JPS62100A - Ｎａｄ＋の水溶性高分子誘導体の合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、多酵素系で使用可能なニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（ＮＡＤＩ（）から誘導される補因子
の新規な合成方法に係る。

連続酵素反応は、固体担体に固定された酵素を用いるか
又は遊離酵素即ち水溶性であるが限外を過膜型の系によ
って反応媒体中に保持されている酵素を用いて生起され
得る。

後者の場合で酵素反応が補酵素を含み多酵素系を形成し
ているときは、反応媒体中に補因子が確実に保持される
ように補因子の分子サイズを増加する必要がある。この
ような補因子の保持によって反応生成物を容易に分離で
き、また反応後に再生を行うときは補酵素の化学量論的
添加によるコスト増を回避できる。

この種の多酵素反応において、補因子特にＮＡＤＨ（こ
れは最も多く使用される補因子である）を＃＃咽＊命反
応媒体中に維持し得るサイズの水溶性ポリマーと結合さ
せることが提案されている。

しかし乍ら補因子を用いる連続条酵素反応では、補因子
の活性が高いレベルに維持されることが必ルに維持する
ことは現在まで達成されていない。

本発明の目的は、ＮＡＤＨから誘導された水溶性高分子
補因子の新規な合成方法を提供することによって前記欠
点を是正することである。本発明の補因子は反応媒体中
で高い酵素活性を有し、この酵素活性はしばしばｒベー
ス」の補因子即ち合成原料となった補因子の活性を上回
る。

本発明の目的は、Ｎｌ１位またはＣ８位置が窒素又は酸
素の如きヘテロ原子１つ以上を含む炭化水素鎖によって
置換されたＮＡＤ＋核とアミノ酸ポリマーとから成るＮ
ＡＤＨの高分子誘導体の合成方法を提供することである
。本発明方法の特徴は、ＮＡＤ”のＮ８位又は０８位置
換誘導体を調製した後に、結合剤として２−エトキシ−
Ｎ−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン
（ＥＥＤＱ）を使用して前記ＮＡＤ＋の置換誘導体をア
ミノ酸ポリマーに結合することである。

１つ以上のへテロ原子を含む炭化水素鎖をＮＡＤ”核の
アデニン部分のＮ６位又は０８位に置換によって固定す
る方法の予備ステップは、従来の反応子°順によって実
行される。

ＮＡＤ”核に炭化水素鎖を固定する主な目的は立体障害
（ｅｎｃｏｍｂｒｅｍｅｎｔ　５ｔｅｒｉｑｕｅ）を生
じることなく補因子の活性部位を保護することである。

炭化水素鎖は更に、公知の安定なアミド結合を形成♂亨
ミノ酸ポリマーと容易に結合するも、のでなければなら
ない。

ＮＡＤ＋の置換誘導体として例えば、 Ｎ”−（２−カルボキシエチル）　−ＮＡＤ”　　　　
　　　　　（１）Ｎ８−カルボキシメチル−ＮＡＤ”　
　　　　　　　　　　（２）Ｎ’−（Ｎ−（６−アミノ
ヘキシル）−アセトアミド）　−ＮＡＤ”　（３）Ｃ’
−（６−アミノヘキシル）−アミノ−ＮＡＤ”　　　　
　　（４）Ｎ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ”　　
　　　　　　　　　（５）がある。

誘導体（５）はＳＣＩＭＩＤＴ及びＧＲＥＮＮＥＲ（１
９７６）Ｅｕｒ、　Ｊ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、６７．２９５−３０２に記載の方法で
調製され得る。

誘導体（２）及び（３）はＬＩＮＤＢＥＲＧ等（１９７
３）　Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、４０，１８７−１９３及びＥＮＧＬＡ
ＮＤ等（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｃａｌ　５ｏｃ
ｉｅｔｙ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓユ、１３−１７に
よって記載された手順で調製され得る。

誘導体（３）はＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）から販売されてい
る。

誘導体（４）は既に市販されている公知物質である（Ｐ
Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ＧｍｂＨ）。

主ステツプではＮＡＤ＋核の置換誘導体をアミノ酸ポリ
マーに結合する。該ポリマーとして例えば、−ポリ−Ｌ
−グルタミン酸の如き酸性アミノ酸ホモポリマー 一酸性アミノ酸含量の高いヘテロポリマー−タンパク質
の加水分解から得られるペプチド−上記ポリマーの結合
体 がある。

本発明の方法で使用可能なアミノ酸ポリマーはポリマー
の分子量の好適範囲は、 一ペプチド即ちタンパク質加水分解物の場合はａ、ｏｏ
ｏ〜ｔｏ、ｏｏ。

一酸性アミノ酸ホモポリマー及び酸性アミノ酸含量の高
いアミノ酸ヘテロポリマーの場合は２，０００〜１５，
０００ である。

酸性アミノ酸含量の高いアミノ酸ヘテロポリマーなる用
語は、アミノ酸の総存在量の３０重量％以上のＬ−グル
タミン酸及び／又はＬ−アスパラギン酸を含有するヘテ
ロポリマーを意味する。

ＮＡＤ＋の置換誘導体にアミノ酸ポリマーを固定するた
めに試薬ＥＥＤＱを使用する。

ＥＥＤＱは高収率のペプチド合成が得られる結合剤であ
る（ＢＥＬＬＥＡＵ及びＭＡＬＥＫ（１９６ｇ）Ｊ、Ａ
ｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。

９０、１６５１４６５２）。

本発明方法においてＥＥＤＱはポリアミノ酸にＮＡＤ”
の置換誘導体を固定するためのカルボジイミドの如き常
用の結合剤に比較して顕著な利点を示す（カルボジイミ
ドに関してはＺＡＰＰＥＬＬＩ等（１９７５）Ｅｕｒ、
　Ｊ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、５４，４７５−４８２に記載されてい
る）。

即ち、ＥＥＤＱは第一に有毒な反応副生物を生じない無
毒性試薬である。更に、結合反応の時間がカルボジイミ
ドの反応時間に比較して顕著に短い。

また、安定性がよくコストが安くまた反応媒体のｐＨ調
整が不要なの−で扱い易い。

更に、アミノ酸ポリマーに対するＮＡＤ＋の置換誘導体
の固定率が酵素活性に影響を与えることが判明した。最
適活性を与えるには 一活性に影響を与えるポリマー濃度を超過しない程度で
ＮＡＤ＋ＡＤ＋をアミノ酸ポリマーに十分に固定させる
（活性試験によればこの最大濃度は８町／−のオーダで
ある）こと、及び、 一立体障害によって極度の活性低下が生じないようにポ
リマーに対するＮＡＤ＋ＡＤ＋の過度の固定を回避する
こと が好ましい。

一般には固定率としてポリマー６当たり誘導体６００μ
ｍｏ１未満を選択する。最適固定率はＮＡＤ＋ＡＤ＋の
構造とポリマーの構造との双方に左右される。

従って誘導体とポリマーとの多数の組み合わ仕について
より狭い範囲を特定することはできない。

しかし乍ら例えば、後述の実施例１の生成物Ａの場合の
好適固定率はポリマー１ｇ当たり式（１）のＮＡＤ”誘
導体１００〜１５０μｍｏｌの範囲であり、実施例９の
生成物Ｆの場合の好適固定率はポリマー１ｇ当たりＮＡ
Ｄ＋誘導体誘導体３５註〜５００ この固定率を達成するには、生成物を合成するときに処
理条件特に反応媒体中のＮＡＤ″誘導体の濃度及び／又
は反応時間を調節するとよい。ＮＡＤ＋ＡＤ＋の濃度が
高いほど及び／又は反応時間が長いほど固定率が高くな
る。

本発明方法を実施例に基づいて以下に説明する。

寒１」■ ｌＯ町′のＣ’　−（６−アミノヘキシル）−アミノ−
ＮＡＤ″誘導体と７Ｍの尿素を含有する１０町のポリ−
Ｌ−グルタミン酸の水溶液２ｍとを混合した。０．５Ｍ
水酸化ナトリウム溶液を添加して混合物をｐｔｆ７．０
に調整した。９鬼のＥＥＤＱを含むｌ−のエタノール溶
液を添加し室温で２４時間反応させた。

エタノールを蒸発させ、７Ｍ尿素で平衡化し溶出するＢ
ｉｏｇｅｌ　Ｐ２カラムで混合物をクロマトグラフ処理
した。

誘導体を含有する第１の溶出ピークに対応する両分を４
℃の蒸留水５００ＴＲ１を３回交換して１５時間透析し
凍結乾燥した。

得られた生成物をＡと指称する。

実施例２ 一Ｌーグルタミン酸に対応する沈澱物を除去する付加ス
テップが必要である。

得られた生成物をＢと指称する。

実施例３ 尿素を使用しないで実施例１と同様の反応を実施する。

得られた生成物をＣと指称する。

実施例４ 先ず式（３）で示されるＮＡＤ＋の置換誘導体を調製す
る。

更に、ペプシンの存在中でウシ血清アルブミンを加水分
解してアミノ酸ポリマー（ペプチド）を調製する。加水
分解物をクロマトグラフ処理し平均分子量３，０００の
オーダの第１ピークに対応する両分を回収する。このた
めにＢＯＵＩＬＬＩＥＲ−ＯＵＤＯＴ（１９８１）Ｄｒ
、Ｉｎｇ、　　Ｔｈｅｓｉｓ　０ｒｄｅｒ　Ｎｏ、５６
ＮＳＡ　Ｔｏｕｌｏｕｓｅ（Ｆｒａｎｃｅ）に記載の手
順を用いる。

次に２７町のポリマーと６ｍｇの式（３）の置換誘導体
とを１．４ｉの蒸留水中で混合する。次に１．６ｍｌの
エタノールに溶解したＩＯ町のＥＥＤＱを混合物に添加
する。室温で７時間反応させ混合物を等容の低温エタノ
ール（−５℃）に２回に分けてゆっくりと流し込む。得
られた混合物を４℃で１晩静置した後４０００回転／分
で１０分間遠心して乾燥顆粒を得る。この顆粒を再溶解
し次にクロマトグラフで分別する。

得られた生成物をＤと指称する。

実施例５ 先ず式（５）で示されるＮＡＤ”の置換誘導体を調製す
る。

更に、実施例４で調製したポリマー（ペプチド）をポリ
−Ｌ−グルタミン酸と以下の手順で結合させてアミノ酸
ポリマーを調製する。

１０町のポリ−Ｌ−グルタミン酸を１．２ｄの７Ｍ尿素
水溶液に導入する。０．５Ｍ水酸化ナトリウムを添加し
混合物のｐｎを７．０に調整する。実施例４で調製した
ポリマー３．５躍をこの溶液に添加する。０．３−のエ
タノールに溶解させた２鬼のＥＥＤＱを混合物に流し込
む。

室温で２４時間反応させ得られた溶液を５００ｍの蒸留
水を３回交換して４℃で２４時間透析する。残存する沈
澱物即ちグルタミン酸を遠心分離によって除去する。

上記の如き結合によって得られた１３ｍｇのアミノ酸ポ
リマーを含有する１、４ｍｊの水溶液と、５４町の式（
５）のＮＡＤ”誘導体とに１．６ｍｌのエタノールに溶
解さけた８、５町のＥＥＤＱを添加する。室温で１５時
間反応させた後、溶液を２５０ｄの蒸留水を３回交換し
て８時間透析し凍結乾燥する。

得られた生成物をＥと指称する。

実施例６ 実施例１〜５に記載の方法で調製した生成物Ａ−Ｈに関
してヒドロゲナーゼの初期還元速度の測定試験を実施し
た。

この測定は、ＮＡＤ＋誘導体の結合ＮＡＤ＋に換算して
０．１７ｍＭの補酵素と５０ｍＭのトリスＨＣＩバッフ
ァｐＨ８，０と飽和量の水素と２９ｍＵの２１０／町ヒ
ドロゲナーゼとを含む０．２８ｍ１の反応媒体で行った
。

比較のためにＮＡＤ＋核及び式（４）及び（５）の置換
誘導体に関しても同じ測定を実施した。

得られた結果を表１に示す。

表１ 誘導体　　　　　初期還元率（％） ＮＡＤ”　　　　　　　　　１００ 誘導体（４）　　　　　　　５６ 誘導体（５）　　　　　　　９（１ Ｂ　　　　　　　　　　　７５ ＣＩ９．５ Ｄ　　　　　　　　　　　１２４ Ｅ　　　　　　　　　　　１４６ 叉１」巳 同じ生成物に関してＮａ２５ｔＯ＋で処理して還元し、
し−乳酸脱水素酵素の初期酸化速度の測定試験を実施し
た。

この測定は、（実施例６と同様に換算して）Ｑ、１７ｍ
Ｍの補酵素と５０ｍＭの同じバッファと１６ｍＭのピル
ビン酸ナトリウムと１７ｍＵの７０００／町のし−乳酸
脱水素酵素とを含む０．５ｍＩの反応媒体で行った。

比較のためにＮＡＤＨと式（４）の還元誘導体に関して
も同様の測定を実施した。

得られた結果を表２に示す。

表２ 誘導体　　　　　初期酸化率（％） ＮＡＤＨ１００ 式（４）の還元誘導体　　　６２．５ Ａ　　　　　　　　　　　　３３ Ｃ１２ Ｄ　　　　　　　　　　　　７５ Ｅ　　　　　　　　　　　　４０．５ 実施例８ ＣＯＬＯＷＩＣＫ（１９５１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、４０，１８７−１９３に記載の方法でＮＡＤ”誘導体
のＮＡＤ＋濃度を測定した。

得られた結果を表３に示すＪ 表３ 誘導体　　　結合ＮＡＤ”（μｍｏｌ／ＩＦ）誘導体（
５）　　　　　　２７．２ ＾　　　　　　　７５ Ｂ　　　　　　　　　　　　　　３２ Ｃ７５ Ｄ　　　　　　　　　　　　Ｉ２７ Ｅ　　　　　　　　　　　　１２．５ 実施例６及び７で得られた結果を検討すると、本発明方
法で得られたＮＡＤ＋の高分子誘導体がいずれも高度の
ＮＡＤ＋活性を有することが判明した。［ベースＪＮＡ
Ｄ”の活性を上回る活性を示す予想外の好結果（誘導体
り及びＥ）も得られた。

実施例９ 反応時間を２０時間に制限して実施例１に記載の方法に
よって誘導体を調製する。これにより生成物Ａ′を得る
。

更に、式（１）のＮＡＤ＋誘導体を式（３）の誘導体に
代え合成時間を１７時間に制限して同じ反応を実施し生
成物Ｆを得る。

生成物Ａ°及びＦの夫々の活性を検定するために、一方
では結合したＮＡＤ＋の濃度をＣ０ＬＯＷ　［ＣＫの方
法で測定し、他方では還元後の３４０ｎｍでの吸光度の
変化によって還元性ＮＡＤ”の濃度を測定する。

得られた結果を表４に示す。

表４ 誘導体　　　　結合ＮＡＤ”　　　　　還元性ＮＡＤ”
Ａ’　　　　　　　、６３　　　　　　　６３Ｆ　　　
　　　　３７７　　　　　　　２１０〔単位はポリ−Ｌ
−グルタミン酸１ｇ当りのμｍｏｌ　）更に、上記のご
とく調製された生成物Ａ゛及びＦを用いＡｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ　ｅｕｒｏｐｈｕｓのヒドロゲナーゼのＫＭ（
ＭＩＣｆＴＡＥＬＩＳ定数）の測定試験を実施する。

これらの測定は補因子と５０Ｉｌ１ＭトリスＨＣＩバッ
ファｐＨ８，０と飽和量の水素と９３ｍＵの３００／’
￥のヒドロゲナーゼとを含む０．５ｍｌの反応媒体中で
行い、結合ＮＡＤ＋に換算した補因子の濃度は 一生成物Ａ”ｔ’ｌ；ｔｏ、０３６４ｍＭ−０，５１６
ｍＭテアリー生成物Ｆでは０．１０６ｍト２．１３ｍＭ
である。

得られた結果を表５に示す。

表５

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）窒素又は酸素の如きヘテロ原子を１つ以上含む炭
   化水素鎖でＮ＾６位又はＣ＾８位が置換されたＮＡＤ＾
   ＋核とアミノ酸ポリマーとから成るＮＡＤ＾＋の水溶性
   高分子誘導体を合成する方法において、ＮＡＤ＾＋のＮ
   ＾６位又はＣ＾８位置換誘導体を調製した後、結合剤と
   して２−エトキシ−Ｎ−エトキシ−カルボニル−１，２
   −ジヒドロキノリンを使用して前記置換誘導体をアミノ
   酸ポリマーに結合することを特徴とする方法。
2. （２）アミノ酸ポリマーの分子量が、１，０００〜３０
   ，０００、好ましくは２，０００〜１５，０００である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）アミノ酸ポリマーが酸性アミノ酸ホモポリマーで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項
   に記載の方法。
4. （４）アミノ酸ポリマーが酸性アミノ酸含量の高いアミ
   ノ酸ヘテロポリマーであることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項又は第２項に記載の方法。
5. （５）アミノ酸ポリマーがタンパク質の加水分解によっ
   て得られたペプチドであることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項又は第２項に記載の方法。
6. （６）窒素又は酸素の如きヘテロ原子を１つ以上含む炭
   化水素鎖によってＮ＾６位又はＣ＾８位が置換されたＮ
   ＡＤ＾＋核と前記置換誘導体に結合したアミノ酸ポリマ
   ーとから成るＮＡＤ＾＋の水溶性高分子誘導体であって
   特許請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方
   法で調製されることを特徴とするＮＡＤ＾＋の水溶性高
   分子誘導体。
7. （７）連続多酵素処理における補因子としての特許請求
   の範囲第６項に記載の高分子誘導体の使用。