JPS6187698A - ガンマ−インタ−フエロンの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はガンマ−インターフェロ７ｆＣＬＩ！ｉＡＩ、
、、　特にモノクローナルおよびポリクローナル杭棒を
使用してガンマ−インターフエロン？ｎ　ｉｆ！する方
法に関する。

（２）従来技術 免８２またはガンマ−インターフエロンは初期の頃酸処
理および／または５６℃への加熱に対するその不安定性
ゆえに、タイプ■インターフェロンとして＠塩的Ｍ、ｍ
で分類された。この操作上の分類は、一般に敵または熱
に対して安定なウィルス白米のタイプｌインターフェロ
ン（アルファ２よびベータ）とこのタイプ■インターフ
ェロンとを区別した。王なインターフェロン謔（アルフ
ァ。

ベータおよびガンマ）の各々に対する狩異な抗血ａ！の
広範な利用可能性の結果として、谷型の分類および区別
は今”？通冨血清学市または兄疫字的方法で行なわれる
。そｎにもかかわらず、ガンマ−インターフエロン調製
物はまだ猷処理の際のそｎらの急運な不活化によって１
町定されている。］匣Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔ
ｅｍ　、　第２版、　Ｗ、１．ＳｔｅｗａｒｔｌＩ。

スプリンガー−パーラーグ、ニューヨーク（１９８１）
乞参照されたい。

一般に、ガンマ−インターフエロンの同定に用いろ九る
酸不油比法はガンマ−インターフエロン含有溶成のｐＨ
乞約２に下げること、二〇ｐＨで短時間（２，５分ない
し数時間）インキュベートマること、仄いで塩基の祭刀
口またはＰＢＳに対する透釘によりそのｐ　Ｈを中性に
することをａ含する。このような処理後の活性回復は通
常対照活性のｆ１１Ｌ］％である。本Ｉｔｈ！願人の知
る限りでは、酸処理後のガンマ−インターフエロンの抗
ウィルスＹ占性乞１０％より者しく尚い水準まで回復さ
せることを示す報告は今日まで一件もない。

選択された生物学的物質の梢製溶液乞得るために用いろ
ｎる強力な＋段の１つに、抗体アフイニテイクｏ”ｙト
ゲラフイー（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｆｆ約ｉｔｙｃｈｒ
ｏｍａ　ｔｏｇｒ　ａｐｈｙ）がある。二〇方法によれ
ば。

精製しようとする生物学的物質に対する抗体を共有結合
で固定して含４ｒするクロマトグラフィーカラムが準備
され、そしてこの生物学的＠質と夾雑物とを含む浴江が
このカラムの中を通される。固定さ九た抗体はカラムに
残存する生物学的物質と抗原−抗体複合体を形成し、−
万夾ｍＷの大部分？含む溶液の残部はそのカラムＹ：通
過する。固定された抗体からその選択さｎだ生物学的＠
實を遊離させるために、抗原−抗坏複合体を解離させう
る縞２溶液がそりカラムの中七通される。種々の物質（
例えばチオシアン酸カリウム、尿素、グアニジン塩散埴
など）がこの％離ン遅成させるためにその第２溶液中に
加えろｎるが、最も一般的に用いられる方法はただ率に
その溶液？酸性比することである。

本発明以前には、ガンマ−インターフエロンの皺による
失活が知られていたので、抗体アフイ二アイクロマトグ
ラフィーはこの■賛な生ｗ字凶物質を精製するのに用い
られたことがなかった。すなわち、クロマトグラフィー
カラムに固定させうるガンマ−インターフエロンの抗体
は入手できるケ几ども、抗体カラムからこのインターフ
ェロン２生ｖＩＪ学的活性のほとんどを破壊することな
く俗化する方法が全く仰られていなかったので、蜘技術
分野ではガンマ−インターフエロンにこのアフイニテイ
クロマトグラフイー乞便用したことがなかった。ａｙ＆
的な溶出方法である酸によるｒ６出は。

ガンマ−インターフエロンの基礎検定の１つがばの存在
下での不活比試＊Ｖａ含するという事実からして、はと
んど実施不可能な方法であった。さらに、抗原−抗体伏
合体乞解離させうる他の既知物質（例えば千オシアン戚
カリウム２よひ尿素）の多くモまたガンマ−インターフ
エロンを不法比することか知られ１いた。

当技術分野は、アフイニテイクロマトグラフイーを用い
るよりむしろ、複体な多二機の椙製法へと向かった。汽
えは、賦州特許公開第６５４８２号明細壱はガンマ−イ
ンターフエロン宮Ｍ浴ｍ’ｖ市す仰された多孔質ガラス
ピーズカラム、コンカナバリンＡ−セファロースまたは
ヒラマメＶクチンーセファロースもしくはエントウマメ
レクチン−セファロースカラム、ヘパリン−セファロー
スまたはプロシアンレッド−セファロースカラム、によ
びゲル濾過カラムに通すこと７ａｌ−宮ｔｊ４工程梢製
法（中性または埴基性Ｐ）ｉで行なわれる）乞報告して
いる。同様に、ＹＩｐ、　Ｙ＋に、、　Ｂａｒｒｏｗｃ
ｌｏｕｇｈ　。

Ｂ、Ｓ、、　Ｕｒｂａｎ、　Ｃ１，およびＶ目ｃｅｋ、
　Ｊ、、　ＫよるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、（ＬＪＳＡ）　＋第７９巻、１８２０〜１８２
４頁、１９８２年５月ハ制餌された多孔質ガラスへの第
１の吸着およびそｎからのｆ＆出、コンカナバリン人−
セファロースへの第２の吸着およびそ几からの＃出、Ｓ
よびその後のｐ）１８．０での天錐蛋白質のｊＪＥＡＥ
−セファセルへの吸着除去を含むガンミーインターフェ
ロンの６エ程棺袈法七報告している。

発明の概侠 当技術分野のこの状態をＪｉｌｌ朦して１本発明の目的
はガンマ−インターフエロンを精製するための改良方法
を提供することである。より詳細には。

本発明の目的は抗体アフイニテイクロマトグラフイーを
用いるガンマ−インターフエロンの精製法を提供するこ
とである。さらに、＊発明の目的はガンマ−インターフ
エロンを戚諮出によって抗体カラムから取り出丁抗坏ア
フイニテイクロマトグラフイーを提供することである。

本発明のさらに他の目的は戚不后比ガンマ−インターフ
エロンの再活性【ヒ万ｆ：を提供てることである。

これらの目的を達成するために１本発明は緻江状聾がガ
ンミーインターフェロンを確かに不活比するけれども、
そのインターフェロンは制御すれたｐＨおよび温度で長
時間インキュベートすることによって丹活性比′：！：
れ得ることを見出した。よりａｔ−＋ｌ’４１１には、
１１！２不法比ガンマ−インターフエロンは、もしそれ
が幻５．５〜９５のＰ）ｉおよび豹２〜８℃の温度に少
なくとも２４時間保持されるならば。

もとの生物学的油性の笑質的部分を回復するだろうとい
うことがわかった。本発明の好適な実施態様では、その
再活性比方法は＃？１６．０−Ｖ、００）　ｐ　Ｈｊ＝
よひ豹４℃の温度でｆＪ９６時間大施される。

この丹活性比方法を用いて１本発明は初のてガンマ−イ
ンターフエロンのｆｉｌ製に抗体アフイニテイクロマト
グラフイーの使用をａｔ舵にする。＃＋細には１次の工
程： ａ）ガンマ−インターフエロンに対する１極またはそれ
以上の抗体Ｖ駒製すること； ｂ）１梅またはそれ以上の抗体′ｆｔ面体支持体に固定
すること； Ｃ）ガンマ−インターフ、二ロンを富有する第１鰺液と
１祉またはそれ以上の固定した抗体と乞接触させて、ガ
ンマ−インターフエロンと１種またはそれ以上の固定し
た抗体との間に固定した杭棒−抗原複合体を形成するこ
と： ｄ）固定した抗体−抗ＩＡ複合俸から第１浴敦を分離す
ること； ｅ）固定した抗体−抗原伏台体と敵性ｐＨン、つ８に２
浴故とｔ接触させて、ガンマーイ／ター７エロンン１襠
またはそれ以上の固定した抗体から第２溶液中に解離す
ること（この場合、前記第２溶液のば性１！Ｌは解離し
たガンマ−インターフエロンをｂ分的番τまたは完全に
失活させる作用を有する）；ｆ）１４重またはそれ以上
の固定した抗体から第２溶ｇ！Ｌを分離すること； ｇ）その第２溶液のｐＨ′Ｉ￥：約５．５〜９．５に、
）ｌ！如し。

仄いでｐＨ調調節た溶液２豹２〜８℃の温度で少なくと
も２４時間インキュベートすることにより第２溶液中の
ガンマ−インターフエロンの活性のいくらかまたは全て
ン回復させること；からなるガンマ−インターフエロン
の精製法が本発明により提供される。精製法の好２！！
な笑施態様において、再活性ｆとは約６．０〜８０のｐ
Ｈ２よび豹４℃の温度でｆ１９６時間実施される。

図面の説明 第１図はｐＨ２，４で１ｋＲｆ間インキュベートしたヒ
トカンマ−インターフェロンの８油性１ヒを示−ｊ／グ
ラフある。より詳細には１部分手官製したヒトガフｗ−
インター７　ｚ　ａン（比活性２　Ｘ　１０’　ｕ／ｍ
ｙ　）乞り一！７ｒ：１！ｍ衝Ｍ（最Ｎ　ｐ　）ｉ＝　
２．４　）　　中＆Ｃ１：１００の割合で希釈し、氷上
で６０分間インキュベートした。アリコート１０ＩＬｔ
はＮａＵＨｙ（用いてｐＨ６，９＜　Ｏ）Ｖｃ；固体ト
リスｙａ’用いてｐＨ７，５（＋）に；固体トリス乞用
いてｐ）１ａ２５（＊）に；そして固体トリスン用いて
ｐＨ９，１（Ｘ）にｐＨ調節した。この夫験のための対
照は標準検定媒体（ｐｔ（７，２）中の同一インターフ
ェロンのｉ：ｔｏｏ＊釈物であった。対照は酸性［とし
かつｐＨＢＸ４ｔｌｔＪｌ、た溶液と正確に同じ方法で
４℃において水上でインキュベートした。

０８目の試料は塩基でのｐＨ調節の２時間後に検定され
た。

第２図は第１図に記載した溶液の絶対力１ｄＦｌヲ示す
グラフである。対照のデータ点（豐）；その他の溶液の
データ点は第１図と則じ。

第５図はＰ　Ｈ２−４で８日間インキュベートしたヒト
ガンマ−インターフエロンの！＋活性（’ＣＹ　示ｊ　
グラフである。よつ睦細には、ヒトカンマ−インターフ
ェロンのもとの敵性化混合＠（＠１図および第２図）を
４℃で８日間インキュベートした後。

ＮａＬ）Ｈ１１用いてｐＨ６，６（０）に：固体トリス
？用いてｐｔ４８．２５Ｃ＋）に；固体トリス乞用いて
ｐＨ８，５５（＊）に；そして固体トリスを用いてｐＨ
Ｖ、１（Ｘ）Ｋ　ｐ　Ｈ調節した。この実験のための対
照は第１図に関して先に述べたものと同じであった。

第４図は第６図に記載した溶液の絶対力価？示すグラフ
である。対照のデータ点（≠）；その他の溶液のデータ
点は纂６図と同じ。

ｗ、５図および縞６図は全蛋白質濃度、イオン預度およ
び賊終ｐ）１ｆｉ＜１ｔｌＪｌ［ｌした条件下でのガン
マーインターフエクンの酸による不活１とおよびｐＨＥ
’ａｎｖ示すグラフである。より詳細には９部分梢表し
たカンマ−インターフェロンＹ　（：Ａｋｌ　（ｐＨ２
，４）甲ＫＧ１００　ＱＷｔｌ会で希釈し、氷上で６０
分間インキュベートし０次いで固体トリス（最終濃度約
ＩＭ）２用いてｐＨ８，２に調即した。その後この舒欣
馨４℃でインキュベートして、Ｏ日月（４時間後）、６
８目および７８目に力１曲乞山１ｊ足した。対照はＣＡ
１３＋トリス（約Ｉ　Ｍ　＞　、　　ｐＨ８，２中にｉ
：ｉｏ。

の割合で希釈して４℃でインキュベートした。第５図は
対照のパーセントとして表わされる酸性比しかつｐｕｔ
）＠節した試料の力価？示す。第６図は酸性化試料（０
）および対照試４＋（Ｘ）の杷対力幽【示す。

稟７図および藁８図は全蛋臼質釦しイオン強度およびｄ
％５　ｐ　ｆ（ン制御した条件下でのガンマ−インター
フエロンの敵による不活【ヒおよびｐＨ調頗七示すグラ
フである。より詳細には、祉分梢製シタカンマーインタ
ーフェロン１νＹｉＯＮ）ｉｃＪｏ、ｏｉｏ酊でｐ）１
２．１に敵性比し、氷上で６０分間インキュベートした
。次いでこのｍ液０．１紅な検定媒体ｃ？、９紅に加え
た。対照試料は水上で６０分間インキュベートし１次い
でこの試料ｏ、ｉＩＬｔｖｍ定媒坏９．９Ｌｔに加えた
。その後１円試料は４℃で打威し１図に示す時期に力価
を測定した。第７図は対照のパーセントとして衣わされ
るＨｃ　ｌ−７性比しかつｐＨ調頗した試料の粘性？示
す。藁８図は敵性比試料（０ンおよび一７１煕試料（Ｘ
）の絶対の１１ｉｔｌ’ａ’示す。

第９図はガンマ−インターフエロン’ｋ［ｆｆｆ６ため
に用いられたポリクローナル抗坏カラムからのＩＧ山分
１のウェスターンプロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌ
ｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）　　ｙ示す。

第１０図はガンマ−インターフエロンを梢製するために
用いられたモノクローナル抗体カラムからの溶出分画の
ウェスターンプロット分析を示す。

発明の開示 上述のごと（１本発明は絃−不活１ヒしたガンｉ−イン
ターフェロンン８油性比するための方法。

および抗体アフイエテイクロマトグラフイーによるガン
マ−インターフエロンのＳ製における前記方法の使用に
関する。

その再活性比方法はａ）ｐ）ｉが１Ｆ１３．５〜９５の
溶液中にガンマ−インターフエロンを入れる二と：およ
びｂ）その舒猷ｒ約２〜８９Ｃの温良で少なくとも２４
時時間ンキュベートすること：の各工程から成っている
。好ましくは、その温液はｐＨが杓６．０〜８０であり
、温良は約４℃である万がよい。

インキエペーションの時間は４時間程度の短時間でもガ
ンマ−インターフエロン油性の有意な部分ンＬｇＪ仮さ
せるのに役立つが、豹２４〜９６時間程度が好適であり
、９６時間程良が最適である。右性比溶液は５．５〜ｉ
５のｐＨをもつ以外に、必ずしも必賛ではないか、過度
のイオン弦長（飼えば幻０．１〜０．５根度）および２
１１１度の蛋白質濃度（約えば約０．［１３〜２．Ｄ７
ｙ＋ｙ／ＩＬｔＷ！　）　ｋもツコトがｕｔＬいと考え
られる。

アフイニテイクロマトグラフイー法は次の工程：ｆａｌ
ガンマ−インターフエロンに対する１１皿またはそれ以
上の抗体のＩＪ＃　；　ｉｂｌ／　Ｈマドグラフィーカ
ラムの形体の固体支持体へこれらの抗体′ｊＩｒ：固定
すること：（Ｃ）ガンマ−インターフエロン含有溶液ン
そのカラムに通すこと；１ｄｌａｔｌ’用いて七のカラ
ムからガンマ−インターフエロンな溶出すること；およ
び（Ｃ）８后性ｆヒ方法を用いてガンマ−インターフエ
ロンを再活性１ヒすること；ンａ含する。

ガンマ−インターフエロンに対する抗体は歯妖術分野で
匂られた多くの方法で調製することができる。ガえは、
ポリクローナル抗体はＢｅｎｅｄｊｃｔ　。

人、Ａ、らによる１抗皿信の産生”、　Ｍｅｔｈｏｄｓ
約　　ｉｍｍｕｎｏｌｏ　　ｙ、工：１９７〜５０６（
１９６７）に６己載された方法によって作ることができ
、−１ニアクロ一ナル抗体はＭｅｔｈｏｄｓ　約　ｊｊ
ｎｚ　ｍｏｌｏ　ｙ、　ｍ　９２巻。

稟１部（１９８５年）Ｋ記載された方法で作ることがで
きる。一般に、モノクローナル抗体はそれらの特異性ゆ
えに本発明方法で使用するのに適している。ガンツーイ
ンターフェロンに対する七ツクローナル抗体の特に好適
な産生方法は以下の実施例５にｉ己載する。

ひとたび抗体が得られると、それらは轟技術分野でよく
知られた数多くの方法で固体支持体へ共有結合で結合さ
れる。ガえば、固定ｆヒは臭化シアンで活性化されたセ
ファロース４Ｂにュージャージー州、ビスカタクエイ、
Ｐｈｏｒｍａｃｉａ）、トリサクリル（メリーランド州
、ベテスダ、ＬＫＢ）または類似の物質においてなされ
る。これらの支持体への抗体の共有結合は、これらの製
品の製造業者により提供される製品パン７ノツトに記載
されている。例えば、Ａ比シアン活性ｆとセファロース
４Ｂへの結合は率Ｋ　Ｏ，５Ｍ炭酸す）　ＩＪウム緩面
Ｍ　（Ｐ）ｉ８．［＋　）　　中で抗体とその固体支持
体とｔインキュベートすることな含む。臭化シアン油性
（ヒセファロース４Ｂは、今日までの七の広い使用ゆえ
に０本＠明での使用に将に適した支持体であると考えら
れる。

精製しようとするガフマーインターフェロンは種々の方
法で調製することができる。１つのｍ当な方法はＪｏｈ
ｎｓｏｎらのＭｅｔｈｏｄｓ　約　＆ｚｙｍｏｌｏｇｙ
　。

纂７８舎、１３８〜１６２貞（１９１３１年）に記載さ
れている。他の方法は先に示した欧州脣許公開餓６５ｄ
Ｂ２号明細蕾に見出せる。ガンマ−インターフエロンの
特に好ましいｙ４製方法は本発明と同一出願人による１
９８２キ１２月２日付米−特許比顔第４４６１６０号明
細書に記載されている。

ナルアフイニテイクロマトグラフイーは他の積装方法の
助けｔ借りずにカンマ−インターフェロンを精製するこ
とができるので、カラムに加えろ九るガン！−インター
フェロン含肩＃欲は木精製のものであるのが好ましい。

未梢襞のガフマーインターフェロンはカラムにかかる荷
Ｊｔ！：容ｔ’に瓢ｆるために、別えば中２７アイパー
フイルター乞用いてｄｍｌｌえば１００Ｘ）するのが好
適である。

もちろん、１３１望により、ガンマ−インター７エロ／
含有溶液はカラムに加える前に市す−された多孔質ガラ
スピーズまたはケイ酸ビーズへの吸着、および／または
ＤＥＡＥ−セファセルもしくは類似の１勿質でのイオン
交換クロマトグラフィーのような技術によりｈ公的に梢
製さ１１″Ｃもよい。

結合したガンマ−インターフエロンをポリクローナルま
たはモノクローナル抗体カラムから溶出するのに用いろ
ｎる酸溶級は株々なｐＨおよび様々な組成ｔもつことが
できる。適当な溶出液の例には０．１Ｍクエン酸、ｐＨ
２，０；　　Ｉ　Ｍプロピオン酸。

ｐＨ２，５；および０．１　Ｍグリシン、　）））ｉ５
．ｏがある。

本発明は次の実施ｖＡｊによって十分に開示されるが、
いかなる方法も本発明を限定するものではないｊ 冥施ガ１ ガンマ−インターフエロンは先に示した米１！１許出鵬
第４４６１６０号明ａ書に記載の方法に従って陶製した
。費約すると、健康な血液提供者（ペンシルバーア州、
フィラデルフィア、赤十字社）からのプールされたヒト
パツフイコート（ｂｕｆｆｙｃｏａｔ）か遠７０分離、
その後の大部分の血小板および赤血球の除去により調製
された。白血球はルＰＭＩ媒体、５Ａ！！／−のｐＨ人
（ウイスーンシン州、ミルウオーキー、　Ｐ−Ｌｌ　ｋ
ｌｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ）および１２５ｍｇ／−のヒ
ト血ｆｆ’Ｙ含む溶液中に直径が１３０ｍのベトリ皿あ
たり１０’＠ｌのａ′Ｉ＆でｂ［した。培養物は５　ｑ
ｂｃｏ、雰囲気中５７℃で４日間インキ為ベートし、そ
の上置みｔ採取し、速ＩＯ分離により細胞破片を除いて
と明１とし、そしてベリコン中！７アイパー績ｍ機にュ
ージャージー州。

’７−’／７ト７、Ｍ口１＋ｐｏｒｅ）でｆＪ１ｏｏ＊
Ｋａａしたｕ　（６らｎた生成物は本明細否において１
未ｔ〃製の濃扁ガンマーインターフェロン１と呼ばれる
。

２、部分精製 末梢製のｒ！ｊｋ−ガンマ−インターフエロン（約５０
００００ｕ／Ｉｒ　、１００ｍｇ／−蛋白質）ｔｌｘＰ
ＢＳ　（０，１３Ｍ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　１４９２ナ
トリウＡ　、　ｐＨ７，２）でｆｃ＃Ｌだケイ酸（ミズ
リー州。

セントルイス、Ｓｉｇｍａ）カラムに通した。ガン！−
インターフェロンは４０％エチＶングリーール（Ｆｉｓ
ｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　ｅ　ｉ、５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌおよび２０ｍＭＡ歌ナトリウム、ｐＨ７，２Ｙ用い
てこのカラムから溶出した。溶出された物質の比活性は
約２　Ｘ　１０’　ｕ／ｍｙ　　であった。舒１ｔｈｌ
されたｖＪ質は１ｘＰＢＳに対して透析され、アリ；−
トに分けて一７０℃で凍結貯賦した。

６、抗ウイルス検定 ガンマ−インターフエロンの抗ウィルス活性は。

Ｈｇｐ−２細胞およびチャレンジウィルスとしてのＶＳ
Ｖｙ用いる細胞変性作用阻杏検定で測定した。

未知試料の力価が計算され、そして社内の標品に対して
補正された。

上記のようにして陶製した部分精製のガンマ−インター
フエロン（比活性約２ＸＩＱ’ｕ／町）ｔ。

Ｑ、５Ｍ　ＮａＣニア３および０．１Ｍクエン酸から成
るクエｙｒＲ緩衝！（（、’ＡＢ）での１：１００布釈
により最終ｐＨ２，４へ酸性比した。全１の溶液の温良
ｔ４℃に保って、＃に成分の混合を氷上で行なった。酸
性化した後、インターフェロン含有溶液は以下に示す時
間の間４℃でインキ岑ベートした。

Ｂ、方法２ 上記のようにしてｙ４ｆｆした部分精製のガンマ−イン
ターフエロン（比ｒ８性ｉ！：Ｊ２Ｘ１０’　ｕ／ｍ、
ｇ）　Ｙ：ｉＱＮ　ＨＣ：ｌの龜加によりｐ）ｉ２．１
へ敵性ｆとした。全ての溶液の温度′％：４℃に保って
、諸成分の混合を氷上で行なった。敵性化した後、イン
ターフェロン官有溶液は以下に示す時間の間４℃でイン
キエペートした。

５、酸性１ヒした溶液のｐＨ調節 酸インキュベーション後、インターフェロン含有溶液の
ｐＨＹｌＯＮ　　ＮａＵＨ、固体トリスまたは検定媒体
乞用いているいろな最終ｐＨへｖ４ｍした。

各溶液はｐＨ調節の間氷上に置かれ、セして埴基添加後
穏やかに渦を発生させた。几ＰＭＩ　（Ｇｉ　ｂｃｏ）
から成る標準検定媒体にはＬ−グルタミン、アミ／ＭＵ
、ビタミン類、炭酸水素ナトリウムおよび約１７ｔｇ／
ｌｒｌまでの生まれたばかりのクシ血清を補足した。

６、　　ｐ）ｌｖ１４節した溶液のインキュベーション
ｐＨ調節後、各溶液？＃：菌濾過し、４℃のところに配
置し、そして以下に示す時間その温良に保持した。

上述のごと（、ガンマ−インターフエロンの活性が酸処
理によって初期の値のＦｌｉｏ％に急速に低下すること
はよく知られている。この作用および簡いｐＨでの短期
間インキュベーションの＊質的活性回復失敗についての
データを縞１表に示す。

ガンマ−インターフエロンの　による不Ｉ　　　ＣＡＢ
　　２．４　　６０分　６．９０　　ＮｕＯＨ２ｔ５２
　　　ＣＡＢ　　２．４　　６０分　７．５０　トリス
　１２．５５　　　ＣＡＢ　　２．４　　６０分　８．
２５）リス　　８．２ａ　　　ＣｈＢ　　２．４　　６
０分　ｙｌｏ　トリス　１３．８５　　　　ＣＡＢ　　
　２．４　　　８　　　日　　６．６０　　　ＮａＵＨ
１３，６６（、：ＡＨ２，４８日　８．２５）リス　　
　Ｚ４７　　　ＣＡＢ　　　２．４　　８　　日　８．
５５　　）リス　　　８．１ｆ３　　　ＣＡＢ　　２．
４　　８　　日　９１０　トリス　　６．５９　　　Ｃ
ＡＢ　　２．４　　６０分　８．２０　　）ＩＪス２１
０１０　　ｋ−ＬＣＬ　　２．１　６０分７．２０　　
Ｎａ！Ｕ（Ｊ、　５２．Ｑ実験１〜４において、ガンマ
−インターフエロン含有溶液はクエン酸緩衝液で１００
倍に希釈しく最終ｐＨ２，４）　、氷上で６０分間イン
キエペートし１次いで１ＱＮ　ＮａＯＨまたは固体トリ
スを用いて第り表に示す高いｐＨへｐＨ調節した。ｐＨ
ｖ４節および４℃警のインキュベーションの２時間後。

活性はガンマ−インターフエロンの別の試料を検定媒体
（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、２）で
１００倍に希釈して４℃で２時間インキュベートするこ
とにより調製した対照の２　’Ｌ５％（最鵡）から８．
２％（最低ンまでの＃ｉ囲であった。

爽駿５〜８において、実験１〜４の試料と同じ方法で＠
製した試′Ｉｐｒ（最終ｐＨ２，４）は４℃で８日間貯
蔵し１次いでＮ　ａＵＨまたはトリスでｐＨ調節した。

この場合もまた。高いｐＨでの短期間インキュベーショ
ン（５時間）後に測定した活性は同−条注下に貯蔵した
対照の活性と比較して１３．６〜６．５％と低かった。

央１９において、（、？ＡＢ処理した試料はトリスでｐ
Ｈ８，２へＨａしかつ４℃で４時間インキュベートした
後に対照活性の２１％？示した。災厭１０において、１
ＯＮ　ｋ４ｃｌ　　で酸処理したカンマ−インターフェ
ロン（最終ｐ）４２．１　）は、慌定媒俸で１００倍に
希釈することによりＰ）１１．４Ｔｈしかつ４℃で４時
間インキュベートした後に対照油性の５２％？回復した
。

上記実親で用いたガンマ−インターフエロン調製物は抗
ガンマーインターフェロン抗血溝によって完全に中和さ
れるが、抗アルファーインターフェロンまたは抗ベータ
ーインターフェロン抗血清によっては中和さｔ’Ｌない
ことが見出された。従って、これらの実験における全て
の抗ウィルス活性はガンマ−インターフエロンのみに帰
因する。

且 ガンマ−インターフエロンはその１１Ｌｔ試料乞ＣＡｌ
１で１００倍に希釈しく最終）１）１２．４　）　、水
上で６０分間インキニベートすることにより酸不活ｒヒ
した。同時に、１１ＩＬｔ対照試料は検定媒体（ｅＨ７
、２　）で１００倍に希釈して１ＩＩＩＪ様に氷上でイ
ンキュベートした。

酸性１ヒ試料は４つの等しいアリコートに分け。

１　ＯＮ　ＮａＯＨ（ｐＨ６，９試料）または固体トリ
ス（ｐＨ７，５，８，２５オ！ヒ９．１　）各ｇｉ　）
　テＰ　ｌｉ調ｍした。４℃で２時間インキュベーショ
ン後、各試料は抗ウィルス活性について検定した（第１
表の実験１〜４および上記−文を参照されたい）。対照
を含む全ての試料はその後滅菌濾過して４℃でインキュ
ベートした。周期的な間隔をおいて各試料を抗ウイルス
検定のために取り出した。

第１表（爽ｊＦｔ１〜４）に示すごとく、かつまた先に
−じたごとく、対照のパーセントとして表わされるｐ）
ｌｖＩ４１＋シた試料の活性は４℃で２時間インキュベ
ーション後に８．２〜２１３％　と低かった。

しかしながら、第１図に示すように、溶液の最終調＠ｐ
Ｈにかかわらず４℃で４日間インキュベーション後にほ
とんど完全な活性回復か達成された。

４℃で１日後には４つの試料のうち５つが対照活性のＦ
１６０％の活性乞示した。Ｐ）ｉＡｌｌｌｌ：ｌ後４日
までに全ての試料は対照活性の豹１ｏｏ％を示した。

ｗＩ２図に示すように、全１の絃先埋した試料の力価は
開始時点（２時間）後に増加し、こｎに加えて対照試料
の力価は実組の期間中大体一定のままであった。このこ
とは対照試料の活性の順次状退および酸処理した試料の
比較的一定の低水準活性が存在することに対立てるもの
として真のｈａ性化がおこったことを示している。

同じ結果は６０分間咳処理（第１表の実験１〜４）した
−じガンマーインターフェｏ７Ｙ　ｐＨ２，４でＣＡＢ
中８中間日間にインキュベート（第１表の実験５〜８）
した場合にも得られた。篤１表に示すように、６．６．
に３．２５，８．５５　Ｍ！Ｕ９．１へｐ）ｉｑ節して
５時間後に低水準の活性（対照の６．５〜１３．６％）
が観察された。しかし、第５図に示すように、ｉ％ｉ６
いｐＨおよび４℃でのインキュベーションの６日後に２
つの試料（ｐ）ｉ８．２５およびｐ）１９．１）はｎ照
活ａのＦｌｓｏ４ｖ示り、　＠５査ｆｌノ試料（ｐＨ８
，５５）！！約６０％そＬ″ｃｇ４を目ノｘ、ｅ（ｐＨ
６，６）はＦ１４０％？示した。この場合も、酸処理し
た試料の力価は最初の時点（５時間目）から増加乞示し
、対照試料（第１図のものと同じ）の力価は実球の期間
中大体一定であった（第４図さ照）。

藁１〜４図に示した２組の実験において、酸処理しかつ
ｐＨ調節した試料は蛋白質ａ反およびイオン強度につい
て制御されていなかった。両刃の組の実線に１６いて、
対照試料は約１．５ｍｙ／ａｕ　の最終蛋白質磯にであ
ったが、−万能処理した試料は０、５　ｍｇ、乙１の蛋
白質ｄ度であった。こ九らの実験における対照試料のイ
オン強度は生理賞塩液（約０．１３）に近いが、酸処理
した試料のイオン強直はＣＡＢ希釈物が０．５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１および０．１Ｍクエン畝ン含みかつｐＨ調節で約１
Ｍまでのトリス塩基またはｆｌＯ，ｏＩＭまでのＮａ０
）１が加えられたのでより高かった。

再活性ｒ上方法でに動じつるイオン強度およびｉ白實良
匿の作用ン調べるために、誦１表の実験９および１０が
行なわｎた。

突成９において、ガンマ−インターフエロンはＣ，１１
３で１００＠に希釈しく最終Ｐ８２．４　）　、水上で
６０分間インキュベートし１次いでトリスを用いて最終
ｐ　）１８．２へｐＨ調節した。この実験のための対照
はＣＡＢ十に−ＩＪスで１００倍に希釈されたガンマ−
インターフエロン（ｐＨ８，２）であった。従って、酸
処理した試料およ°び対照試料の蛋白質濃度（０，５町
〜）、イオン強度にｏ、ｓ）および最終ｐＨ（８，２）
は同じであった。

各試料は４℃で７日間インキュベートし、第５図に示す
時間に検定した。ｐＨ調節の４時間後。

酸処理した試料のパーセント油性は対照の２１％であっ
た。４℃でのインキュベーションの５日後。

その活性は対照の８４係まで上昇し、そして７日後には
対照の８７％であった（第５図）。前の実験と同様に、
ＩＲ処理した試料の力価は時間とともに増加し、かつ対
照試料の活性には側ら拭退が表われなかった（第６図）
。

第１表の夾歇１０において、１ばのガンマ−インターフ
エロン溶液は０．０１０ゴの１（ＩＮ　ＭＣＩ　　で酸
性化した（最１ｐＨ２，１）。氷上で６０分間インキュ
ペーション後、その酸性化試料ン検定鍼体で１００倍に
希釈して４℃でインキュベートした。

この実験のための対照は同じ１１Ｌ１ガンマ−インター
フエロン溶液を検定媒体で１００倍に希釈したものであ
った。この実験の場合も、蛋白質濃度（１，５ｍｇ／ａ
ｔ）　、イオンｇＨ（：０．１３）−１ｇよひ最終ｐ）
ｉ（７，２）は試料および対照において同一であった。

第７図に示すように、ｐ）ｉｖ！４ｍの４時間後に試料
の活性は対照の５２％であった。４℃でのインキュベー
ションの７日後に、ｐＨ調節した試料はその活性の全て
（１１８％）χｉｇ１俵した。開始時点（４時間目）か
らの力価の増加ならびに比較的一定の対照力価がこの場
合にも畝祭された（１８図〕前述のデータは敵失活した
ガンマ−インターフエロンの再活性［ヒが賜いＰ）ｉお
よび制御された温度での長期間インキュベーションによ
って達成され得ること？明瞭に立証し二いろ。その再活
性ｆヒはイオン張度および蛋白質績良を制御した条件Ｓ
よび劃−しない条件の両条件下でおこる。

実施例２ ガンマ−インターフエロンを槍製するためのポリクロー
ナル抗体カラムは次の方法で作製された。

１、　　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ社に
ュージャージー州、二二一プルンスウインク、カタログ
ム５７１０）から入手できるアフィニティー梢殺したウ
サギの抗ガンマーインターフェロンＬｇＧは、先に示し
た米＠特許出ｍ第４４６１６０号記載のガンマ−インタ
ーフエロン調製方法により′Ａ製された末梢製品中に通
常見出せる王な夾雑物（？ｌＪえはヘモグロビン、　Ｉ
ｇＧおよび類似のもの）を含む蛋白質−セファロースカ
ラムでクロマトグラフ処理された。この方法によって、
夾雑物に対する抗体はカラムに吸着され、−万ガンマー
インター７エロンに対する抗体はカラム％Ｉ：通過した
。非抗ガンマーインターフェロン抗体′Ｉｋ：出来るだ
け多（除去するために少なくともうサイクルのクロマト
グラフ処理を行なった。

２、工程１で単離した抗ガンマーインターフェロン抗体
は、その抗体と臭１！シアン活性比セファロース４Ｂゲ
ルと？０．５Ｍ戻酸ナトリクＪ−緩衝液（ｐＨ８，０”
）　　中で一晩インキエペートすることにより、ゲル１
１Ｌｔあたり抗体１０ｍＩＩの濃度でそのゲルに結合さ
せた。

上記工程によって得られたカラムは次の方法でガンマ−
インターフエロンを絹製するために使用された。

１、　水冷および滅菌濾過した未精製の濃縮ガフマーイ
ンターフェロン（実施例１のようにして調製したｌ−１
縦／分の流速のもと４℃で上記抗体カラムに装填した。

２、その後、カラム流出液が≦０．０１の人２８０絖み
とりｔ有するまでそのカラム′％：１ｘＰＢｓで広範囲
に洗浄した。

３、　ガンマーインターフェロンは次いで水冷したりｚ
ｙｇ椴衝液ＣＯ，Ｉ　Ｍ／：ｒ−：／Ｕ、０．５Ｍ　Ｎ
ａＣ１゜ｐ）ｉ２．０）乞用いてカラムから溶出した。

４、工程６で得た水冷しｔＳ溶出分画にｐＨが９．０に
なるまで固体ト１ノス（カリフォルニア州、リツｆ％７
ド、　Ｂ＋ｏ４ａｄ）　ｇ加えた。

５、ｐＨ−節した溶出分画は次いで滅菌濾過してみ活性
（ｌ：におニさせるために４℃のところに起重した。

代表的実験の上記方法で４た徳々の分−に見出されたガ
ンマーインターフェロン活性′％：揖２表に示す。カラ
ムのガンマ−インターフエロン結合部位１に：完全に飽
和させるために、初め大過剰のガンマ−インターフエロ
ン（４０ＤＸ１０＠率位）が七〇カラムにｖｃ＊された
。流出した物質（５［ＩＤＸ１０’率位）は保存して次
の実験の装填物質として使用した。

この芙厭における準位の全回収率は９４％であり、そし
て≧５Ｘ１０’率位／ｍｇの比活性が浴出分ＩＪｊＩＪ
Ｋついて得られた。このことはカラムに刃口えた未精製
の凝縮ガンマーインターフェロンの１００Ｄ倍稽Ｈを意
味する。

第　　２　表 装　填　　　　　４０１　八ｉｕ　　　　　５ｘ１０”
ｕ／ｍｇ流　出　　　　　　ろ０８　八１　ｕ　　　　
　　５ｘ　１０”　ｕ／ｍＪ１洗浄　　　１３Ｍｕ　　
　　・・・・・・・・・溶　　出　　　　　　　　　５
５Ｍｕ　　　　　　≧５ｘ１０”ｕ／ｍｙ浴出分画に見
出された活性がアルファーインターフェロンまたはベー
ターインターフェロ／活性に対立するものとしてガンマ
−インターフエロン活性を表わすということは、アルフ
ァ、ベータおよびガンマ−インターフエロンに特異的な
抗体の使用により立証された。この分析によれば、譜出
分画の活性は１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ
社にュージャージー州、ニューブルンスウイック、カタ
ログＡ１７５０）で作られた抗アルファーインターフｚ
　ｏ　ｙ抗体、またはＣｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ　（カリフォルニア州、エメリービル）で作られた
抗ベーターインターフェロン抗体のどちらによっても中
和されないが、　　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ社（カタμｆ　４５８　Ｄ　Ｏ）　オＬ　Ｕニュ
ーシャーシー州、ニューヨークのｔｈｅ　Ｓｌｏａｎ−
Ｋｅｔｔｅｒ約ｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅの両社で作られ
たモノクローナル抗ガンマーインターフェロン抗体によ
って完全に中和されることが見出された（　Ｂ　、　Ｙ
　、　ＲＡＪ　ｂ　ｉ　ｎらのＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆと
＝＝と二　第１３０巻、　１０１９ページ。

１９８５年を参照されたい）。

ポリクローナル抗体カラムから溶出されたガンマ−イン
ター７二ロ／の物理的ならひに化学酌量ｋ”Ｙｖ！４べ
るために１次の方法を用いてウエスターンプａ７ト分析
（Ｗ、ＨｏＢｕｒｎｅｔｔｅの人ｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１１２：　１９５（１９８１）
　１ｒ：＃照されたい）が行なわれた。蚊初に、疹山分
−の２つの試料ｔＳＤ８処理して、１０−２０４ポリア
クリルアミドゲル勾配で分子蓋マーカー蛋白質の４つの
試料と平行して電気泳＃にかけた（浴め試料はＶ−ン２
および５であり；ｉ−カー蛋白簀はレーン１．５．４お
よび６である；Ｖ−ン１，２および５はそれぞれＶ−７
４，５および６に等しい。）。電気泳動した試料は次に
ニトロセルロースのシートに電気泳動的に移した（Ｈｏ
Ｔｏｗｂ約、　Ｔ、８ｔｅｈｅｌ約　　およびＧｏｒｄ
ｏｎによるＪ、ＰＮＡＳ、７６：４５５０（１９７９年
）を参照されたい。）。ニトロセルロースシート上の蛋
白質バンドは免疫学的染色法（人、Ｌ。

ＤｅＢＩａｓおよびＨ，Ｍ、Ｃｂｅｒｗ約ｓｋｉ　　Ｋ
よるＡｎ　ａ　ｌ　。

Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ、、上９：２１４ＣＩ９Ｂ５年）ヲ参
照されたい。）により次のようにして視覚化さ九た。

１）ニトロセルロースシートを半分に切って、レーン１
．２およびろを含むパート人はガンマ−インターフエロ
ンを特異的に認識スる１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｃｉｅｎ
ｃｅｓ社で作られたマウスのモノクローナル抗体（カタ
ログＡ３８００）と−晩インキユベートした。

２）レーン４．５および６Ｆ含ム二）ＯセｙＨ−スシー
トの残りの半分バートＢはモノクローナル抗体？含まな
い対照緩＠液中で一晩インキュペートした。

５）ニトロセ／Ｉ／ロースシートの四牛分は次いでヤギ
の抗マウスポリクローナル抗体（ペンシルバーア州、：
ＩクランビＡ−、Ｃａｐｐｅｌ研究Ｆ９Ｔ）ど共にイン
キュベートした。

４ｒ両半分は次にペルオキシダーゼ＃累およびマウスの
七ツクローナル抗ペルオキシダーゼから成る分子狸合体
（ＰＡＰ）（メリーランド州、ジャＶットビｐｙ　、　
８ｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−Ｍｅｙｅｒ　）と共にイアキ
ュベートした。

５）最後に両学会はニトロセルロースシート上に黒色バ
ンドを発現させるために過酸ｆヒ水累および３．５′−
ジアミノベンジジン（ｉＪＡＢ）と共にインキュベート
した。

この方法によれば、パー）Ａの７−７２に現われるがバ
ー）Ｂのレーン５に現わｎないバンドはガンマ−インタ
ーフエロンに特異的なバンドを表わす。−万、Ｖ−ン２
および５の両刃に現われるバンドはガンマ−インターフ
エロン以外のものに特異的である。

上記のようにして得らｎた芯出分画の結果？第９図に示
す。この図かられかるように、カンマ−インターフェロ
ンに特異的なバンドは１３．５Ｋ。

１７に、２１に、５０に、５２に、５４におよび５８に
ダルトンの分子量位置に現わｎる。第９図のレーン２に
おける全バンド数に対するカンマ−インターフェロンに
特異的なバンド数に基づいて、かつガンマ−インターフ
エロンの埋處的比活性が約１ｘｉｏ’ｕ　／　ｍｇであ
る（Ｐ、ＡｎｄｅｒｓｏｎらによるＪｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　
１２５８谷、　６４９７〜６５０２頁（１９８５年）を
参照）と仮定して、これらのデータはポリクローナル抗
体カラムでのクロマトグラフィーにより得られたガンマ
−インターフエロンがｆＪ５０％の純匿であることを示
した。

ヒトガンマ−インターフエロンに対するモノクローナル
抗体は次のようにして得られた。

最初に、　Ｈａｌ　ｂ／ｃマウスは５００μＩ廓　のイ
ンターフェロンン含むリポソームＦｆ！Ａ濁液０．２ａ
ｋＺづつで一週間おきに４回腹腔内圧射により免疫した
。

このマウスは最後のリボンーム注射の６ケ月後に不完全
なフロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄｓａｄｊｕｖ
ａｎｔ）　中のインターフェロン１００μｓの促進を受
け、その後さらに１２ケ月間休ませ、この間抗インター
フェロンの力価は５ｘｉｏ”　中和単位／ハ以上存在し
ていた。最後に、このマウスは不完全なフロインドアジ
ュバント中の精製ガンマーイ／ターフエロン２５〜５０
μＩで腹腔内圧射により促進された。こｎらの免疫比に
使用したヒトガンマ−インターフエロンは前記方法によ
って帰られ。

最Ｗの５回の注射に対しては約１ｘｉｏ’　　準位／町
の活性を有し、＃Ｌ後の注射に対しては約５Ｘ１０＠率
位／ｍｇの活性を有していた。

最後の注射の６日後、マクスからの膵臓細胞？４匹の照
射さｒした受容坏Ｂａｌ　ｂ／ｃマウスに静脈内注射し
た。　　Ｐ、Ｃ０Ｆｏｘ、Ｅ、Ｈ１Ｂａｒｅｎｓｔｅ約
オよひＲｏＰ、Ｓｊｒａｇａｎｉａｎ　ＶＣよる１抗原
特異的ナハイブリドーマの頻度を高めることについて”
ＥｕｒＪ。

士＝とニム、二：４５１〜４５４（１９８１）’に＃照
されたい。各マウスは不完全なフロインドアジュバント
中のガンマ−インターフエロン（５Ｘ１０＠率位／ｍｙ
）２５〜５０μｙの腹腔内促進な受けた。５日後これら
のマウスからの膵臓細胞は融合のために使用された。

ＮＳ−１−５［１３ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）は５
５４　ＰＥＧ１０００により膵臓細胞と融合させた。

Ｍ、Ｌ、Ｇｅｆｔｅｒ、　Ｄ、Ｈ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ
およびＭ、Ｄ。

５ｃｈａｒｆｆ　　による１マウスのミエローマ細胞の
ポリエチレングリコールにより促進された簡率なハイブ
リダイゼーション法′″Ｓｏｍａ　ｔ　ｉ　ｃ　Ｃｅ日
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、１．２５１〜２５６（１９７７）
　ｅおよびＴ、Ｋａｗａｍｏｔｏ、　Ｊ、Ｄ、５ａｔｏ
、　Ａ、Ｌｅ、　Ｄ、Ｂ。

ＭｃＣｌｕｒｅ　およびＧ、）ｉ、８ａｔｏによる＠Ｎ
５−１マウスのミエローマ細胞の増殖用血清不吉培地の
開発およびＮＳ−２ハイブリドーマの単離へのその通用
”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ
、　１ろ０：４４５〜，１１１３５（１９８５）　　乞
ε照されたい。融合細胞は９６のつｚ）ｖプｖ　−）　
（ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に球型した。２〜５週間後に
陽性フェルは希釈′％：限定することによりクローン化
された。

融合細胞によってｆｆ１ｇ：されたモノクローナル抗体
の特異性は中和恢定、沈降検定、クエスターンプロット
分析およびアフイニテイクロ！トゲラフイーにより決定
された。この抗体はヒトガンマ−インターフエロンに対
して特異的であって、ヒトアルファまたはベーターイン
ターフェロンには縦合しないことがわかった。前記方法
により産生されたモノクローナル抗体はＩｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎＳｃｉｅｎｃｅｓ社（カタログＡ３８００）から
市販されている。

実施例４ ガンマ−インターフエロン′％：梢製するためのモノク
ローナル抗体カラムは次の方法で作製された。

１）冥施？ＩＪ　５　Ｋより産生されたガンマ−インタ
ーフエロンに対するモノクローナル抗体は、ヒツジ、の
抗マウスＩｇＧ（ペンシルバニア州、コクランビルｓ　
Ｌａｐｐｅｌ　研兄所）を含むカラムでアフイニテイク
ロマトグラフィーにより稽製した。

２）＄４製したモノクローナル抗体は、実施料２ＩＣお
いて上述した方法７用いてゲル１ａあたり抗体１０ｍｇ
の濃度で具１ヒシアン活性ｆ！セファロース４Ｂへ結合
させた。

児成したカラムはポリクローナル抗体カラムについての
実施料２で上述した方法にエリガンマ−インターフエロ
ン？絹製するのに用いた。

代表的実験のデータを第５表に示す。２２Ｘ１０’率位
のガンマ−インターフエロンが≧ｌＸ１０’率位／ｍｇ
の比活性でこのカラムから疹出された。

全回収率は６２％であった。

第１０図は上記カラムから得られた溶出分画のウェスタ
ーンプロット分析の結果を示す。この分＠ＶＣおいて用
いた方法は第９図について上述した方法と同じであった
。ガンマ−インターフエロンに峙異的なバンド（パート
人）は１３．５に、　１７Ｋ。

２１に、５０に、５２に、５４に、５８五（および４（
ＩＫメダルンの分子量位置に見二せる。唯一の夾雑物は
臭１ヒシアン市性１ヒセファロース４ＢゲルＫｕ合さ才
した抗体に通常ＩＥ！！祭されるような、カラムから漏
出した少量のマウスＩｇ（ｊ（７）蔗鯖（５ＯＫ）であ
ると思われる。

観察された比活性≧Ｉ　Ｘ　１０’率位／ｍｙ　および
ウェスターンプロット分析はともにカラムから浴ｌｉｄ
れたガンマ−インターフエロンがほとんど純粋であるこ
とを立証する。

実施ガ２および４の結果は、高純度のガンマ−インター
フエロンＹｆｆ溶出を用いることにより抗体カラムから
取り出すことかでｆ！、かつガンマ−インターフエロン
活性のほとんど完全な回りがｐＨ４￥節および実施料１
に記載した条件下でのインキエベーショ７により得らｎ
ることｔ明瞭に示し工いる。

第　　５　　表 ンマーインターフェロンノ梢製 分画　　全単位　　比活性 装填　　８７Ｍｕ　　　　５Ｘ１０” 泥　　出　　　　　　　　５［ＩＭｕ　　　　　　　　
　　５Ｘ１０’洗浄　　ｔ２Ｍｕ　　　　・・・・・・
・・・。

溶出　　２２Ｗｉｕ　　　≧１Ｘ１０’本発明の特定の
実施態様を記載しかつ例示してさたが１本発明の精神お
よび範囲から逸脱することなく変更が可能であることは
理解されるべぎである。例えば１例示したものに加えて
他の塩基性＠質がインターフェロン含有溶液のｐＨｔ調
加するのに用いらｎる。同様に、例示したもの以外の棟
々のクロマトグラフィーカラム２よひ抗体調製物が本発
明を実施するのに用いられる。

【図面の簡単な説明】

＾１図はｐ）１２．４で１時間インキュベートしたヒト
ガフロンンターフ正ロンの８活性比を示すグラフである
。 第２図は纂１図に示した溶液の絶対力価を示すグラフで
ある。 謳５図はｐ）１１４で８時間インキエペートしたヒトガ
ンマ−インターフエロンの再活性ｔヒを示すグラフであ
る。 第４図はＩＮ５図に示した溶液の絶対力価を示すグラフ
である。　　゛ 第５図および第６図は全蛋白質＃度、イオン強反および
最終ｐＨＹ制御した鉄性下でのガンマ−インターフエロ
ンの酸による小芯化およびｐＨＮ節？示すグラフである
。 第７図および概８図は全蛋白質酸度、イオン強良および
Ｒ？ｐ％Ｐ’ｄン制惧した条件下でのガンマ−インター
フエロンの敵による不活化およびｐ　Ｈｖｉａ節を示す
グラフである。 第９図はガンマ−インターフエロン乞梢製するのに用い
たポリクローナル抗体カラムからの浴出分画のウェスタ
ーンプロット分析を示す。 第１０図はガンミーインターフェロンをｆｌｆｆｍ−ｆ
るのに用いたモノクローナル抗体カラムからの溶出分画
のウェスターンプロット分子ｒを示す。 ｐＨγ節筏の口取 第１図。 ｐＨ調吟ＨＬｔｔ＞口友 第２図 ｐＨ調外孫の１机 第３図 ２　　　　４　　　　６　　　　８　　　　　℃ｐＨ賞
津儂禮日τ、 ｐＨｆｆＩｈ状−日改 Ｎ６図 ｐＨｇ′ｆｐ撲の日炎 第７図 ｐＨ調節後の日収 第８図 ；面の浄ａ（内容°二変更なしコ ＭｌｇＧ　ＲＡＧ−５ＬＭＷ縮ｇＧ　ＲＡＧ−５しＷ；
＝の浄ａ（ｉ答にス２なしン バートＡ　　　　　ハートＢ ＬＭＷ　ＭＡＧ−Ｉ　ＭｌｇＧ　　ＬＭＷ　ＭＡＧ’ｌ
　Ｍ［ｇＧ第１０図 特許庁長官志　　賀　　　　学殿＠ １、事件の表示 昭和ｇｏ年ｉう′＋願第　　≦６ｒり　号３、補正をす
る者 事件との関係　　出　願　人 住所 ｚ　ｉ′：ｒ　　イ・ターフｃＯν　サイニジシス　／
シフ−叶ル−卆、トー４、代理人 ミ桶ニジー９；三−５管：う；三　−弓３：ミ、発Ｓミ
。 ６、補正の対象 図　　　面

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）ガンマ−インターフエロンに対する１種また
   はそれ以上の抗体を調製する工程； ｂ）１種またはそれ以上の抗体を固体支持体へ固定する
   工程； ｃ）ガンマ−インターフエロンを含有する第１溶液と１
   種またはそれ以上の固定された抗体とを接触させて、ガ
   ンマ−インターフエロンとその抗体との間に固定された
   抗体−抗原複合体を形成する工程； ｄ）固定された抗体−抗原複合体から第１溶液を分離す
   る工程； ｅ）固定された抗体−抗原複合体と酸性ｐＨをもつ第２
   溶液とを接触させて、ガンマ−インターフエロンを１種
   またはそれ以上の固定された抗体から第２溶液中へ解離
   する工程（この場合、前記第２溶液の酸性度は解離した
   ガンマ−インターフエロンを部分的にまたは完全に失活
   させる作用を有する）； ｆ）１種またはそれ以上の固定された抗体から第２溶液
   を分離する工程；および ｇ）該第２溶液のｐＨを約５．５〜９．５に調節し次い
   で、ｐＨ調節された該第２溶液を約２〜８℃の温度で少
   なくとも２４時間インキュベートすることにより、第２
   溶液中のガンマ−インターフエロンの活性の幾分かまた
   は全部を回復させる工程； からなるガンマ−インターフエロンの精製法。
2. （２）該第２溶液の酸性ｐＨは約１．５〜４．０である
   特許請求の範囲第１項記載の精製法。
3. （３）該第２溶液のｐＨは約６．０−９．０へ調節され
   る特許請求の範囲第１項記載の精製法。
4. （４）ｐＨ調節された第２溶液は約４℃でインキュベー
   トされる特許請求の範囲第１項記載の精製法。
5. （５）ｐＨ調節された第２溶液は約２４〜９６時間貯蔵
   される特許請求の範囲第１項記載の精製法。
6. （６）ｐＨ調節された第２溶液は約９６時間貯蔵される
   特許請求の範囲第５項記載の精製法。
7. （７）第２溶液のｐＨは約６．０〜９．０へ調節されか
   つ該溶液はその後約４℃で約９６時間貯蔵される、特許
   請求の範囲第１項記載の精製法。
8. （８）酸性溶液と接触していたガンマ−インターフエロ
   ンの活性の幾分かまたは全部を回復させる方法であつて
   、 ａ）該ガンマ−インターフエロンをｐＨが約５．５〜９
   ．５の溶液中に加える工程；およびｂ）該溶液を約２〜
   ８℃の温度で少なくとも２４時間インキュベートする工
   程； からなることを特徴とする上記方法。
9. （９）該溶液のｐＨは約６．０〜９．０である特許請求
   の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）該溶液は約４℃でインキュベートされる特許請
    求の範囲第８項記載の方法。
11. （１１）該溶液は約２４〜９６時間インキュベートされ
    る特許請求の範囲第８項記載の方法。
12. （１２）該溶液は約９６時間インキュベートされる特許
    請求の範囲第１１項記載の方法。
13. （１３）該溶液のｐＨは約６．０〜９．０でありかつ該
    溶液は約４℃で約９６時間インキュベートされる、特許
    請求の範囲第８項記載の方法。