液は除去され、そして４℃で１００．０００　Ｘ　Ｐでペレット被覆小胞および他の
膜フラグメンドに高速遠心分離される。

７、　そのベレットは６．２　ｐＨのＭＥＳ　２Ｑ　ｍ
ＭおよびＣａＣ１ｚ　２ｍＭの５−（緩衝液Ｂ）中に再
懸濁化され、そして同じ緩衝液中に平衡にあるセファロ
ース−２Ｂ　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　２Ｂ）　　に結合
している、抗クラスワンモノクローナル抗体の１−カラ
ムに適用される。

８、緩衝液Ｂ５０容量でその方ラムの洗浄の後、その力
２ムは緩衝液Ｃ（８，ＯｐＨのトリス（Ｔｒｉｓ）５０
ｍＭ　、ＥＤＴＡｌｍＭ）　　で溶離され６　ｏ　Ｈ小
胞ｆｉａが溶出し、そしてそれらのクラスワン被覆はそ
のカラム上に残っている。

９、その溶離物は緩衝液Ｃ中のオクチルグルコサイド２
％で１：１まで希釈され、これにより膜小胞は破砕され
る。

１０．３０分間４℃に放置後、溶離物をＺ４のｐＨのリ
ン酸塩緩衝塩故に対して透析する。これにより、リセプ
ターが被覆小胞体から溶出し、ミセルを形成する。

１１、　　マウスを透析カラム溶離物で免疫し溶離物中
の成分（イ／スリンリセプターも含む）に対するモノク
ローナル抗体を製造する。

実施例２抗トランスフエリンリセプターモノクローナル抗体に結
合したりテンが被覆小胞中に入り込むか否かの決定。（
リチン結合モノクローナル抗体はソーぺ、ピー、イー、
　（Ｔｈｏｒｐｅ、Ｐ、　Ｅ、　）およびロス、ダブリ
ュ、シー、ジエイ、　（Ｒｏｓｓ、Ｗ、　Ｃ。

Ｊ、）（１９８２）、ｒ抗体−毒素結合物の製造および
細胞毒性」、イムツル、レプ、　（工ｍｍｕｎｏ１．Ｒ
ｅｖ、）３２：ｌ１１９−１５８）に記載されている方
法で調製した。

１、１０　個のＢリンホブラストイド株化細胞を、１ｍ
ｇ／づのリチン−結合抗トランスフエリンリセプターマ
ウスモノクローナル抗体とともに、４℃でｐＨ７４のリ
ン酸緩衝塩浴液１０ｄ中に懸濁させた。

２、細胞を前記工程２−９と同様に処理した。

３、山羊−抗−マクスエｇをポリ塩化ビニルのマイクロ
タイタープレートに固定化し、蛋白質結合サイトをウシ
血清アルブミンでブロックした。

４、抗−クラスワンモノクローナル抗体カラムからの溶
離液を前記被覆プレートに加え、４℃で１時間後に、未
結合物質を洗い去った。

５、　プレートに結合したマウスモノクローナル抗体の
存在は、１２吋−抗−マウスＩｇまたは酵素結合抗−マ
ウスＩｇにより検出した。陽性の信号は、リチン結合−
抗体が細胞中の被覆小胞中に入り込んでおり、最後には
細胞中の酸性小室に向けられるであろうことを証拠だで
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は細胞表面リセプターを回収するための本発明の
方法における様々な工程を示す模式図である。１！ｌ１ｆｆの浄書で１内容に変更なし）手　　続　　
補　　正　　書昭和ｌσ年／１）月／１日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）細胞をリガンドの存在下で、該リガンドが細胞膜
表面のリセプターに結合して該リガンドと該リセプター
との複合体を形成し、該複合体が細胞内に被覆小胞（こ
の被覆小胞は、蛋白質で被覆された複数の前記複合体を
含む）の形で内在するようになるに十分な時間インキュ
ベートし、前記複合体が前記細胞内で前記被覆小胞から
放出される以前に、前記細胞の膜を破砕して、細胞フラ
グメンドと被覆小胞との分散物を得、そして前記分散物
を前記被覆小胞の前記蛋白被覆に対して特異的なモノク
ローナル抗体と接触させて、これによジ前記リガンドの
前記細胞表面リセプターを有する前記被覆小胞を回収す
ることよりなる、特異的リガンドに対する細胞表面リセ
プターを回収する方法。
（２）モノクローナル抗体を支持体に結合させる特許請
求の範囲第１項記載の方法。
（３）支持体をカラム中で分散させ、該分散物とモノク
ローナル抗体との接触を、前記分散物をカラム中に通過
させて行なう、特許請求の範囲第２項記載の方法。
（４）被覆小胞を破砕してリガンドとリセプターの分散
物を得る、特許請求の範囲第１項記載の方法。
（５）リガンドとリセプターの分散物を免疫源として用
い、該リセプターに対するモノクローナル抗体を得る、
特許請求の範囲第４項記載の方法。
（６）細胞源が組織サンプルである、特許請求の範囲第
１項記載の方法。
（７）細胞源が細胞の生存培養物である、特許請求の範
囲第１項記載の方法。
（８）リガンドの存在下での細胞のインキュベーション
を、約２℃ないし約４℃の第一温度で約４０ないし約８
０分間、そしてその後約３２℃ないし約４２℃の第二温
度で約２ないし約７分間行なう、特許請求の範囲第１項
記載の方法。
（９）リガンドの存在下での細胞のインキュベーション
を、約４℃の第一温度で約６０分間、そしてその後約３
７℃の第二温度で約３ないし約５分間行なう、特許請求
の範囲第１項記載の方法。
（１０）リガンドの細胞への添加を、約０．１ないし約
１ｍｇ／ｍｌのリガンド濃度の溶液または分散液として
、細胞１ｍｇ当り約０．００１ないし約０．０１ｍｇの
リガンドに相当する量で行なう、特許請求の範囲第１項
記載の方法。
（１１）モノクローナル抗体が抗−クラスリン（ａｎｔ
ｉ−ｃｌａｔｈｒｉｎ）である特許請求の範囲第１項記
載の方法。
（１２）細胞をリガンドの存在下で、該リガンドが細胞
膜表面のリセプターに結合して該リガンドと該リセプタ
ーとの複合体を形成し、該複合体が細胞内に被覆小胞（
この被覆小胞は、蛋白質で被覆された複数の前記複合体
を含む）の形で内在するようになるに十分な時間インキ
ュベートし、前記複合体が前記細胞内で前記被覆小胞か
ら放出される以前に、前記細胞の膜を破砕して、細胞フ
ラグメンドと被覆小胞との分散物を得、そして前記分散
物を前記被覆小胞の前記蛋白被覆に対して特異的なモノ
クローナル抗体と接触させて、これにより前記リガンド
の前記細胞表面リセプターを有する前記被覆小胞を回収
し、該被覆小胞について該リガンドの存在を分析するこ
とよりなる、リガンドの細胞内への内在化の測定方法。
（１３）モノクローナル抗体を支持体に結合させる特許
請求の範囲第１２項記載の方法。
（１４）支持体をカラム中で分散させ、該分散物とモノ
クローナル抗体との接触を、前記分散物をカラム中に通
過させて行なう、特許請求の範囲第１６項記載の方法。
（１５）被覆小胞を破砕してリガンドとリセプターの分
散物を得る、特許請求の範囲第１２項記載の方法。
（１６）細胞源が組織サンプルである、特許請求の範囲
第１５項記載の方法。
（１７）細胞源が細胞の生存培養物である、特許請求の
範囲第１２項記載の方法。
（１８）リガンドの存在下での細胞のインキュベーショ
ンを、約２℃ないし約４℃の第一温度で約４０ないし約
８０分間、そしてその後約３２℃ないし約４２℃の第二
温度で約２ないし約７分間行なう、特許請求の範囲第１
２項記載の方法。
（１９）リガンドの存在下での細胞のインキュベーショ
ンを、約４℃の第一温度で約６０分間、そしてその後約
３７℃の第二温度で約６ないし約５分間行なう、特許請
求の範囲第１２項記載の方法。
（２０）リガンドの細胞への添加を、約０．１ないし約
１ｍｇ／ｍｌのリガンド濃度の溶液または分散液として
、細胞１ｍｇ当り約０．００１ないし約０．０１ｍｇの
リガンドに相当する量で行なう、特許請求の範囲第１２
項記載の方法。
（２１）モノクローナル抗体が抗−クラスリン（ａｎｔ
ｉ−ｃｌａｔｈｒｉｎ）である特許請求の範囲第１２項
記載の方法。