JPS6193948A - スクロ−スセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、スクロース（ショ糖）センサに関する。さ
らに詳しくは、固定化酵素を利用して試料中のショ糖の
定量を行なうことができ、天然物、生体試料、培養液等
の種々の試料中のショ糖の含有量を簡便に測定できるス
クロースセンサに関する。

（ロ）従来技術 スクロース（ショ糖）は下記に示すごとくβ−Ｄ−７フ
クトフフノシルーα−Ｄ−４’〜コピフッシト結合から
なシ、加水分解で１分子のβ−り一フルクトースと１分
子のα−Ｄ−グｙコースを生じることが知られている。

試料中における上記スクロースの定量法として最近、固
定化酵素カラムを備えたセンナを用いる方法が知られて
いる。このセンサは、β−フμクトフフノシダーゼ（イ
ンベμターゼ）をｆｉｌ定化したカラムに、試料溶液を
通過させることによりスクロースを酵素的に加水分解し
てβ−Ｄ−フルクトースとα−Ｄ−グ〃コースを生じせ
しめ、これをムタローゼを固定化したカラムに通過させ
ることによりその中のα−Ｄ−グ〃コースをβ−Ｄ−グ
ルコースに変換せしめ、これをβ−Ｄ−グルコース検出
器（例えば、グルコースオキンダーゼ固定化醇素と酸素
電極を組合せたグルコース計等）に導入してグルコース
−量を測定し、これに基づいて試料中のスクロース量を
定量しようとするものである。

しかしながら、上記β−フルクトフフノシダーゼ固定化
カカラを用いたセンサーにおいては、β−フルクトフラ
ノシダーゼがそもそもβ−Ｄ−フフクトフラノシル基ｔ
−Ｓ織して加水分解を行なう九め、意図するスクロース
以外にβ−Ｄ−フフク′トフフノシル結合を有するオリ
ゴ糖などにも作用してしまい、結局、限られた条件、す
なわちスクロース以外のフラクトフフノシμ基含有糖類
が実質的に存在しない条件下でないとスクロース量を定
量することができないという問題点かあつｆＣ。

（ノリ発明の目的 この発明は、上記問題点を解消すべくなされたものであ
り、他のβ−Ｄ−フックトフラノＶ〜基含有糖類が混在
した試料においても分離等の前処理を行なうことなくス
クロースのみを簡便に検知し定量できるスクロースセン
ナを提供しようとするものである。

本発明渚らは、スクロースを加水分解しうる酵素には上
記β−）〃クトフフノシダーゼ以外にα−Ｄ−グ〃コピ
フッＶｆｉ／基を認識して加水分解を行なうα−グルコ
シダーゼが存在する点に想着し、ことに数らるα−グル
コシダーゼの中でもスクロースに対して特異的に作用す
るとされてｉるビール酵母起源のα−グｌｖ：１クダー
ゼに着目し、鋭意研究を行なった結果、このα−グルコ
シダーゼが担体に固定化可能で６４）かつ固定化した際
においてもスクロースに対する特異的な加水分解作用が
発現されること及びこの固定化α−グ〃コシダーゼ担体
とムタローゼ固定化カラム並びにグルコース検出器を組
合せることによシ、高精度でスクロースの選択的な定量
が可能であることを見出しこの発明に到達した。

（ニ）発明の構成 かくしてこの発明によれば、ビール酵母起源のα−グル
コシダーゼを固定化してなる固定化酵素カラムと、ムタ
ローゼを固定化してなる固定化酵素カラムと、β−Ｄ−
グ〜コース検出器を順次備えたことを特徴とするスクロ
ースセンナが提供される。

この発明は、要するに従来の固定化β−フルクトフラノ
シダーゼの代わシにビール酵母起源の固定化α−グ〃コ
シダーゼを用いることによシ、種々のβ−Ｄ−フヲクト
フラノシル基含有糖類が混在した試料においてもスクロ
ースのみを高精度に定量できるように構成したものであ
る。

この発明におけるビール酵母起源のα−グルコシダーゼ
は、例えばシグマ（Ｓ工ＧＭＡ）社（米国）のα−ＧＬ
ＵＣＯＳよりＡＳＥ　−’１１７ｐｅ　Ｍの名称で容易
に入手可能である。

この発明に用いる上記α−グルコシダーゼの固定化酵素
カラムは、α−グルコシダーゼを種々の公知の方法で粒
子状や膜状の担体に固定化したものを充填してなる試料
溶液の流通可能なものが挙げられる。これらのうち、担
体として、金属アルコキクドや酸素を配位子とする有機
金属キレート化合物の加水分解によシ生成する金属水酸
化物系のゲル体、ことに粒子状のゲル体を用い、これに
上記α−グルコシダーゼを固定化させたものを用いるの
が、高い活性が得られスクロースのよ〕正確な定量゛を
行なえる点好ましい。この際の担体の原料となる金属７
μコキシドとしては、５ｉ（ＯＣＨｓ）４．５ｉ（ＯＣ
Ｊ、）４、Ｔｉ（ＯＣｓＨｙ）４、Ｖ（００２Ｈ５）３
、Ａ＃（ＯＣｓＨｙ）ｓ、Ｃｏ（ＯＣ＆）ａ、Ｎ１（Ｏ
ＣＪｓ）ｚ、Ｆｅ（ＱＣ，Ｈ，）、等が挙げられ、これ
らのうち低級アルコキシンフンが好ましい。また、酸素
を配位子とする有機金属キレート化合物としては、アル
カンジオン又はその誘導体の金属キレート化合物が適し
ており、例えば、２．４−ペンタンジオン（アセチルア
セトン）、３−フエニ／Ｌ’−２，４−ペンタンジオン
（３−フェニルアセチルアセトン）、２．４−ヘキサン
ジオン、２．４（又は３，５）−へブタンジオン、２，
２，６．６−チトラメテＡ／−３，５−ヘプタンジオン
（ジピバロイルメタン）等の低級７μカンジオン類のカ
ルシウム、アルミニウム、チタン、亜鉛、鉄又はカリラ
ムキレート化合物が挙げられる。これら金属７〜コキシ
ドや有機金属キレート化合物はもちろん混合して用いて
もよい。

このような原料を溶解した易揮発性Ｏ親水注溶謀溶液（
例えば、低級ア〃コーμ溶液）に酸を添加し放置するこ
とによシ加水分解を進めてゲル化させ、これを乾燥した
のち破砕することによシ、好まじり担体を得る仁とがで
きる。

このような担体へのα−グルコシダーゼの固定化は、通
常、この担体ｔシランカップリング剤〔例えはγ−アミ
ノプロピ〃トリエトキシシフン、Ｔ−クワロプロヒルト
リメトキシシフン、ビニルトリエトキクシフン、γ−グ
リシドキシグロビルトリメトキシシラン、Ｎ−β−（ア
ミノエテμ）−γ−アミノプロビルトリメトキシシフン
等〕の水溶液に接触させてシランカップリング剤をゲル
体中に水酸基を介して導入し次いで二官能性の固定化剤
（例えはグμりμアルデヒド等）の水溶液で処理した後
ビール酵母起源のα−グｆｉ／：ＩＶダーゼの水溶液を
接触させてα−グルコシダーゼをシランカップリング剤
伐基との化学結合により固定化することによって行なう
ことができる。ただし、場合によっては臭化シアン活性
化法のようにカップリング剤を介さずしてα−グルコシ
ダーゼを直接固定化することもできる。なおこの際の適
切な固定量は１０〜２０Ｕ／ダ担体である。

この発明に用いるムタローゼの固定化酵素カラムは、そ
れ自体公知のもの金適用す石ことかできるが、やはシ前
述のごとき金属水酸化物系のゲル体を用いるのが好まし
い。

一方、この発明に用いるβ−Ｄ−グ〃コース検出器とし
ては、少なくと４液中のβ−Ｄ−グルコースを検知しそ
の量を測定しうるものが種々適用テキ、例えば、グルコ
ースオキシダーゼ固定化酵素カラムと酸素電極とを流路
に組合せカラム通過前後の溶存酸素量の変化を測定して
試料溶液中のグ／Ｌ／コース量を測定する方式、グルコ
ースオキシダーゼ固定化膜を被覆した酸素電極からなる
グルコース電ｇｉｆｔ用いた方式、グルコースオキシダ
ーゼ固定化酵素カラムの通過液にルミノールと赤血塩又
はルミノールとビストリクロロフエニＩｖ蓚酸エステＡ
／（２）ごとき化学発光剤を混合してその化学発光量に
よジグμコース量を測定する方式などのグルコース検出
器が適用できる。

（ホ）実施例 以下この発明を図に示した実施例によシ詳説する０ 第１図は、この発明のスクロースセンサーを示す構成説
明図である０図においてスクロースセンサー（１）は、
緩衝液（５１）の供給路（５）を備えたα−グルコシダ
ーゼ固定化酵素カカラ（２）と、該カラム（２）から流
路（６）を介して接続されるムタローゼ固定化酵素カラ
ム（３）と、該カラム（３）から流路（））を介して接
続されるβ−Ｄ−グルコース検出器（４）とを備えてな
るＯ　（４１）は演算表示部、（５２）は試料導入口で
ある０ 上記、ａ−グルコンダーゼ固定化酵素カラム（２）は、
下記のようにして得られたものである。

（担体の作製） テトラエトキシシフン５ｉ（ＱＣ２Ｈｓ）４０．５２モ
〃、エタノ−Ａ／　１．７２モμ、水１．８２モμ、塩
酸０．０２８モ〃及び７ツ化水素酸０．０５８〜０．１
１５モルの混合物（ｐＨ約１）を室温下で均一になるま
で数十分混合攪拌し友。

次いで８０℃のウォーターパス中で３昼夜加熱して加水
分解反応で生じたエチル７μコーμ、水及び残存する塩
酸や未反応の微量のフッ化水素酸を蒸発することによシ
約３０９の多孔性ゲル状担体を得た。

（アミノア〃キ〃化） 上記で得られたゲル状担体を粉砕して１２０　／２０　
Ｑメツシュのビーズを得た。

５ｗｔ％のγ−アミノプロピμトリエトキシクフン水溶
液ｉ５Ｎ塩酸でｐＨ３，５に調整し、この溶液４５１＋
４に対し上記ビーズ状ゲμ状物を各々５２投入し、さら
にｐＨ３，５になるように調整した。この混合物を、攪
拌機、温度計、ジムロートを付設した四ツロフフスコに
入れウォーターパスで温度を７５℃に保ち、攪拌させな
がら３時間反応を行なった。

反応終了後、ビーズを吸引メンプランフィルターニ移し
、１４の蒸留水で未反応のγ−アミノプロピルトリエト
キシンランを除去した後、デシケータ−で乾燥させてア
ミノアルキル化グ〃状担体ヲ得た。このアミンアρキｐ
化ゲル状物はデシケータ−内で保存する。

（酵素の固定化） 上記アミノアルキル化ゲル状担体（ビーズ状）を二官能
性のグルタルアルデヒド（２，５ｗｔ％）のリン酸塩緩
衝溶液（ｐＨ７，０）　Ｉｃ浸漬し、アスピレータ−で
減圧させつつ約３０分攪拌下反応させ次。

続いてさらに約３０分常圧で攪拌下反応させた。反応温
度は３０℃でらった０これをｐＨ７’、ｏのリン酸塩緩
衝液で充分に洗浄し、乾燥させた。この処理によシゲμ
状物に７μデヒド基を有するシッフベースが導入される
。

得られたゲル状担体１００ｍ９を、ビール酵母起源のα
−グルコシダーゼ含有液（シグマ社を月相ＶＩ　；４０
Ｕ／ダ）５０Ｍ９のリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）溶液
（１０ｍ！’）に浸漬し、３０’Ｃ下湯せんで５時間ゆ
っくりと振散させて固定化反応を行ない、α−グルコシ
ダーゼ固定化酵素（ビーズ状）を得た。

この固定化酵素を、液入口及び液出口を備えたガラス製
の筒状容器（２，ｌＪ２＋’　Ｘ　５．０囚）Ｋ充填す
ることにより、前記α−グルコシダーゼ固定化酵素カカ
ラ（２）を得た。

なお、ムタローゼ固定化酵素カラム（３）は、ムタロー
ゼ８００　Ｕｔ′上記と同様にしてゲル状担体に固定化
し充填したものを用いた。また、β−Ｄ−グ〃コース検
出器（４）としては、高車りリニカルグルコース計（（
株）島津製作所製；グ〃コースオキシダーゼの作用によ
りバッチ槽中の液中の溶存酵素の減少速度を検知し、こ
れに基づいて液中のグルコース量を検知する方式）を用
いた０ま九緩衡液（５１）はリン酸塩ＩＩｃ衝液を用い
た。

このように構成され九スクロースセンサ（１）において
、スクロースを含んだ試料導入口（５２）より導入する
ことによシ、まずカラム（２）内でスクロースが選択的
に加水分解されてα−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−フルク
トースに変換され、次いでカラム（３）内でα−Ｄ−グ
ルコースがβ−Ｄ−グｐコースに変換され、これがβ−
Ｄ−グルコース検出器（４）で検出され、演算表示部（
４１）で発車グルコース量をベースとして試料中のスク
ロース濃度が定量されることとなる。

種々の濃度のスクロースを含有する試料を用いて、グル
コース生成量との関係を調べた結果を第２図に示した。

このようにスクロース濃度とグルコース生成量との間に
良好な直線関係が確認された０ （比較例） 上記実施例と同様にして約２００　ＵＯビーｌｖ酵母起
源のα−グμコシダーゼを有する固定化酵素ビーズを作
製し、比較例として同様に２００　Ｕのβ−フルクトフ
ラ７シダーゼを有する固定化酵素ビーズヲ作製し、これ
らのフラクトオリゴ糖に対する活性を評価した。なお、
フラクトオリゴ糖は下記のごとく加水分解してグルコー
スとフフクトースとを産生しうるものである。

酵素 また、実験は、フラクトオリゴ糖水溶液（５，ＯＷ／Ｖ
％）５０ｉ１中に上記固定化酵素ビーズを入れ、２０℃
下スターラーで攪拌し、この時間ごとのグルコース生成
量を前記と同様にグルコース量にて測定することにより
行なった。

この結果は第３図に示した。このようにこの発明に用い
るグルコシダーゼ固定化酵素は、β−フルクトフフノシ
ダーゼ固定化酵素に比してグルコース生成速度が低く、
実質的にフラクトオリゴ糖に対して不活性でラシ、スク
ロースに対して選択的な加水分解作用を有することが判
明した。なお、３時間後のグルコース生成量はグルコシ
ダーゼ固定化酵素については４５１９／（Ｌｇであり、
フラクトフラノシダーゼ固定化酵素については５３８■
／ジであり、１時間経過後に前者は全く作用していない
ことも判った。

（へ）発明の効果 以上述べたごとく、この発明のスクロースセンサーによ
れば、他のβ−Ｄ−７μクトフフノシル基含有糖類が混
在した試料においても、分離等の前処理を行なうことな
くスクロースを定量することができ種々の分野において
有用である。ことにβ−Ｄ−フルクトフラノシドのオリ
ゴ糖類を含む天然物中のショ糖含量の定量に有用である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明のスクロースセンナの一実施例を示
す構成説明図、第２図は、同実施例のセンサのスクロー
ス応答性を示すグラフ、第３図はビール酵母起源のα−
グルコシダーゼ固定化酵素のフラクトオリゴ糖に対する
活性を比較例と共に示すグラフでおる。 （１）・・・スクロースセンサ、 （２）・・・　α−グルコシダーゼ固定化酵素カラム、
（３）・・・ムタローゼ固定化酵素カラム、（４）・・
・β−Ｄ−グルコース検出器。 代理人　弁理士　　野河　倍大− ・５３゛ 第　１　図 竺　２　晒 スクロースｌ友（’／、）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビール酵母起源のα−グルコシダーゼを固定化し
   てなる固定化酵素カラムと、ムタローゼを固定化してな
   る固定化酵素カラムと、β−Ｄ−グルコース検出器を順
   次備えたことを特徴とするスクロースセンサ。