JPS6187628A - 増殖性濾過性病原体類の不活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、フィブリノーゲンおよび第ＸＪＩＩ因子を
含有している組織接着剤（こおいて、これらの成分の生
物学的活性を十分に保持しながら、増殖性（濾過性病原
体を不活性化する方法に関する。

組織接着剤は、ヒトまたは動物の、血液または血漿を材
料として製造し、組織または骨の各部分を生理的に接着
するのに適用され、創”傷を封鎖し、出血を止め、創傷
治癒の促進（こ有用である。組織接η剤はフィブリノー
ゲンと第ＸＩＩＩ因子を活性成分として含有しており、
また所望により、例えばフイフロネクチン、アルブミン
、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質および／または
プラスミン阻害物質のようなそのほかの血漿タンパク質
、およびさら（こその他の添加物を含有しでいることも
ある。

２十 これらの、ｍ織接着剤の作用機序は、Ｃａ　　イオンの
存在下で第ｘ■因子がトロンビンにより活性化されて第
ＸＩ［Ｉａ因子となり、生成したフィブリンが第ｘｍａ
因子によって架橋反応を起こして高重合体となるため、
易溶性フィブリノーゲンが不溶性のフィブリンに変化す
ることに基づいている。

フィブリンの架橋形成、特にフィブリンα鎖の架橋形成
は、生成するａ塊の強度、したがって粘着性の強度が、
それによって際立って増大することから特に重要である
〔ジエン（Ｌ、　Ｌ、５ｈｅｎ　）、マクドナー　（Ｒ
０Ｐ８ＭｃＤｏｎａｇｈ　）、ハーマンス（Ｊ。

Ｈｅｒｍａｎｓ　Ｊｒ、　）　、［フィブリンゲル、ス
トラフチャー：インフルエンス、オブ、カルシウム、ア
ンド、コバレント、クロスリンキング、オン、ジ、エラ
スティシティ−（Ｆｉｂｒｉｎｇｅｌ　　５ｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃａｌｃｉｕｍ　
ａｎｄ　ＣｏｖａｌｅｎｔＣｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　
ｏｎ　ｔｈｅ　Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）　Ｊ　、バイオ
ケミカル、アンド、バイオフィジカル、リサーチ、フン
ミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　Ｒｃｓ　、Ｃｏｍｍ、）、５６巻
、７９３〜７９８頁（１９７４年）。ゼーリツヒ（Ｔ、
　Ｓ　ｅｅｌ　１ｃｈ）、レドル（ＨｏＲｅｄｌ　）　
、ｒテオレテイッシエ、グルントラーゲン、デス、フィ
ブリンクレーペルス（Ｔｈｅｏｒｃｔｉｓｃｈｅ　Ｇｒ
ｕｎｄｌａｇｅｎ　ｄｅｓ　Ｆｉｂｒｉｎ−ｋｌｅｂｅ
ｒｓ　）　Ｊ、シムプ７　（Ｋ、　Ｓｃｈｉｍｐｆ　）
編、［フィブリノーゲン、フィブリン、ラント、フイブ
リンクＬ／−ヘル（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ、　Ｆｉｂｒ
ｉｎ　ｕｎｄＦｉｂｒｉｎｋｌｃｂｅｒ　）　Ｊ　１９
９〜２０８頁（１９８０年）、Ｆ、に、シャッタウェル
、フエアラーク（Ｆ、に、５ｃｈａｔｔａｕｅｒ　Ｖｃ
ｒＪａｇ、　ＳｔｕｔｔｇａｒｔＮｅｗ　）ａｒｋ　）
刊〕。

したかつて組織接着剤の品質は、実質的にトロンビン（
こよってｌ疑固可能となる易溶性フィブリノーゲンその
ものの含有ｉ７）と、生成したフィブリンの、第ＸＩＩ
Ｉ因子の存在によって起こり得る架橋形成能によってき
まる。　　。

血液製剤の製造においては、出発物質の注意深い試験に
かかわらず、処置後、患者か微生物感染によって発病す
る危険率が低くはない。確かに、病原体を不活性化する
ため多数の試みがなされて来たが、活性物質の生物学的
活性がそこなわれるため、製剤の安全性が必ずしも常に
確保されているとは限らない。

砂流用の目的に限定して使用される製剤の場合は、生物
学的活性の損失の代償として投与量を増量することによ
って、経済的な影響はあるとしても、製品の効果を補う
ことができる。然し、組織接着剤の場合は、低下した生
物学的活性（トロンビンによって凝固可能となる易溶性
フィブリノーゲンそのものの含有用およびそれによって
生成するフィブリンの架橋形成能によって表わされる）
を投与量の増加によって補うことができない。何故なら
ば、低品質の接着剤だからと言って、それを多量に使用
しても接着は決して強まらないからである。それどころ
か、架橋結合を形成したフィブリンは線維芽細胞の増殖
を刺激して創傷治癒を促進するが、フィブリノーゲンま
たは架橋していないフィブリンにはこの好ましい効果か
ほとんど見られないことが知られている〔カサイ（Ｓ。

Ｋａｓａｉ　）、クニモト（Ｔ、　Ｋｕｎｉｍｏｔｏ　
）、ニッタ（Ｋ、　Ｎ目ｔａ）、「クロスリンキング、
オフ、フィブリン、パイ、アクテイベーテイッド、ファ
クターＸＩＩＩ、ステイミュレーツ、アタッチメント、
モルホロジカル、チェンジズ、アンド、プロリフニレ−
ジョン、オフ、フィブロブラスッ（Ｃｒｏｏｓ−Ｌｉｎ
ｋｉｎｇ　ｏｆ　　Ｆｉｂｒｉｎ　ｂｙ　　Ａｃｔｉｖ
ａｔｅｄ　ＦａｃｔｏｒＸＩＩＩ　　　Ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｅｓ　　　Ａｔｔａｃｈｍｃｎｔ、　　Ｍｏｒｐｈｏ
ｌｏ　−ｇｉｃａｌ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏ
目Ｅｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆＦｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　）
　Ｊ　、バイオメジカル、リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄ、Ｒ
ｅｓ、）、４巻、１５５〜１６０頁（１９８３年）〕。

このために、組織接着剤の不活性化の方法は、ウィルス
のような増殖性７濾過性病原体に関しては高度に効果的
であると同時番こ、これらの製剤の生物学的活性の大部
分を保有しなければならないという両面からの要求を充
たすものでなければならない。

血液製品番こ含まれでいる増殖性一過性病原体を不活性
化するため、それらを熱処理にかける多数の方法が知ら
れている。

即ち、公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ３２１０３８７１
号には、乾燥状態で加熱し、存在する感染性ウィルスを
不活性化する血液凝固酵素組成物の処理方法が記載され
ている。「乾燥状態」とは、この場合、０．０５（５（
重＠）％〕までの水分含有潰を意味する。然しなから、
ここに示された組成物はフィブリノーゲンおよび１ＸＩ
ｆｆ因子を含有しておらず、またそれらは組織接着用の
製剤ではない。

ローゼンヘルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　）　　らは、第
Ｘ■回輸血国際会議の論文抄録〔ザ、Ｘ■ス、インター
ナショナル、コンブレス、オン、ブラッド、トランスヒ
ュージ：Ｉ７　（ｔｈｅ　ＸＩＩｔｈ　　Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏ−ｎａｌ　　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｂｌｏ
ｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　）、アブストラクツ（
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　）、（１９６９年）、「ミア」パ
プリツシャーズ（′ＭＩＲ″Ｐｕｂｌ　１ｓｈｅｒｓ　
。

Ｍｏｓｃｏｗ）刊、４７３〜４７５頁〕に、アルブミン
溶液およびフィブリノーゲンを乾燥状態で１０時間、６
０℃に加熱することにより不活性化する方法を記載して
いる。この静注投与可能な製剤はフィブリノーゲン欠乏
症候群の処置用（こだけ使用されるものであって、この
製剤の場合、フィブリノーゲンは易溶性で、またｄ固可
能でなければならない。これらの製剤は第ＸＩＩＩＩＩ
因子を含有しておらず、組織接着（こ使用すべきもので
はない。

さら（こヨーロッパ特許出願公開第１０３，１９６号に
開示されている様に、組織接着剤溶液の分別操作中、ジ
ルシウムイオンの存在とともに、安定剤として大計のシ
ュクロースとグリシンの存在下で加熱を行なう組織接着
剤製剤の製造法が知られている。然しこの方法は、大量
の安定剤を加熱期間中に加えなければならず、処理後ま
たこれらを分離しなければならない不都合がある。その
間１こ１部のフィブリノーゲンが変性を起こし、加熱段
階のあとでこれを分離しなければならない。以上の問題
に加えて、この種の処理は、添加した安定剤がタンパク
質だけではなく、恐らく存在していると考えられるウィ
ルスまでも熱に対して安定化させる不都合がある。した
がって、この種の方法の効率は、アルブミン分子が高熱
に対して著しく抵抗性を有することから、大計の安定剤
を加えなくても、標準的なアルブミン溶液の加熱処理方
法（６０℃で１０時間加熱）を遂行できるという理由で
、標準的方法の効率とは決して比較し得るものではない
。

本発明は、これらの既知方法の不都合を排除しようとす
るものであって、ウィルスのような増殖性一過性病原体
に関して高い安全性を示し、しかも、高濃度のフィブリ
ノーゲンが易溶性を保ち、トロンビンによる凝固能を保
持し、また生成したフィブリンが高い架橋形成能を有す
るという意味において生物学的活性を十分に保持してい
る、ヒトまたは動物起源の組織接着剤製剤を提供するこ
とを目的としている。特にこの発明にしたかって調製し
た組織接着剤を使用して創傷処置を行なうこと【こより
、接着部位の十分な強度と、合併症をともなわないすみ
やかな創傷冶瘤が保証される。

この目的を達成するため、本発明方法は、第牒因子含量
をフィブリノ−デフ１ｇ当たり少なくとも１００単位含
有する組織接着剤製剤を、乾燥状態で、酸素を含まない
不活性保、獲気体、好ましくは窒素の存在下に、または
真空下で加熱することからなる。この場合、「乾燥状態
」とは０．０５までの水分含有ｍ〔５（重電）％〕を意
味する。

加熱は５０〜１２０℃の温度で、少なくとも１分〜１０
０時間より長い時間にわたって好適に実施でき、最も短
時間の場合はそれに対応して最も高温で行ない、またそ
の逆も成り立つ。加熱処理は、製造のあらゆる段階、お
よび／または製剤を最終容器に充填した後に実施するこ
とができる。

組織接着剤製剤の「乾燥状態」は、五酸化リンのような
水結合剤（脱水剤）で後乾燥処理を行なうことによって
支障なく達成することができる。

好ましい態様としては、ヒトのクリオプレシピテート（
寒冷型沈降物）を分別し、第ＸＩＩＩ因子の天然含量に
、好ましくはフィブリノーゲン１ｇ当たり約５００単位
の第ＸＩＩＩ因子含量合計が得られるまで、第ＸＩＩＩ
Ｉ因子をさらに追加し、分別操作の何れの段階および／
または製剤を最終容器に充填した後に加熱処理を行なう
ことによって組織接着ｄ斉１］ を製造する。

△ 熱処理を加えた製剤は、乾燥状態下で都合よく最終容器
中に貯蔵でき、使用前に１−当たり少なくとも７０■の
フィブリノーゲン濃度になる様に溶解することができる
。

然しまた、加熱段階の後で生成物を溶解し、最終容器に
充填し、安定性を保つため冷凍状態で貯蔵することも可
能である。

本発明方法は、下記（こ挙げる新しい知見に基づいてい
る。

（１）酸素を含んでいない保護気体下、または真空下の
方が、酸素の流通時よりも加熱処理中の製剤の安定性（
熱負荷耐容能）が実質的に高い。

（２）組織接着剤製剤の安定性（熱負荷耐容能）は第Ｘ
ＩＩＩ因子含量の増加によって増大するが、含水量（残
留湿度）の増加によって低下する。

（３）乾燥状態での酸素を含んでいない環境下での加熱
処理による不活性化の程度は、空気接触下の場合と実質
的に同じである。

これらの事実は、以下に示す実験例で得られる結果によ
ってもよく説明できる。

実験例１　各種含水量を有する組織接着剤製剤の窒素ま
たは真空条件下、および空気の存在下における安定性 米国特許第４，４１４，９７６号に記載の方法にしたが
い、既知の方法で組織接着剤製剤を調製した。

新たに調製し、−２０℃に凍結したヒト血漿２７７１を
＋２℃まで加温し、生成したクリオプレシピテートを遠
心によって分離し、１１当たり、クエン酸三ナトリウム
塩１．２８２０６．６　ｇ　、ＮａＣｌ３．４ｇ、グリ
シン１０．０ｇ、アプロチニン２５，０００ＫＩＵ　お
よびヘパリン２００１．Ｕ、　を含有しているｐＨ５，
５の緩衝液で処理し、ついで、＋２℃で２回目の遠心を
行なった。分離した沈澱を、１１当たり、ヒトのアルブ
ミン１９．０ｇ、グリシン９゜ｏｇ、クエン酸三ナトリ
ウム、・２Ｈ２０１，Ｏｇ　。

アプロチニン２５，０ＯＯＫＩＵ　およびヘパリン２０
０１、Ｕ、を含有しているｐＨ７，９の新たな緩衝液３
こ再度溶解し、タンパク質濃度が１１当たり５０ｇとな
るように調節した。この溶液を滅菌濾過し、それぞれ１
２．５ｍ／づつ最終容器（バイアル）に充填し、冷凍し
て凍結乾燥した。このようにして得られた製剤中のフィ
ブリノーゲンに対する第ＸＩＩＩ因子の割合は、フィブ
リノーゲン１ｇ当たり、第ＸＩＩＩ因子１０９単位とな
った。製剤中の水分含−晟（残留湿度）は０，０１（１
（重機）％〕より少なかった。

フィブリノーゲンの含量は、ＵＳＰ第ＸＶＩ版２９８頁
の規定にしたがい、トロンビンによって凝固し得るタン
パク質をキエルダール法で測定する方法により測定した
。

第ＸＩＩＩ因子の含量は、第ＸＩＩＩ［因子を含有して
いないフィブリノーゲンを基質として使用するフィブリ
ン架橋形成試験により、下記の要領で測定した。

フィブリノーゲン含量が１０■／ｍｔである第豆因子を
含んでいないフィブリノーゲン溶液０．５ｍ／！を、測
定すべき試料の各種希釈液０．０５ｍ／、および１ｒｎ
ｌ当たりトロンビン６０■、Ｕ、とＣａ　Ｃ１２１３０
μモルを含有している溶液０．１　ｍ７つつとそれぞれ
混合し、これを３７℃でインキュベートする。インキュ
ベーション時間２時間後、反応を停止し、尿素、ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびβ−メルカプトエタ
ノールの混合物を添加することにより、タンパク雪中に
含まれているジスルフィド架橋を還元的に切断する。こ
のようにして得られた試料の５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行ない〔ウェーバ−（Ｋ、　Ｗｃｂｅ
ｒ）、オスポー：／　（Ｍ、　０ｓｂｏｒｎ　）、　「
ザ、リライアビリテイー、オフ、モレキュラー、ウェイ
ト、デターミネーションズ、パイ、ドデシルサルフェー
ト−ポリアクリルアミド−ゲル、エレクトロフオレシス
（Ｔｈｅ　Ｒｅ１ｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＷｃｉｇｂｔ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｓ　ｂｙ　Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙａ
ｃｒｙｌａｍｉｄｅ　−Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ）」、ジャーナル、オフ、バイオロジカル、
ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２４４巻
、４４０６〜４４１２頁（１９６９年）〕、これをクー
マシーブルーで染色して、フィブリンｒ鎖の架橋形成度
をデンシトメトリーにより測定し、測定値を第Ｘ１バ因
子の含有用とする。

プールしたヒトのクエン酸化血秦を標学品とし、血９１
ｍ１中に第ＸＩＩＩ因子１単位を含有するものと定義し
た。フィブリンｒ鎖の５０％が架橋結合を生じる試料お
よび標準品の希釈度を測定し、もとの試料の第ｘ■因子
含量は、下記の式から計算する。。

（但し、式中、■ｘは未知試料の希釈度、Ｖｓは標準品
の希釈度を表わす） 水分含量は、カール、フィッシャーの方法により、無水
メタノールで抽出し、電量分析的な方法により滴定した
〔ショルッ（Ｅ、　５ｃｈｏｌｚ　）、フレゼニウス、
ツアイトシュリフト、フユール、アナリテイッシエ、ヒ
エミー　（Ｆｒｅｓｅｎｊｕｓ’　Ｚ、ａｎａｌｌＣｈ
ｅｍ、）、３１４巻、５６７〜５７１　頁（１９８３年
）〕。

記載した方法で得た組織接着剤製剤の凍結乾燥品の１部
を、タンパク質濃度５０〜／ｉとなる様に溶解し、各２
．°５−づつバイアルに充填して冷凍し、新たに凍結乾
燥した。

ついで、試料を異なった水分含量、即ち０．００７［：
０．７（重＠）％〕、０．０３（３（重＠）％〕および
０．０５（５（重着）％〕となるようそれぞれ調節した
。水分含量０．００７の試料を、直空中（＜１０Ｐａ、
即ち〈０．１ミリバール）または窒素中また常圧空気中
で密封した。水分含ｆｆ１０．０３および０．０５の試
料は、窒素中または空気中で密封した。

次に、各種試料の数個を６０℃で１０時間加熱した後、
加熱品または加熱しなかった凍結乾燥試料をそれぞれ蒸
留水各１ｍｌに溶解し、これらについて残留活性、即ち
トロンビンで凝固可能な無傷のフィブリノーゲンの含着
およびフィブリンα鎖の架橋形成能を生物学的活性の値
として測定した。

フィブリンα鎖架橋形成能は、架橋形成試験により、次
の通り実施した（ゼーリツヒ（Ｔ。

５ｅＣ１ｉｃｈ　）、レドル（ＨｏＲｅｄｌ　）、［テ
オレティツシエ、グルントラーゲン、デス、フィブリン
クレーベルス（Ｔｈｃｏｒｅｔ　１ｓｃｈｅ　　Ｇｒｕ
ｎｄｌａｇｃｎｄｅｓ　Ｆｉｂｒｉｎｋｌｅｂｅｒｓ　
）Ｊ、シムプ７　（Ｋ。

Ｓｃｈｉｍｐｆ　）　　編、［フィブリノーゲン、フィ
ブリン、ラント、フィブリンクレーベル（Ｆｉｂｒｉｎ
ｏｇｅｎ。

Ｆｉｂｒｉｎ　ｕｎｄ　Ｆｉｂｒｉｎｋｌｅｂｅｒ　）
　Ｊ　、ｌ　９９〜２０８頁（１９８０年）、Ｆ、に、
シャッタウェル、フエアラーグ（Ｆ、に、５ｃｈａｔｔ
ａｕｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ。

Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）刊〕。溶
解して使用塾備のととのった接着剤と、１−当たりＣａ
　Ｃ／　２４０μモルおよびトロンビンｌ　５１．Ｕ、
を含有している同母の溶液を混合し、この混合液を３７
℃でインキュベートする。反応を停止し、尿素、ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびβ−メル、カプトエ
タノールの混合物を添加することによって、タンパク雪
中に含まれているジスルフィド架橋を還元的に切断した
後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない
〔ウェーバ−（Ｋ。

Ｗｅｂｅｒ　）、オスボーア　（Ｍ、０ｓｂｏｒｎ　）
　、［ザ、リライアビリテイー、オフ、モレキュラー、
ウェイト、デターミネーションズ、パイ、ドデシルサル
フェート−ポリアクリルアミド・ゲル、エレクトロフオ
レシス（Ｔｈｅ　Ｒｅ１ｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　　Ｍ
ｏ１ｅ　−ｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｌｌｔ　　Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｏｎｓ　　ｂｙＤｏｃＪｃｃｙＪ　５ｕ１
ｆａｔｅ　−ＰｏＪ　ｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　−Ｇｅ
ｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）　Ｊ、ジャーナ
ル、オフ、バイオロジカル、ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ。

）、２４４巻、４４０６〜４４１２頁（１９６９（ＴＥ
　）　）　、これをクーマシーブルーで染色１−で、フ
ィブリンα鎖の架橋形成度をデンシトメトリーで測定す
る９ 得られた成績を第１表にまとめる。

加熱しなかった試料は、種々の条件下で加熱を行なった
試料の対照品とした。

フィブリンα鎖の架橋形成に関して得られた値の比較か
ら、第１に、窒素また真空中で加熱を行なったｆＪｌ織
接薪剤の安定性は、空気中で行なったものよつ明らかに
すぐれていること、第２に、水分含着の増加にともなっ
て安定性が減少するということが判明１−た。

実験例２　種々の第ｘｍ因子含量の組織接着剤’Ｍ　／
Ｆｉｌの、フィブリノーゲン１ｇ当たりの第ＸＩＩＩ因
子の単位比で表わした安定性 実験例１と同様の方法により、組織接着剤製剤を製造し
た。その１部を、タンパク質濃度か５０ｍ９　／’　ｍ
ｌとなるように溶解した。この溶液を２つに分けた５゜ その一方の溶液に、１ｒｎ１当たり１部単位の第ｘ■因
子を加えて混和した。この２つの溶液をそれぞれ２．５
−づつ、数個のバイアルに充填し、冷凍して凍結乾燥し
、窒素中で密封した。実験例１に記載した要領でフィブ
リノーゲンと＠ＸＩＩＩ因子の食用をｆｆ１．ｌＪ定し
、２種の製剤について、それぞれフィブリノーゲン１ｇ
当たりの第ＸＩ［因子の合計を計算した。

２裂剤の試料を数個づつ、６０℃と８０℃の温度で時間
を変えて加熱した。加熱前および加熱操作中の一定時間
毎にそれぞれ２個づつの試料を抜き取り、残留活性を測
定した 残留活性の測定は、実験例１に記載した方法で行なった
。その成績を第２表にまとめる。

得られたフィブリンα鎖の架橋形成［直の比較から、（
第ＸＩＭ因子の単位）：（フィブリンｇ数）の比で表わ
される第ＸＮ因子合計の増加にともなって組織接着剤製
剤の安定性が明らかＩこ増大することが判明した。

実験例３＠Ｘｌｆｆ因子含量がフィブリノ−デフ１ｇ当
たり５００単位で、含水量が０．００５である組織接着
剤製剤の窒素中１２０℃までの温度における加熱安定性 実験例１および２と同様にして組織接着剤製剤の製造を
行なった。、製剤の含水量の測定値は０．００５であり
、（第ＸＩ因子単位）：（フィブリノーゲンｇ数）比の
測定値は４９６であった。

製剤試料を６０℃〜１２０℃の範囲で、温度および加熱
時間を変えて加熱した。加熱前および加熱期間中の一定
時間毎（こ２個つつ試料を抜き取り、それぞれ残留活性
を測定した。残留活性の測定は、実験例１１こ記載した
方法で実施した。

成績を第３表にまとめる。

フィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩ因子を材料とする組
織接着剤に要求される品質特性、即ち、フィブリノーゲ
ン音量か少なくとも７０ｍｙ／ｍｉであり、フィブリン
α鎖の架橋形成が、記載した架橋形成試験で少なくとも
０．３５（３５％）であることを考えると、示された条
件下で、このような組織接着剤製剤はあまり大きい品質
上の損失を招がないで、この実験よりもかなり長時間加
熱することがてきることがわかる。

第；３表　第ＸＩＩＩ因子含丑かフィブリノ−デフ１ｇ
当たり４９６単位で含水量が０．　Ｏ０５である組織接
着剤製剤のや素中における加熱安定性この発明における
増殖性ρ過性病原体の不活性化方法を、下記の実施例に
よってさらに詳細に説明する。血液製品中のウィルス不
活性化に関して必要な実験を、直らイこヒトに実施する
ことはできないので、モデル・ウィルスを使用する方法
により不活性化効果の評価を行なう。

実施例１；窒素または真空中、および空気中における乾
燥加熱処理による、モデル・ウィルス〔シンドビスウイ
ルス（５ｉｎｄｂｉｓ　　ｖｉｒｕｓ　）　］の不活性
化と組織接着剤製剤の残留活性 組織接着剤製剤は実験例■と同様イこして製造した。

得られた組織接着剤製剤の凍結乾燥品の１部を、タンパ
ク質ぺ３度が５０ｍ９／ｍｌとなるように溶解し、これ
にシンドビスウィルスの１０Ｍ１９９細胞培養培地浮遊
液またはウィルスを含まない細胞培養培地だけを加えて
混和し、それぞれ２．６　ｍｌつつをバイアルに充填し
、冷凍し、含水＝ｏ、ｏ　Ｏ５Ｃ０゜５（重晴）％〕と
なるまで凍結乾燥した。試料の１部は真空下に（（１０
Ｐａ）、また他の１部は窒素中で、さらに他の１部は常
圧空気中で密封した。

密封した試料を、６０℃の温度で加熱時間を種種変化さ
せて加熱した。加熱前および加熱操作中の一定時間毎に
、それぞれ３個づつの試料を抜き取り、ウィルス力価を
測定すると同時に、製剤の残留活性を測定した。

ウィルス力価の測定は、下記の方法で行なった。

試料をそれぞれ水ｉ、　ｏ　ｍ／に溶解し、等偏食塩液
を用いて、これを１：１０の割合に系列希釈した。

シンドビスウイルスの力価は、マイクロタイター板で、
感受性ベロ（ｖｅｒｏ　）細胞に対する細胞変性効果を
評価することによって測定した。結果は、得られた値を
リードおよびミュンクの式〔リード（Ｊ、　Ｌ、　Ｒｅ
ｅｄ　）　、ミュンク（ＨｏＭｕｅｎｃｈ　）、アメリ
カン、ジャーナル、オフ、ハイジーン（Ａｍｅｒ、　Ｊ
、　Ｈｙｇ、　）　、２７巻、４９３頁（１９３８年）
〕によって統統計環を行なった後、対数ＴＣＩＤ５ｏ　
として表わした。

残留活性の測定は、実験例１に記載した方法で行なった
。成績を第４表にまとめる。この成績から、この例に示
した組織接着剤製剤において、シンドビスウイルスを完
全に不活性化することができるだけではなく、酸素を排
除した条件、即ち、不活性保護気体の存在下または真空
下の加熱処理によって、ウィルス不活性化と製剤の残留
活性間の割合が、著しく改善されるという重要な知見を
得ることができた。

実施例２： 実施例１と全く同様の操作を繰り返しくただし凍結屹燥
後、さらに試料をＰ２Ｏ５乾燥剤の存在下で、真空下に
、水分が０．００２となるまで乾燥する）（「後乾燥処
理」）、真空下（＜１０Ｐａ）に密封し、７０℃で種々
時間を変えて加熱したつ得られた成績を第５表にまとめ
る。。

実施例３：窒素中、６０℃で乾燥加熱処理による組織接
着剤製剤における３種の異なるモデルウィルスの不活性
化 組織接着剤製剤は、実験例１の記載と同様にして製造し
、組織接着剤の希釈液を滅菌−過する前に、１ｒｎ！当
たり１部単位の第Ｘ１ｌｒ因子をこれに添加した。凍結
乾燥後、この製剤はフィブリノ−デフ１ｇ当たり５部０
単位の第Ｘｌ［因子を含有していた。

得られた製剤の１部をとり、これをタンパク質濃度が１
ｒｎｌ当たり５０■となるように溶解し、この溶液の１
部に、それぞれシン１ビスウイルス、ＶＳＶ（水痘性口
内炎ウィルス（ヱｅｓｉｃｕｌａｒｐｔｏｍａｔｉｔｉ
ｓ　　ｖｉｒｕｓ　）またはＬＣＭ（リンパ球性脈絡髄
膜炎（Ｉｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｃｈｏｒｉｏｍｅｎ
ｉｎｇｉｔｉｓ）〕ウィルスの、各ＴＣＭＩ　９９細胞
培養培地１７遊液、またはウィルスを含まない細胞培養
培地だけ、を加えて混和し、それぞれ２．６　ｍ７つつ
をバイアルに充填して冷凍し、含水ｆｉ０．００６とな
るまで凍結乾燥し、窒素中で密封した。この製剤を６０
℃で加熱し、実施例１に記載したように、加熱前および
加熱後一定時間毎にウィルス力価および残留活性を測定
した。

成績を第６表にまとめる。

実施例１で得られた結果、即ち、組織接着剤製剤中のン
ンドビスウイルスは、６０℃で３０時間乾燥加熱するこ
とによって完全に不活性化できることが、この実施例に
よって改めて証明された。

ＬＣＭウィルスおよびＶＳＶは加熱処理後１０時間で、
既；こ完全に不活化されていた。

組織接着剤製剤の活性は、加熱処理後３０時間たっても
ほとんど完全に保有されたつ 実施例４９０℃で加熱乾燥処理した場合の組織接着剤製
剤中のバクテリオファージＸ１７４の不活性化 組織接着剤製剤は、実施例３の記載と同様にして製造し
た。

得られた製剤の１部を、タンパク質濃度か５０ｍグ／ｍ
ｌとなるように溶解し、バクテリオファージＸ１７４の
大１１易菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌ　ｉ　）
　１１３０３川培則ｉ′？、遊液またはウィルスを含ん
でいない培地だけを加えて混用し、それぞれ２．６−づ
つをバイアルに充填して冷凍し、含水量が０．００５と
なるよう凍結乾燥し、窒素中で密封した。

試料の１部を、９０℃で種々時間を変えて加熱し、加熱
前および加熱操作中の一定時間毎にウィルス力価と残留
活性を測定したつ ウィルス力価の測定は、下記の方法で行なった。

試）；ＦをそれぞれＨ２Ｏ１，Ｏｍｌ　ｊこ溶解し、１
ｍＭλｆ　ｇ　Ｃｌ　２　を用いて、これを１：１０の
割合（こ系列后択した。０．７％バクト・アガー（Ｂａ
ｃｔｏ　−Ａｇａｒ　）　　３．ｎｌ（４３〜４５℃）
、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）液体培地浮遊１００μ１１およびバクテリオ
ファージ含有試料または希釈液２００μｌの混合物を、
混合してすみやか（こ普通寒天平板培地（ＡＴＣＣ１２
９）に注入した。１夜３７℃でインキュベーションした
後、密集細胞層の、増殖性ウィルス粒子によって形成さ
れたプラークを計数装置を用いて算定した（　ＰＦＵ、
プラーク形成眼位）。結果をｌｏｇ、ｏＰＦＵて表わし
た。

残留活性の測定は、実験例１に記載した方法で実施した
。成績を第７表にまとめる。その結果、窒素中、９０℃
の加熱処理では、組織接着剤製剤の活性はほぼ完全に保
有されており、しかも製剤中のバクテリオファージＸ１
７４（熱に対して比較的抵抗性）を完全に不活性化でき
ることが判明した。

実施例５：１１０℃で乾燥加熱することによる組織接着
剤製剤中のシンドビスウイルスおよびイヌ１圧炎ウイル
ス（ｃａｎｉｎｅ　１１ｃｐａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ
　）の不活性化 組織接着剤製剤は、実施例３の記載と同様にして製造し
た。得られた組織接着剤製剤凍結乾燥品の１部を、タン
パク質濃度が５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、シン
ドビスウイルスまたはイヌ肝炎ウィルスの各ＴＣＭ１　
ｇ　ｇ細胞培養培地浮遊液、またはウィルスを含んでい
ない細胞培養培地たけ、を加えて混和し、それぞれ２．
６　ｒｎｌつつバイアル）こ充填し、冷凍して、含水ｆ
？ｔＯ，ｏ０５となるまで凍結乾燥し、窒素中で密封し
た。試料を１１０”Ｃで種々時間を変えて加熱し、加熱
前および加熱操作中の一定時間毎に、既述した方法で製
剤の活性およびウィルス力価を測定した。

成績を第８表に才とめる。

この実施例では、シンドビスウイルスだけてはなく、特
（こ熱に対して抵抗性を有することか知られているイヌ
肝炎ウィルスも、この発明の方法番こより、組織液θ剤
製剤の生物学的活性の損失を招来することなく、製剤中
において完全に不活性化できることを示している。。

実施例６：窒素中で６０℃に加熱処理した場合の、含水
量０．０４の組織接着剤製剤中の３種のモデルウィルス
〔シンドビスウイルス、ＶＳＶおよびコロナウィルス（
ｃｏｒｏｎａ　ｖｉｒｕｓ　）　］の不活性化 組織接着剤製剤は、実施例３の記載と同様にして製ａし
た。

得られた組織接着剤製剤凍結乾燥品の１部を、タンパク
質濃度か５０ｍｙ／ｍｌとなるように溶解し、シンドビ
スウイルスまたはＶＳＶ（水底性口内炎またはコロナウ
ィルスの、５ＴＣ〜１１９９細胞培地△ ｚ−７遊液、またはウィルスを含んでいない細胞培養培
地だけをそれぞれこれ番こ加えて混和し、各２．６ｍ１
つつをバイアルに充填し、冷凍して凍結乾燥し、含水ｊ
ｌ：か０．０４となるように調節し、窒素中で密封した
つ 製剤試雛−Ｆを６０℃で加熱し、実施例１に記載したよ
うに、加熱１）りおよび加熱操作中の一定時間毎に残留
活性およびウィルス力価を測定した。

成債を第９表にまとめる。

記載した条件下において、シンドビスウィルスは、加熱
後わずか３時間で完全に不活性化され、またＶＳＶおよ
びコロナウィルスは、わずか１時間で既に不活性化され
た。しかも製品の活性は、いずれの場合も十分番こ保有
されていた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フィブリノーゲンおよび第ＸIII因子を含有する組
   織接着剤製剤中の増殖性ろ過性病原体類を、該組織接着
   剤の生物学的活性を十分に保持しながら不活性化する方
   法であつて、酸素を含まない不活性保護気体の存在下ま
   たは真空下に、乾燥状態で、第ＸIII因子含量がフィブ
   リノーゲン１ｇ当たり少なくとも１００単位である該製
   剤を加熱することからなる方法。 ２、該保護気体が窒素である第１項記載の方法。 ３、５０〜１２０℃の温度で、少なくとも１分間以上の
   時間、組織接着剤製剤の加熱を行なう第１項記載の方法
   。 ４、組織接着剤製剤の乾燥状態を、水結合剤を用いる後
   乾燥処理によつて達成する第１項記載の方法。 ５、五酸化リンを水結合剤とする第４項記載の方法。 ６、フィブリノーゲンおよび第ＸIII因子を含有する組
   織接着剤製剤中の増殖性ろ過性病原体類を、該組織接着
   剤の生物学的活性を十分に保持しながら不活性化する方
   法であつて、 ヒトのクリオシピテートを分別することによつて天然含
   有量の第ＸIII因子を有する該組織接着剤製剤を製造し
   、 第ＸIII因子の該天然含量にさらに第ＸIII因子を追加し
   、 この組織接着剤製剤を乾燥状態で、酸素を含まない不活
   性保護気体の存在下にまたは真空下に加熱することから
   成る方法。 ７、分別化のいずれかの段階で加熱を行なう第６項記載
   の方法。 ８、製剤を最終容器に充填し、最終容器に充填し終えた
   製剤に加熱を行なう第６項記載の方法。 ９、分別化のいずれかの段階、および製剤を最終容器に
   充填した後で加熱を行なう第８項記載の方法。 １０、第ＸIII因子含量合計がフィブリノーゲン１ｇ当
   たり約５００単位に達するまで、さらに第ＸIII因子の
   追加を行なう第６、第７、第８または第９項記載の方法
   。