JPS6187671A - 抗腫瘍免疫細胞誘導用の刺激材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液細胞中の免疫細胞を活性化して抗腫癌免
疫細胞を訪導する機能を有する免疫細胞刺激材に関する
。

（従来の技術） 周知の如く、生体の悪性ＩＩΩに対する免疫監視機Ｃを
になう抗腫母細胞としては、キラーＴ細胞、ＮＫ細胞、
活性化マクロファージ、Ｋ細胞等カニ重要な役割をは九
していることが報告されている。

したがって、悪性腫弓シて対する免疫学的療法としては
、癌、【者免疫細胞（白血球）を活性化して、これらの
抗腫瘍細胞を効率的に芯心することが考えられる。しか
しながら、癌恵者は一般的に、癌の進行とともに免疫能
が低下することが報告てれており、価患者生体中におい
ては、免疫応：Ｔｒを抑制すｂ免疫抑制因子゛の存在お
るいはサプレッサーＴ細胞、サプレッサーマクロファー
ジの肪導活性化が報告されている。

このような免疫能の抑制状態下にあるら恵者生体中にお
いて、効率的な抗腫瘍細胞の鍔導は困雌でおると言わな
ければならな＾。し穴がって、免疫抑制状態から解放さ
れ、九体外に患者白血球を取り出し、体外で効率的な抗
ａ瘍細胞訪導活性化を行なうことは、効果の高い新しい
価免疫療法になると考えられる。

キラーＴ細胞は、抗腫瘍細胞の中でも荷に抗癌免疫にお
いて主役をはたしていると考えられてｈるが、これを体
外で訪導活性化しようとする研究が精力的になされてき
友。すなわち、体外に取シ出し７’Ｃ癌患者末梢血白血
球に、摘出し′ｆｃ患者腫瘍細胞を感作させ、患者白血
球を活性化して、特異的に患者腫瘍細胞だけを障害し、
７り者正常細胞は障害しないキラーＴ細胞を詩？、ダし
て、これを癌、ｃ者体内にもどすことによシ、癌を治療
しようとする試みである。

しかしながら、この方法で５尋したキラーＴ細胞は、治
療効果全期待できるほど弘力ではなめため、リンフ才力
インの１種であるＴ九山胞増殖因子を用いて堀玄し、大
量に増が【させた後、患者番で投与する方法が考えられ
ている。

（）６１刃が解決しようとする問題点）前記の方法は、
Ｔ細胞増殖因子が逍伝子操作の技術により工業的大量生
産が可１１ととなシ、大公〇Ｔ細胞増殖因子が使用でき
ることが現実化してきたために実施可能ではあるが、キ
ラーＴ細胞を体外で長期間培養することによる細胞の変
質等の問題がおる。また、そのほかにも実用化するには
困難な口々の間１点があり、例えば、キラーＴ細廚の誘
導のために、忠者１１４Ａ’５細胞と乎術が必要なこと
、試みた癌思者の一部にのみキラーＴＩ！Ｉｌ胞の誘導
が可能で、全例で３４されるわけではないこと、操作が
非常に煩雑であること等、解決されなければならない問
題点が多い。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の如き従来技術に基づく抗腫瘍免疫細胞
３導の問題点に鑑み、従来の方法よジも実用性、操作性
、安全性の点で飛躍的に向上させた抗腫瘍免疫細胞誘導
用刺激材を提供するものである。

本発明者らは、上記目的に沿って鋭意研究した結果、核
酸塩基およびその誘導体を共有結合で不溶性担体に結合
させ九刺激材を、ヒト末梢血白血球またはマウス牌臓ｌ
Ｈｉ胞白血球に接触させたところ、驚くべきことに、極
めて強力な１■嘔障害性細胞が誘導されることを見出し
ｆｃ、すなわち、細胞浮遊液中に遊離し定状態では細胞
活性化能を付定ない核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオ
チドおよびそれらの化学修飾誘導体が不溶性担体に結合
し定状態で、ヒトおよびマウスの白血ｇ′！！−活性化
する能力金有し、この活性化白血球を腫瘍細胞と混合し
九ところ、５時間の培養でほとんどＯ１腹弓細胞が４害
をうけて破壊逼れ、強力な腫瘍障害性細胞がＳ尋されて
いることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレ
オチドおよび七れらの化学修飾誘導体の一控以上を表面
に有することを特徴とする抗住瘍免疫細胞誘尋用白血球
刺激材に係Ｓ。

本発明における刺激材の表面とは、細胞すなわち白血球
と接触可能な刺激材Ｉｆｔ］を指す。

本発明における白血球とは、血液Ｆｆｌ胞のうち赤血球
および血小板を除いた、いわゆる白血球を指すが、この
白血球よシ顆粒球おるいはＢ細胞を除去し九細胞分画も
、本発明における白血球のｔ１念に含−！れる。本発明
において活性化を行なう白血球は、述Ｌｃ遠心分離法に
て末梢血より採取した白血球分画を用いてもよく、また
、フィコールパークＭＰｉ遠心分シ１ｔ＠にて分離した
単核細胞分画でもよく、あるいは末梢血単該ｒ山胞より
公知のノイラミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト形成
で分離ａ縮し７ｃＴ細胞分画全使用しても、強力な腫瘍
障害性細胞の誘導が可能である。

本発明において３導活性化する佳＠障害性ａ胞は、白血
球の中で顆粒球、単球、マクロファージを除くリンパ球
分画に属し、とシわけＴ細胞の性質を有している。

本発明において用いることのできる不溶性担体に結合す
る核ｒＲ塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれ
らの化学修飾誘導体としては、天然および合成物の如何
なるものでも使用できる。

すなわち、アデニン、１−メチルアデニン、２−メチル
アデニン、Ｎ−（７’リン−６−イルカルバモイル）−
Ｌ−トレオニン、Ｓ−（△宜−インペンテニル）アデニ
ン、２−メチルチオ−♂−（が−インペンテニル）７デ
ニン、２−ヒドロキシアデニン、ｔ−メチルアデニン、
ｔ、♂−ジメチルアデニン、Ｎｌ＋−（ｃｉｓ−４−ヒ
ドロキシインペンテニル）アデニン、ゼアチン、２−ア
ミノアデニン、グアニン、１−メチルグアニン、マーメ
チルグアニア、Ｎ”、Ｎ”−ジメチルグアニン、７−メ
チルグアニン、シトシン、３−メチルシトシン、−一ア
七チルシトシン、Ｎ４−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−チオシト
シン、ウラシル、３−メチルシトシ／、チミン、４−チ
オウラシル、５−ヒドロキシウラシル、５−ヒドロキシ
メチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−カルボキ
シメチルウラシル、２−チオチミン、５−カルボキシメ
チル−２−チオウラシル、５−（メトキシカルボニルメ
チル）−２−チオウラシル％　　５　（Ｎ−メチルアミ
ノメチル）−２−チオウラシル、５．６−シヒドロウラ
シル、５，６−シヒドロチミ７．５−（７”トレシノメ
チル）ウラシル、Ｓ（ト）５−（４，５−ジヒドロキシ
ペンチル）ウラシル、オート酸、ワイ、ワイア。

テン、ペルオキシワイプチン、ヒボキサンチン、１−メ
チルヒボキサンチン、キサンチン、尿酸等の［２塩基、
アデノシン、２−メチルアデノシン、グアノシ／、１−
メチルグアノシ／、イノシン、シチジン、ウリジン等の
ヌクレオシド、アデノシン３′−リン酸、グアノシフ３
′−リン酸、シチジン３′−リン酸、ウリジン３′−り
ン識等のヌクレオチドが挙げられる。中でも核酸塩基が
最も好ましい結果を与える。不溶性担体に結合する核酸
塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの誘導
体の分子量としては、好ましくは１万以下、さらに好ま
しくは１，０００以下である。

本発明で周込られる不溶性担体＃−１ｔ１親水性担体。

疎水性担体いずれも使用できる。不溶性担体の形状は、
粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの公知の形状
も用いることができる。粒状もしくは球状不溶性担体と
しては、粒径１ミクロン〜３０００ミクロンのものが使
用できる０粒径１ミクロン以下では活性化白血球との分
１１１ｍが困難でろる。とくに粒径５０ミクロン以上で
おれば、容易に活性化白血球とＯ濾過分離が可能であシ
、粒径３０００ミクロン以上では、白血球との担体単位
Ｍ量あ几シの接触面積が低下する九め好ましくない。籍
に好ましくは、粒径８０〜２０００ミクロンのものであ
る。ま几粒状吃しくけ球状不溶性担体の比重が１．０７
以上であれば、容易に活性化白血球との遠心もしくは静
置による分離が可能でるる。また、平膜状あるｂは中空
糸状多孔性担体を使用する場合、その孔径力；、細胞は
通過できないが培地成分は自由に通過できる０、０５〜
１０ミクロンのものを使用すれば、膜の一万の面に結合
し几白血球に膜の他方の面より栄餐を補給でき、高δ度
の白血球を刺激活性化することが可能でる骨。

特に０．１〜５ミクロンの孔径の平膜状あるいは中空糸
状の多孔性担体が良好に使用できる。

不溶性担体の材質としては、無機ペースのものＫあって
は活性炭、ガラス等およびその誘導体があシ、天然高分
子出来担体には、セルロース、セファロース、デキスト
ラン、デンプン等の単純多抛纂およびその二８尋体がる
る。

また、合成高分子にあっては、ビニル系高分子には、ス
チレン、酢酸ビニル、メタクリル９エステル、アクリル
戯エステル、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化ビニリデン
、アクリロニトリル、アクリルアミド、メチルビニルケ
トン、ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、エチレ
ン、フロピレン、ブタジェン、イングレン等分よびその
誘導体の重合体および共重合体があり、環状化合物の開
環重合体には、ジメチルシクロプロパン、スピロ−ジー
Ｏ−キシリレン、ノルボルネン、シクロフ。

テン、トリオキサン、ラクチド、シクロポリシロキサン
、塩化ホスホニトリル％Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸
無水物等およびその誘導体の重合体および共重合体、ポ
リホルムアルデヒド、ポリエチレンオキシド、ポリプロ
ピレングリコール、ポリ−３，３−ビス（クロルメチル
）オキサシクロブタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリ
カプロラクタム等およびその誘導体がある。。

まｆｃｓＭｉａ合体には、ポリエステル、ポリアミド、
ボリア／ヒドリド、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリ
スルホンアミド、ボリイばド、ポリベンシイミダゾール
等およびその６４体があげられる。

樹脂その他のものにあっては、アクリル樹脂、メタクリ
ル樹脂、フッ素樹脂、壬ポキシ樹脂、尿素樹脂、アミノ
樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹脂、ポリウレタン、シ
リコン樹脂、アルキド樹脂等およびぞの誘導体が例示で
きる。

以上にあげｔ高分子担体は、必要に応じた逍轟なコモノ
マー、架橋剤を用い、不溶ｆヒ担体を得ることができ、
架橋剤にあっては、硫黄、■機過酸化物、フェノール樹
脂、ジイソシ７ナート、エポキシｆヒ合物、ジエン、グ
ルタルアルデヒド等、被架砲物の官能基に合わせ、種々
のものを追択できる（大成社、″架橋剤）・ンドブツク
”、Ｐ３〜７７゜１９８１）。

また、上記不ｒＪ性担体にコーティングを施しｔ多）ｔ
！１ｍ造を有しｆｃ指担体使用できる。たとえば、活性
炭やガラスピーズにポリヒドロキシルエチルメタクリレ
ートテコ−ティングした担体等が使用できる。

核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド等ヲ不溶性担体
の表面に固定する方法としては、共有結合、イオン結合
、物理吸着ζダめらゆる公却の方法を用いることができ
るが、醪出性から考えると、共有結合で固定して用いる
ことがｇＩましい。七の九めには通常固定化酵紫、アフ
イニテイタロマトグラフイで用いられる方法を用いるこ
とができる。

例えば、臭化水素（ＣＮＢｒ　）で７ガロース、セファ
ロース等全活性化し、あるいはシリカガラスピーズをγ
−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させてアル
キルアミノガラスを得、これをグルタルアルデヒドで活
性化し、結合させる等の方法を用いることができる。ま
几必要に応じて、不溶性担体との間に任意の長≧の分子
（スペーサー）を導入して使用することもできる。例え
ば、アガロースノヒトロキシル基とへキサメチレンジイ
ソシアナートの片側のインシアナート基を反応結合させ
、残り九イソシアナート基と核散塩基、ヌクレオシド、
ヌクレオチド等の７ミノ基を反応結合させるごと〈実施
することができる。

以上の要素よりなる本発明の刺激材ｏｐ？Ｌ法は、その
構成要素の結合順序を規定したものではない。

具体的には、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドの
導入法において、これらをモノマーに結合して重合を行
なう方法やこれらｔ活性化後、不浴性担体に結合させる
ことも可能である。すなわち、本発明は、基本的には表
面に核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれ
らの化学！’１％　悠誘導体の一種以上を有すればより
ので＝？）り、製造方法［：Ｅ右されるものではなり０ 刺激材による白血球の活性化は、血’６？成分を宥培地
で行なうと強力な腫瘍障害性細胞の誘導が可能である。

すなわち、牛脂児血渭、午血清、馬血清等のｗｂ物血清
あるｂはヒト血τａを２〜２０チ含有した培地會ｒＡＮ
する。この場合の培地は、動物細胞培養に一般的に用い
られる培地、例えば、ＲＰＭ１１６４０培地、Ｍ　Ｅ　
Ｍ培地等が使用できる。また、血Ｔ￥！成分例えば皿消
アルブミン全添卵したＲ　Ｐ　Ｒｉ　１１６４０培地で
も使用が可能である。また、３導期間中１（インタリュ
ーキ７２　ｆ添加しても、より強力な＠勅障害性細胞ケ
誘導できる。

調製した培地中に、イ・ユ々の方法で採取した白面ｇ　
ｆ　Ｏ，５〜５　Ｘ　１０’（固／　ｔｄ］ａｌｊｌｉ
１３Ｒ”Ｃ浮遊させ、これに適幽士の刺激材を添加し、
温度２５〜４５ｔ／’培薫ｒ行なう。温度２５Ｃ以下で
はほとんど有効な白血球の活性比が起こらず、温度４５
Ｇ以トで一開面球の生存惠が獣下する一培芒ｄ石訴の細
胞培π用のプラスチック失容器を使用し、ＣＯｔインキ
ュベーター中で行なえばＷＪ便である。培つｚ数時間で
白血球は刺激材に付着し活性化てれる。

、このようにして活性化しｔ白血球は、強力な腫瘍障害
細胞を含有することを見出し穴。すなわち、刺激材で活
性化し九ヒト末梢血白血球ｔと）ＩＩＪ［細胞に作用さ
せ九ところ、ＭＫＮ−１胃癌細胞、ｐｃ−ｔｏ肺癌細胞
を強く障害した。また、刺激材で活性化したＢ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　／　ｃマウスｎ臓の白血球は、Ｃｏ１ｏｎ　２６
　（ＢＡＬＢ／Ｃ由来＠＠細胞株）％　Ｂ−１ｂ（（５
７／ＢＬ６山来メラノーマ）を強く障害し九。

また５、活性化白血球の表面抗原を解析したところ、刺
激材との仮触前と比較して、ヒト白血球ではＬｅｕ２ａ
抗原、マウス白血球ではＬｙｔｚ抗原を有する細胞の抗
原密度および増加が観察さｎ　；’ｊ　。

）１重湯障害性Ｍｆｉ胞誘導能を持つ刺激材を実際の臨
床に用いる場合は、たとえば第１図に示した膣錫障否住
則胞コ導装置を用いる。この装置は容器１内に刺激材２
を収容し、両端に白血球液流入口５および流出口４を有
し、それぞれフィルター５で区分でれている。このフィ
ルター５は刺激材２が容器１外に流出するのを防ぐもの
である。この容器１は洗浄装置６に連結されており、洗
浄装置６は空気排出口９、洗か液出口１０をηδえてお
シ、細〃８が洗浄液排出口１０へ出るのを防止するため
のフィルター８が設けられている。

この装置は、画分的に患者末梢血白血球より腫瘍障害性
細胞のｇ尋を行ない、操作性よく肋Ｑ障害性細胞の分離
、洗浄、回収を行なう装置である。

すなわち、患者末梢血よ！ｌｌ連続遠心分離等の公知の
方法を用いて採取し九白面球液を容器１の白血球液流入
口３よシ流入させ、白血球を刺激材２に吸着させた後、
空気（５％ｃｏｔ　）　’ｅ飽和させた培養液を循環さ
せ、５７Ｃに保温し肺瘍１％害性細胞の誘導活性化を行
なう。その後、洗浄装置６を述結し、空気排出口より７
スビレーターで吸引を行ないながら洗浄液ｔ−流入口５
より流す。洗浄液は疏浄液排比口１０を通ってその下に
連結された容器Ｋｆｃｂら九る。担体から洗浄によシ分
離しｆｃ腫嘔障害性細胞は、フィルター８の上部７に集
められる。充分に洗浄を行なつ九後、容器１をとりはず
・し、腫瘍障害性細胞を回収し、治療に用いる。

（発明の効果） 本発明の刺激材＃：ｔ１以上述べてきたように、患者末
梢血白血球を効率よく活性化し、安全にかつ操作性よく
、強力な腫瘍障害性細胞を誘導するものであり、胃癌、
肺帰、乳癌、肝癌等の癌治療はもとより、胆癌患者のリ
ンパ球機能検査や、マウス、ラット、ウサギ等の動物笑
駁に訃いて、抗腫瘍免疫の研究等に用いようとするもの
である。

（実施例） 実施例１ 刺激材の調製は、次のようにして行なり九。すなわち、
ポリビニルアルコール系ゲル（ポリビニルアルコールと
トリアリルイソシアナートの共重合体二粒径１４Ω−２
１０μｍ）ｔ−エビクロロヒドリ７法（アフイニテイク
党マドグラフィー、千畑一部著、講談社すイエンテイフ
イク、１９７（を年。

Ｐ７１）によって、エポキシ活性化ゲルとし、こ九に各
筏核酸塩基の５チ水酸化カリウム溶液を添加し、５０Ｃ
にて２４時同撮とつして結合せしめ、ｐ　Ｈ４，０，１
八１酢酸バツフアー、ｐＨ８，５炭酸ナトリウムバツフ
アーでくり返し洗浄後、生理食塩水で洗浄、オートクレ
ーブ滅菌して実験に供し九。

不溶性担体の核酸塩基保持量は、初めに添加し上桟酸塩
基量より、結合反応後の上清中の核酸塩基ｉｔさし引い
て結合ｍ　ｋ求め計＝し九ところ、不溶性担体Ｉ　Ｍｌ
　６７ｔ　Ｆ）　１０　ｔｔｍＯＬ　〜１００１１！′
ｒＩＯＡであった。核ａ２垣基公は紫外吸収で測定し元
。

、　ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、採血
し九ヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、フィコール
パーク液（ファルマシア社製）に重層し、２０００　ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離しｆｃ後、中間層の白血球層ヲ
分にｔして、これをハンクス液で洗つ７を後、自己血ｒ
Ｗを１０チ添加したＲＰＭ１１６４０培地にツスイ）に
２×１０畠／　ｒｌの細胞濃度で浮遊させた。この日胞
浮遊液を１ｄずつ、細胞培養用の２−ウェル（ファルコ
ン屋３０４７）に分注し、これに刺ｒ１：１羽Ｊ１００
μＬずつ添加し、ＣＯ，インキュベーター中で温度５７
Ｃで培養を行なりな。４日間培養を行なった後、培養液
をビベツテイ／グして活性化白血球を刺激材表面からは
がして静置すると、刺激材は容器の底に沈下するので、
上清細胞液をとり、これ七ノ・ンクスで洗った後、自己
血清１０チ添加ＲＰＭＩ培地に５　Ｘ　１０＠／−の細
胞濃度で浮遊させ九。

この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するかどうかは
、次のようなキラー活性測定法を用−て評価し７′ｃ、
培養プレートに付着して増殖する種々のヒト癌細胞株を
標的ｍ胞として、５Ｘ１０４／Ｍｔの細胞ａ、度で１０
チ牛脂児血清添加ＲＰＭＩ　１６４０培地に浮遊させ、
こＡｕｔｏμｔずり１０μを容テラサキプレートに分注
し、　Ｇｏ、インキュベーター中で温度３７Ｃで培養す
る。２４時間培養を行なうと、癌ＭＢ胞は培養プレート
底面に強く付２する。

これを培養液で洗った後、活性化白血球浮遊液１０μｍ
１添加し、！１７Ｃで４時間、ＣＯ，インキュベーター
中で培養し、プレートに付着している癌細胞を障害させ
る。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への付着性を
表失し、ハンクス液で銑うと活性化白血球とともに除去
される。生残してプレート底面に付着している癌細胞を
ア七トンで固定し、ギムザ液で染色した後、Ｆ！Ａａ鏡
で計数する。

キラー活性は次式によシ計ヰする。

キラー活性＝ このようにして評価した各種刺激材の腫Ｏ障害性Ｍｉｇ
酌導能を表ＩＫ示す。

表　１　　各社刺激材の腫心障害性細胞誘導能白血球の
表面抗原の解析は、次のようにして行なった。すなわち
、測定に供する白血球１×１０・個ｉ０．１％牛血清ア
ルブミンと０．１嗟アジ化ナトリウム添加ＲＰＭＩ　１
６４０培地に浮遊させ、温度４ＵＫてＦＩＴＣ標識抗ヒ
トＬｅｕ２ａモノクローナル抗体（ペクト／＆デキンン
ン社）１０μｔｔ添加して、１時間反応させ几後、２ゴ
Ｏ上記培地で先浄し、ＩＷＬｔの培地に浮遊させ几。細
胞表面上の抗と）Ｌｅｕ２ａモノクローナル抗体の検出
は。

ＥＰＩＣ８”−Ｖ　（ｓ−ル／−社）を用りで、公知の
方法で行なつ九。

刺激材による白血球活性化前後の表面抗原の解析結果を
図示し几。すなわち、グアニンを結合したポリビニルア
ル；−ル系ゲル（刺激材）によるヒト末梢血白血球のＬ
ｅｕ　２　ａ抗原の変化を第２図（刺激材との接触前）
と第３図（刺激材と４日間接触後）に示す。

比較例１ １０チ自己血清添加ＲＰＭＩ　１６４０培地１−にヒト
末梢血白血球２×１０・ａｔ浮遊させ、ポリビニルアル
コール系ゲル２００μｔｔ添加して、４日間培養したが
、＠瘍障害性細胞＃−を誘導されなかった。

実施例２ 刺激材の調Ｂは、次のようにして行なった。すなわち、
粒径１２０μｍのガラスと−ズを３−クリシトキシプロ
ビルトリメトキシシランと反応させて、ガラスピーズに
現状エポキシ基を導入し、実施ｆＦＩ１１と同様に各ａ
核酸塩基を結合せしめて実験に供し几。

マウス白血球は次のようにした。すなわち、Ｂ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　／　ｃマウス（４〜６週令）から摘出しｆｃ＃　
臓をステンレス・メツシュでほぐした後、ハンクス液に
浮遊して静置、ｎ８細胞を臓器片と分離後、８００　ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離して得た細胞ベレットを赤血球
除去のため、０．８５％塩化アンモニウム水溶液Ｖｃだ
濁させ、温度３７Ｃで２分間インキエペートシ几後、直
ちに１０倍量のハンクス液と混合、８００　ｒｐｍで１
０分間遠心分離して、牛胎児血清を１０＋％添加したＲ
ＰＭＩ−１６４０培地にツスイ）に５　Ｘ　１０＠／ｓ
ｔｌの細胞ａＲで浮遊させ友。この細胞浮遊液を２−ず
つ細胞培養用の２−ウェル（ファルコンム５０４７　）
Ｋ分注し、こ九に刺激材１（Ｉｆずつ添加し、　ＣＯ，
インキュベーター中で温度５７Ｃで培養し九。４日間の
培養を行なりｔ後、培養液をピペッティングして活性化
白血球を刺激材表面からはがして静置すると、刺激材は
容器の底に沈下するので、上清細胞液をとシ、これをハ
ンクス液で洗った後、牛胎児血清１０％添加ＲＰＭＩ　
１６４０培地、にＩ　Ｘ　１０？／ｇＬｔの細胞濃度で
浮遊させた。

この活性化白血球が腫ｇｊＩＩＢ胞障害性を有するかど
うかは、マウス癌細胞株を標的細胞として、実施例１と
同様のキラー活性測定法で評価した。

各種刺激材の肺瘍障害性細胞銹導能を表２に示す。

活性化前後の白血球表面抗原の解析は、Ｆ！ＴＣ標識抗
マウスＬｙｔ−２モノクロ一ナル抗体（ペクトン＆デキ
ンソン社）を用いて、実施例１と同様の方法で行なった
。結果を第４図（刺激材との接触前）および第５　ｉｇ
（刺α材との接触後）に示す。

表　２　各種刺激材の腫＠障害性細胞誘６能比校例２ １０チ牛脂児血消添加ＲＰＭ１１６４Ｑ培地２ゴに、実
施例２と同様の方法で得７’（ＢＡＬＢ／ｃマクス白血
球Ｉ　白面１０？個全浮遊させ、これにガラスピーズ（
粒径１２０μｍ）０．５ｆｉ添加して、４日間培養した
マウス白血球ＯＣｏ１ｏｎ　−２６およびＢ−１６腫石
細胞株に対するキラー活性は、いずれも１０チ以下でお
った。なお、キラー活性の測定は、実施例２と同様の方
法で行なった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いる抗ＵＳ免疫細胞訪導装置の一例
を示す断４飢第２図は実施例１の刺激材による白血球活
性化前の表面抗原の解析結果金示すグラフ、第３図は同
白血球活性化後の表面抗原の解析結果を示すグラフ、第
４図は実施例２の刺激材による白血球活性化前の表面抗
原の解析結果を示すグラフ、第５図は同白血球活性化後
の表面抗原の解析結果を示すグラフである。 １・・・・・・容器　２・・・・・・刺激材　３・・・
・・・白血球液流入口４・・・・・・液流出口　５・・
・・・・フィルター　６・・・・・・洗浄装置　７・・
・・・・活性化白血球貯留部　８・・・・・・フィルタ
ー　９・・・・・・空気排出口　１０・・・・・・洗浄
液排出口 第１図 第２図 第３図 梠対驕九池蔑（対相ヒ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの
   化学修飾誘導体の一種以上を表面に有することを特徴と
   する抗腫瘍免疫細胞誘導用刺激材。