JPS6192565A

JPS6192565A - 生合成方法およびそのための細胞

Info

Publication number: JPS6192565A
Application number: JP60210886A
Authority: JP
Inventors: ケイス・シー・バツクマン
Original assignee: Biotechnica International Inc
Current assignee: Biotechnica International Inc
Priority date: 1984-09-24
Filing date: 1985-09-24
Publication date: 1986-05-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本発明は係属中の米国特許出、穎第６５３１９３号（１
９８４年９月２４日付）の一部継続出願であり、上記特
許出願はまた係属中の米国９イ許出、頴第５１１０１９
０号（１９８３年１０月７日付）の一部継続出１頭であ
る。

本発明は目的とる、化合物のインビボ生産に関る、。

化合物のインビボ生産方法における基本的制約は、生物
がしばしば化合物の合成を生物自体の要求に十分な量に
制限る、調節’Ｆ３４１Ｑをもち、それにより生物の原
料およびエネルギーの消耗を回避る、ということである
。生合成の調節は生合成経路における酵素のフィードバ
ック阻害により行われ、こうして阻害化合物の濃度が一
定レベルに到達る、と酵素の触媒活性が実質的に低下る
、（前記阻害化合物は目的とる、化合物であるか、また
はその代謝前、駆体である）。

フィードバック阻害を回避る、だめの種々の方、去が知
られている。

シネンキ（Ｓ　ｙｎｅｎｋｉ　）らの欧州特許（ＥＰ）
第０７７１９６号は、芳香族アミノ酸によるフィードバ
ック阻害に抵抗る、ＤＡＨＰシンターゼ（合成酵素）を
コードる、遺伝子の単離を開示している。この遺伝子は
比較的高濃度の芳香族アミノ酸の存在下にＤＡＨＰシン
ターゼを生産る、大腸菌の突然変異株から単離される。

目的生産物の類似体は、生産物それ自体がフィードバッ
ク阻害を引き起こすのと同様に生産物の生合成に使用さ
れる酵素を阻害る、ので、普通は宙性であるが、その類
似体に抵抗る、突然変異体を単離る、ことも知られてい
る。類似体によって死滅しない生物は、目的生産物だけ
でなく類似体によるフィードバック阻害からも解放され
る。例えば、ソチダの米国特許第４４０７９５２号を参
照されたい。これはフェニルアラニンおよびフェニルア
ラニン類似体によるフィードバック阻害に抵抗る、大腸
菌突然変異株を開示している。

生合成の調節は遺伝子の発現レベルでも行われる。例え
ば、十分量または過剰の特定化合物は、その化合物の生
合成経路における反応を触媒る、１つまたはそれ以上の
酵素をコードる、遺伝子の発現を抑制る、。酵素をコー
ドる、構造遺伝子の近くに位置る、遺伝子配列が酵素の
発現を調節る、。いくつかの場合では１つ以上の調節配
列が１つの遺伝子と関連している。このような調節配列
の例にはプロモーター、オペレーター、アテニュエータ
ー、抗ターミネータ−、リポソーム結合部位および正の
エフェクターのだめの部位が含まれる。

直伝子転写のフィードバック制御を回避る、独々の方法
が知られており、上記の相互参照される特許出願（参照
によりここに引用される）に記載されている。

発明の要約第１の面において、本発明は一般に目的化合物の生合成
経路における酵素（この酵素は目的化合物によりフィー
ドバック阻害される第１のアイソザイム、である）のフ
ィードバック阻害を回避る、ことにより、その化合物の
生産を増大させるべく細胞を変えることを特徴とる、。

本明細書で用いるところの目的化合物により「フィード
バック阻害される」という？セ現は、ひとたび阻害剤の
濃度が一定レベルに到達すれば酵素の触媒活性が実質′
的に阻害されるということを彦味している（前記阻害剤
は目的化合物であるか、またはその化合物の生合成経路
における代謝前駆体である）。前記表現は、目的化合物
以外の化合物の合成へと導くその生合成経路からはずれ
た分岐路上に存在る、化合物による酵素阻害を含まない
ものである。第１のアイソザイムのフィードバック阻害
を回避る、ために、化合物生産用細胞は前記阻害剤の湿
度レベルで実質的に阻害されない第２のアイソザイムを
コードる、遺伝子を用いて形質転換される。

この第２アイソザイムの遺伝子は前記阻害剤の濃度に応
答して転写調節を受けず、こうして第２アイソザイムは
十分量生産されて目的化合物の生産を増大させる。

第１の面の好適な実旅態様では、その細胞が犬腸菌柚の
一員であり、そして目的化合物が阻害剤である。目的化
合物がフェニルアラニンのような芳香族アミノ酸である
場合、そのアイソザイムはａｒｏ遺伝子によってコード
され、例えば第１アイソザイムがｃＬｒｏＧによってコ
ードされそして第２アイソザイムがａｒｏｆ；’によっ
てコードされる。もう１つには、目的化合物がトレオニ
ン、メチオニンまたはりシンであり、そしてアイソザイ
ムがこれらの化合物の少なくとも２つの生合成に共通る
、工程を触媒る、。目的化合物の存在下での第２アイソ
ザイムの転写は、細胞内にその遺伝子の十分なコピー数
を供給して転写調節エフェクターを数の上で圧倒る、こ
とにより可能である。また、係属中の上記特許出願明細
書に記載される転写制御の回避方法も使用される。

第２の面において、本発明は親細胞集団よりも目的化合
物の生産がまさった突然変異細胞を選択る、ことを特徴
とる、。Ｍａ１胞は目的化合物と細胞増殖にとって必須
の第２化合物の両方の生合成に共通る、化学反応を触媒
しかつフィードバック阻害を受ける酵素をコードる、遺
伝子を持っている。その親細胞を酵素阻害濃度の前記阻
害剤の存在下に培養し、そして増殖維持量の第２化合物
が酵素の触媒活性の結果としてのみ得られるような条件
下で増殖る、能力に基づいて突然変異体を選択る、。こ
のような突然変異体はフィードバック阻害からの解放を
示す。

第２の而の好適な実施態様では、阻害剤が目的化合物で
あり、酵素がアイソザイムであり、そして親細胞が選択
条件下に増殖維持量のき工２化合物を供給る、のに十分
効果的にその反応を触媒る、他のアイソザイムを生産る
、能力を持ち合わせていない。親細胞は好ましくは芳香
族アミノ酸またハ非芳香族アミノ酸（トレオニン、メチ
オニンまたはりシン）の１種の生産を増大させるために
、上記第１の面で述べた方法によって作られた細胞であ
る。酵素が第２アイソザイムであり、それが第２化合物
によって阻害されるばかりでなく、第１アイソザイムを
制御る、のと同じ阻害剤によってもある程度まで（阻害
剤の濃度がより一層高いときのみであるが）阻害される
場合、上記方法を使って目的化合物、第２化合物または
それらの代謝前駆体によシフイードバック阻害されない
目的化合物の生合成経路のアイソザイムをコードる、遺
伝子を発生させることができる。

どちらの面の好適な実施態様でも、目的化合物は上記の
ようにして作られた細胞を液体培地で培養し、培地から
目的化合物を回収る、ことによシ生産される。

従って、本発明は同じ化学反応を触媒る、が、目的生産
物またはその代謝前駆体によるフィードバック阻害に対
る、応答がＨニア造画にかつ機能的に全く異なる複数の
酵素（アイソザイム）の存在を利用している。得られた
生物は、自然界に存在る、フィードバック阻害されるア
イソザイムの代わりにフィードバック阻害されないアイ
ソザイムを便って問題の反応を行うことが可能である。

先に述べたように転写調節を回避る、ことにより達成さ
れる条件の下で、十分なコピー数の脱調節アイソザイム
が生産される限り化合物の生産は増大る、であろう。こ
のように遺伝子操作によって作り出された細胞は普通の
調節機（ｌｔ７を回避る、が故に、生産物の過剰量に応
答して合成を縮小る、ことがない。多くの場合、生産物
の−」゛が増すにつれてその生産物は周囲の培地に放出
され、その結果目的化合物の回収が一層容易になる。

本発明の他の特徴および利点は以下の好適な実施態様の
説明から明らかになるであろう。

発現ベクター目的生産物は、通常フィードバック阻害されるアイソザ
イムにより触媒される少なくとも１つの工程を含む合成
経路を経て合成され、従って阻害剤（普通は目的とる、
生産物）の濃度が一定のレベルに到達る、と、アイソザ
イムの触媒作用は抑制されるかまたは非常に低下る、。

このようなフィードバック阻害は、目的生産物またはそ
の代謝前駆体によりフィードバック阻害されない別のア
イソザイムを用いて、細胞にその反応工程を行わせるこ
とによシ回避される。たとえフィードバック１君害され
ないアイソザイムが自然界でその細胞内に存在る、とし
ても、その利用可能性は一般に遺伝子転写の調節または
他の物質の阻害を含めた種々の理由のために不十分であ
る。

しかし、フィードバック阻害されないアイソザイムのこ
の種の調節を回避る、ことができる場合には、生産物の
生産量が増大る、。酵素１泪害および遺伝子発現の調節
を解除る、ために選択される合成経路工程は、好結果の
抑制解除が生産物の収量増加を示すような工程に制限さ
れるであろう。

本発明はＬ−フェニルアラニンの生産に有用なベクター
を例にとってここに説明る、。特定のア・イソザイムの
例はａｒｏ遺伝子によってコードされるＤＡＨＰシンタ
ーゼである。ＤＡＨＰシンターゼは３種の芳香族アミノ
酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン
）の全ての生合成に共通る、化学反応を触媒る、。ａｒ
ｏＧ遺伝子はＬ−フェニルアラニンによりフィードバッ
ク阻害されるＤ　Ａ　ＨＰンンターゼをコードる、。ａ
ｒｏＦおよびαｒｏＩ（によりそれぞれコードされる他
のアイソザイムは、Ｌ−フェニルアラニンのフィードバ
ック阻害に対して感受性であるとしてもかなりその程度
が劣っている。従って、Ｌ−フェニルアラニン生産の障
害は、他の方法で生ずるよシも多量のａｒｏＦまたはα
ｒｏＨ遺伝子産物を、特にａｒｏＦまたはＣＬｒｏＨ遺
伝子産物を阻害る、物質が存在しない系において、供給
る、ことにより避けることができる。詳しくは、発現ベ
クターがａｒｏＦ遺伝子またはそれから誘導される変異
型（以下に一層詳しく説明る、）を含む。ａｒｏＦを使
って以下に述べるようにフェニルアラニンを生産る、場
合、「制御された切除（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｃｌ　Ｅｚ
ｃｉｓｉｏｎ　）　Ｊと嘱る、１９８５年２月１３日付
の米国特許出願第７０１０９１号（参照によりここに引
用される）に記載されるようなｔｙｒ−宿主を使用する
ことにより、生産量の間中ａｒｏＦ遺伝子産物を阻害る
、チロシンの存在を避けることが有効である。

合成経路中のその工程が酵素をコードる、遺伝子の発現
レベルを制御る、ところのＤＮＡ配列によってさらに調
節される場合、そのベクターは上記調節の回避をも包含
る、。その酵素遺伝子の発現の調節を回避る、１つの方
法は、組換えＤＮＡ技術を使って上記調節ＤＮＡ配列を
異種調節配列で置き換えることにより生合成経路の正規
の調節を回避し、そして正規の調節が目的化合物のそれ
以上Ｃ生産を停止させた点を越えてその生産を増大させ
ることである。遺伝子発現の起こりうる全ての制御機構
を不活化る、ために、構造遺伝子（その発現が抑制解除
される）と共に自然界に存在る、調節ＤＮＡを除き、そ
して外来プロモーター（すなわち、自然界に存在る、構
造体におし・てその遺伝子の発現を支配しないもの）を
挿入る、ことが好ましい。

好適な実権態様において、このことは脱阻害酵素をコー
ドる、遺伝子を合成オペロン内に組入れることにより達
成でき、そのオペロン内のプロモーターはオペロンの構
造遺伝子の全てにとって外来性であるか、あるいは抑制
解除のために選択された遺伝子にとって少なくとも外来
性である。２つの合成オペロン遺伝子は互いに接近して
いる方がよいが、それらの遺伝子間に転写を停止させる
信号が存在しない限り、それらの間に短い配列またはか
なり長い配列でさえも存在し得る。各合成オペロン遺伝
子は自然界に存在る、遺伝子の構造成分に相当る、。「
相当る、」という表現は、オペロン遺伝子が自然界に存
在る、構造遺伝子と同一であるかまたは密接に関連して
おり、そしてそのオペロン遺伝子が天然の遺伝子産物に
より触媒される反応を触媒る、ところの酵素をコードる
、ということを意味している〇他のオペロン成分の選択は、別の合成経路の酵素を高度
に発現る、構成物を遺伝子操作により作り出す機会を与
える。１つには別の律速（ｒａｔｅ−ｃｒｉｔｉｃａｌ
　）合成経路段階を選ぶことが好ましい。他のオペロン
成分、すなわちベクターにおいて使用される調節物質を
有る、遺伝子を選択る、ことによりクローニング方法を
簡単にる、こともできる。その場合、オペロンの３′セ
グメントは抑制解除される構造遺伝子であり得、そして
５′セグメントは自然界に存在る、調節配列を有る、オ
ペロンの他の員子でありうる。

オペロンの両頁子に外因性または外来性であるプロモー
ターが使用される場合、それらの員子はどちらの順序で
結合されてもよい。別の構造遺伝子がオペロンに付加さ
れてもよく、またそれらのうちの１つ以上が天然に存在
る、＋７４造体においてフィードバック阻害されてもよ
く、従ってそれもオペロン内に挿入る、ことにより抑制
解除される。

好適なベクター７１ＫＢ　７１２およびｐＫＢ７５０の
２つの例を以下に説明る、。

各ベクターは、それがフ・イードバック転写制御を受け
ない形のａｒｏＦ遺伝子を含むばかりでなく、それが大
腸菌のｐｈ、ｅ　Ａ　遺伝子（自然界では得られるフェ
ニルアラニンに応答して調節される）の抑制解除された
発現を可能にる、ので、Ｌ−フェニルアラニンの合成に
有用である。ｐｈｅ　Ａの産物である二重機能酵素のコ
リスメート（ｃｈｏｒｉｓｍｔｘｔｅ　）ムターゼープ
レフエネー）　（ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ　）デヒドラタ
ーゼは、フェニルアラニン生合成の終わりから２番目の
工程を行う。ｐｈｅＡ発現の調節はリプレッサー／オペ
レーター系とリーダーペプチド／アテニュエーター系の
両方により生ずる。十分量または過剰量のフェニルアラ
ニンが得られると、ｐｈｅＡの発現は止まりかつフェニ
ルアラニン合成が停止る、。

ｐｈｅｆｉ、に関連したプロモーター／オペレーターお
よびリーダーペプチド／アテニュエーターのＤＮＡが別
のプロモーターからのＤＮＡと置き換えられる。このよ
うな構成物を含む細胞はｐｈｅＡの発現を中止せず、ま
た過剰のフェニルアラニンに応答してその生合成を停止
しない。その結果、この種の細胞は十分量のフェニルア
ラニンを供給して、それを周囲の培地へ分泌る、。

第２図は２成分からのｐＫＢ７１２の作製を示す０第１の成分は、第１図に示すｐＫＢ６６３　の作製に関
して上記の相互参照される親出願に記載されているｌａ
ｃオペロン−ｐｈｅＡＢ合物である。プラスミドｐＫＢ
６Ｇ３はアメリカンｅタイプ・カルチャー・コレクショ
ンにＡＴＣＣ３９４６２，！：して寄託されたＹＭＣ９
／ｐＫＢ　６６３株から得られる。ｐｈｅＡ遺伝子の末
端を越えてすぐのＢａｎＩ部位は、修復されたＥＣＱＲ
Ｉ　部位に接合る、ことによシＥ　ｃｏ　ＲＩ部位に変
換る、。詳Ｍには、得られたプラスミドを処理して、１
ＣＬＣプロモーターの５′側のＴｔｈｌｌｌｌ　部位に
Ｈｉｎｄ＠リンカ−を挿入る、。

第２の成分は、先に述べた理由によって選ばれだａｒｏ
Ｆ構造遺伝子である。詳細には、ｐＫＢ４５に含まれる
ａｒｏＦをＥｃｏＲＶ／Ｐｖｕ、ｌ断片としてｐＢＲ３
２２内でサブクローニングし、それによりｐＫ８６４８
　を得る。ＥｃｏＲＶ　　部位はαγＯＦ遺伝子に先行
しくａｒｏＦ遺伝子の５′側）、このＥ　ｃｏ　ＲＶ　
　部位を切断してエキンヌクンアーゼ分解により切除し
、その後ατｏＦ遺伝子のリポソーム・結合部位から約
２０　ｂｐ上流の位置にＥＣＩ）ＲＩクリンカを挿入る
、。ａｒｏＦの３′末端近辺にｐｕｕ■部位があり、こ
のｐｖｕ１部位はｐＢＲ３２２のＰτｔｔＨ部位へ接合
できる。従ってクローニングされる遺伝子の３′側のＴ
ｔｈ１１１１部位はリンカ−によってＨｉｎｄＭに変え
られる。

上記の２成分はそれらのＥｃｏＲＩ末端で接合され、そ
して７）ＢＲ３２２のＨｉｎｄｌｌ　　部位にクローニ
ングされる。

ｐＫＢ　７１２　　では、２つの構造遺伝子がｐｈａＡ
末端の第１停止コドンから約８ヌクレオチド後方の位置
と、ａｒｏＦ遺伝子のリポソーム結合部位から約２０ヌ
クレオチド上流の位置とで接合される。

ｐＫＢ７５０は、それがｌａｃプロモーターではな（ａ
ｒｏＦプロモーターの制御下に発現されるという点で上
記の発現ベクターと異なっている。

第３図に示すように、７）ＫＢ７５０　は２つの断片か
ら作られる。

第１の断片は、ｐＫＢ４５からｐＫＢ６４８　　を経る
ことにより得られた、自然界で関連したプロモーターを
有る、αγＯＦ遺伝子であり、そのセグメントはαγｏ
Ｆ遺伝子の５′側のＥｃｏＲＶ部位から始まシそしてα
ｒＯＦ末端のＰｖ１Ｌ■部位の隣に位置る、ＫｐｎＩ部
位で終わっている。

第２の断片は、ｐｈｅＡ遺伝子の５′側にＫｐｎ１部位
を結合しそしてその３′側にＥＣｏＲＩ部位を結合した
ｐｈｅＡ遺伝子である。Ｋｐｎ１部位は例えばｐＫＢ　
４５または適当な誘導体のｐｈｅＡの５′側の５ｔ１Ｌ
１部位を切餅しそしてｐｈｅＡに向けてエキソヌクレア
ーゼ分解により切除る、ことにより作らｉｔｌその後Ｋ
ｐｎＩ　’）ンカーが付加される。

ＥｃｏＲＩ部位はｆ３ａｎ工部位を修復されたＥｃｏＲ
Ｉ部位に接合る、ことにより作られる。

これらの断片は■＜ｐｎ１部位で接合し、ｐＢＲ３２２
内でクローニングして７７ＫＢ　７５０　　を得る。

ＫＢ３５８の作製ｎ、ｒＯＦ遺伝子産物はａｒｏＧ遺伝子産物を実質的に
阻害る、ｌのフェニルアラニンによって本質的に阻害さ
れない。しかしながら、上記の遺伝子（イ、７成物ヲ団
うことによりフェニルアラニンの濃度が一層高まると、
ａｒｏＦ遺伝子産物はその触媒活性を幾分失うであろう
。

従って、ＤＡＨＰシンターゼで触媒される反応はこのよ
うな高ａＫでフェニルアラニンを合成る、際の限定要因
には恐らくなり得す、このような高濃度でさえも阻害さ
れないａ、ｒＯＦの突然変異体をｔ！Ｉることか有効で
ある。３つの芳香族アミノ酸全部を合成る、のにαｒｏ
アイソザイムの１種であるａｒｏＦに実質的に依存る、
生物を使って、発明の背景において述べた致死類似体を
含まないところの以下で述べる選択方法を行うことが可
能である。

この選択方法で用いる親株は、３つの芳香族アミノ酸全
部を合成る、際に主としてａｒｏＦ遺伝子産物に依存す
べきである。このことはａｒｏ　Ｇ遺伝子を持たない多
数の大腸菌株のいずれか（例えばＫＢ２５８）を用いる
ことにより達成される。

αｒ　ｏ　Ｈ遺伝子は細胞を増殖させるのに十分なりＡ
ＨＰシンテターゼを合成しないので存在していてもよい
。もし培地に低濃度（約２０　ｆｎｌ／ｌ　）のチロシ
ンが添加されるか、あるいはａｒｏＦ遺伝子産物を阻害
る、のに十分高濃度（少なくとも約５　！Ｊ／ｌ　）の
フェニルアラニンが添加される場合には、細胞内のＤＡ
ＨＰシンターゼ活性がチロシンおよびトリプトファンの
前駆体を供給る、のに不十分となシ、そして細胞増殖が
止まるであろう。

いくつかの細胞内では自然発生的突然変異が起こり、そ
して捜し求める突然変異はαｒＯＦ遺伝子産物をフェニ
ルアラニン阻害から解放る、ものである。この突然変異
は生じた酵素反応がチロシンおよびトリプトファンの合
成を可能にる、が故にその突然変異体を増殖させるので
識別できる。

芳香族アミノ酸の合成において主としてａｒｏＦに依存
る、親株は、５り７１以上（最適には約１０　ｑ／ｌ　
）の濃度のフェニルアラニンの存在下に培養される。こ
のようなフェニルアラニン濃度で増殖る、ことができる
自然発生的突然変異体が、ａｒｏＦ内の突然変異（αｒ
ＯＦ　　）の結果として少なくとも一部発生し、上記ａ
ｒｏ　Ｆ　　はフェニルアラニンのフィードバック阻害
に対して感受性でない酵素をもたらす。同じ突然変異は
明らかにチロ／、／に対る、感受性も取り除く。ＫＢ２
５８のこのような突然変異体の１つはＫＢ３５８という
Ｘ、！！字が与えられ、そしてアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションＫ　ＡＴＣＣ５３０４６として
寄託された。この寄託菌は以下で説明る、条件下１Ｃ作
られる。

ＫＢ３５８はＫＢ２５８の増殖を阻害る、σ０度よりも
一層高濃度のフェニルアラニンの存在下に増殖る、こと
ができるが、増殖期に至る前に遅滞期が観桜される。

既知の技術を使ってＫＢ３５８からのａｒｏＦ＊を含め
た遺伝物質を他の大腸菌株に移し、それによってこれら
の受容菌株にａｒｏ　Ｆ　　の有利性を導入る、ことも
可能である。

フェニルアラニンの生産多数の菌株がフェニルアラニン発酵用の生産微生物とし
て使用できる。

アメリカン−タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴ
ＣＣ３３９２７として寄託された大腸菌Ｋ１２株ＹＭＣ
９（バックマン（Ｂａｃｋｍａｎ　）らの国立科学アカ
デミ−会報（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔんｅＮ
ａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ
ａｓ　）　ＵＳＡ７８（１９８１）、３７４３〜３７４
７を参照〕はｐＫＢ７１２またはｐＩ（Ｂ２Ｓ３を用い
て形質転換し、そして得られた細菌をＭ９塩、４ｍｇ／
ｍｌのグルコースおよび１μｇ／ｍｌのチアミンの存在
下３７℃で培養る、ＯＩＯ〜１５時間インキュベージョ
ンを続け、この時点で上清中のフェニルアラニン含有量
を測定る、。

プラスミドｐＫＢ７５０　または７）ＫＢ７１２は、「
細胞系列および発酵方法」と題る、本出願人の係属中の
米国特許出願第５３９９８１号（１９８３年１０月７日
付）に記載されるＫＢ２８５およびＩ（Ｂ２８０のよう
な大腸菌株を形質転換る、のに使用できる。また、ｐＫ
Ｂ６６３・はＫＢ３５８のような大腸菌の突然変異株を
形質転換る、のに用いられる。ＫＢ２８０およびＫＢ２
８５はそれぞれアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クショにＡＴＣＣ３９４６１およびＡＴＣＣ３９４６３
として寄託されている。得られた細菌を使って、本明細
書で述べたようにＬ−フェニルアラニンを合成る、。

フェニルアラニン濃度はフェニルアラニン検定ＡＴＣＣ
８０４２（ディフコ争マニュアル、１９５３）を使って
倣生物学的に定量る、。

ベクターｐＫＢ　６６３．ｐＫＢ７１２．ｐＫＢ７５０
゜ｐＫＢ７６６およびＫＢ３５８株はメリーランド州ロ
ックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンにそれぞれＡＴＣＣ３９４６２゜３９８５６．３９
８５７．３９８５８および５３０４６として寄託された
。本出乙１の譲受人であるバイオテクニカ・インターナ
７ヨナル社は、万一これらの培養物が交付されだ特許の
期間終了以前に死滅した場合にそれらを取り換える責任
と、上記特許の交付をＡＴＣＣに通知る、責任とを負い
、この時点で上記寄託物は一般の人々に利用できるよう
になるであろう。その時点までは上記寄託物は３７　Ｃ
ＦＲセクション１．１４および３５ＵＳＣセクシヨン１
１２の条件のもとて特許局長官に利用されるであろう。

他の実施態様他の実施態様は特許請求の範囲内のものである。

例えば、ベクターｐＫＢ６６３．　ｐＫＢ７１２　　お
よびｐＫＢ７５０の誘導体が発現ベクターとして使用で
き、またｐＫＢ７６６の誘導体が適当な外来プロモータ
ーを挿入る、場合の発現ベクター前駆体として使用でき
る。「誘導体」という用語は、自然界に存在る、かまた
は遺伝子操作により作シ出されたベクターの変異型であ
って意図る、機能を保持る、ものを意味る、。

上記選択方法および非フイードバツク調節アイソザイム
への依存は他の生合成経路、例えばリシン、メチオニン
およびトレオニンの生合成経路に適用できる。上記ベク
ターのだめの他の宿主も使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図はそれぞれプラスミドｐＫ、Ｂ６６３゜ｐＫ
Ｂ７１２．　ｐＫＢ７５０およびｐＫＢ７６６　を遺伝
子操作により作製る、際の工程を表わす０（外５名）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）生合成経路の反応を触媒し、且つ目的化合物また
はその代謝前駆体から成る阻害剤の第１の濃度レベルを
超える濃度においてその触媒活性が実質的に阻害される
第１アイソザイムのフィードバック阻害を回避すること
により、該生合成経路からの目的化合物の生産を増大さ
せるべく細胞を変換する方法であつて、該阻害剤の第１の濃度レベルにおいてその触媒活性が実
質的に阻害されない第２アイソザイムをコードする遺伝
子を含むＤＮＡを用いて該細胞を形質転換し、そして該
阻害剤濃度において目的化合物の生産を高めるのに十分
な量で該遺伝子が転写されることから成る方法。
（２）細胞が大腸菌種の一員である、特許請求の範囲第
１項記載の方法。
（３）阻害剤が目的化合物である、特許請求の範囲第１
項記載の方法。
（４）目的化合物が芳香族アミノ酸である、特許請求の
範囲第１項記載の方法。
（５）目的化合物がフェニルアラニンである、特許請求
の範囲第４項記載の方法。
（６）第１アイソザイムおよび第２アイソザイムがそれ
ぞれａｒｏＦ、ａｒｏＧおよびａｒｏＨの産物より選択
され、第１アイソザイムが第２アイソザイムとは異なる
遺伝子の産物である、特許請求の範囲第１項記載の方法
。
（７）第１アイソザイムがａｒｏＧの産物であり、そし
て第２アイソザイムがａｒｏＦまたはａｒｏＨの産物で
ある、特許請求の範囲第６項記載の方法。
（８）第２アイソザイムがａｒｏＦの産物である、特許
請求の範囲第７項記載の方法。
（９）該遺伝子の転写が転写抑制エフェクターによつて
フィードバック調節されており、そして該エフェクター
を数の面で上回るのに十分なコピー数の該遺伝子を該細
胞に提供することにより該転写調節が回避される、特許
請求の範囲第１項記載の方法。
（１０）目的化合物がトレオニン、メチオニンおよびリ
ジンの３種のアミノ酸より選択され、そしてアイソザイ
ムが該アミノ酸の少なくとも２種の生合成経路に共通す
る反応を触媒する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
（１１）特許請求の範囲第１項記載の方法により作られ
た細胞。
（１２）目的化合物を生合成しうる細胞であつて、該生
合成が該目的化合物またはその代謝前駆体によるフィー
ドバック阻害に抵抗するアイソザイムによつて触媒され
る反応から成り、該アイソザイムは転写が該目的化合物
またはその代謝前駆体によつてフィードバック抑制され
ない遺伝子により該細胞内で生産され、該細胞は該遺伝
子を含むＤＮＡを用いて前駆細胞を形質転換することに
より作られることを特徴とする上記細胞。
（１３）アイソザイムがａｒｏ遺伝子の産物であり、そ
して目的化合物が芳香族アミノ酸である、特許請求の範
囲第１２項記載の細胞。
（１４）アイソザイムがａｒｏＦまたはａｒｏＨの産物
であり、そして目的化合物がフェニルアラニンである特
許請求の範囲第１３項記載の細胞。
（１５）特許請求の範囲第１１または１２項記載の細胞
を液体培地で培養し、該培地から目的化合物を回収する
ことからなる目的化合物の生産方法。
（１６）目的化合物の生合成と細胞増殖にとつて必須の
第２化合物の生合成とに共通する化学反応を触媒すると
ころのフィードバック阻害される酵素をコードする遺伝
子を含む親細胞から、該親細胞の生産レベルよりも増大
した量の目的化合物を生産する突然変異細胞を選択する
方法であつて、該親細胞を酵素阻害濃度の阻害剤の存在下に培養し；そ
して増殖維持量の第２化合物が該酵素の触媒活性の結果とし
て得られるような条件下で増殖しうる突然変異細胞を選
択する；ことからなる上記方法。
（１７）該酵素が目的化合物によつて阻害される、特許
請求の範囲第１６項記載の方法。
（１８）該酵素が一定レベル以上の阻害剤濃度で阻害さ
れるアイソザイムであり、そして親細胞が該阻害剤濃度
レベルにおいて他のアイソザイムにより増殖維持量の第
２化合物を生産する能力を欠いている、特許請求の範囲
第１６項記載の方法。
（１９）該酵素がＤＡＨＰシンターゼであり、目的化合
物が芳香族アミノ酸である、特許請求の範囲第１６項記
載の方法。
（２０）目的化合物がフェニルアラニンであり、該酵素
がａｒｏＦによつてコードされる特許請求の範囲第１９
項記載の方法。
（２１）該酵素がトレオニン、メチオニンおよびリジン
のうち少なくとも２種のアミノ酸の生合成に共通する反
応を触媒するアイソザイムであり、そして目的化合物が
前記アミノ酸のうちの１種である、特許請求の範囲第１
６項記載の方法。
（２２）該酵素がさらに第２化合物によつてフィードバ
ック阻害され、そして選択された突然変異細胞が阻害剤
または第２化合物によつてフィードバック阻害されない
酵素を生産する、特許請求の範囲第１６項記載の方法。
（２３）特許請求の範囲第１６項記載の方法によつて作
られた突然変異細胞。
（２４）細胞ＫＢ３５８（ＡＴＣＣ５３０４６）または
その誘導株。
（２５）特許請求の範囲第２３項記載の細胞またはその
誘導株を培地にて培養し、該培地から目的化合物を回収
することからなる目的化合物の生産方法。