JPH0566400B2 - - Google Patents
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- JPH0566400B2 JPH0566400B2 JP60006657A JP665785A JPH0566400B2 JP H0566400 B2 JPH0566400 B2 JP H0566400B2 JP 60006657 A JP60006657 A JP 60006657A JP 665785 A JP665785 A JP 665785A JP H0566400 B2 JPH0566400 B2 JP H0566400B2
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
(1) 発明の分野
本発明はガンマ−インターフエロンに関し、特
にモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使
用してガンマ−インターフエロンを精製する方法
に関する。 (2) 従来技術 免疫またはガンマ−インターフエロンは初期の
頃酸処理および／または56℃への加熱に対するそ
の不安定性ゆえに、タイプインターフエロンと
して物理的基準で分類された。この操作上の分類
は、一般に酸または熱に対して安定なウイルス由
来のタイプインターフエロン（アルフアおよび
ベータ）とこのタイプインターフエロンとを区
別した。主なインターフエロン型（アルフア、ベ
ータおよびガンマ）の各々に対する特異な抗血清
の広範な利用可能性の結果として、各型の分類お
よび区別は今や通常血清学的または免疫学的方法
で行なわれる。それにもかかわらず、ガンマ−イ
ンターフエロン調製物はまだ酸処理の際のそれら
の急速な不活化によつて同定されている。The
Interferon System、第２版、W.E.Stewart、
スプリンガー−バーラーグ、ニユーヨーク
（1981）を参照されたい。 一般に、ガンマ−インターフエロンの同定に用
いられる酸不活化法はガンマ−インターフエロン
含有溶液のPHを約２に下げること、このPHで短時
間（２、３分ないし数時間）インキユベートする
こと、次いで塩基の添加またはPBSに対する透
析によりそのPHを中性にすることを包含する。こ
のような処理後の活性回復は通常対照活性の約10
％である。本出願人の知る限りでは、酸処理後の
ガンマ−インターフエロンの抗ウイルス活性を10
％より著しく高い水準まで回復させることを示す
報告は今日まで一件もない。 選択された生物学的物質の精製溶液を得るため
に用いられる強力な手段の１つに、抵抗アフイニ
テイクロマトグラフイー（antibody
affinitychromatography）がある。この方法に
よれば、精製しようとする生物学的物質に対する
抗体を共有結合で固定して含有するクロマトグラ
フイーカラムが準備され、そしてこの生物学的物
質と夾雑物とを含む溶液がこのカラムの中を通さ
れる。固定された抗体はカラムに残存する生物学
的物質と抗原−抗体複合体を形成し、一方夾雑物
の大部分を含む溶液の残部はそのカラムを通過す
る。固定された抗体からその選択された生物学的
物質を遊離させるために、抗原−抗体複合体を解
離させうる第２溶液がそのカラムの中を通され
る。種々の物質（例えばチオシアン酸カリウム、
尿素、グアニジン塩酸塩など）がこの解離を達成
させるためにその第２溶液中に加えられるが、最
も一般的に用いられる方法ただ単にその溶液を酸
性化することである。 本発明以前には、ガンマ−インターフエロンの
酸による失活が知られていたので、抗体アフイニ
テイクロマトグラフイーはこの重要な生物学的物
質を精製するのに用いられたことがなかつた。す
なわち、クロマトグラフイーカラムに固定させう
るガンマ−インターフエロンの抗体は入手できる
けれども、抗体カラムからこのインターフエロン
を生物学的活性のほとんどを破壊することなく溶
出する方法が全く知られていなかつたので、当技
術分野ではガンマ−インターフエロンにこのアフ
イニテイクロマトグラフイーを使用したことがな
かつた。標準的な溶出方法である酸による溶出
は、ガンマ−インターフエロンの基礎検定の１つ
が酸の存在下での不活化試験を包含するという事
実からして、ほとんど実施不可能な方法であつ
た。さらに、抗原−抗体複合体を解離させうる他
の既知物質（例えばチオシアン酸カリウムおよび
尿素）の多くもまたガンマ−インターフエロンを
不活化することが知られていた。 当技術分野は、アフイニテイクロマトグラフイ
ーを用いるよりむしろ、複雑な多工程の精製法へ
と向かつた。例えば、欧州特許公開第63482号明
細書はガンマ−インターフエロン含有溶液を制御
された多孔質ガラスビーズカラム、コンカナバリ
ンＡ−セフアロースまたはヒラマメレクチン−セ
フアロースもしくはエンドウマメレクチン−セフ
アロースカラム、ヘパリン−セフアロースまたは
プロシアンレツド−セフアロースカラム、および
ゲル濾過カラムに通すことを含む４工程精製法
（中性または塩基性PHで行なわれる）を報告して
いる。同様に、Yip、Y.K.、Barnowclough、B.
S.、Urban、C.、およびVilcek、J.、による
Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）、第79巻、1820〜
1824頁、1982年３月は制御された多孔質ガラスへ
の第１の吸着およびそれからの溶出、コンカナバ
リンＡ−セフアロースへの第２と吸着およびそれ
からの溶出、およびその後のPH8.0での夾雑蛋白
質のDEAE−セフアセルへの吸着除去を含むガン
マ−インターフエロンの３工程精製法を報告して
いる。 発明の概要 当技術分野のこの状態を顧慮して、本発明の目
的はガンマ−インターフエロンを精製するための
改良方法を提供することである。より詳細には、
本発明の目的は抗体アフイニテイクロマトグラフ
イーを用いるガンマ−インターフエロンの精製法
を提供することである。さらに、本発明の目的は
ガンマ−インターフエロンを酸溶出によつて抗体
カラムから取り出す抗体アフイニテイクロマトグ
ラフイーを提供することである。本発明のさらに
他の目的は酸不活化ガンマ−インターフエロンの
再活性化方法を提供することである。 これらの目的を達成するために、本発明は酸性
状態がガンマ−インターフエロンを確かに不活化
するけれども、そのインターフエロンは制御され
たPHおよび温度で長時間インキユベートすること
によつて再活性化され得ることを見出した。より
詳細には、酸不活化ガンマ−インターフエロン
は、もしそれが約5.5〜9.5のPHおよび約２〜８℃
の温度に少なくとも24時間保持されるならば、も
との生物学的活性の実質的部分を回復するだろう
ということがわかつた。本発明の好適な実施態様
では、その再活性化方法は約6.0〜9.0のPHおよび
約４℃の温度で約96時間実施される。 この再活性化方法を用いて、本発明は初めてガ
ンマ−インターフエロンの精製に抗体アフイニテ
イクロマトグラフイーの使用を可能にする。詳細
には、次の工程： (a) ガンマ−インターフエロンに対する１種また
はそれ以上の抗体を調製すること； (b) １種またはそれ以上の抗体を固体支持体に固
定すること； (c) ガンマ−インターフエロンを含有する第１溶
液と１種またはそれ以上の固定した抗体とを接
触させて、ガンマ−インターフエロンと１種ま
たはそれ以上の固定した抗体との間に固定した
抗体−抗原複合体を形成すること； (d) 固定した抗体−抗原複合体から第１溶液を分
離すること； (e) 固定した抗体−抗原複合体と酸性PHをもつ第
２溶液とを接触させて、ガンマ−インターフエ
ロンを１種またはそれ以上の固定した抗体から
第２溶液中に解離すること（この場合、前記第
２溶液の酸性度は解離したガンマ−インターフ
エロンを部分的にまたは完全に失活させる作用
を有する）； (f) １種またはそれ以上の固定した抗体から第２
溶液を分離すること； (g) その第２溶液のPHを約5.5〜9.5に調節し、次
いでPH調節した溶液を約２〜８℃の温度で少な
くとも24時間インキユベートすることにより第
２溶液中のガンマ−インターフエロンの活性の
いくらかまたは全てを回復させること； からなるガンマ−インターフエロンの精製法が本
発明により提供される。精製法の好適な実施態様
において、再活性化は約6.0〜9.0のPHおよび約４
℃の温度で約96時間実施される。 図面の説明 第１図はPH2.4で１時間インキユベートしたヒ
トガンマ−インターフエロンの再活性化を示すグ
ラフである。より詳細には、部分精製したヒトガ
ンマ−インターフエロン（比活性２×104u／mg）
をクエン酸緩衝液（最終PH＝2.4）中に１：100の
割合で希釈し、氷上で60分間インキユベートし
た。アリコート10mlはNaOHを用いてPH6.9（０）
に；固体トリスを用いてPH7.5（＋）に；固体トリ
スを用いてPH8.25（＊）に：そして固体トリスを
用いてPH9.1（×）にPH調節した。この実験のため
の対照は標準検定媒体（PH7.2）中の同一インタ
ーフエロンの１：100希釈物であつた。対照は酸
性化しかつPH調節した溶液と正確に同じ方法で４
℃において氷上でインキユベートした。０日目の
試料は塩基でのPH調節の２時間後に検定された。 第２図は第１図に記載した溶液の絶対力価を示
すグラフである。対照のデータ点（＃）；その他
の溶液のデータ点は第１図と同じ。 第３図はPH2.4で８日間インキユベートしたヒ
トガンマ−インターフエロンの再活性化を示すグ
ラフである。より詳細には、ヒトガンマ−インタ
ーフエロンのもとの酸性化混合物（第１図および
第２図）を４℃で８日間インキユベートした後、
NaOHを用いてPH6.6（０）に；固体トリスを用い
てPH8.25（＋）に；固体トリスを用いてPH8.55
（＊）に；そして固体トリスを用いてPH9.1（×）
にPH調節した。この実験のための対照は第１図に
関して先に述べたものと同じであつた。 第４図は第３図に記載した溶液の絶対力価を示
すグラフである。対照のデータ点（＃）；その他
の溶液のデータ点は第３図と同じ。 第５図および第６図は全蛋白質濃度、イオン強
度および最終PHを制御した条件下でのガンマ−イ
ンターフエロンの酸による不活化およびPH調節を
示すグラフである。より詳細には、部分精製した
ガンマ−インターフエロンをCAB（PH2.4）中に
１：100の割合で希釈し、氷上で60分間インキユ
ベートし、次いで固体トリス（最終濃度約1M）
を用いてPH8.2に調節した。その後この溶液を４
℃でインキユベートして、０日目（４時間後）、
３日目および７日目に力価を測定した。対照は
CAB＋トリス（約1M）、PH8.2中に１：100の割
合で希釈して４℃でインキユベートした。第５図
は対照のパーセントとして表わされる酸性化しか
つPH調節した試料の力価を示す。第６図は酸性化
試料（０）および対照試料（×）の絶対力価を示
す。 第７図および第８図は全蛋白質濃度、イオン強
度および最終PHを制御した条件下でのガンマ−イ
ンターフエロンの酸による不活化およびPH調節を
示すグラフである。より詳細には、部分精製した
ガンマ−インターフエロン１mlを10N Hcl0.010
mlでPH2.1に酸性化し、氷上で60分間インキユベ
ートした。次いでこの溶液0.1mlを検定媒体9.9ml
に加えた。対照試料は氷上で60分間インキユベー
トし、次いでこの試料0.1mlを検定媒体9.9mlに加
えた。その後、両試料は４℃で貯蔵し、図に示す
時期に力価を測定した。第７図は対照のパーセン
トとして表わされるHcl−酸性化しかつPH調節し
た試料の活性を示す。第８図は酸性化試料（０）
および対照試料（×）の絶対力価を示す。 第９図はガンマ−インターフエロンを精製する
ために用いられたポリクローナル抗体カラムから
の溶出分画のウエスターンブロツト分析
（Western blot analysis）を示す。 第１０図はガンマ−インターフエロンを精製す
るために用いられたモノクローナル抗体カラムか
らの溶出分画のウエスターンブロツト分析を示
す。 発明の開示 上述のごとく、本発明は酸−不活化したガンマ
−インターフエロンを再活性化するための方法、
および抗体アフイニテイクロマトグラフイーによ
るガンマ−インターフエロンの精製における前記
方法の使用に関する。 その再活性化方法は(a)PHが約5.5〜9.5の溶液中
にガンマ−インターフエロンを入れること；およ
び(b)その溶液を約２〜８℃の温度で少なくとも24
時間インキユベートすること；の各工程から成つ
ている。好ましくは、その溶液はPHが約6.0〜9.0
であり、温度は約４℃である方がよい。インキユ
ベーシヨンの時間は４時間程度の短時間でもガン
マ−インターフエロン活性の有意な部分を回復さ
せるのに役立つが、約24〜96時間程度が好適であ
り、96時間程度が最適である。活性化溶液は5.5
〜9.5のPHをもつ以外に、必ずしも必要ではない
が、適度のイオン強度（例えば約0.1〜0.5程度）
および適度の蛋白質濃度（例えば約0.05〜2.0
mg／ml程度）をもつことが望ましいと考えられ
る。 アフイニテイクロマトグラフイー法は次の工
程：(a)ガンマ−インターフエロンに対する１種ま
たはそれ以上の抗体の調製；(b)クロマトグラフイ
ーカラムの形体の固体支持体へこれらの抗体を固
定すること；(c)ガンマ−インターフエロン含有溶
液をそのカラムに適すこと；(d)酸を用いてそのカ
ラムからガンマ−インターフエロンを溶出するこ
と；および(e)再活性化方法を用いてガンマ−イン
ターフエロンを再活性化すること；を包含する。 ガンマ−インターフエロンに対する抗体は当技
術分野で知られた多くの方法で調製することがで
きる。例えば、ポリクローナル抗体はBenedict、
A.A.、らによる“抗血清の産生”、Methods in
Immunology、１：197〜306（1967）に記載され
た方法によつて作ることができ、モノクローナル
抗体はMethods in Enzymology、第92巻、第１
部（1983年）に記載された方法で作ることができ
る。一般に、モノクローナル抗体はそれらの特異
性ゆえに本発明方法で使用するのに適している。
ガンマ−インターフエロンに対するモノクローナ
ル抗体の特に好適な産生方法は以下の実施例３に
記載する。 ひとたび抗体が得られると、それらは当技術分
野でよく知られた数多くの方法で固体支持体へ共
有結合で結合される。例えば、固定化は臭化シア
ンで活性化されたセフアロース4B（ニユージヤー
ジー州、ピスカタウエイ、Phormacia）、トリサ
クリル（メリーランド州、ベテスダ、LKB）ま
たは類似の物質においてなされる。これらの支持
体への抗体の共有結合は、これらの製品の製造業
者により提供される製品パンフレツトに記載され
ている。例えば、臭化シアン活性化セフアロース
4Bへの結合は単に0.5M炭酸ナトリウム緩衝液
（PH8.0）中で抗体とその固体支持体とをインキユ
ベートすることを含む。臭化シアン活性化セフア
ロース4Bは、今日までのその広い使用ゆえに、
本発明での使用に特に適した支持体であると考え
られる。 精製しようとするガンマ−インターフエロンは
種々の方法で調製することができる。１つの適当
な方法はJohnsonらのMethods in Enzymology、
第78巻、158〜162頁（1981年）に記載されてい
る。他の方法は先に示した欧州特許公開第63482
号明細書に見出せる。ガンマ−インターフエロン
の特に好ましい精製方法は本発明と同一出願人に
よる1982年12月２日付米国特許出願第446160号明
細書に記載されている。 抗体アフイニテイクロマトグラフイーは他の精
製方法の助けを借りずにガンマ−インターフエロ
ンを精製することができるので、カラムに加えら
れるガンマ−インターフエロン含有溶液は未精製
のものであるのが好ましい。未精製のガンマ−イ
ンターフエロンはカラムにかかる荷重容量を減ず
るために、例えば中空フアイバーフイルターを用
いて濃縮（例えは100×）するのが好適である。
もちろん、所望により、ガンマ−インターフエロ
ン含有溶液はカラムに加える前に制御された多孔
質ガラスビーズまたはケイ酸ビースへの吸着、お
よび／またはDEAE−セフアセルもしくは類似の
物質でのイオン交換クロマトグラフイーのような
技術により部分的に精製されてもよい。 結合したガンマ−インターフエロンをポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体カラムから溶出
するのに用いられる酸溶液は様々なPHおよび様々
な組成をもつことができる。適当な溶出液の例に
は0.1Mクエン酸、PH2.0；1Mプロピオン酸、PH
2.5；および0.1Mグリシン、PH3.0がある。 本発明は次の実施例によつて十分に開示される
が、いかなる方法も本発明を限定するものではな
い。 実施例 １ 酸により不活化したガンマ−インターフエロン
の再活性化方法および物質 １ ガンマ−インターフエロンの調製 ガンマ−インターフエロンは先に示した米国
特許出願第446160号明細書に記載の方法に従つ
て調製した。要約すると、健康な血液提供者
（ペンシルバニア州、フライデルフイア、赤十
字社）からのプールされたヒトバツフイコート
（buffycoat）が遠心分離、その後の大部分の血
小板および赤血球の除去により調製された。白
血球はRPMI媒体、5μｇ／mlのPHA（ウイスコ
ンシン州、ミルウオーキー、Ｐ−Ｌ
Biochemicals）および1.25mg／mlのヒト血清を
含む溶液中に直径が150mmのペトリ皿あたり106
個の細胞で採置した。培養物は５％CO2雰囲気
中37℃で４日間インキユベートし、その上澄み
を採取し、遠心分離により細胞破片を除いて澄
明化し、そしてペリコン中空フアイバー濃縮機
（ニユージヤージー州、ワーシントン、
Millipore）で約100倍に濃縮した。得られた生
成物は本明細書において“未精製の濃縮ガンマ
−インターフエロン”と呼ばれる。 ２ 部分精製 未精製の濃縮ガンマ−インターフエロン（約
500000μ／ml、100mg／ml蛋白質）を１×PBS
（0.15M NaCl、20ｍＭ燐酸ナトリウム、PH7.2）
で洗浄したケイ酸（ミズリー州、セントルイ
ス、Sigma）カラムに通した。ガンマ−インタ
ーフエロンは40％エチレングリコール（Fisher
Scientific）、1.5M NaClおよび20ｍＭ燐酸ナ
トリウム、PH7.2を用いてこのカラムから溶出
した。溶出された物質の比活性は約２×104μ／
mgであつた。溶出された物質は１×PBSに対
して透析され、アリコートに分けて−70℃で凍
結貯蔵した。 ３ 抗ウイルス検定 ガンマ−インターフエロンの抗ウイルス活性
は、HEp−２細胞およびチヤレンジウイルス
としてのVSVを用いる細胞変性作用阻害検定
で測定した。未知試料の力価が計算され、そし
て社内の標品に対して補正された。 ４ 酸による不活化 Ａ 方法１ 上記のようにして調製した部分精製のガンマ
−インターフエロン（比活性約２×104μ／mg）
を、0.3M NaClおよび0.1Mクエン酸から成る
クエン酸緩衝液（CAB）での１：100希釈によ
り最終PH2.4へ酸性化した。全ての溶液の温度
を４℃に保つて、諸成分の混合を氷上で行なつ
た。酸性化した後、インターフエロン含有溶液
は以下に示す時間の間４℃でインキユベートし
た。 Ｂ 方法２ 上記のようにして調製した部分精製のガンマ
−インターフエロン（比活性約２×104μ／mg）
を10N HClの添加によりPH2.1へ酸性化した。
全ての溶液の温度を４℃に保つて、諸成分の混
合を氷上で行なつた。酸性化した後、インター
フエロン含有溶液は以下に示す時間の間４℃で
インキユベートした。 ５ 酸性化した溶液のPH調節 酸インキユベーシヨン後、インターフエロン
含有溶液のPHを10N NaOH、固体トリスまた
は検定媒体を用いていろいろな最終PHへ調節し
た。各溶液はPH調節の間氷上に置かれ、そして
塩基添加後穏やかに渦を発生させた。RPMI
（Gibco）から成る標準検定媒体にはＬ−グル
タミン、アミノ酸類、ビタミン類、炭酸水素ナ
トリウムおよび約１mg／mlまでの生まれたばか
りのウシ血清を補足した。 ６ PH調節した溶液のインキユベーシヨン PH調節後、各溶液を滅菌濾過し、４℃のとこ
ろに配置し、そして以下に示す時間その温度に
保持した。 結 果 酸による失活および高いPHでの短時間インキユベ
ーシヨンの実質的活性回復不能 上述のごとく、ガンマ−インターフエロンの活
性が酸処理によつて初期の値の約10％に急速に低
下することはよく知られている。この作用および
高いPHでの短時間インキユベーシヨンの実質的活
性回復失敗についてのデータを第１表に示す。 【表】 実験１〜４において、ガンマ−インターフエロ
ン含有溶液はクエン酸緩衝液で100倍に希釈し
（最終PH2.4）、氷上で60分間インキユベートし、
次いで10N NaOHまたは固体トリスを用いて第
１表に示す高いPHへPH調節した。PH調節および４
℃でのインキユベーシヨンの２時間後、活性はガ
ンマ−インターフエロンの別の試料を検定媒体
（50ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液、PH7.2）で
100倍に希釈して４℃で２時間インキユベートす
ることにより調製した対照の21.3％（最高）から
8.2％（最低）までの範囲であつた。 実験５〜８において、実験１〜４の試料と同じ
方法で調製した試料（最終PH2.4）は４℃で８日
間貯蔵し、次いでNaOHまたはトリスでPH調節
した。この場合もまた、高いPHでの短期間インキ
ユベーシヨン（３時間）後に測定した活性は同一
条件下に貯蔵した対照の活性と比較して13.6〜
6.3％と低かつた。 実験９において、CAB処理した試料はトリス
でPH8.2へ調節しかつ４℃で４時間インキユベー
トした後に対照活性の21％を示した。実験10にお
いて、10N HClで酸処理したガンマ−インター
フエロン（最終PH2.1）は、検定媒体で100倍に希
釈することによりPH調節しかつ４℃で４時間イン
キユベートした後に対照活性の32％を回復した。 上記実験で用いたガンマ−インターフエロン調
製物は抗ガンマ−インターフエロン抗血清によつ
て完全に中和されるが、抗アルフア−インターフ
エロンまたは抗ベータ−インターフエロン抗血清
によつては中和されないことが見出された。従つ
て、これらの実験における全ての抗ウイルス活性
はガガンマ−インターフエロンのみに帰因する。 高いPHでの長期間インキユベーシヨンによる酸不
活化ガンマ−インターフエロンの完全再活性化 ガンマ−インターフエロンはその１ml試料を
CABで100倍に希釈し（最終PH2.4）、氷上で60分
間インキユベートすることにより酸不活化した。
同時に、１ml対照試料は検定媒体（PH7.2）で100
倍に希釈して同様に氷上でインキユベートした。 酸性化試料は４つの等しいアリコートに分け、
10N NaOH（PH6.9試料）または固体トリス（PH
7.5、8.25および9.1の各試料）でPH調節した。４
℃で２時間インキユベーシヨン後、各試料は抗ウ
イルス活性について検定した（第１表の実験１〜
４および上記論文を参照されたい）。対照を含む
全ての試料はその後滅菌濾過して４℃でインキユ
ベートした。周期的な間隔をおいて各試料を抗ウ
イルス検定のために取り出した。 第１表（実験１〜４）に示すごとく、かつまた
先に論じたごとく、対照のパーセントとして表わ
されるPH調節した試料の活性は４℃で２時間イン
キユベーシヨン後に8.2〜21.3％と低かつた。し
かしながら、第１図に示すように、溶液の最終調
節PHにかかわらず４℃で４日間インキユベーシヨ
ン後にほとんど完全な活性回復が達成された。４
℃で１日後には４つの試料のうち３つが対照活性
の約60％の活性を示した。PH調節後４日までに全
ての試料は対照活性の約100％を示した。 第２図に示すように、全ての酸処理した試料の
力価は開始時点（２時間）後に増加し、これに加
えて対照試料の力価は実験の期間中大体一定のま
まであつた。このことは対照試料の活性の漸次衰
退および酸処理した試料の比較的一定の低水準活
性が存在することに対立するものとして真の再活
性化がおこつたことを示している。 同じ結果は60分間酸処理（第１表の実験１〜
４）した同じガンマ−インターフエロンをPH2.4
でCAB中８日間さらにインキユベート（第１表
の実験５〜８）した場合にも得られた。第１表に
示すように、6.6、8.25、8.55および9.1へPH調節
して３時間後に低水準の活性（対照の6.3〜13.6
％）が観察された。しかし、第３図に示すよう
に、高いPHおよび４℃でのインキユベーシヨンの
３日後に２つの試料（PH8.25およびPH9.1）は対
照活性の約80％を示し、第３番目の試料（PH
8.55）は約60％そして第４番目の試料（PH6.6）
は約40％を示した。この場合も、酸処理した試料
の力価は最初の時点（３時間目）から増加を示
し、対照試料（第１図のものと同じ）の力価は実
験の期間中大体一定であつた（第４図参照）。 第１〜４図に示した２組の実験において、酸処
理しかつPH調節した試料は蛋白質濃度およびイオ
ン強度について制御されていなかつた。両方の組
の実験において、対照試料は約1.3mg／mlの最終
蛋白質濃度であつたが、一方酸処理した試料は
0.3mg／mlの蛋白質濃度であつた。これらの実験
における対照試料のイオン強度は生理食塩液（約
0.15）に近いが、酸処理した試料のイオン強度は
CAB希釈物が0.3M NaClおよび0.1Mクエン酸を
含みかつPH調節で約1Mまでのトリス塩基または
約0.01MまでのNaOHが加えられたのでより高か
つた。 再活性化方法で変動しうるイオン強度および蛋
白質濃度の作用を調べるために、第１表の実験９
および10が行なわれた。 実験９において、ガンマ−インターフエロンは
CABで100倍に希釈し（最終PH2.4）、氷上で60分
間インキユベートし、次いでトリスを用いて最終
PH8.2へPH調節した。この実験のための対照は
CAB＋トリスで100倍に希釈されたガンマ−イン
ターフエロン（PH8.2）であつた。従つて、酸処
理した試料および対照試料の蛋白質濃度（0.3
mg／ml）、イオン強度（0.5）および最終PH
（8.2）は同じであつた。 各試料は４℃で７日間インキユベートし、第５
図に示す時間に検定した。PH調節の４時間後、酸
処理した試料のパーセント活性は対照の21％であ
つた。４℃でのインキユベーシヨンの３日後、そ
の活性は対照の84％まで上昇し、そして７日後に
は対照の87％であつた（第５図）。前の実験と同
様に、酸処理した試料の力価は時間とともに増加
し、かつ対照試料の活性には何ら衰退が表われな
かつた（第６図）。 第１表の実験10において、１mlのガンマ−イン
ターフエロン溶液は0.010mlの10N HClで酸性化
した（最終PH2.1）。氷上で60分間インキユベーシ
ヨン後、その酸性化試料を検定媒体で100倍に希
釈して４℃でインキユベートした。この実験のた
めの対照は同じ１mlガンマ−インターフエロン溶
液を検定媒体で100倍に希釈したものであつた。
この実験の場合も、蛋白質濃度（1.3mg／ml）、イ
オン強度（0.15）および最終PH（7.2）は試料
および対照において同一であつた。 第７図に示すように、PH調節の４時間後に試料
の活性は対照の32％であつた。４℃でのインキユ
ベーシヨンの７日後に、PH調節した試料はその活
性の全て（118％）を回復した。開始時点（４時
間目）からの力価の増加ならびに比較的一定の対
照力価がこの場合にも観察された（第８図）。 前述のデータは酸失活したガンマ−インターフ
エロンの再活性化が高いPHおよび制御された温度
での長期間インキユベーシヨンによつて達成され
得ることを明瞭に立証している。その再活性化は
イオン強度および蛋白質濃度を制御した条件およ
び制御しない条件の両条件下でおこる。 実施例 ２ ポリクローナル抗体を用いてのガンマ−インタ
ーフエロンの精製 ガンマ−インターフエロンを精製するためのポ
リクローナル抗体カラムは次の方法で作製され
た。 １ Interferon Sciences社（ニユージヤージー
州、ニユーブルンスウイツク、カタログNo.
3710）から入手できるアフイニテイ−精製した
ウサギの抗ガンマ−インターフエロンIgGは、
先に示した米国特許出願第446160号記載のガン
マ−インターフエロン調製方法により調製され
た未精製品中に通常見出せる主な夾雑物（例え
ばヘモグロビン、IgGおよび類似のもの）を含
む蛋白質−セフアロースカラムでクロマトグラ
フ処理された。この方法によつて、夾雑物に対
する抗体はカラムに吸着され、一方ガンマ−イ
ンターフエロンに対する抗体はカラムを通過し
た。非抗ガンマ−インターフエロン抗体を出来
るだけ多く除去するために少なくとも３サイク
ルのクロマトグラフ処理を行なつた。 ２ 工程１で単離した抗ガンマ−インターフエロ
ン抗体は、その抗体と臭化シアン活性化セフア
ロース4Bゲルとを0.5M炭酸ナトリウム緩衝液
（PH8.0）中で一晩インキユベートすることによ
り、ゲル１mlあたり抗体10mgの濃度でそのゲル
に結合させた。 上記工程によつて得られたカラムは次の方法で
ガンマ−インターフエロンを精製するために使用
された。 １ 氷冷および滅菌濾過した未精製の濃縮ガンマ
−インターフエロン（実施例１のようにして調
製した）を１ml／分の流速のもと４℃で上記抗
体カラムに装填した。 ２ その後、カラム流出液が≦0.01のA280読み
とりを有するまでそのカラムを１×PBSで広
範囲に洗浄した。 ３ ガンマ−インターフエロンは次いで氷冷した
クエン酸緩衝液（0.1Mクエン酸、0.3M NaCl、
PH2.0）を用いてカラムから溶出した。 ４ 工程３で得た氷冷した溶出分画にPHが9.0に
なるまで固体トリス（カリフオルニア州、リツ
チモンド、Bio−Rad）を加えた。 ５ PH調節した溶出分画は次いで滅菌濾過して再
活性化をおこさせるために４℃のところに配置
した。 代表的実験の上記方法で得た種々の分画に見出
されたガンマ−インターフエロン活性第２表に示
す。カラムのガンマ−インターフエロン結合部位
を完全に飽和させるために、初め大過剰のガンマ
−インターフエロン（400×106単位）がそのカラ
ムに装填された。流出した物質（300×106単位）
は保存して次の実験の装填物質として使用した。 この実験における単位の全回収率は94％であ
り、そして≧５×106単位／mgの比活性が溶出分
画について得られた。このことはカラムに加えた
未精製の濃縮ガンマ−インターフエロンの1000倍
精製を意味する。 【表】 溶出分画に見出された活性がアルフア−インタ
ーフエロンまたはベータ−インターフエロン活性
に対立するものとしてガンマ−インターフエロン
活性を表わすということは、アルフア、ベータお
よびガンマ−インターフエロンに特異的な抗体の
使用により立証された。この分析によれば、溶出
分画の活性はInterferon Sciences社（ニユージ
ヤージー州、ニユーブルンスウイツク、カタログ
No.1750）で作られた抗アルフア−インターフエロ
ン抗体、またはCetus Corporation（カリフオル
ニア州、エメリービル）で作られた抗ベータ−イ
ンターフエロン抗体のどちらによつても中和され
ないが、Interferon Sciences社（カタログNo.
3800）およびニユージヤージー州、ニユーヨーク
のthe Sloan−Kettering Instituteの両社で作ら
れたモノクローナル抗ガンマ−インターフエロン
抗体によつて完全に中和されることが見出された
（B.Y.RubinらのJournal of Immunology第130
巻、1019ページ、1983年を参照されたい）。 ポリクローナル抗体カラムから溶出されたガン
マ−インターフエロンの物理的ならびに化学的純
度を調べるために、次の方法を用いてウエスター
ンブロツト分析（W.H.BurnetteのAnal.
Biochem.、112：195（1981）を参照されたい）が
行なわれた。最初に、溶出分画の２つの試料を
SDS処理して、10−20％ポリアクリルアミドゲル
勾配で分子量マーカー蛋白質の４つの試料と平行
して電気泳動にかけた（溶出試料はレーン２およ
び５であり；マーカー蛋白質はレーン１、３、４
および６である；レーン１，２および３はそれぞ
れレーン４，５および６に等しい。）。電気泳動し
た試料は次にニトロセルロースのシートに電気泳
動的に移した（H.Towbin、T.Stehelinおよび
GordonによるJ.PNAS、76：4350（1979年）を参
照されたい。）。ニトロセるロースシート上の蛋白
質バンドは免疫学的染色法（A.L.DeBlasおよび
H.M.CherwinskiによるAnal.Biochem.、133：
214（1983年）を参照されたい。）により次のよう
にして視覚化された。 (1) ニトロセルロースシートを半分に切つて、レ
ーン１、２および３を含むパートＡはガンマ−
インターフエロンを特異的に認識する
Interferon Sciences社で作られたマウスのモ
ノクローナル抗体（カタログNo.3800）と一晩イ
ンキユベートした。 (2) レーン４、５および６を含むニトロセルロー
スシートの残りの半分パートＢはモノクローナ
ル抗体を含まない対照緩衝液中で一晩インキユ
ベートした。 (3) ニトロセルロースシートの両半分は次いでヤ
ギの低マウスポリクローナル抗体（ペンシルバ
ニア州、コクランビル、Cappel研究所）と共
にインキユベートした。 (4) 両半分は次にペルオキシダーゼ酵素およびマ
ウスのモノクローナル抗ペルオキシダーゼから
成る分子複合体（PAP）（メリーランド州、ジ
ヤレツトビル、Sternberger−Meyer）と共に
インキユベートした。 (5) 最後に両半分はニトロセルロースシート上に
黒色バンドを発現させるために過酸化水素およ
び３，3′−ジアニノベンジジン（DAB）と共
にインキユベートした。 この方法によれば、パートＡのレーン２に現わ
れるがパートＢのレーン５に現われないバンドは
ガンマ−インターフエロンに特異的なバンドを表
わす。一方、レーン２および５の両方に現われる
バンドはガンマ−インターフエロン以外のものに
特異的である。 上記のようにして得られた溶出分画の結果を第
９図に示す。この図からわかるように、ガンマ−
インターフエロンに特異的なバンドは15.5K、
17K、21K、30K、32K、34Kおよび38Kダルトン
の分子量位置に現われる。第９図のレーン２にお
ける全バンド数に対するガンマ−インターフエロ
ンに特異的なバンド数に基づいて、かつガンマ−
インターフエロンの理論的比活性が約１×107μ／
mgである（P.AndersonらによるJournal of
Biological Chemistry、第258巻、6497〜6502頁
（1983年）を参照）と仮定して、これらのデータ
はポリクローナル抗体カラムでのクロマトグラフ
イーにより得られたガンマ−インターフエロンが
約50％純度であることを示した。 実施例 ３ ガンマ−インターフエロンに対するモノクロー
ナル抗体の調製 ヒトガンマ−インターフエロンに対するモノク
ローナル抗体は次のようにして得られた。 最初に、Bal ｂ／ｃマウスは500μｇ／mlのイ
ンターフエロンを含むリポソーム懸濁液0.2mlづ
つで一週間おきに４回腹腔内注射により免疫し
た。このマウスは最後のリポソーム注射の６ケ月
後に不完全なフロインドアジユバント
（Freunds′ adjuvant）中のインターフエロン
100μｇの促進を受け、その後さらに12ケ月間休
ませ、この間抗インターフエロンの力価は５×
103中和単位／ml以上存在していた。最後に、こ
のマウスは不完全なフロインドアジユバント中の
精製ガンマ−インターフエロン25〜50μｇで腹腔
内注射により促進された。これらの免疫化に使用
したヒトガンマ−インターフエロンは前記方法に
よつて得られ、最初の５回の注射に対しては約１
×105単位／mgの活性を有し、最後の注射に対し
ては約５×106単位／mgの活性を有していた。 最後の注射の３日後、マウスからの脾臓細胞を
４匹の照射された受容体Bal ｂ／ｃマウスに静
脈内注射した。P.C.Fox、E.H.Barensteinおよび
R.P.Siraganianによる“抗原特異的なハイブリ
ドーマの頻度を高めることについて“Eur.J.
Immunol.、11：431〜434（1981）を参照された
い。各マウスは不完全なフロインドアジユバント
中のガンマ−インターフエロン（５×106単位／
mg）25〜50μｇの腹腔内促進を受けた。５日後こ
れらのマウスからの脾臓細胞は融合のために使用
された。 NS−１−503ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）は
35％PEG1000により脾臓細胞と融合させた。M.
L.Gefter、D.H.MarguliesおよびM.D.Scharffに
よる“マウスのミエローマ細胞のポリエチレング
リコールにより促進された簡単なハイブリダイゼ
ーシヨン法”Somatic Cell Genetics、３、231
〜236（1977）、およびT.Kawamoto、J.D.Sato、
A.Le、D.B.McClureおよびG.H.Satoによる
“NS−１マウスのミエローマ細胞の増殖用血清不
含倍値の開発およびNS−２ハイブリドーマの単
離へのその適用”Analytical Biochemistry、
130：445〜453（1983）を参照されたい。融合細胞
は96のウエルプレート（well plate）に採置し
た。２〜３週間後に陽性ウエルは希釈を限定する
ことによりクローン化された。 融合細胞によつて産生されたモノクローナル抗
体の特異性は中和検定、沈降検定、ウエスターン
ブロツト分析およびアフイニテイクロマトグラフ
イーにより決定された。この抗体はヒトガンマ−
インターフエロンに対して特異的であつて、ヒト
アルフアまたはベータ−インターフエロンには結
合しないことがわかつた、前記方法により産生さ
れたモノクローナル抗体はInterferon Sciences
社（カタログNo.3800）から市販されている。 実施例 ４ モノ ローナル抗体を用いてのガンマ−インタ
ーフエロンの精製 ガンマ−インターフエロンを精製するためのモ
ノクローナル抗体カラムは次の方法で作製され
た。 (1) 実施例３により産生されたガンマ−インター
フエロンに対するモノクローナル抗体は、ヒツ
ジの抗マウスIgG（ペンシルバニア州、コクラ
ンビル、Cappel研究所）を含むカラムでアフ
イニテイクロマトグラフイーにより精製した。 (2) 精製したモノクローナル抗体は、実施例２に
おいて上述した方法を用いてゲル１mlあたり抗
体10mgの濃度で臭化シアン活性化セフアロース
4Bへ結合させた。 完成したカラムはポリクローナル抗体カラムに
ついての実施例２で上述した方法によりガンマ−
インターフエロンを精製するのに用いた。 代表的実験のデータを第３表に示す。22×106
単位のガンマ−インターフエロンが≧１×107単
位／mgの比活性でこのカラムから溶出された。全
回収率は62％であつた。 第１０図は上記カラムから得られた溶出分画の
ウエスターンブロツト分析の結果を示す。この分
析において用いた方法は第９図について上述した
方法と同じであつた。ガンマ−インターフエロン
に特異的なバンド（パートＡ）は15.5K、17K、
21K、30K、32K、34K、38Kおよび40Kダルトン
の分子量位置に見出せる。唯一の夾雑物は臭化シ
アン活性化セフアロース4Bゲルに結合された抗
体に通常観察されるような、カラムから漏出した
少量のマウスIgGの重鎖（50K）であると思われ
る。 観察された比活性≧１×107単位／mgおよびウ
エスターンブロツト分析はともにカラムから溶出
されたガンマ−インターフエロンがほとんど純粋
であることを立証する。 実施例２および４の結果は、高純度のガンマ−
インターフエロンを酸溶出を用いることにより抗
体カラムから取り出すことができ、かつガンマ−
インターフエロン活性のほとんど完全な回復がPH
調節および実施例１に記載した条件下でのインキ
ユベーシヨンにより得られることを明瞭に示して
いる。 【表】 本発明の特定の実施態様を記載しかつ例示して
きたが、本発明の精神および範囲から逸脱するこ
となく変更が可能であることは理解されるべきで
ある。例えば、例示したものに加えて他の塩基性
物質がインターフエロン含有溶液のPHを調節する
のに用いられる。同様に、例示したもの以外の
種々のクロマトグラフイーカラムおよび抗体調製
物が本発明を実施するのに用いられる。
にモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使
用してガンマ−インターフエロンを精製する方法
に関する。 (2) 従来技術 免疫またはガンマ−インターフエロンは初期の
頃酸処理および／または56℃への加熱に対するそ
の不安定性ゆえに、タイプインターフエロンと
して物理的基準で分類された。この操作上の分類
は、一般に酸または熱に対して安定なウイルス由
来のタイプインターフエロン（アルフアおよび
ベータ）とこのタイプインターフエロンとを区
別した。主なインターフエロン型（アルフア、ベ
ータおよびガンマ）の各々に対する特異な抗血清
の広範な利用可能性の結果として、各型の分類お
よび区別は今や通常血清学的または免疫学的方法
で行なわれる。それにもかかわらず、ガンマ−イ
ンターフエロン調製物はまだ酸処理の際のそれら
の急速な不活化によつて同定されている。The
Interferon System、第２版、W.E.Stewart、
スプリンガー−バーラーグ、ニユーヨーク
（1981）を参照されたい。 一般に、ガンマ−インターフエロンの同定に用
いられる酸不活化法はガンマ−インターフエロン
含有溶液のPHを約２に下げること、このPHで短時
間（２、３分ないし数時間）インキユベートする
こと、次いで塩基の添加またはPBSに対する透
析によりそのPHを中性にすることを包含する。こ
のような処理後の活性回復は通常対照活性の約10
％である。本出願人の知る限りでは、酸処理後の
ガンマ−インターフエロンの抗ウイルス活性を10
％より著しく高い水準まで回復させることを示す
報告は今日まで一件もない。 選択された生物学的物質の精製溶液を得るため
に用いられる強力な手段の１つに、抵抗アフイニ
テイクロマトグラフイー（antibody
affinitychromatography）がある。この方法に
よれば、精製しようとする生物学的物質に対する
抗体を共有結合で固定して含有するクロマトグラ
フイーカラムが準備され、そしてこの生物学的物
質と夾雑物とを含む溶液がこのカラムの中を通さ
れる。固定された抗体はカラムに残存する生物学
的物質と抗原−抗体複合体を形成し、一方夾雑物
の大部分を含む溶液の残部はそのカラムを通過す
る。固定された抗体からその選択された生物学的
物質を遊離させるために、抗原−抗体複合体を解
離させうる第２溶液がそのカラムの中を通され
る。種々の物質（例えばチオシアン酸カリウム、
尿素、グアニジン塩酸塩など）がこの解離を達成
させるためにその第２溶液中に加えられるが、最
も一般的に用いられる方法ただ単にその溶液を酸
性化することである。 本発明以前には、ガンマ−インターフエロンの
酸による失活が知られていたので、抗体アフイニ
テイクロマトグラフイーはこの重要な生物学的物
質を精製するのに用いられたことがなかつた。す
なわち、クロマトグラフイーカラムに固定させう
るガンマ−インターフエロンの抗体は入手できる
けれども、抗体カラムからこのインターフエロン
を生物学的活性のほとんどを破壊することなく溶
出する方法が全く知られていなかつたので、当技
術分野ではガンマ−インターフエロンにこのアフ
イニテイクロマトグラフイーを使用したことがな
かつた。標準的な溶出方法である酸による溶出
は、ガンマ−インターフエロンの基礎検定の１つ
が酸の存在下での不活化試験を包含するという事
実からして、ほとんど実施不可能な方法であつ
た。さらに、抗原−抗体複合体を解離させうる他
の既知物質（例えばチオシアン酸カリウムおよび
尿素）の多くもまたガンマ−インターフエロンを
不活化することが知られていた。 当技術分野は、アフイニテイクロマトグラフイ
ーを用いるよりむしろ、複雑な多工程の精製法へ
と向かつた。例えば、欧州特許公開第63482号明
細書はガンマ−インターフエロン含有溶液を制御
された多孔質ガラスビーズカラム、コンカナバリ
ンＡ−セフアロースまたはヒラマメレクチン−セ
フアロースもしくはエンドウマメレクチン−セフ
アロースカラム、ヘパリン−セフアロースまたは
プロシアンレツド−セフアロースカラム、および
ゲル濾過カラムに通すことを含む４工程精製法
（中性または塩基性PHで行なわれる）を報告して
いる。同様に、Yip、Y.K.、Barnowclough、B.
S.、Urban、C.、およびVilcek、J.、による
Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）、第79巻、1820〜
1824頁、1982年３月は制御された多孔質ガラスへ
の第１の吸着およびそれからの溶出、コンカナバ
リンＡ−セフアロースへの第２と吸着およびそれ
からの溶出、およびその後のPH8.0での夾雑蛋白
質のDEAE−セフアセルへの吸着除去を含むガン
マ−インターフエロンの３工程精製法を報告して
いる。 発明の概要 当技術分野のこの状態を顧慮して、本発明の目
的はガンマ−インターフエロンを精製するための
改良方法を提供することである。より詳細には、
本発明の目的は抗体アフイニテイクロマトグラフ
イーを用いるガンマ−インターフエロンの精製法
を提供することである。さらに、本発明の目的は
ガンマ−インターフエロンを酸溶出によつて抗体
カラムから取り出す抗体アフイニテイクロマトグ
ラフイーを提供することである。本発明のさらに
他の目的は酸不活化ガンマ−インターフエロンの
再活性化方法を提供することである。 これらの目的を達成するために、本発明は酸性
状態がガンマ−インターフエロンを確かに不活化
するけれども、そのインターフエロンは制御され
たPHおよび温度で長時間インキユベートすること
によつて再活性化され得ることを見出した。より
詳細には、酸不活化ガンマ−インターフエロン
は、もしそれが約5.5〜9.5のPHおよび約２〜８℃
の温度に少なくとも24時間保持されるならば、も
との生物学的活性の実質的部分を回復するだろう
ということがわかつた。本発明の好適な実施態様
では、その再活性化方法は約6.0〜9.0のPHおよび
約４℃の温度で約96時間実施される。 この再活性化方法を用いて、本発明は初めてガ
ンマ−インターフエロンの精製に抗体アフイニテ
イクロマトグラフイーの使用を可能にする。詳細
には、次の工程： (a) ガンマ−インターフエロンに対する１種また
はそれ以上の抗体を調製すること； (b) １種またはそれ以上の抗体を固体支持体に固
定すること； (c) ガンマ−インターフエロンを含有する第１溶
液と１種またはそれ以上の固定した抗体とを接
触させて、ガンマ−インターフエロンと１種ま
たはそれ以上の固定した抗体との間に固定した
抗体−抗原複合体を形成すること； (d) 固定した抗体−抗原複合体から第１溶液を分
離すること； (e) 固定した抗体−抗原複合体と酸性PHをもつ第
２溶液とを接触させて、ガンマ−インターフエ
ロンを１種またはそれ以上の固定した抗体から
第２溶液中に解離すること（この場合、前記第
２溶液の酸性度は解離したガンマ−インターフ
エロンを部分的にまたは完全に失活させる作用
を有する）； (f) １種またはそれ以上の固定した抗体から第２
溶液を分離すること； (g) その第２溶液のPHを約5.5〜9.5に調節し、次
いでPH調節した溶液を約２〜８℃の温度で少な
くとも24時間インキユベートすることにより第
２溶液中のガンマ−インターフエロンの活性の
いくらかまたは全てを回復させること； からなるガンマ−インターフエロンの精製法が本
発明により提供される。精製法の好適な実施態様
において、再活性化は約6.0〜9.0のPHおよび約４
℃の温度で約96時間実施される。 図面の説明 第１図はPH2.4で１時間インキユベートしたヒ
トガンマ−インターフエロンの再活性化を示すグ
ラフである。より詳細には、部分精製したヒトガ
ンマ−インターフエロン（比活性２×104u／mg）
をクエン酸緩衝液（最終PH＝2.4）中に１：100の
割合で希釈し、氷上で60分間インキユベートし
た。アリコート10mlはNaOHを用いてPH6.9（０）
に；固体トリスを用いてPH7.5（＋）に；固体トリ
スを用いてPH8.25（＊）に：そして固体トリスを
用いてPH9.1（×）にPH調節した。この実験のため
の対照は標準検定媒体（PH7.2）中の同一インタ
ーフエロンの１：100希釈物であつた。対照は酸
性化しかつPH調節した溶液と正確に同じ方法で４
℃において氷上でインキユベートした。０日目の
試料は塩基でのPH調節の２時間後に検定された。 第２図は第１図に記載した溶液の絶対力価を示
すグラフである。対照のデータ点（＃）；その他
の溶液のデータ点は第１図と同じ。 第３図はPH2.4で８日間インキユベートしたヒ
トガンマ−インターフエロンの再活性化を示すグ
ラフである。より詳細には、ヒトガンマ−インタ
ーフエロンのもとの酸性化混合物（第１図および
第２図）を４℃で８日間インキユベートした後、
NaOHを用いてPH6.6（０）に；固体トリスを用い
てPH8.25（＋）に；固体トリスを用いてPH8.55
（＊）に；そして固体トリスを用いてPH9.1（×）
にPH調節した。この実験のための対照は第１図に
関して先に述べたものと同じであつた。 第４図は第３図に記載した溶液の絶対力価を示
すグラフである。対照のデータ点（＃）；その他
の溶液のデータ点は第３図と同じ。 第５図および第６図は全蛋白質濃度、イオン強
度および最終PHを制御した条件下でのガンマ−イ
ンターフエロンの酸による不活化およびPH調節を
示すグラフである。より詳細には、部分精製した
ガンマ−インターフエロンをCAB（PH2.4）中に
１：100の割合で希釈し、氷上で60分間インキユ
ベートし、次いで固体トリス（最終濃度約1M）
を用いてPH8.2に調節した。その後この溶液を４
℃でインキユベートして、０日目（４時間後）、
３日目および７日目に力価を測定した。対照は
CAB＋トリス（約1M）、PH8.2中に１：100の割
合で希釈して４℃でインキユベートした。第５図
は対照のパーセントとして表わされる酸性化しか
つPH調節した試料の力価を示す。第６図は酸性化
試料（０）および対照試料（×）の絶対力価を示
す。 第７図および第８図は全蛋白質濃度、イオン強
度および最終PHを制御した条件下でのガンマ−イ
ンターフエロンの酸による不活化およびPH調節を
示すグラフである。より詳細には、部分精製した
ガンマ−インターフエロン１mlを10N Hcl0.010
mlでPH2.1に酸性化し、氷上で60分間インキユベ
ートした。次いでこの溶液0.1mlを検定媒体9.9ml
に加えた。対照試料は氷上で60分間インキユベー
トし、次いでこの試料0.1mlを検定媒体9.9mlに加
えた。その後、両試料は４℃で貯蔵し、図に示す
時期に力価を測定した。第７図は対照のパーセン
トとして表わされるHcl−酸性化しかつPH調節し
た試料の活性を示す。第８図は酸性化試料（０）
および対照試料（×）の絶対力価を示す。 第９図はガンマ−インターフエロンを精製する
ために用いられたポリクローナル抗体カラムから
の溶出分画のウエスターンブロツト分析
（Western blot analysis）を示す。 第１０図はガンマ−インターフエロンを精製す
るために用いられたモノクローナル抗体カラムか
らの溶出分画のウエスターンブロツト分析を示
す。 発明の開示 上述のごとく、本発明は酸−不活化したガンマ
−インターフエロンを再活性化するための方法、
および抗体アフイニテイクロマトグラフイーによ
るガンマ−インターフエロンの精製における前記
方法の使用に関する。 その再活性化方法は(a)PHが約5.5〜9.5の溶液中
にガンマ−インターフエロンを入れること；およ
び(b)その溶液を約２〜８℃の温度で少なくとも24
時間インキユベートすること；の各工程から成つ
ている。好ましくは、その溶液はPHが約6.0〜9.0
であり、温度は約４℃である方がよい。インキユ
ベーシヨンの時間は４時間程度の短時間でもガン
マ−インターフエロン活性の有意な部分を回復さ
せるのに役立つが、約24〜96時間程度が好適であ
り、96時間程度が最適である。活性化溶液は5.5
〜9.5のPHをもつ以外に、必ずしも必要ではない
が、適度のイオン強度（例えば約0.1〜0.5程度）
および適度の蛋白質濃度（例えば約0.05〜2.0
mg／ml程度）をもつことが望ましいと考えられ
る。 アフイニテイクロマトグラフイー法は次の工
程：(a)ガンマ−インターフエロンに対する１種ま
たはそれ以上の抗体の調製；(b)クロマトグラフイ
ーカラムの形体の固体支持体へこれらの抗体を固
定すること；(c)ガンマ−インターフエロン含有溶
液をそのカラムに適すこと；(d)酸を用いてそのカ
ラムからガンマ−インターフエロンを溶出するこ
と；および(e)再活性化方法を用いてガンマ−イン
ターフエロンを再活性化すること；を包含する。 ガンマ−インターフエロンに対する抗体は当技
術分野で知られた多くの方法で調製することがで
きる。例えば、ポリクローナル抗体はBenedict、
A.A.、らによる“抗血清の産生”、Methods in
Immunology、１：197〜306（1967）に記載され
た方法によつて作ることができ、モノクローナル
抗体はMethods in Enzymology、第92巻、第１
部（1983年）に記載された方法で作ることができ
る。一般に、モノクローナル抗体はそれらの特異
性ゆえに本発明方法で使用するのに適している。
ガンマ−インターフエロンに対するモノクローナ
ル抗体の特に好適な産生方法は以下の実施例３に
記載する。 ひとたび抗体が得られると、それらは当技術分
野でよく知られた数多くの方法で固体支持体へ共
有結合で結合される。例えば、固定化は臭化シア
ンで活性化されたセフアロース4B（ニユージヤー
ジー州、ピスカタウエイ、Phormacia）、トリサ
クリル（メリーランド州、ベテスダ、LKB）ま
たは類似の物質においてなされる。これらの支持
体への抗体の共有結合は、これらの製品の製造業
者により提供される製品パンフレツトに記載され
ている。例えば、臭化シアン活性化セフアロース
4Bへの結合は単に0.5M炭酸ナトリウム緩衝液
（PH8.0）中で抗体とその固体支持体とをインキユ
ベートすることを含む。臭化シアン活性化セフア
ロース4Bは、今日までのその広い使用ゆえに、
本発明での使用に特に適した支持体であると考え
られる。 精製しようとするガンマ−インターフエロンは
種々の方法で調製することができる。１つの適当
な方法はJohnsonらのMethods in Enzymology、
第78巻、158〜162頁（1981年）に記載されてい
る。他の方法は先に示した欧州特許公開第63482
号明細書に見出せる。ガンマ−インターフエロン
の特に好ましい精製方法は本発明と同一出願人に
よる1982年12月２日付米国特許出願第446160号明
細書に記載されている。 抗体アフイニテイクロマトグラフイーは他の精
製方法の助けを借りずにガンマ−インターフエロ
ンを精製することができるので、カラムに加えら
れるガンマ−インターフエロン含有溶液は未精製
のものであるのが好ましい。未精製のガンマ−イ
ンターフエロンはカラムにかかる荷重容量を減ず
るために、例えば中空フアイバーフイルターを用
いて濃縮（例えは100×）するのが好適である。
もちろん、所望により、ガンマ−インターフエロ
ン含有溶液はカラムに加える前に制御された多孔
質ガラスビーズまたはケイ酸ビースへの吸着、お
よび／またはDEAE−セフアセルもしくは類似の
物質でのイオン交換クロマトグラフイーのような
技術により部分的に精製されてもよい。 結合したガンマ−インターフエロンをポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体カラムから溶出
するのに用いられる酸溶液は様々なPHおよび様々
な組成をもつことができる。適当な溶出液の例に
は0.1Mクエン酸、PH2.0；1Mプロピオン酸、PH
2.5；および0.1Mグリシン、PH3.0がある。 本発明は次の実施例によつて十分に開示される
が、いかなる方法も本発明を限定するものではな
い。 実施例 １ 酸により不活化したガンマ−インターフエロン
の再活性化方法および物質 １ ガンマ−インターフエロンの調製 ガンマ−インターフエロンは先に示した米国
特許出願第446160号明細書に記載の方法に従つ
て調製した。要約すると、健康な血液提供者
（ペンシルバニア州、フライデルフイア、赤十
字社）からのプールされたヒトバツフイコート
（buffycoat）が遠心分離、その後の大部分の血
小板および赤血球の除去により調製された。白
血球はRPMI媒体、5μｇ／mlのPHA（ウイスコ
ンシン州、ミルウオーキー、Ｐ−Ｌ
Biochemicals）および1.25mg／mlのヒト血清を
含む溶液中に直径が150mmのペトリ皿あたり106
個の細胞で採置した。培養物は５％CO2雰囲気
中37℃で４日間インキユベートし、その上澄み
を採取し、遠心分離により細胞破片を除いて澄
明化し、そしてペリコン中空フアイバー濃縮機
（ニユージヤージー州、ワーシントン、
Millipore）で約100倍に濃縮した。得られた生
成物は本明細書において“未精製の濃縮ガンマ
−インターフエロン”と呼ばれる。 ２ 部分精製 未精製の濃縮ガンマ−インターフエロン（約
500000μ／ml、100mg／ml蛋白質）を１×PBS
（0.15M NaCl、20ｍＭ燐酸ナトリウム、PH7.2）
で洗浄したケイ酸（ミズリー州、セントルイ
ス、Sigma）カラムに通した。ガンマ−インタ
ーフエロンは40％エチレングリコール（Fisher
Scientific）、1.5M NaClおよび20ｍＭ燐酸ナ
トリウム、PH7.2を用いてこのカラムから溶出
した。溶出された物質の比活性は約２×104μ／
mgであつた。溶出された物質は１×PBSに対
して透析され、アリコートに分けて−70℃で凍
結貯蔵した。 ３ 抗ウイルス検定 ガンマ−インターフエロンの抗ウイルス活性
は、HEp−２細胞およびチヤレンジウイルス
としてのVSVを用いる細胞変性作用阻害検定
で測定した。未知試料の力価が計算され、そし
て社内の標品に対して補正された。 ４ 酸による不活化 Ａ 方法１ 上記のようにして調製した部分精製のガンマ
−インターフエロン（比活性約２×104μ／mg）
を、0.3M NaClおよび0.1Mクエン酸から成る
クエン酸緩衝液（CAB）での１：100希釈によ
り最終PH2.4へ酸性化した。全ての溶液の温度
を４℃に保つて、諸成分の混合を氷上で行なつ
た。酸性化した後、インターフエロン含有溶液
は以下に示す時間の間４℃でインキユベートし
た。 Ｂ 方法２ 上記のようにして調製した部分精製のガンマ
−インターフエロン（比活性約２×104μ／mg）
を10N HClの添加によりPH2.1へ酸性化した。
全ての溶液の温度を４℃に保つて、諸成分の混
合を氷上で行なつた。酸性化した後、インター
フエロン含有溶液は以下に示す時間の間４℃で
インキユベートした。 ５ 酸性化した溶液のPH調節 酸インキユベーシヨン後、インターフエロン
含有溶液のPHを10N NaOH、固体トリスまた
は検定媒体を用いていろいろな最終PHへ調節し
た。各溶液はPH調節の間氷上に置かれ、そして
塩基添加後穏やかに渦を発生させた。RPMI
（Gibco）から成る標準検定媒体にはＬ−グル
タミン、アミノ酸類、ビタミン類、炭酸水素ナ
トリウムおよび約１mg／mlまでの生まれたばか
りのウシ血清を補足した。 ６ PH調節した溶液のインキユベーシヨン PH調節後、各溶液を滅菌濾過し、４℃のとこ
ろに配置し、そして以下に示す時間その温度に
保持した。 結 果 酸による失活および高いPHでの短時間インキユベ
ーシヨンの実質的活性回復不能 上述のごとく、ガンマ−インターフエロンの活
性が酸処理によつて初期の値の約10％に急速に低
下することはよく知られている。この作用および
高いPHでの短時間インキユベーシヨンの実質的活
性回復失敗についてのデータを第１表に示す。 【表】 実験１〜４において、ガンマ−インターフエロ
ン含有溶液はクエン酸緩衝液で100倍に希釈し
（最終PH2.4）、氷上で60分間インキユベートし、
次いで10N NaOHまたは固体トリスを用いて第
１表に示す高いPHへPH調節した。PH調節および４
℃でのインキユベーシヨンの２時間後、活性はガ
ンマ−インターフエロンの別の試料を検定媒体
（50ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液、PH7.2）で
100倍に希釈して４℃で２時間インキユベートす
ることにより調製した対照の21.3％（最高）から
8.2％（最低）までの範囲であつた。 実験５〜８において、実験１〜４の試料と同じ
方法で調製した試料（最終PH2.4）は４℃で８日
間貯蔵し、次いでNaOHまたはトリスでPH調節
した。この場合もまた、高いPHでの短期間インキ
ユベーシヨン（３時間）後に測定した活性は同一
条件下に貯蔵した対照の活性と比較して13.6〜
6.3％と低かつた。 実験９において、CAB処理した試料はトリス
でPH8.2へ調節しかつ４℃で４時間インキユベー
トした後に対照活性の21％を示した。実験10にお
いて、10N HClで酸処理したガンマ−インター
フエロン（最終PH2.1）は、検定媒体で100倍に希
釈することによりPH調節しかつ４℃で４時間イン
キユベートした後に対照活性の32％を回復した。 上記実験で用いたガンマ−インターフエロン調
製物は抗ガンマ−インターフエロン抗血清によつ
て完全に中和されるが、抗アルフア−インターフ
エロンまたは抗ベータ−インターフエロン抗血清
によつては中和されないことが見出された。従つ
て、これらの実験における全ての抗ウイルス活性
はガガンマ−インターフエロンのみに帰因する。 高いPHでの長期間インキユベーシヨンによる酸不
活化ガンマ−インターフエロンの完全再活性化 ガンマ−インターフエロンはその１ml試料を
CABで100倍に希釈し（最終PH2.4）、氷上で60分
間インキユベートすることにより酸不活化した。
同時に、１ml対照試料は検定媒体（PH7.2）で100
倍に希釈して同様に氷上でインキユベートした。 酸性化試料は４つの等しいアリコートに分け、
10N NaOH（PH6.9試料）または固体トリス（PH
7.5、8.25および9.1の各試料）でPH調節した。４
℃で２時間インキユベーシヨン後、各試料は抗ウ
イルス活性について検定した（第１表の実験１〜
４および上記論文を参照されたい）。対照を含む
全ての試料はその後滅菌濾過して４℃でインキユ
ベートした。周期的な間隔をおいて各試料を抗ウ
イルス検定のために取り出した。 第１表（実験１〜４）に示すごとく、かつまた
先に論じたごとく、対照のパーセントとして表わ
されるPH調節した試料の活性は４℃で２時間イン
キユベーシヨン後に8.2〜21.3％と低かつた。し
かしながら、第１図に示すように、溶液の最終調
節PHにかかわらず４℃で４日間インキユベーシヨ
ン後にほとんど完全な活性回復が達成された。４
℃で１日後には４つの試料のうち３つが対照活性
の約60％の活性を示した。PH調節後４日までに全
ての試料は対照活性の約100％を示した。 第２図に示すように、全ての酸処理した試料の
力価は開始時点（２時間）後に増加し、これに加
えて対照試料の力価は実験の期間中大体一定のま
まであつた。このことは対照試料の活性の漸次衰
退および酸処理した試料の比較的一定の低水準活
性が存在することに対立するものとして真の再活
性化がおこつたことを示している。 同じ結果は60分間酸処理（第１表の実験１〜
４）した同じガンマ−インターフエロンをPH2.4
でCAB中８日間さらにインキユベート（第１表
の実験５〜８）した場合にも得られた。第１表に
示すように、6.6、8.25、8.55および9.1へPH調節
して３時間後に低水準の活性（対照の6.3〜13.6
％）が観察された。しかし、第３図に示すよう
に、高いPHおよび４℃でのインキユベーシヨンの
３日後に２つの試料（PH8.25およびPH9.1）は対
照活性の約80％を示し、第３番目の試料（PH
8.55）は約60％そして第４番目の試料（PH6.6）
は約40％を示した。この場合も、酸処理した試料
の力価は最初の時点（３時間目）から増加を示
し、対照試料（第１図のものと同じ）の力価は実
験の期間中大体一定であつた（第４図参照）。 第１〜４図に示した２組の実験において、酸処
理しかつPH調節した試料は蛋白質濃度およびイオ
ン強度について制御されていなかつた。両方の組
の実験において、対照試料は約1.3mg／mlの最終
蛋白質濃度であつたが、一方酸処理した試料は
0.3mg／mlの蛋白質濃度であつた。これらの実験
における対照試料のイオン強度は生理食塩液（約
0.15）に近いが、酸処理した試料のイオン強度は
CAB希釈物が0.3M NaClおよび0.1Mクエン酸を
含みかつPH調節で約1Mまでのトリス塩基または
約0.01MまでのNaOHが加えられたのでより高か
つた。 再活性化方法で変動しうるイオン強度および蛋
白質濃度の作用を調べるために、第１表の実験９
および10が行なわれた。 実験９において、ガンマ−インターフエロンは
CABで100倍に希釈し（最終PH2.4）、氷上で60分
間インキユベートし、次いでトリスを用いて最終
PH8.2へPH調節した。この実験のための対照は
CAB＋トリスで100倍に希釈されたガンマ−イン
ターフエロン（PH8.2）であつた。従つて、酸処
理した試料および対照試料の蛋白質濃度（0.3
mg／ml）、イオン強度（0.5）および最終PH
（8.2）は同じであつた。 各試料は４℃で７日間インキユベートし、第５
図に示す時間に検定した。PH調節の４時間後、酸
処理した試料のパーセント活性は対照の21％であ
つた。４℃でのインキユベーシヨンの３日後、そ
の活性は対照の84％まで上昇し、そして７日後に
は対照の87％であつた（第５図）。前の実験と同
様に、酸処理した試料の力価は時間とともに増加
し、かつ対照試料の活性には何ら衰退が表われな
かつた（第６図）。 第１表の実験10において、１mlのガンマ−イン
ターフエロン溶液は0.010mlの10N HClで酸性化
した（最終PH2.1）。氷上で60分間インキユベーシ
ヨン後、その酸性化試料を検定媒体で100倍に希
釈して４℃でインキユベートした。この実験のた
めの対照は同じ１mlガンマ−インターフエロン溶
液を検定媒体で100倍に希釈したものであつた。
この実験の場合も、蛋白質濃度（1.3mg／ml）、イ
オン強度（0.15）および最終PH（7.2）は試料
および対照において同一であつた。 第７図に示すように、PH調節の４時間後に試料
の活性は対照の32％であつた。４℃でのインキユ
ベーシヨンの７日後に、PH調節した試料はその活
性の全て（118％）を回復した。開始時点（４時
間目）からの力価の増加ならびに比較的一定の対
照力価がこの場合にも観察された（第８図）。 前述のデータは酸失活したガンマ−インターフ
エロンの再活性化が高いPHおよび制御された温度
での長期間インキユベーシヨンによつて達成され
得ることを明瞭に立証している。その再活性化は
イオン強度および蛋白質濃度を制御した条件およ
び制御しない条件の両条件下でおこる。 実施例 ２ ポリクローナル抗体を用いてのガンマ−インタ
ーフエロンの精製 ガンマ−インターフエロンを精製するためのポ
リクローナル抗体カラムは次の方法で作製され
た。 １ Interferon Sciences社（ニユージヤージー
州、ニユーブルンスウイツク、カタログNo.
3710）から入手できるアフイニテイ−精製した
ウサギの抗ガンマ−インターフエロンIgGは、
先に示した米国特許出願第446160号記載のガン
マ−インターフエロン調製方法により調製され
た未精製品中に通常見出せる主な夾雑物（例え
ばヘモグロビン、IgGおよび類似のもの）を含
む蛋白質−セフアロースカラムでクロマトグラ
フ処理された。この方法によつて、夾雑物に対
する抗体はカラムに吸着され、一方ガンマ−イ
ンターフエロンに対する抗体はカラムを通過し
た。非抗ガンマ−インターフエロン抗体を出来
るだけ多く除去するために少なくとも３サイク
ルのクロマトグラフ処理を行なつた。 ２ 工程１で単離した抗ガンマ−インターフエロ
ン抗体は、その抗体と臭化シアン活性化セフア
ロース4Bゲルとを0.5M炭酸ナトリウム緩衝液
（PH8.0）中で一晩インキユベートすることによ
り、ゲル１mlあたり抗体10mgの濃度でそのゲル
に結合させた。 上記工程によつて得られたカラムは次の方法で
ガンマ−インターフエロンを精製するために使用
された。 １ 氷冷および滅菌濾過した未精製の濃縮ガンマ
−インターフエロン（実施例１のようにして調
製した）を１ml／分の流速のもと４℃で上記抗
体カラムに装填した。 ２ その後、カラム流出液が≦0.01のA280読み
とりを有するまでそのカラムを１×PBSで広
範囲に洗浄した。 ３ ガンマ−インターフエロンは次いで氷冷した
クエン酸緩衝液（0.1Mクエン酸、0.3M NaCl、
PH2.0）を用いてカラムから溶出した。 ４ 工程３で得た氷冷した溶出分画にPHが9.0に
なるまで固体トリス（カリフオルニア州、リツ
チモンド、Bio−Rad）を加えた。 ５ PH調節した溶出分画は次いで滅菌濾過して再
活性化をおこさせるために４℃のところに配置
した。 代表的実験の上記方法で得た種々の分画に見出
されたガンマ−インターフエロン活性第２表に示
す。カラムのガンマ−インターフエロン結合部位
を完全に飽和させるために、初め大過剰のガンマ
−インターフエロン（400×106単位）がそのカラ
ムに装填された。流出した物質（300×106単位）
は保存して次の実験の装填物質として使用した。 この実験における単位の全回収率は94％であ
り、そして≧５×106単位／mgの比活性が溶出分
画について得られた。このことはカラムに加えた
未精製の濃縮ガンマ−インターフエロンの1000倍
精製を意味する。 【表】 溶出分画に見出された活性がアルフア−インタ
ーフエロンまたはベータ−インターフエロン活性
に対立するものとしてガンマ−インターフエロン
活性を表わすということは、アルフア、ベータお
よびガンマ−インターフエロンに特異的な抗体の
使用により立証された。この分析によれば、溶出
分画の活性はInterferon Sciences社（ニユージ
ヤージー州、ニユーブルンスウイツク、カタログ
No.1750）で作られた抗アルフア−インターフエロ
ン抗体、またはCetus Corporation（カリフオル
ニア州、エメリービル）で作られた抗ベータ−イ
ンターフエロン抗体のどちらによつても中和され
ないが、Interferon Sciences社（カタログNo.
3800）およびニユージヤージー州、ニユーヨーク
のthe Sloan−Kettering Instituteの両社で作ら
れたモノクローナル抗ガンマ−インターフエロン
抗体によつて完全に中和されることが見出された
（B.Y.RubinらのJournal of Immunology第130
巻、1019ページ、1983年を参照されたい）。 ポリクローナル抗体カラムから溶出されたガン
マ−インターフエロンの物理的ならびに化学的純
度を調べるために、次の方法を用いてウエスター
ンブロツト分析（W.H.BurnetteのAnal.
Biochem.、112：195（1981）を参照されたい）が
行なわれた。最初に、溶出分画の２つの試料を
SDS処理して、10−20％ポリアクリルアミドゲル
勾配で分子量マーカー蛋白質の４つの試料と平行
して電気泳動にかけた（溶出試料はレーン２およ
び５であり；マーカー蛋白質はレーン１、３、４
および６である；レーン１，２および３はそれぞ
れレーン４，５および６に等しい。）。電気泳動し
た試料は次にニトロセルロースのシートに電気泳
動的に移した（H.Towbin、T.Stehelinおよび
GordonによるJ.PNAS、76：4350（1979年）を参
照されたい。）。ニトロセるロースシート上の蛋白
質バンドは免疫学的染色法（A.L.DeBlasおよび
H.M.CherwinskiによるAnal.Biochem.、133：
214（1983年）を参照されたい。）により次のよう
にして視覚化された。 (1) ニトロセルロースシートを半分に切つて、レ
ーン１、２および３を含むパートＡはガンマ−
インターフエロンを特異的に認識する
Interferon Sciences社で作られたマウスのモ
ノクローナル抗体（カタログNo.3800）と一晩イ
ンキユベートした。 (2) レーン４、５および６を含むニトロセルロー
スシートの残りの半分パートＢはモノクローナ
ル抗体を含まない対照緩衝液中で一晩インキユ
ベートした。 (3) ニトロセルロースシートの両半分は次いでヤ
ギの低マウスポリクローナル抗体（ペンシルバ
ニア州、コクランビル、Cappel研究所）と共
にインキユベートした。 (4) 両半分は次にペルオキシダーゼ酵素およびマ
ウスのモノクローナル抗ペルオキシダーゼから
成る分子複合体（PAP）（メリーランド州、ジ
ヤレツトビル、Sternberger−Meyer）と共に
インキユベートした。 (5) 最後に両半分はニトロセルロースシート上に
黒色バンドを発現させるために過酸化水素およ
び３，3′−ジアニノベンジジン（DAB）と共
にインキユベートした。 この方法によれば、パートＡのレーン２に現わ
れるがパートＢのレーン５に現われないバンドは
ガンマ−インターフエロンに特異的なバンドを表
わす。一方、レーン２および５の両方に現われる
バンドはガンマ−インターフエロン以外のものに
特異的である。 上記のようにして得られた溶出分画の結果を第
９図に示す。この図からわかるように、ガンマ−
インターフエロンに特異的なバンドは15.5K、
17K、21K、30K、32K、34Kおよび38Kダルトン
の分子量位置に現われる。第９図のレーン２にお
ける全バンド数に対するガンマ−インターフエロ
ンに特異的なバンド数に基づいて、かつガンマ−
インターフエロンの理論的比活性が約１×107μ／
mgである（P.AndersonらによるJournal of
Biological Chemistry、第258巻、6497〜6502頁
（1983年）を参照）と仮定して、これらのデータ
はポリクローナル抗体カラムでのクロマトグラフ
イーにより得られたガンマ−インターフエロンが
約50％純度であることを示した。 実施例 ３ ガンマ−インターフエロンに対するモノクロー
ナル抗体の調製 ヒトガンマ−インターフエロンに対するモノク
ローナル抗体は次のようにして得られた。 最初に、Bal ｂ／ｃマウスは500μｇ／mlのイ
ンターフエロンを含むリポソーム懸濁液0.2mlづ
つで一週間おきに４回腹腔内注射により免疫し
た。このマウスは最後のリポソーム注射の６ケ月
後に不完全なフロインドアジユバント
（Freunds′ adjuvant）中のインターフエロン
100μｇの促進を受け、その後さらに12ケ月間休
ませ、この間抗インターフエロンの力価は５×
103中和単位／ml以上存在していた。最後に、こ
のマウスは不完全なフロインドアジユバント中の
精製ガンマ−インターフエロン25〜50μｇで腹腔
内注射により促進された。これらの免疫化に使用
したヒトガンマ−インターフエロンは前記方法に
よつて得られ、最初の５回の注射に対しては約１
×105単位／mgの活性を有し、最後の注射に対し
ては約５×106単位／mgの活性を有していた。 最後の注射の３日後、マウスからの脾臓細胞を
４匹の照射された受容体Bal ｂ／ｃマウスに静
脈内注射した。P.C.Fox、E.H.Barensteinおよび
R.P.Siraganianによる“抗原特異的なハイブリ
ドーマの頻度を高めることについて“Eur.J.
Immunol.、11：431〜434（1981）を参照された
い。各マウスは不完全なフロインドアジユバント
中のガンマ−インターフエロン（５×106単位／
mg）25〜50μｇの腹腔内促進を受けた。５日後こ
れらのマウスからの脾臓細胞は融合のために使用
された。 NS−１−503ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）は
35％PEG1000により脾臓細胞と融合させた。M.
L.Gefter、D.H.MarguliesおよびM.D.Scharffに
よる“マウスのミエローマ細胞のポリエチレング
リコールにより促進された簡単なハイブリダイゼ
ーシヨン法”Somatic Cell Genetics、３、231
〜236（1977）、およびT.Kawamoto、J.D.Sato、
A.Le、D.B.McClureおよびG.H.Satoによる
“NS−１マウスのミエローマ細胞の増殖用血清不
含倍値の開発およびNS−２ハイブリドーマの単
離へのその適用”Analytical Biochemistry、
130：445〜453（1983）を参照されたい。融合細胞
は96のウエルプレート（well plate）に採置し
た。２〜３週間後に陽性ウエルは希釈を限定する
ことによりクローン化された。 融合細胞によつて産生されたモノクローナル抗
体の特異性は中和検定、沈降検定、ウエスターン
ブロツト分析およびアフイニテイクロマトグラフ
イーにより決定された。この抗体はヒトガンマ−
インターフエロンに対して特異的であつて、ヒト
アルフアまたはベータ−インターフエロンには結
合しないことがわかつた、前記方法により産生さ
れたモノクローナル抗体はInterferon Sciences
社（カタログNo.3800）から市販されている。 実施例 ４ モノ ローナル抗体を用いてのガンマ−インタ
ーフエロンの精製 ガンマ−インターフエロンを精製するためのモ
ノクローナル抗体カラムは次の方法で作製され
た。 (1) 実施例３により産生されたガンマ−インター
フエロンに対するモノクローナル抗体は、ヒツ
ジの抗マウスIgG（ペンシルバニア州、コクラ
ンビル、Cappel研究所）を含むカラムでアフ
イニテイクロマトグラフイーにより精製した。 (2) 精製したモノクローナル抗体は、実施例２に
おいて上述した方法を用いてゲル１mlあたり抗
体10mgの濃度で臭化シアン活性化セフアロース
4Bへ結合させた。 完成したカラムはポリクローナル抗体カラムに
ついての実施例２で上述した方法によりガンマ−
インターフエロンを精製するのに用いた。 代表的実験のデータを第３表に示す。22×106
単位のガンマ−インターフエロンが≧１×107単
位／mgの比活性でこのカラムから溶出された。全
回収率は62％であつた。 第１０図は上記カラムから得られた溶出分画の
ウエスターンブロツト分析の結果を示す。この分
析において用いた方法は第９図について上述した
方法と同じであつた。ガンマ−インターフエロン
に特異的なバンド（パートＡ）は15.5K、17K、
21K、30K、32K、34K、38Kおよび40Kダルトン
の分子量位置に見出せる。唯一の夾雑物は臭化シ
アン活性化セフアロース4Bゲルに結合された抗
体に通常観察されるような、カラムから漏出した
少量のマウスIgGの重鎖（50K）であると思われ
る。 観察された比活性≧１×107単位／mgおよびウ
エスターンブロツト分析はともにカラムから溶出
されたガンマ−インターフエロンがほとんど純粋
であることを立証する。 実施例２および４の結果は、高純度のガンマ−
インターフエロンを酸溶出を用いることにより抗
体カラムから取り出すことができ、かつガンマ−
インターフエロン活性のほとんど完全な回復がPH
調節および実施例１に記載した条件下でのインキ
ユベーシヨンにより得られることを明瞭に示して
いる。 【表】 本発明の特定の実施態様を記載しかつ例示して
きたが、本発明の精神および範囲から逸脱するこ
となく変更が可能であることは理解されるべきで
ある。例えば、例示したものに加えて他の塩基性
物質がインターフエロン含有溶液のPHを調節する
のに用いられる。同様に、例示したもの以外の
種々のクロマトグラフイーカラムおよび抗体調製
物が本発明を実施するのに用いられる。
第１図はPH2.4で１時間インキユベートしたヒ
トガンマ−インターフエロンの再活性化を示すグ
ラフである。第２図は第１図に示した溶液の絶対
力価を示すグラフである。第３図はPH2.4で８時
間インキユベートしたヒトガンマ−インターフエ
ロンの再活性化を示すグラフである。第４図は第
３図に示した溶液の絶対力価を示すグラフであ
る。第５図および第６図は全蛋白質濃度、イオン
強度および最終PHを制御した条件下でのガンマ−
インターフエロンの酸による不活化およびPH調節
を示すグラフである。第７図および第８図は全蛋
白質濃度、イオン強度および最終PHを制御した条
件下でのガンマ−インターフエロンの酸による不
活化およびPH調節を示すグラフである。第９図は
ガンマ−インターフエロンを精製するのに用いた
ポリクローナル抗体カラムからの溶出分画のウエ
スターンブロツト分析を示す。第１０図はガンマ
−インターフエロンを精製するのに用いたモノク
ローナル抗体カラムからの溶出分画のウエスター
ンブロツト分析を示す。
トガンマ−インターフエロンの再活性化を示すグ
ラフである。第２図は第１図に示した溶液の絶対
力価を示すグラフである。第３図はPH2.4で８時
間インキユベートしたヒトガンマ−インターフエ
ロンの再活性化を示すグラフである。第４図は第
３図に示した溶液の絶対力価を示すグラフであ
る。第５図および第６図は全蛋白質濃度、イオン
強度および最終PHを制御した条件下でのガンマ−
インターフエロンの酸による不活化およびPH調節
を示すグラフである。第７図および第８図は全蛋
白質濃度、イオン強度および最終PHを制御した条
件下でのガンマ−インターフエロンの酸による不
活化およびPH調節を示すグラフである。第９図は
ガンマ−インターフエロンを精製するのに用いた
ポリクローナル抗体カラムからの溶出分画のウエ
スターンブロツト分析を示す。第１０図はガンマ
−インターフエロンを精製するのに用いたモノク
ローナル抗体カラムからの溶出分画のウエスター
ンブロツト分析を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a) ガンマ−インターフエロンに対する１種
またはそれ以上の抗体を調製する工程； (b) １種またはそれ以上の抗体を固体支持体へ固
定する工程； (c) ガンマ−インターフエロンを含有する第１溶
液と１種またはそれ以上の固定された抗体とを
接触させて、ガンマ−インターフエロンとその
抗体との間に固定された抗体−抗原複合体を形
成する工程； (d) 固定された抗体−抗原複合体から第１溶液を
分離する工程； (e) 固定された抗体−抗原複合体と酸性PHをもつ
第２溶液とを接触させて、ガンマ−インターフ
エロンを１種またはそれ以上の固定された抗体
から第２溶液中へ解離する工程（この場合、前
記第２溶液の酸性度は解離したガンマ−インタ
ーフエロンを部分的にまたは完全に失活させる
作用を有する）； (f) １種またはそれ以上の固定された抗体から第
２溶液を分離する工程；および (g) 該第２溶液のPHを約5.5〜9.5に調節し次い
で、PH調節された該第２溶液を約２〜８℃の温
度で少なくとも24時間インキユベートすること
により、第２溶液中のガンマ−インターフエロ
ンの活性の幾分かまたは全部を回復させる工
程； からなるガンマ−インターフエロンの精製法。 ２ 該第２溶液の酸性PHは約1.5〜4.0である特許
請求の範囲第１項記載の精製法。 ３ 該第２溶液のPHは約6.0〜9.0へ調節される特
許請求の範囲第１項記載の精製法。 ４ PH調節された第２溶液は約４℃でインキユベ
ートされる特許請求の範囲第１項記載の精製法。 ５ PH調節された第２溶液は約24〜96時間貯蔵さ
れる特許請求の範囲第１項記載の精製法。 ６ PH調節された第２溶液は約96時間貯蔵される
特許請求の範囲第５項記載の精製法。 ７ 第２溶液のPHは約6.0〜9.0へ調節されかつ該
溶液はその後約４℃で約96時間貯蔵される。特許
請求の範囲第１項記載の精製法。 ８ 酸性溶液と接触していたガンマ−インターフ
エロンの活性の幾分かまたは全部を回復させる方
法であつて、 (a) 該ガンマ−インターフエロンをPHが約5.5〜
9.5の溶液中に加える工程；および (b) 該溶液を２〜８℃の温度で少なくとも24時間
インキユベートする工程； からなることを特徴とする上記方法。 ９ 該溶液のPHは約6.0〜9.0である特許請求の範
囲第８項記載の方法。 １０ 該溶液は約４℃でインキユベートされる特
許請求の範囲第８項記載の方法。 １１ 該溶液は約24〜96時間インキユベートされ
る特許請求の範囲第８項記載の方法。 １２ 該溶液は約96時間インキユベートされる特
許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 該溶液のPHは約6.0〜9.0でありかつ該溶液
は約４℃で約96時間インキユベートされる、特許
請求の範囲第８項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/577,908 US4499014A (en) | 1984-02-07 | 1984-02-07 | Method for purifying gamma-interferon |
| US577908 | 1984-02-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6187698A JPS6187698A (ja) | 1986-05-06 |
| JPH0566400B2 true JPH0566400B2 (ja) | 1993-09-21 |
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| JP (1) | JPS6187698A (ja) |
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-
1985
- 1985-01-17 JP JP60006657A patent/JPS6187698A/ja active Granted
- 1985-02-05 AT AT85400190T patent/ATE53591T1/de active
- 1985-02-05 EP EP85400190A patent/EP0152346B1/en not_active Expired - Lifetime
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