JPH025400B2

JPH025400B2 -

Info

Publication number: JPH025400B2
Application number: JP57148756A
Authority: JP
Inventors: Yoshinobu Myashita; Tadashi Hamanaka; Shinji Satomura
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1982-08-27
Filing date: 1982-08-27
Publication date: 1990-02-01
Also published as: JPS5939300A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規な基質、すなわち新規なアミロー
ス誘導体を基質として使用することを特徴とする
α−アミラーゼ活性の測定方法に関するものであ
る。試料、特にヒト生体内の唾液、膵液、血液、尿
中のα−アミラーゼ活性は医学上の診断において
重量である。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎に
おいては、血液、尿中のα−アミラーゼ活性は通
常の値に比べて著しい上昇を示す。 α−アミラーゼ活性の測定方法については、こ
れまでに種々の方法が発表されているが、主に、
アミロクラスチツク法、クロモゲニツク法、サツ
カロゲニツク法の３群に分類することができる。アミロクラスチツク法のうちではキヤラウエイ
法が最も広く使用されてきたが、共存タンパクが
デンプンをヨードの呈色を阻害するため、又反応
時間が短いため再現性が悪い等の問題点がある。クロモゲニツク法は一般にブルースターチ法と
呼ばれ、デンプン又はアミロースに色素を結合し
た不溶性基質を用い酵素反応で生成する可溶性色
素を測定する方法である。この方法は、最近広く
使用されているが、基質としての活性が弱いこ
と、不溶性であるため反応系が不均一であるこ
と、繁雑な操作が必要であり自動分析装置への適
用が困難であること等の問題点がある。サツカロゲニツク法ではソモジ−法が代表的で
あるが、試料中のグルコースにより高値を示す、
操作が繁雑である等の問題がある。このように従来のα−アミラーゼ活性の測定方
法には各々に個有の欠点があるが、さらに共通し
て、基質に使用しているデンプンの品質により測
定値にバラツキが生じる、又α−アミラーゼ反応
を真に化学量論的反応として測定できないという
欠点がある。本発明者等は、α−アミラーゼ活性を反応速度
法で精度よく、しかも自動分析装置で測定する方
法に関し鋭意研究を重ねた結果本発明を完成する
に到つた。本発明は、α−アミラーゼ活性を測定するに際
し、アミロースのグルコース単位６〜35毎にカル
ボキシメチル基（−CH₂COOH）又はその塩を
有するアミロース誘導体を基質として使用するこ
とを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法で
ある。カルボキシメチル基の塩としては、溶解してカ
ルボキシメチルイオンを与えるものが好ましく特
に限定されないが、例えば、Na、Ｋ、Li等のア
ルカリ金属塩、アンモニウム塩が代表例としてあ
げられる。 α−アミラーゼは、α−１、４−グリコシド結
合鎖を加水分解する酵素であり、α−１、６−グ
リコシド結合を含むデンプンあるいはアミロペク
チンではα−１、６−グリコシド結合がα−アミ
ラーゼ反応を妨害する。又、アミロースの方が化
学構造的に均一性が良い為、α−アミラーゼの基
質としてはデンプンあるいはアミロペクチンより
優れており、結果として測定精度が向上する。しかしながら、アミロースを基質としα−アミ
ラーゼにグルコアミラーゼあるいはα−グルコシ
ダーゼを共役させ生成するグルコースを測定する
方法に於いて、グルコアミラーゼあるいはα−グ
ルコシダーゼは、α−アミラーゼに関わりなくア
ミロースの非還元末端からα−１、４−グリコシ
ド結合を加水分解するエキソタイプの酵素である
ため、α−アミラーゼ反応に関係なく基質を分解
してしまう欠点を有する。この結果、測定用試液
中に、基質とグルコアミラーゼあるいはα−グル
コシダーゼの両方を含有できない、測定に充分な
グルコアミラーゼあるいはα−グルコシダーゼを
使用できない、又試薬盲検の著しい上昇を生じる
等、正確な測定法の組立てが困難であつた。さらに、アミロースは水に対する溶解性が極め
て低く、非常に老化（retrogradation）し易い分
子であることはよく知られている。〔デンプンハ
ンドブツク P.58〜91 朝倉書店（1961）〕本発明者らはかかる欠点を有するアミロースに
対し、アミロースのグルコース単位６個から35個
に１個の割合でカルボキシメチル基又はその塩を
導入したもの（以下修飾アミロースという）がア
ミラーゼの親和性に優れており良好な基質となる
こと、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼ
の基質とならないこと、さらに水に対する溶解性
が顕著に上昇し、アミラーゼの反応に至適な充分
量の基質濃度で使用できること、水溶液での安定
性が向上することを見出し本発明を完成するに至
つたものである。以下、本発明について例をあげて詳細に説明す
る。グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼはエ
キソタイプの酵素であるため本修飾基質を基質と
できない。これに対しα−アミラーゼはアミロー
スの任意のα−１、４グリコシド結合を加水分解
するエンド型酵素であり、本修飾基質を基質とで
きるため、α−アミラーゼの酵素作用によつて修
飾基質が加水分解されて非還元末端が新たに生成
する。この新たに生成した非還元末端に対してα
−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼが作用し
てグルコースが生成し、生成したグルコース量を
測定することによりα−アミラーゼ活性を知るこ
とが出来る。ここまでの反応式を次に示す。（上式中Ｇはグルコース単位、Ｘはカルボキシメ
チル基またはその塩を表わし、ｎ、ｍは２以上の
整数を表わす。）グルコースの定量方法は多数知られており、こ
れらの方法のいずれも使用できることは言うまで
もない。主なグルコースの定量方法を示す。まずグルコースにグルコースオキシダーゼを作
用させると酸化され、同時に過酸化水素が生じ
る。生成した過酸化水素は共存するペルオキシダ
ーゼを介して色原体を定量的に酸化し、生成した
酸化型色原体の呈色を比色することにより反応液
中のグルコース量を測定することができる。以下
に反応式を示す。ブドウ糖＋O₂＋H₂Oグルコースオキシダーゼ ―――――――――――→ H₂O₂＋グルコン酸 H₂O₂＋色原体ペルオキシダーゼ ――――――――→ 酸化型色原体＋H₂O また、グルコースはATP存在下ヘキソキナー
ゼによつてグルコース−６−リン酸となる。生成
したグルコース−６−リン酸はNAD存在下、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素によつて６−ホ
スホグルコノラクトンとなり、一方NADは還元
されNADHとなるのでこのNADHの340nｍ付近
に於ける吸光度の増加を測定することにより、反
応液中のグルコース量を測定することが出来る。
以下に反応式を示す。グルコース＋ATRヘキソキナーゼ ―――――――→ Mg²⁺グルコース−
６−リン酸＋ADP グルコース−６−リン酸＋NADグルコース−６−リン酸
脱水素酵素 ――――――――――――――――→ ６−ホスホグルコノラクトン＋NADH ATP；アデノシン−5′−トリリン酸塩 ADP；アデノシン−5′−ジリン酸塩 NAD；β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド NADH；還元型−β−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド本修飾アミロースを用いたα−アミラーゼ活性
側定法に於いて、α−アミラーゼと同時に又はこ
れに次いで共役酵素のグルコアミラーゼ、又はα
−グルコシダーゼを作用させ生成するグルコース
を測定するが、検体特に血清、尿などの生体試料
に共存するグルコースの影響を受ける可能性があ
り、α−アミラーゼの反応に先行して、既存グル
コースを消失することは本測定法を実施する上で
有効な手段となる。消去の方法としてはグルコースオキシダーゼ−
カタラーゼによる方法、ヘキソキナーゼによる方
法（特開昭57−47495号公報）、グルコースオキシ
ダーゼ−ペルオキシダーゼによる方法等、種々の
方法があり、いずれの方法も自由に組合せること
が可能である。本発明に使用する修飾アミロースの製法につい
てその例を述べると、分子量約3000から20万程度
のアミロース、水酸化ナトリウム、そしてモノク
ロル酢酸を水溶液中で反応させる。アミロースの
グルコース単位１モルに対し、アルカリは５〜30
モル、モノクロル酢酸は0.5〜５モルを使用する。
反応は約30〜70℃で30分〜３時間加熱撹拌するこ
とにより進行する。本反応は、S.Peat等の方法
〔Nature、159、810（1947）〕による。次いで生成物を中和後、中性付近の水溶液中で
グルコアミラーゼを加え37℃で10〜30時間作用さ
せ、修飾アミロースの非還元末端、あるいはその
近辺のグルコースにカルボキシメチル基又はその
塩が導入された修飾アミロースとなる。反応の一
般式を下に示す。（ここでＧはGlucose単位を示し、Ｘはカルボキ
シメチル基又はその塩を示す。ｎは正の整数、ｍ
は約５〜34の整数を表わす。）このグルコアミラーゼ処理は必須ではないが、
測定値の盲検値レベルを下げることに於いて有効
である。さらに反応生成物を外液に水を使用し透析する
透析作用により、塩化ナトリウム、ハイドロキシ
酢酸ナトリウム等の反応副生物及びグルコアミラ
ーゼにより加水分解されたグルコース除去され
る。次いで濃縮後、乾燥し修飾アミローを得る。
本生成物のカルボキシメチル化アミロースのナト
リウム塩のカルボキシメチル化度はPH滴定するこ
とにより求めることが出来る。アミロースに対し導入するカルボキシメチル基
又はその塩からなる修飾基の数はα−アミラーゼ
活性測定の精度、正確性の上で重要な要素とな
る。アミロースへの修飾基の多過ぎる導入は、α
−アミラーゼの作用を妨害し、グルコース５個に
対し１個以上の割合で修飾基を導入した場合、α
−アミラーゼの作用が低下する。したがつて、感
度、精度、正確性を低下させることになり実用に
耐えない。一方、導入量が少ない場合、修飾基によるアミ
ロースの溶解性向上への寄与が少なく、十分な溶
解度を有する修飾アミロースが生成しない。必要量の基質濃度を維持する為には、少なくと
もグルコース35個に１個以上の割合で修飾基が入
つていることが必要である。従つて修飾アミロースとしては、修飾基がアミ
ロースのグルコース単位６〜35個毎に１個含有す
るものが用いられる。本発明の測定対象となる試料は、α−アミラー
ゼを含有する検体なら何れを用いてもよく、例え
ば、生体成分として血液、血清、尿等がある。グルコアミラーゼ、又はα−グルコシダーゼと
しては、特に限定されないが例えば動物、微生物
由来のものが利用できる。又、本発明を実施する測定条件として、反応温
度は特に限定されないが、好ましくは約25〜40℃
であり、反応時間は目的により自由に選択でき
る。至適PHとしては特に限定されないが、PH約６〜
８が好ましい例である。至適PHを維持する緩衝剤
は自由に使用できるが、例えば、リン酸塩、グツ
ドの緩衝剤などがある。さらにα−アミラーゼの賦活剤として、例えば
塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム
等が使用される。アミラーゼ活性の測定方法は、一定条件での反
応速度を測定するレイトアツセイ、あるいは反応
停止剤を使用するワンポイントアツセイとしても
よく、いずれの測定方法も実施できる。本発明の修飾アミロースをα−アミラーゼ活性
の測定用基質として用いることにより、以下(イ)〜
(ト)の利点を有する測定法の組立てができる。 (イ) 本修飾アミロースは水に易溶なため、α−ア
ミラーゼ反応に充分な基質濃度を使用でき、検
量関係が良好で測定域が広い。 (ロ) 本修飾アミロースはグルコアミラーゼ、α−
グルコシダーゼの基質とはならず、α−アミラ
ーゼの特異基質であるため副反応が起らず、試
薬盲検値は極めて小さい。 (ハ) グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼの必
要十分量が使用可能なため、α−アミラーゼ反
応以降の反応が速く、正確なレイトアツセイが
可能である。 (ニ) グルコースの測定系に導びき、測定感度が高
く、精度の良い測定法の組立てができる。 (ホ) 測定操作が簡単である。 (ヘ) 自動分析装置への適応性が良い。 (ト) 測定用試液が安定である。以下に実施例を示しさらに詳しく説明する。実施例１修飾アミロースの調製試薬 (1) アミロース平均分子量約150000のアミロース (2) 水酸化ナトリウム溶液 50％水酸化ナトリウム溶液を調製する。 (3) モノクロル酢酸溶液 25％モノクロル酢酸溶液を調製する。 (4) グルコアミラーゼ Rhizopus由来実験方法アミロース10ｇに水150ml、水酸化ナトリウム
溶液50mlを加え、50℃で１時間撹拌混合する。次
いで25％モノクロル酢酸40mlを適下し、さらに50
℃で１時間加温する。室温まで冷却した後、塩酸で中和し、グルコア
ミラーゼ1000単位を加え37℃で約15時間作用させ
る。反応で副生した塩化ナトリウム、ハイドロキシ
酢酸ナトリウム、及びグルコースを除去するため
反応液を透析チユーブに入れ、外液にイオン交換
水を使用し50時間透析する。この液を濃縮後、凍結乾燥により修飾アミロー
スを得る。収率は90％であつた。本品の一定量に0.1N塩酸を加え、0.1N水酸化
ナトリウムでPH滴定を行うことによりアミロース
のカルボキシメチル化度を求める。アミロースの
グルコース単位約22個毎に１個の割合で、ソデイ
ウムカルボキシメチレートが入つていることを確
認した。実施例２試薬 (1) 試薬１グツド緩衝液（PIPES）40ｍmol、グルコア
ミラーゼ５万単位、グルコースオキシダーゼ10
万単位、ムタロターゼ200単位、カタラーゼ50
万単位、４−アミノアンチピリン0.7ｍmol、
塩化ナトリウム15ｍmol、塩化カルシウム５ｍ
molをとり精製水に溶かして水酸化ナトリウム
でPH6.9とし全量を１とする。 (2) 試薬２グツド緩衝液（PIPES）40ｍmol、ペルオキ
シダーゼ15000単位、塩化ナトリウム15ｍmol、
塩化カルシウム５ｍmol、実施例１で調製した
修飾アミロース３ｇ、窒化ナトリウム15ｍ
mol、フエノール10ｍmolをとり精製水に溶か
して水酸化ナトリウムでPH6.9とし全量を１
とする。測定方法試液１の２mlに検体血清20μを加え、37℃で
５分間加温する。これに試液２の１mlを加え、37
℃で反応させ505nｍに於ける２分後から５分後
までの３分間の吸光度変化（△Ｅ／分）を測定す
る。別にα−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い
上記と同様に操作して検量線を作製し、この検量
線から検体のα−アミラーゼ活性を求める。この時のの検量線を第１図に示す。試薬盲検とアミラーゼの測定結果を、基質にア
ミロースを使用したものと、修飾アミロースを使
用したものと比較して比較例として以下に示す。比較例１ (1) 試液３実施例２の試液１に同じ。 (2) 試液４実施例２の試液２に同じ。 (3) 試液５実施例２の試液２におけるソデイウムカルボ
キシメチル基が入つたアミロース３ｇの代わり
に平均分子量16000のアミロース0.3ｇを用い、
以下実施例２の試液２に同じ。 (4) 検体血清 α−アミラーゼ活性300Somogyi単位の血
清。測定方法試液３の２mlに検体血清20μ、もう一方には
精製水20μを加え、37℃で５分間加温する。これらの試液４の１mlを加え37℃で反応させ、
505nｍに於ける２分後から５分後までの３分間
の吸光度変化（△Ｅ／分）を測定し、基質に修飾
アミロースを用いた場合の血清アミラーゼと試薬
盲検の測定結果とする。又、試液４の代わりに試液５を使用し、以下上
記と同様に操作して基質にアミロースを用いた場
合の血清アミラーゼと試薬盲検の測定結果とす
る。結果を表１に示す。【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２における標準検体のα−ア
ミラーゼ活性（Somogyi単位／dl）と505nｍに
於ける吸光度変化（△Ｅ／分）との検量関係を示
した図である。標準検体のα−アミラーゼ活性は
500Somogyi単位である。

Claims

【特許請求の範囲】１ α−アミラーゼ活性を測定するに際し、アミ
ロースのグルコース単位６〜35毎にカルボキシメ
チル基（−CH₂COOH）又はその塩を有するア
ミロース誘導体を基質として使用することを特徴
とするα−アミラーゼ活性の測定方法。２ α−アミラーゼの共役酵素としてグルコアミ
ラーゼ又はα−グルコシダーゼを用い、生成する
グルコース量を測定することを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の測定方法。