JPS6188898A - 固定化酵素カラムを用いた電気化学検出器によるアセチルコリン及びコリンの同時分析方法 - Google Patents
固定化酵素カラムを用いた電気化学検出器によるアセチルコリン及びコリンの同時分析方法Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はアセチルコリン及びコリンをそれらの分解酵素
の作用により分！！７シて測定する方法に関するもので
ある。
の作用により分！！７シて測定する方法に関するもので
ある。
従来技１１ｉ
アセデルコリン及びコリンは生体内で神経伝達物質とし
て重要な動きをしているものと認識されている。従来、
これらの物質はガスンロマトグラフー質量分析計方式、
ガスクロマトグラフ−エレクトロキャプチャ一方式等に
より測定されてきた。
て重要な動きをしているものと認識されている。従来、
これらの物質はガスンロマトグラフー質量分析計方式、
ガスクロマトグラフ−エレクトロキャプチャ一方式等に
より測定されてきた。
しかしながら、これらの方法は装置構成が高価（；１と
なり、前処理及び誘導体処理などが頃雑であるためより
筒便な測定方法の開発が９上れてきた。
なり、前処理及び誘導体処理などが頃雑であるためより
筒便な測定方法の開発が９上れてきた。
一方、液体クロマトグラフィーによるこれら成分の測定
は実用的な検出で５度を有する検出コーカイを在しなか
ったため、はとんど行なわれなかったというのか実情で
ある。この液体クロマトグライー法における検出器で１
度の問題を克；１１（する方法としては１９８３年アメ
リカ合衆国のＮ Ｉ Ｈが発表した方ｌ去（Ｊ 、 Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ、 Ｖｏ３４１ ＤＩ ８８１があ
る。この方法は酵（マを用いることによりアセチルコリ
ン々びコリンの分解を行ないその分解生成物を電気化学
的に検出するこ七からなる液クロー電気化学検出器法を
＋Ｉｌ成するものであり、脳内アセチルコリン及びコリ
ンを分析するに十分な測定感度を有するものであるか、
酵素を反応溶液として用いるためきわめでランニングコ
ストが高くなるという欠、壱があった。
は実用的な検出で５度を有する検出コーカイを在しなか
ったため、はとんど行なわれなかったというのか実情で
ある。この液体クロマトグライー法における検出器で１
度の問題を克；１１（する方法としては１９８３年アメ
リカ合衆国のＮ Ｉ Ｈが発表した方ｌ去（Ｊ 、 Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ、 Ｖｏ３４１ ＤＩ ８８１があ
る。この方法は酵（マを用いることによりアセチルコリ
ン々びコリンの分解を行ないその分解生成物を電気化学
的に検出するこ七からなる液クロー電気化学検出器法を
＋Ｉｌ成するものであり、脳内アセチルコリン及びコリ
ンを分析するに十分な測定感度を有するものであるか、
酵素を反応溶液として用いるためきわめでランニングコ
ストが高くなるという欠、壱があった。
発明の目的
本発明は、目的成分であるアセチルコリン及びコリンを
分解するための酵素をＨ効に、すなわち大量消費するこ
となく利用して簡便、かつ経済的にこれらを測定しよう
とするものである。
分解するための酵素をＨ効に、すなわち大量消費するこ
となく利用して簡便、かつ経済的にこれらを測定しよう
とするものである。
発明の構成
本発明は、コリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼ
を酵素固定化用ミニカラムに同時に固定し、アセチルコ
リン及びコリンを含む試料をこれに通ずることにより前
記アセチルコリン及びコリンを分解させ、その分解生成
物の量を電気化学検出器で検出することによりアセチル
コリン及びコリンの濃度を測定することを↑￥ Ｂ’ｉ
とする１）のであり、この測定のためにミニカラＪ１に
固定した酵４７を比較的長期間継続的に作用させること
ができる。
を酵素固定化用ミニカラムに同時に固定し、アセチルコ
リン及びコリンを含む試料をこれに通ずることにより前
記アセチルコリン及びコリンを分解させ、その分解生成
物の量を電気化学検出器で検出することによりアセチル
コリン及びコリンの濃度を測定することを↑￥ Ｂ’ｉ
とする１）のであり、この測定のためにミニカラＪ１に
固定した酵４７を比較的長期間継続的に作用させること
ができる。
実施例の説明
本発明の原理は酵素ＡｃｈＥ （アセチルコリンエステ
ラーゼ）及び酵素ＣｈＯ（コリンオキシダーゼ）を固定
したミニカラムにアセチルコリン及びコリンを含む試料
を通ずることにより、アセチルコリンをコリン及び酢酸
に分解し、この分解されたコリン及び試料中に含まれて
いたコリンをヘタイン及び過酸化水素に分解し、ｆ４酸
化水素を電気化学検出器の白金電極で酸化させ、その際
の電極電流を検出することにより間接的にアセチルコリ
ン及びコリンの濃度を測定するものである。
ラーゼ）及び酵素ＣｈＯ（コリンオキシダーゼ）を固定
したミニカラムにアセチルコリン及びコリンを含む試料
を通ずることにより、アセチルコリンをコリン及び酢酸
に分解し、この分解されたコリン及び試料中に含まれて
いたコリンをヘタイン及び過酸化水素に分解し、ｆ４酸
化水素を電気化学検出器の白金電極で酸化させ、その際
の電極電流を検出することにより間接的にアセチルコリ
ン及びコリンの濃度を測定するものである。
すなわち、
＋Ａｅｈニアセチルコリン）
２Ｈ，Ｏ，ｆｃｈ・コリン）
（電気化学的酸化反応）
次に、第１図を参照して本発明の方法を実施するための
好よしいｒＡＥＷ”６１１＾成例について説明する。
好よしいｒＡＥＷ”６１１＾成例について説明する。
第１図において、（１）は移動相送液ポンプ、（２）は
試料注入部であり、ここから注入された試料が前記移動
相によりカラム流路及び検出器流路に送られるようにな
っている。この試料注入部（２）の下流側には分離カラ
ム（３）、三方接手（４）ミキシングコイル（５）及び
酵素固定化ミニカラム（６）が順次接合され、これら（
３）〜（６）は恒温水Ｉｆｆ（７）内に収容される。（
８）は水槽（７）のための恒温水循環器である。三方接
手（４）にはさらにＰｌ］調整川送用（ηポンプ（９）
のＰ ｌ−１調整液ラインが接続される。ミニツノラム
（６）の出口流路は白金電極セル（ｌＯ）に接続される
。（１１）はこの白金電極セル（ｌＯ）の制御及び信号
検出ａ１：、（１２）は検出ｆ３号の記ｉ、？、ｉ’！
Ｉ′、である。
試料注入部であり、ここから注入された試料が前記移動
相によりカラム流路及び検出器流路に送られるようにな
っている。この試料注入部（２）の下流側には分離カラ
ム（３）、三方接手（４）ミキシングコイル（５）及び
酵素固定化ミニカラム（６）が順次接合され、これら（
３）〜（６）は恒温水Ｉｆｆ（７）内に収容される。（
８）は水槽（７）のための恒温水循環器である。三方接
手（４）にはさらにＰｌ］調整川送用（ηポンプ（９）
のＰ ｌ−１調整液ラインが接続される。ミニツノラム
（６）の出口流路は白金電極セル（ｌＯ）に接続される
。（１１）はこの白金電極セル（ｌＯ）の制御及び信号
検出ａ１：、（１２）は検出ｆ３号の記ｉ、？、ｉ’！
Ｉ′、である。
上記のような流路１１６成において、本発明の方法を実
施するため、まず酵第５固定化ミニツノラム（ｆ；）が
次のように調整される。すなわち、ミニカラム（６）と
しては内径２φ×長さ２０ｍＩＩ＋のステンレス製カラ
ムをハ扛１、そのカラム充填剤としてはシリカゲル担体
にアミノ基を化学結合させたもの（たとえば、Ｌｉｃｈ
ｒｏｓｏｒｂ ＮＯ３）を用いる。充填後のカラムには
４〜５？６のグルタルアルデヒド溶液（０，１Ｍ炭酸水
素ナトリウム水溶液）を流速１ｍＱ／ｍ ｉ ｎで約２
時間通水し、これによって充填剤に化学結合しているア
ミノ基にグルタルアルデヒドを化学結合させる。過剰の
グルタルアルデヒドは薫溜水を流速２ｍＱ 、 ｍｉｎ
で約３時間通水することにより洗浄する。次に、０．１
Ｍ繍酸緩街ｉ１Ｖ （Ｐ １−１８．０）に溶解した酵
素溶液を１ｍ９．１Ｉｉｎの流速で通水する。酵素量は
１４８０ Ｕ、２ｍｇＡｃｈＥ （シグマ比）及び１４
Ｕ ｆｆｌｇＣｈＯ（東１４二＊ｊ； ）の場合、Ａｃ
ｈＥについては０．２−ｇ、ＣｈＯについては２呵で十
分であった（ ２９ ｆ３ ＵＡｃｈＥ及び２８１ｊＣ
ｈＯ）。
施するため、まず酵第５固定化ミニツノラム（ｆ；）が
次のように調整される。すなわち、ミニカラム（６）と
しては内径２φ×長さ２０ｍＩＩ＋のステンレス製カラ
ムをハ扛１、そのカラム充填剤としてはシリカゲル担体
にアミノ基を化学結合させたもの（たとえば、Ｌｉｃｈ
ｒｏｓｏｒｂ ＮＯ３）を用いる。充填後のカラムには
４〜５？６のグルタルアルデヒド溶液（０，１Ｍ炭酸水
素ナトリウム水溶液）を流速１ｍＱ／ｍ ｉ ｎで約２
時間通水し、これによって充填剤に化学結合しているア
ミノ基にグルタルアルデヒドを化学結合させる。過剰の
グルタルアルデヒドは薫溜水を流速２ｍＱ 、 ｍｉｎ
で約３時間通水することにより洗浄する。次に、０．１
Ｍ繍酸緩街ｉ１Ｖ （Ｐ １−１８．０）に溶解した酵
素溶液を１ｍ９．１Ｉｉｎの流速で通水する。酵素量は
１４８０ Ｕ、２ｍｇＡｃｈＥ （シグマ比）及び１４
Ｕ ｆｆｌｇＣｈＯ（東１４二＊ｊ； ）の場合、Ａｃ
ｈＥについては０．２−ｇ、ＣｈＯについては２呵で十
分であった（ ２９ ｆ３ ＵＡｃｈＥ及び２８１ｊＣ
ｈＯ）。
上記のようにして調整された酵素固定化ミニツノラムは
測定のため次のようにして訂（晶される。よＡ１第１図
の測定流路から分１ｉ１ｔカラム（３）を外してフロー
インンエクション分析法（Ｆ Ｉ Ａ）によりヂエック
を行なう。前述の原理かられかるように、１モルのＡｃ
ｈからは２モルの過酸化水素が生成する。したがって、
評価のため１モルの過酸化水素を注入して１りられた電
流値が、ミニカラム（６）に１モＪｌのＡｃｈを注入し
て得られた電流値の１．−′２になれば、試ｔ）中のｌ
へｃｈはずべて過酸（ヒ水素に変換されたことになる。
測定のため次のようにして訂（晶される。よＡ１第１図
の測定流路から分１ｉ１ｔカラム（３）を外してフロー
インンエクション分析法（Ｆ Ｉ Ａ）によりヂエック
を行なう。前述の原理かられかるように、１モルのＡｃ
ｈからは２モルの過酸化水素が生成する。したがって、
評価のため１モルの過酸化水素を注入して１りられた電
流値が、ミニカラム（６）に１モＪｌのＡｃｈを注入し
て得られた電流値の１．−′２になれば、試ｔ）中のｌ
へｃｈはずべて過酸（ヒ水素に変換されたことになる。
実際の計部にわいて、測定ノスデムの移動相送液高圧ポ
ンプ（１）は流速 １ｍＱ 、 ｍｉｎで、 ０．０１
Ｍ酢酸ソーダー及び０．０２Ｎ！クエン酸（ＰＨ５，Ｏ
）を送＋［シし、ＰＨ：Ａ整用送ｉ（Ｗポンプ（９）は
ｉｆｆ速０ 、６ｍＱ ｚ制ｎにおいて０．２ぺ１の嬶
酸第二ナトリウム（ＰＨ８，５１を送１【更する。
ンプ（１）は流速 １ｍＱ 、 ｍｉｎで、 ０．０１
Ｍ酢酸ソーダー及び０．０２Ｎ！クエン酸（ＰＨ５，Ｏ
）を送＋［シし、ＰＨ：Ａ整用送ｉ（Ｗポンプ（９）は
ｉｆｆ速０ 、６ｍＱ ｚ制ｎにおいて０．２ぺ１の嬶
酸第二ナトリウム（ＰＨ８，５１を送１【更する。
この結果、２Φ、く５關のカラムでは約５０？Ｑ、２φ
＞：ｌｏ−ｍのカラムでは杓ｑｏＱＱ、 そして２φ
、＜１５＋ｎｍのカラムでは杓１００Ｑ、ｉのＡｃｈ変
換率を得ることができた。したかって、実施例における
２φＸ２０＋ＩＩＩＩのミニカラム（６）はｌＱＱ？
６のＡｃｈ変換率を得るに十分なものであることがわか
る。
＞：ｌｏ−ｍのカラムでは杓ｑｏＱＱ、 そして２φ
、＜１５＋ｎｍのカラムでは杓１００Ｑ、ｉのＡｃｈ変
換率を得ることができた。したかって、実施例における
２φＸ２０＋ＩＩＩＩのミニカラム（６）はｌＱＱ？
６のＡｃｈ変換率を得るに十分なものであることがわか
る。
測定例
前；己のように調整及び評価されたミニカラム（６）を
含む第１図の流路ＩＩ！成を用いることにより本発明に
よるＡｃｈ及びｃｈ測定方法を次の通り実施した。
含む第１図の流路ＩＩ！成を用いることにより本発明に
よるＡｃｈ及びｃｈ測定方法を次の通り実施した。
分離カラム Ｙａｎａｏａｋ ０ＯＳ−Ｔ （４
１Ｘ２５０＋ｍ）ミキシングカラム ・ ０．２５φ内
径ｙ３０Ｍ（テフロンバイブ） 温度 ２７℃ 検出器 ＋〇 、 ５ ＶｖｓＡｇ／Ａｇｃｌ上の条
件において、まず試料注入孔（２）より試料を導入し、
これを移動相によりカラム（３）に通じてＡｃｈ及びｃ
ｈを分離する。カラム（３）がらの溶出岐には三方接手
（４）においてＤＨ調整用送液ポンプ（９）からｐＨ調
整液を合流させる。さらに、ミキシングカラム（５）内
で移動相とＰＨ調整液の混合を行う。−１’ エｕのｊ
Ａ霞■においてはＩ） Ｉ＋ ８ 、２ 溶液上ｌｉろ
。ミー１−ンングコイル（５）からミ、二ノｌう１、（
６）に流入した溶液中のＣｈ及びＡｃｈはそれぞれ過酸
化水素に変換され、白金電極セル（１０）に入り、それ
らのＡ酸１ヒ水叱が電は酸化を受けることになる。これ
により記録計（１２）は制御部（１１）を介して供給さ
れろ試料成分のクロマトグラムを記録するｔ、のである
。
１Ｘ２５０＋ｍ）ミキシングカラム ・ ０．２５φ内
径ｙ３０Ｍ（テフロンバイブ） 温度 ２７℃ 検出器 ＋〇 、 ５ ＶｖｓＡｇ／Ａｇｃｌ上の条
件において、まず試料注入孔（２）より試料を導入し、
これを移動相によりカラム（３）に通じてＡｃｈ及びｃ
ｈを分離する。カラム（３）がらの溶出岐には三方接手
（４）においてＤＨ調整用送液ポンプ（９）からｐＨ調
整液を合流させる。さらに、ミキシングカラム（５）内
で移動相とＰＨ調整液の混合を行う。−１’ エｕのｊ
Ａ霞■においてはＩ） Ｉ＋ ８ 、２ 溶液上ｌｉろ
。ミー１−ンングコイル（５）からミ、二ノｌう１、（
６）に流入した溶液中のＣｈ及びＡｃｈはそれぞれ過酸
化水素に変換され、白金電極セル（１０）に入り、それ
らのＡ酸１ヒ水叱が電は酸化を受けることになる。これ
により記録計（１２）は制御部（１１）を介して供給さ
れろ試料成分のクロマトグラムを記録するｔ、のである
。
第２１’４ｔ↓上記のようにして測定した各ｌＯ゛λ・
１９のコ１）ン、アセチルコリン及び内部標県物゛ｄの
Ｊ、ナノ１ホモコリンを１ＯｕＱ 注入して得られた
タロマドグラ１、を示ずらのである。この結果は溶液酵
塁を用いたときと同等の検出感度であった。
１９のコ１）ン、アセチルコリン及び内部標県物゛ｄの
Ｊ、ナノ１ホモコリンを１ＯｕＱ 注入して得られた
タロマドグラ１、を示ずらのである。この結果は溶液酵
塁を用いたときと同等の検出感度であった。
発明の効宋
本発明の流路；１へ成に用いた酵素固定化ミニノノラ１
、はきわめて安定ｌｉらのであり、前述の通り ０゜２
ｍｇのＡｃｈＥ 伎び２ＩＩＩｇのｃｈｏの酵３Ｒ量に
おイテ１′］ １月間ｉｔ袂的に開用してら酵Ｊセ活１
にの低下はみられなかった。これをＩｒＱ来の酵ホｉ；
’； ｉｌ’７法の酵富消費量と比較すると、少な（と
ｔう９９”、↓）上の酵素量のｉＭｉ杓となり、きわめ
て経済的、かつ効果的１１八ｃｈ及びＣｂ測定法が構成
されたものであることか明らかである。
、はきわめて安定ｌｉらのであり、前述の通り ０゜２
ｍｇのＡｃｈＥ 伎び２ＩＩＩｇのｃｈｏの酵３Ｒ量に
おイテ１′］ １月間ｉｔ袂的に開用してら酵Ｊセ活１
にの低下はみられなかった。これをＩｒＱ来の酵ホｉ；
’； ｉｌ’７法の酵富消費量と比較すると、少な（と
ｔう９９”、↓）上の酵素量のｉＭｉ杓となり、きわめ
て経済的、かつ効果的１１八ｃｈ及びＣｂ測定法が構成
されたものであることか明らかである。
４１！Ｊ面の簡１ｉ１７ヱ説明
第１１４は本発明の方法を実ｋＪ′るための流路構成を
示ず図、第２図は本発明の方法に、上るクロマトグラム
である。
示ず図、第２図は本発明の方法に、上るクロマトグラム
である。
（１）・・・・・・・・・・・・・・・・移動相送液ポ
ンプ（２）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
試料旺入部（３）・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・分離ノｌラム（４）・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・三方接手（５〉・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・ミキシングコイル（６）・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・酵素固定化ミニカラム
（７）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・恒温水
槽（８）・・・・・・・・・・・・・・・・・・恒温水
話■マ訊（９）・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・送液ポンプ（ｌＯ〉・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・白金ｍ後セル（Ｉｆ）・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・１．制御信号検出部（１２）・・・・
・・・・・・・・・・・・・・検出ｆ３号記録部特許出
願人 株式会比柳本製作所 代 理 人 新 実 健 部〈外１名〉 →２−一
ンプ（２）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
試料旺入部（３）・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・分離ノｌラム（４）・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・三方接手（５〉・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・ミキシングコイル（６）・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・酵素固定化ミニカラム
（７）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・恒温水
槽（８）・・・・・・・・・・・・・・・・・・恒温水
話■マ訊（９）・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・送液ポンプ（ｌＯ〉・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・白金ｍ後セル（Ｉｆ）・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・１．制御信号検出部（１２）・・・・
・・・・・・・・・・・・・・検出ｆ３号記録部特許出
願人 株式会比柳本製作所 代 理 人 新 実 健 部〈外１名〉 →２−一
Claims (1)
- コリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼを酵素固定
化用ミニカラムに同時に固定し、アセチルコリン及びコ
リンを含む材料をこれに通ずることにより前記アセチル
コリン及びコリンを分解させ、その分解生成物の量を電
気化学検出器で検出することによりアセチルコリン及び
コリンの濃度を測定することを特徴とする固定化酵素カ
ラムを用いた電気化学検出器によるアセチルコリン及び
コリンの同時分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20999984A JPS6188898A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 固定化酵素カラムを用いた電気化学検出器によるアセチルコリン及びコリンの同時分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20999984A JPS6188898A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 固定化酵素カラムを用いた電気化学検出器によるアセチルコリン及びコリンの同時分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188898A true JPS6188898A (ja) | 1986-05-07 |
Family
ID=16582174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20999984A Pending JPS6188898A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 固定化酵素カラムを用いた電気化学検出器によるアセチルコリン及びコリンの同時分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6188898A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989001047A1 (en) * | 1987-08-03 | 1989-02-09 | Imperial College Of Science, Technology & Medicine | Enzymatic assay |
| JPH0339096A (ja) * | 1989-07-04 | 1991-02-20 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用高速液体クロマトグラフィー |
| WO2002097417A1 (fr) * | 2001-06-01 | 2002-12-05 | Ecole Centrale De Lyon | Procede electro-enzymatique par inhibition pour la detection de glycoalcaloïdes steroïdiques |
| JP2007135474A (ja) * | 2005-11-18 | 2007-06-07 | Chiba Univ | アセチルコリンの定量方法 |
-
1984
- 1984-10-05 JP JP20999984A patent/JPS6188898A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ANAL BIOCHEM=1984 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989001047A1 (en) * | 1987-08-03 | 1989-02-09 | Imperial College Of Science, Technology & Medicine | Enzymatic assay |
| JPH0339096A (ja) * | 1989-07-04 | 1991-02-20 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用高速液体クロマトグラフィー |
| WO2002097417A1 (fr) * | 2001-06-01 | 2002-12-05 | Ecole Centrale De Lyon | Procede electro-enzymatique par inhibition pour la detection de glycoalcaloïdes steroïdiques |
| FR2825374A1 (fr) * | 2001-06-01 | 2002-12-06 | Lyon Ecole Centrale | Procede electro-enzymatique par inhibition pour la detection de glycoalcaloides steroidiques |
| JP2007135474A (ja) * | 2005-11-18 | 2007-06-07 | Chiba Univ | アセチルコリンの定量方法 |
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