JPH0260311B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0260311B2 JPH0260311B2 JP56156335A JP15633581A JPH0260311B2 JP H0260311 B2 JPH0260311 B2 JP H0260311B2 JP 56156335 A JP56156335 A JP 56156335A JP 15633581 A JP15633581 A JP 15633581A JP H0260311 B2 JPH0260311 B2 JP H0260311B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- enzyme
- polymer
- dehydrogenase
- weight
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、溶液中における不安定酵素の安定化
に関するものである。特定の局面において、本発
明は、臨床診断分析において使用しうる可溶性の
安定化酵素に関するものである。
に関するものである。特定の局面において、本発
明は、臨床診断分析において使用しうる可溶性の
安定化酵素に関するものである。
酵素は、通常未知の化学構造を有する高分子量
かつ複雑な蛋白分子である。これらは、現在その
触媒活性と極端な基質特異性とによつて分類され
る。酵素は、単一基質の反応又は同類群の基質の
反応を触媒しうる生物学的触媒であると定義する
こともできる。
かつ複雑な蛋白分子である。これらは、現在その
触媒活性と極端な基質特異性とによつて分類され
る。酵素は、単一基質の反応又は同類群の基質の
反応を触媒しうる生物学的触媒であると定義する
こともできる。
診断分析において使用される酵素溶液の安定性
は、個々の測定を経過時間にわたつて行なう場
合、これらの測定値間で精確さと均一性とを示す
ような分析法を提供する上で重要である。分析の
再現性が得られないことに加え、酵素溶液の不安
定性はさらに医療の費用を増々高めることにな
る。何故なら、不安定な酵素溶液は廃棄して、新
たな溶液を調合する必要があるからである。
は、個々の測定を経過時間にわたつて行なう場
合、これらの測定値間で精確さと均一性とを示す
ような分析法を提供する上で重要である。分析の
再現性が得られないことに加え、酵素溶液の不安
定性はさらに医療の費用を増々高めることにな
る。何故なら、不安定な酵素溶液は廃棄して、新
たな溶液を調合する必要があるからである。
最近推計されたところでは、アメリカ合衆国に
おいて一年間に行なわれた全試験管診断試験のう
ち約25％が信頼できないものであつた。信頼でき
ない試験は不必要な医療処置と必要処置の棚上げ
と収入減とをもたらすであろう。酵素測定の使用
はその高特異性のため過去数年間にわたり急成長
し、この傾向は持続するであろうと示唆されてい
る。しかしながら、結果の精度と一致性とを確保
するには、厳しい品質管理手段が必要とされる。
この要請は、酵素の正確な本質並びにその反応の
メカニズムが大部分未知であることに基因する。
おいて一年間に行なわれた全試験管診断試験のう
ち約25％が信頼できないものであつた。信頼でき
ない試験は不必要な医療処置と必要処置の棚上げ
と収入減とをもたらすであろう。酵素測定の使用
はその高特異性のため過去数年間にわたり急成長
し、この傾向は持続するであろうと示唆されてい
る。しかしながら、結果の精度と一致性とを確保
するには、厳しい品質管理手段が必要とされる。
この要請は、酵素の正確な本質並びにその反応の
メカニズムが大部分未知であることに基因する。
現在、診断用試薬製造上の最大の制約は、主と
して酵素溶液の不安定な特性にある。現在の診断
法は不安定な成分の使用を必要としている。酵素
の不安定性のため、この種の酵素溶液を製造する
際及び乾燥媒体製剤を再編成する際並びにこの種
の酵素溶液を調合する際、厳しい品質管理が必要
とされ、このような品質管理は高価につく。さら
に、この管理が工程のどこかの段階で高精度内に
維持されないと、最終製品の品質が著しく低下し
て、分析結果の精度を低下させることになる。
して酵素溶液の不安定な特性にある。現在の診断
法は不安定な成分の使用を必要としている。酵素
の不安定性のため、この種の酵素溶液を製造する
際及び乾燥媒体製剤を再編成する際並びにこの種
の酵素溶液を調合する際、厳しい品質管理が必要
とされ、このような品質管理は高価につく。さら
に、この管理が工程のどこかの段階で高精度内に
維持されないと、最終製品の品質が著しく低下し
て、分析結果の精度を低下させることになる。
酵素の反応能力を安定化させるため現在用いう
る技術状態は、固体マトリツクスに対する酵素の
固定、凍結乾燥、主として製薬、診断及び関連工
業において乾燥粉末を錠剤化するため用いられて
いるような乾式配合、或いは固体マトリツクスに
対する酵素の化学構造の固定による不動化であ
る。これらの用語が暗示する精巧さに反し、これ
らの方法は実用的でも望ましいものでもなく、か
つまた高価につく。製造業者は、水を除去して半
製品を供給せざるを得ず、したがつて最終製品の
希釈及び使用において品質管理工程の一部を放棄
せざるを得ない。工場は包装、試薬廃棄、凍結乾
燥及び乾式配合に高経費を費さねばならない。さ
らに、製品の有用性は包装の様式及び寸法によつ
ても制約される。
る技術状態は、固体マトリツクスに対する酵素の
固定、凍結乾燥、主として製薬、診断及び関連工
業において乾燥粉末を錠剤化するため用いられて
いるような乾式配合、或いは固体マトリツクスに
対する酵素の化学構造の固定による不動化であ
る。これらの用語が暗示する精巧さに反し、これ
らの方法は実用的でも望ましいものでもなく、か
つまた高価につく。製造業者は、水を除去して半
製品を供給せざるを得ず、したがつて最終製品の
希釈及び使用において品質管理工程の一部を放棄
せざるを得ない。工場は包装、試薬廃棄、凍結乾
燥及び乾式配合に高経費を費さねばならない。さ
らに、製品の有用性は包装の様式及び寸法によつ
ても制約される。
さらに、診断分析に製品を使用するような工場
においては特に、良好な製品均一性を得ることが
困難である。一般に、凍結乾燥の再編溶液は室温
においてたとえば約24時間乃至５日間という比較
的短い安定性しか持たない。したがつて、その使
用はこのような短い貯蔵寿命によつて制約され
る。
においては特に、良好な製品均一性を得ることが
困難である。一般に、凍結乾燥の再編溶液は室温
においてたとえば約24時間乃至５日間という比較
的短い安定性しか持たない。したがつて、その使
用はこのような短い貯蔵寿命によつて制約され
る。
本発明は、不安定成分を液体試薬中に含有する
にも拘らず酵素溶液を効果的に「安定化」させ、
それにより液状溶液中での不安定成分の活性を管
理するよう独特に設計したものである。安定性を
付与するこの方法は液体媒体中において長期間の
安定性を保証する。さらに、高品質製品の製造に
おいて綿密な許容性管理が達成され、これにより
厳格な包装寸法の不便さ、包装及び凍結乾燥の高
経費並びに試薬廃棄が避けられる。
にも拘らず酵素溶液を効果的に「安定化」させ、
それにより液状溶液中での不安定成分の活性を管
理するよう独特に設計したものである。安定性を
付与するこの方法は液体媒体中において長期間の
安定性を保証する。さらに、高品質製品の製造に
おいて綿密な許容性管理が達成され、これにより
厳格な包装寸法の不便さ、包装及び凍結乾燥の高
経費並びに試薬廃棄が避けられる。
臨床上の診断分野において、酵素分析の実際的
応用は、生物学的液体中の次の成分を決定かつ定
量するのに使用する診断用試薬により代表される
が、これらのみに限定されるものではない： １ グルタミン酸−オキザル酢酸トランスアミナ
ーゼ（SGOT）、 ２ グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（SGPT）、 ３ 乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、 ４ クレアチンホスホキナーゼ（CPK）、 ５ α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（α−
HBD）、 ６ グルコース（ヘキソキナーゼ−Ｇ−６−
PDH又はグルコースデヒドロゲナーゼによ
る）、及び ７ 血中尿素態窒素（BUN）。
応用は、生物学的液体中の次の成分を決定かつ定
量するのに使用する診断用試薬により代表される
が、これらのみに限定されるものではない： １ グルタミン酸−オキザル酢酸トランスアミナ
ーゼ（SGOT）、 ２ グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（SGPT）、 ３ 乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、 ４ クレアチンホスホキナーゼ（CPK）、 ５ α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（α−
HBD）、 ６ グルコース（ヘキソキナーゼ−Ｇ−６−
PDH又はグルコースデヒドロゲナーゼによ
る）、及び ７ 血中尿素態窒素（BUN）。
上記成分につき診断分析を行なうための試薬は
同じように反応し、幾種かの共通の不安定成分を
含有しかつ関与する化学反応の幾つかは共通であ
る。下記の反応系を、関与する反応の一般的性
質を示すためのモデルとして示す。
同じように反応し、幾種かの共通の不安定成分を
含有しかつ関与する化学反応の幾つかは共通であ
る。下記の反応系を、関与する反応の一般的性
質を示すためのモデルとして示す。
反応系
(1) 基質酵素１
pH生成物
(2) 生成物／基質＋NAD−NADH酵素２
pH
NADH−NAD＋副生物
(3) NADH＋クロモゲン（酸化型）触媒
クロモゲン（還元型）＋NAD
上記した全ての酵素反応はこの一般的系に従
い、ここで反応(2)は通常結合反応と呼ばれ、反応
(2)又は(3)は測定反応であり、反応(1)は主反応とし
て特徴付けることができる。しかしながら、必ら
ずしも３種の反応が全て測定に必要とされるわけ
でなく、実際上２種又は１種に限られることが理
解される。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）活性
の紫外線測定の場合、次のように反応(2)のみが関
与する。
い、ここで反応(2)は通常結合反応と呼ばれ、反応
(2)又は(3)は測定反応であり、反応(1)は主反応とし
て特徴付けることができる。しかしながら、必ら
ずしも３種の反応が全て測定に必要とされるわけ
でなく、実際上２種又は１種に限られることが理
解される。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）活性
の紫外線測定の場合、次のように反応(2)のみが関
与する。
反応系−−LDH
ピルビン酸＋NADHLDH
NAD＋乳酸
逆に、上記した３種より多い反応も、たとえば
クレアチンホスホキナーゼ（CPK）の場合のよ
うに関与することがある。
クレアチンホスホキナーゼ（CPK）の場合のよ
うに関与することがある。
反応系−−CPK
(1) CP＋ADPCPK
ATP＋クレアチン
(2) ATP＋グルコースHK
グルコース
−６−PDH＋NADH
(3) グルコース−６−燐酸＋NAD
Ｇ−６−PDH＋NADH
(4) NADH＋（酸化剤）PMS
（還元剤）＋NAD
この場合、反応(2)及び(3)は結合反応と考えるこ
とができ、反応(3)又は(4)は測定反応であり、反応
(1)は主反応である。
とができ、反応(3)又は(4)は測定反応であり、反応
(1)は主反応である。
本明細書中及び上記反応系において次の記号を
使用する。使用した記号は臨床診断分野において
一般的に認められた記号である。
使用する。使用した記号は臨床診断分野において
一般的に認められた記号である。
記 号
CP：燐酸クレアチン
ADP：アデノシン−5′−二燐酸
ATP：アデノシン三燐酸
HK：ヘキソキナーゼ
NAD：ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチ
ド NADH：ニコチンアミド−アデニンジヌクレオ
チド、還元型 Ｇ−６−PDH：グルコース−６−燐酸デヒドロ
ゲナーゼ INT：テトラゾリウム塩 PMS：フエナジンメト硫酸 Ｌ−ASP：Ｌ−アスパラギン酸 OAA：オキザル酢酸 GLU：グルタミン酸 反応系について述べれば、この反応順序の使
用が反応基質／生成物又は触媒酵素のいずれかに
関する定量分析を可能にすることは明らかであり
かつ一般的知識である。
ド NADH：ニコチンアミド−アデニンジヌクレオ
チド、還元型 Ｇ−６−PDH：グルコース−６−燐酸デヒドロ
ゲナーゼ INT：テトラゾリウム塩 PMS：フエナジンメト硫酸 Ｌ−ASP：Ｌ−アスパラギン酸 OAA：オキザル酢酸 GLU：グルタミン酸 反応系について述べれば、この反応順序の使
用が反応基質／生成物又は触媒酵素のいずれかに
関する定量分析を可能にすることは明らかであり
かつ一般的知識である。
生物学的液体におけるこれら成分の定量は、人
間及び動物の病的状態の診断及び処置において充
分に許容されかつ広く使用される診断手段であ
る。
間及び動物の病的状態の診断及び処置において充
分に許容されかつ広く使用される診断手段であ
る。
不安定な酵素は本発明により処理されて、酵素
反応性又は測光吸光度に影響を与えることなく長
期間の安定性をもたらす。本発明は、製造、包
装、貯蔵及び使用の全体を通じて品質管理が確保
されるような試薬を提供する。厳格な包装寸法の
不便さが除かれ、同様に包装、凍結乾燥及び試薬
廃物の高経費も除かれる。液状の安定化された可
溶性酵素の溶液は使用上の融通性を与える。各成
分の分離は、無視しうる製造費を以て容易に行な
われる。本発明における液状の安定化された可溶
性酵素の溶液は、全ての副反応が消散された後、
所望の酵素反応を開始させる融通性を与える。
反応性又は測光吸光度に影響を与えることなく長
期間の安定性をもたらす。本発明は、製造、包
装、貯蔵及び使用の全体を通じて品質管理が確保
されるような試薬を提供する。厳格な包装寸法の
不便さが除かれ、同様に包装、凍結乾燥及び試薬
廃物の高経費も除かれる。液状の安定化された可
溶性酵素の溶液は使用上の融通性を与える。各成
分の分離は、無視しうる製造費を以て容易に行な
われる。本発明における液状の安定化された可溶
性酵素の溶液は、全ての副反応が消散された後、
所望の酵素反応を開始させる融通性を与える。
本発明の安定化された可溶性酵素は、酵素試薬
を新鮮酵素と比較する研究で評価される。これら
の研究は、古い水性試薬と新鮮試薬との間で１：
１の相関関係を示し、同等な感度と精度とを有す
ることを示す。
を新鮮酵素と比較する研究で評価される。これら
の研究は、古い水性試薬と新鮮試薬との間で１：
１の相関関係を示し、同等な感度と精度とを有す
ることを示す。
診断酵素学において、既製液体媒体における酵
素試薬の安定化は、臨床実験室の需要及び管轄官
庁の信頼性要求を満足させる新規かつ画期的な方
法である。安定化された液体酵素系の融通性は、
自動化機器に対する応用を保証すると共に、貯蔵
寿命の制約による試薬廃棄なしに手動試験におけ
る便利さをも保証する。
素試薬の安定化は、臨床実験室の需要及び管轄官
庁の信頼性要求を満足させる新規かつ画期的な方
法である。安定化された液体酵素系の融通性は、
自動化機器に対する応用を保証すると共に、貯蔵
寿命の制約による試薬廃棄なしに手動試験におけ
る便利さをも保証する。
溶液中の不安定酵素の安定化は、本発明によれ
ば、液体媒体中において、安定化すべき酵素をこ
の酵素上の側基と共有結合しうるような修飾基を
有する重合体と反応させることにより達成され
る。酵素と重合体とをさらに、酵素の活性に作用
を及ぼす少なくとも１種の物質と混合する。酵素
の活性に作用を及ぼしうるこの種の物質は酵素の
ための基質、基質と酵素との間の酵素反応により
生ずる生成物、酵素のための活性剤及び（又は）
酵素の抑制剤とすることができる。さらに、重合
体の側基と競合的に反応する物質を加えることも
できる。すなわち、重合体上の側基と結合させる
には、酵素上の側基と競合する物質を加えること
ができる。たとえば、アルブミン及びゼラチンの
ような蛋白質様の物質を加えて、重合体の側基と
の反応において競合させることができる。
ば、液体媒体中において、安定化すべき酵素をこ
の酵素上の側基と共有結合しうるような修飾基を
有する重合体と反応させることにより達成され
る。酵素と重合体とをさらに、酵素の活性に作用
を及ぼす少なくとも１種の物質と混合する。酵素
の活性に作用を及ぼしうるこの種の物質は酵素の
ための基質、基質と酵素との間の酵素反応により
生ずる生成物、酵素のための活性剤及び（又は）
酵素の抑制剤とすることができる。さらに、重合
体の側基と競合的に反応する物質を加えることも
できる。すなわち、重合体上の側基と結合させる
には、酵素上の側基と競合する物質を加えること
ができる。たとえば、アルブミン及びゼラチンの
ような蛋白質様の物質を加えて、重合体の側基と
の反応において競合させることができる。
酸素上の側基と共有結合しうる側基を持つた重
合体は、式 〔式中、ｎは整数であり、Ｒは水素、アルキル、
アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリ
ール、アルカリ−ル、アラルキル及び から選択される基とすることができる〕 の構造単位を有する重合体とすることができる。
合体は、式 〔式中、ｎは整数であり、Ｒは水素、アルキル、
アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリ
ール、アルカリ−ル、アラルキル及び から選択される基とすることができる〕 の構造単位を有する重合体とすることができる。
このような構造を有する特に好適な重合体は、
エチレンと無水マレイン酸との共重合体である。
重合体の無水マレイン酸部分は酵素の修飾アミノ
基と反応する。
エチレンと無水マレイン酸との共重合体である。
重合体の無水マレイン酸部分は酵素の修飾アミノ
基と反応する。
本発明において有用な他の重合体は、ポリアク
リル酸及びポリメタクリル酸の無水物である。こ
の種の重合体は別途に調製することができ、或い
はその場で生成される中間体とすることもでき
る。たとえば、この種の重合体の使用しうる構造
及び生成系は次の通りである： 〔式中、ＲがＨである場合は重合体はポリアクリ
ル酸であり、ＲがCH3である場合は重合体はポリ
メタクリル酸である〕。
リル酸及びポリメタクリル酸の無水物である。こ
の種の重合体は別途に調製することができ、或い
はその場で生成される中間体とすることもでき
る。たとえば、この種の重合体の使用しうる構造
及び生成系は次の通りである： 〔式中、ＲがＨである場合は重合体はポリアクリ
ル酸であり、ＲがCH3である場合は重合体はポリ
メタクリル酸である〕。
この種の重合体に熱と減圧とをかけると、或い
はたとえばジシクロルヘキシルカルボジイミドの
ような適当な脱水剤によりこの種の重合体を脱水
すると、下記の構造を有する中間体がその場で生
成する： 本発明の方法により生成される溶液中で安定化
させうる酵素は、たとえばオキシドレダクター
ゼ、トランスフエラーゼ及びヒドラーゼのような
酵素を包含する。さらに、インターナシヨナル・
ユニオン・オブ・バイオケミストリーにより付与
された番号で同定されるような次の酵素も本発明
の方法により溶液中で安定化させることができ
る： １ リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH） E.
C.1.1.1.37 ２ クラレチンキナーゼ（CK、CPK） E.
C.2.7.3.2 ３ アルカリホリフアターゼ（AP、ALP、ALK
−Phos.） E.C.3.1.3.1 ４ アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼ
（AST、OT、GOT、SGOT） E.C.2.6.1.1 ５ アラニンアミノトランスフエラーゼ（ALT、
PT、GPT、SGPT） E.C.2.6.1.2 ６ γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γGT、γGTP） E.C.2.3.2.1 ７ α−アミラーゼ E.C.3.2.1.1 ８ β−アミラーゼ E.C.3.2.1.2 ９ 乳酸デヒドロゲナーゼ（LD、LDH、ラクチ
ツクデヒドロゲナーゼ） E.C.1.1.1.27 10 グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ
（G6PDH） E.C.1.1.1.49 11 ヘキソキナーゼ（HK） E.C.2.7.1.1 12 グルコースデヒドロゲナーゼ E.C.1.1.1.47 13 グルコースオキシダーゼ E.C.1.1.1.34 14 ペルオキシダーゼ（HRP、HPO、PO）
E.C.1.11.1.7 15 グリセリンデヒドロゲナーゼ E.C.1.1.1.6 16 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ E.C.1.4.1.3 17 コレステロールオキシダーゼ E.C.1.1.3.6 18 コレステロールエステラーゼ E.C.3.1.1.13 19 リパーゼ E.C.3.1.1.3 20 ウリカーゼ E.C.1.7.3.3 21 ウレアーゼ E.C.3.5.1.5 22 グリセリンキナーゼ E.C.2.7.1.30 ここに例として示したこれら酵素群の他、たと
えばリアーゼ、リガーゼ及びイソメラーゼのよう
な酵素も本発明により安定化させることができ
る。
はたとえばジシクロルヘキシルカルボジイミドの
ような適当な脱水剤によりこの種の重合体を脱水
すると、下記の構造を有する中間体がその場で生
成する： 本発明の方法により生成される溶液中で安定化
させうる酵素は、たとえばオキシドレダクター
ゼ、トランスフエラーゼ及びヒドラーゼのような
酵素を包含する。さらに、インターナシヨナル・
ユニオン・オブ・バイオケミストリーにより付与
された番号で同定されるような次の酵素も本発明
の方法により溶液中で安定化させることができ
る： １ リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH） E.
C.1.1.1.37 ２ クラレチンキナーゼ（CK、CPK） E.
C.2.7.3.2 ３ アルカリホリフアターゼ（AP、ALP、ALK
−Phos.） E.C.3.1.3.1 ４ アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼ
（AST、OT、GOT、SGOT） E.C.2.6.1.1 ５ アラニンアミノトランスフエラーゼ（ALT、
PT、GPT、SGPT） E.C.2.6.1.2 ６ γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γGT、γGTP） E.C.2.3.2.1 ７ α−アミラーゼ E.C.3.2.1.1 ８ β−アミラーゼ E.C.3.2.1.2 ９ 乳酸デヒドロゲナーゼ（LD、LDH、ラクチ
ツクデヒドロゲナーゼ） E.C.1.1.1.27 10 グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ
（G6PDH） E.C.1.1.1.49 11 ヘキソキナーゼ（HK） E.C.2.7.1.1 12 グルコースデヒドロゲナーゼ E.C.1.1.1.47 13 グルコースオキシダーゼ E.C.1.1.1.34 14 ペルオキシダーゼ（HRP、HPO、PO）
E.C.1.11.1.7 15 グリセリンデヒドロゲナーゼ E.C.1.1.1.6 16 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ E.C.1.4.1.3 17 コレステロールオキシダーゼ E.C.1.1.3.6 18 コレステロールエステラーゼ E.C.3.1.1.13 19 リパーゼ E.C.3.1.1.3 20 ウリカーゼ E.C.1.7.3.3 21 ウレアーゼ E.C.3.5.1.5 22 グリセリンキナーゼ E.C.2.7.1.30 ここに例として示したこれら酵素群の他、たと
えばリアーゼ、リガーゼ及びイソメラーゼのよう
な酵素も本発明により安定化させることができ
る。
液体媒体中における酵素の安定化は、酵素の活
性に作用を及ぼす少なくとも１種の物質を重合体
及び酵素と混合することにより高められ、この物
質は酵素のための基質、酵素と基質との生成物、
酵素のための活性剤及びこの種の酵素の抑制剤よ
りなる群から選択される。
性に作用を及ぼす少なくとも１種の物質を重合体
及び酵素と混合することにより高められ、この物
質は酵素のための基質、酵素と基質との生成物、
酵素のための活性剤及びこの種の酵素の抑制剤よ
りなる群から選択される。
酵素を安定化させるための液体媒体は、ジメチ
ルスルホキシド、アセトン、ジメチルホルムアミ
ド及びピリジンから選択される有機溶剤の水溶液
からなつている。さらに、液体媒体は、約５〜約
10のPHを与える緩衝剤からなることもできる。緩
衝剤はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、イミダゾール、トリエタノールアミン及び燐
酸緩衝剤よりなる群から選択される。
ルスルホキシド、アセトン、ジメチルホルムアミ
ド及びピリジンから選択される有機溶剤の水溶液
からなつている。さらに、液体媒体は、約５〜約
10のPHを与える緩衝剤からなることもできる。緩
衝剤はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、イミダゾール、トリエタノールアミン及び燐
酸緩衝剤よりなる群から選択される。
追加物質を酵素と重合体の反応混合物又は溶液
に加えることができる。この種のその他物質は、
たとえばアルブミン及びゼラチンから選択される
蛋白質様物質のような蛋白質様物質を包含する。
に加えることができる。この種のその他物質は、
たとえばアルブミン及びゼラチンから選択される
蛋白質様物質のような蛋白質様物質を包含する。
ここに示した本発明の応用は主として臨床生化
学の分野に関するが、本発明の用途は他の分野に
も拡張されることが当業者には明白であろう。広
汎な種類の工業上、製薬上及び化粧に関する工程
及び製品は溶液中の、懸濁液中の及び固体表面上
に不動化させた酵素を利用する。たとえば本発明
により提供されるような酵素の高度熱安定性とい
う性質が広く求められている。ここに開示した方
法により安定化された酵素は、主として均質な水
溶液を生成するが、透析及びイオン交換を含む各
種の技術により反応体及び生成物から容易に分離
される。安定化酵素が耐えうる高温度は、バツチ
式及び連続式工業工程において、より短い反応時
間を可能にする。調合製品中にこの種の安定化酵
素を使用すれば、より長い製品貯蔵寿命及び（又
は）大して厳格でない貯蔵条件が可能となる。
学の分野に関するが、本発明の用途は他の分野に
も拡張されることが当業者には明白であろう。広
汎な種類の工業上、製薬上及び化粧に関する工程
及び製品は溶液中の、懸濁液中の及び固体表面上
に不動化させた酵素を利用する。たとえば本発明
により提供されるような酵素の高度熱安定性とい
う性質が広く求められている。ここに開示した方
法により安定化された酵素は、主として均質な水
溶液を生成するが、透析及びイオン交換を含む各
種の技術により反応体及び生成物から容易に分離
される。安定化酵素が耐えうる高温度は、バツチ
式及び連続式工業工程において、より短い反応時
間を可能にする。調合製品中にこの種の安定化酵
素を使用すれば、より長い製品貯蔵寿命及び（又
は）大して厳格でない貯蔵条件が可能となる。
ここに開示した方法により製造される安定化し
た可溶性酵素は、生物学的液体中の各種成分を測
定する臨床分野において使用することができる。
た可溶性酵素は、生物学的液体中の各種成分を測
定する臨床分野において使用することができる。
安定化した可溶性酵素は、酵素上の側基と共有
結合しうる側基を有する重合体と酵素とを液体媒
体中で反応させることにより製造される。この種
の重合体と酵素との反応に加え、酵素の活性に作
用を及ぼす少なくとも１種の物質を酵素及び重合
体と混合することもできる。たとえば、この種の
物質は特定酵素用の基質、基質と酵素との反応生
成物、酵素用の活性剤及びこの種の酵素の抑制剤
よりなる群から選択することができる。酵素及び
重合体と混合するため選択される特定物質は酵素
の種類に依存する。何故なら、酵素の活性に作用
を及ぼす物質は特定酵素に対し特異的でありうる
からである。
結合しうる側基を有する重合体と酵素とを液体媒
体中で反応させることにより製造される。この種
の重合体と酵素との反応に加え、酵素の活性に作
用を及ぼす少なくとも１種の物質を酵素及び重合
体と混合することもできる。たとえば、この種の
物質は特定酵素用の基質、基質と酵素との反応生
成物、酵素用の活性剤及びこの種の酵素の抑制剤
よりなる群から選択することができる。酵素及び
重合体と混合するため選択される特定物質は酵素
の種類に依存する。何故なら、酵素の活性に作用
を及ぼす物質は特定酵素に対し特異的でありうる
からである。
酵素及び重合体並びに酵素の活性に作用を及ぼ
す物質の他、重合体の可使側基と反応しうる物質
を加えることもできる。たとえば、この種の追加
物質は蛋白質様物質、たとえばアルブミン、ゼラ
チンなどとすることができる。
す物質の他、重合体の可使側基と反応しうる物質
を加えることもできる。たとえば、この種の追加
物質は蛋白質様物質、たとえばアルブミン、ゼラ
チンなどとすることができる。
本発明の方法により安定溶液中に配合しうる酵
素はデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ及び
ペプチダーゼのような酵素を包含する。特に、本
発明の方法により可溶型で安定化させうる特定酵
素は下記のものを包含する： １ マレイン酸デヒドロゲナーゼ（MDH）、 ２ クレアチンキナーゼ（CK、CPK）、 ３ アルカリホスフアターゼ（AP、ALP、ALK
−Phos.）、 ４ アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼ
（AST、OT、GOT、SGOT）、 ５ アラニンアミノトランスフエラーゼ（ALT、
PT、GPT、SGPT）、 ６ γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γGT、γGTP）、 ７ α−アミラーゼ ８ β−アミラーゼ、 ９ 乳酸デヒドロゲナーゼ（LD、LDH、ラクチ
ツクデヒドロゲナーゼ）、 10 グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ
（G6PDH）、 11 ヘキソキナーゼ（HK）、 12 グルコースデヒドロゲナーゼ、 13 グルコースオキシダーゼ、 14 ペルオキシダーゼ（HRP、HPO、PO）、 15 グリセリンデヒドロゲナーゼ、 16 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、 17 コレステロールオキシダーゼ、 18 コレステロールエステラーゼ、 19 リパーゼ、 20 ウリカーゼ、 21 ウレアーゼ、 22 グリセリンキナーゼ。
素はデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ及び
ペプチダーゼのような酵素を包含する。特に、本
発明の方法により可溶型で安定化させうる特定酵
素は下記のものを包含する： １ マレイン酸デヒドロゲナーゼ（MDH）、 ２ クレアチンキナーゼ（CK、CPK）、 ３ アルカリホスフアターゼ（AP、ALP、ALK
−Phos.）、 ４ アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼ
（AST、OT、GOT、SGOT）、 ５ アラニンアミノトランスフエラーゼ（ALT、
PT、GPT、SGPT）、 ６ γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γGT、γGTP）、 ７ α−アミラーゼ ８ β−アミラーゼ、 ９ 乳酸デヒドロゲナーゼ（LD、LDH、ラクチ
ツクデヒドロゲナーゼ）、 10 グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ
（G6PDH）、 11 ヘキソキナーゼ（HK）、 12 グルコースデヒドロゲナーゼ、 13 グルコースオキシダーゼ、 14 ペルオキシダーゼ（HRP、HPO、PO）、 15 グリセリンデヒドロゲナーゼ、 16 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、 17 コレステロールオキシダーゼ、 18 コレステロールエステラーゼ、 19 リパーゼ、 20 ウリカーゼ、 21 ウレアーゼ、 22 グリセリンキナーゼ。
化学的に、これまで知られている酵素は全て蛋
白質である。多くの酵素は、アミノ酸の特定順序
を有する複合蛋白質である。酵素は蛋白質、すな
わち、アミノ酸から構成されているので、アミノ
側基を有する。たとえば、蛋白質はリジン及びア
ルギニンを含むアミノ酸から構成され、ペプチド
結合を介して結合されており、そのままで側基の
アミノ基を与えることができる。酵素の略図を第
１図に示す。第１図において、酵素１０はペプチ
ド結合を介して結合されたアミノ酸の閉鎖分子構
造として示されている。酵素１０は活性部位１２
を有し、この部位は酵素用に選択した基質と反応
することができる。基質を引きつけてこれと反応
する酵素の能力は酵素の活性に関係する。
白質である。多くの酵素は、アミノ酸の特定順序
を有する複合蛋白質である。酵素は蛋白質、すな
わち、アミノ酸から構成されているので、アミノ
側基を有する。たとえば、蛋白質はリジン及びア
ルギニンを含むアミノ酸から構成され、ペプチド
結合を介して結合されており、そのままで側基の
アミノ基を与えることができる。酵素の略図を第
１図に示す。第１図において、酵素１０はペプチ
ド結合を介して結合されたアミノ酸の閉鎖分子構
造として示されている。酵素１０は活性部位１２
を有し、この部位は酵素用に選択した基質と反応
することができる。基質を引きつけてこれと反応
する酵素の能力は酵素の活性に関係する。
基本的に、酵素には３種の構造がある。第１の
構造は、各種のペプチド結合を介して酵素を生成
するアミノ酸及び蛋白質の結合によるものであ
る。酵素の第２の構造は、分子構造のアミノ酸間
における架橋によつてもたらされる。酵素の第３
の構造は、空間における酵素の配向によつてもた
らされる。すなわち、酵素の第３の構造は、酵素
分子がそれ自身及びその部分に関して占める配置
に基づいている。酵素の変性又は失活は、このよ
うな酵素の第３構造の破壊によつて生じうると思
われる。したがつて、酵素の第３構造を維持させ
ることができれば、酵素は安定化されたと云え
る。さらに、酵素は、幾つかの他の物質が酵素と
反応し又は酵素に結合してこの酵素の活性部位を
効果的にブロツクするとその活性を喪失すること
もある。さらに、酵素上の他の部位における物質
の反応が活性部位に何らかの作用を及ぼすことも
ある。たとえば、物質は第２図に示すように酵素
分子を閉鎖する作用を酵素分子に及ぼすような酵
素上の位置で反応して、活性部位を有効にブロツ
クすることもある。この種の作用はアロステリツ
ク阻止と呼ばれる。さらに、他の物質は活性部位
以外の部位で酵素と反応することもあり、この物
質は活性部位において基質に対し酵素の静電親和
性に影響を及ぼし又はこれを変化させる。
構造は、各種のペプチド結合を介して酵素を生成
するアミノ酸及び蛋白質の結合によるものであ
る。酵素の第２の構造は、分子構造のアミノ酸間
における架橋によつてもたらされる。酵素の第３
の構造は、空間における酵素の配向によつてもた
らされる。すなわち、酵素の第３の構造は、酵素
分子がそれ自身及びその部分に関して占める配置
に基づいている。酵素の変性又は失活は、このよ
うな酵素の第３構造の破壊によつて生じうると思
われる。したがつて、酵素の第３構造を維持させ
ることができれば、酵素は安定化されたと云え
る。さらに、酵素は、幾つかの他の物質が酵素と
反応し又は酵素に結合してこの酵素の活性部位を
効果的にブロツクするとその活性を喪失すること
もある。さらに、酵素上の他の部位における物質
の反応が活性部位に何らかの作用を及ぼすことも
ある。たとえば、物質は第２図に示すように酵素
分子を閉鎖する作用を酵素分子に及ぼすような酵
素上の位置で反応して、活性部位を有効にブロツ
クすることもある。この種の作用はアロステリツ
ク阻止と呼ばれる。さらに、他の物質は活性部位
以外の部位で酵素と反応することもあり、この物
質は活性部位において基質に対し酵素の静電親和
性に影響を及ぼし又はこれを変化させる。
酵素は三次元の化学構造を有しかつ酵素の活性
は酵素の形状及び配位（第３構造）に依存するの
で、本発明の方法は酵素の第３構造を保護又は維
持することによる酵素の安定化方法を提供するも
のである。安定化すべき酵素を、酵素と反応しう
る側基を有する重合体と反応させる。たとえば、
重合体は酵素構造中に存在する側基のアミン及び
（又は）酵素と反応しうる側基を有することがで
きる。今回、重合体骨格に沿つて又は骨格中に無
水物側基又は無水物成分を有する重合体は、この
種の無水物側基と酵素上の側基との共有結合を可
能にすることが見出された。
は酵素の形状及び配位（第３構造）に依存するの
で、本発明の方法は酵素の第３構造を保護又は維
持することによる酵素の安定化方法を提供するも
のである。安定化すべき酵素を、酵素と反応しう
る側基を有する重合体と反応させる。たとえば、
重合体は酵素構造中に存在する側基のアミン及び
（又は）酵素と反応しうる側基を有することがで
きる。今回、重合体骨格に沿つて又は骨格中に無
水物側基又は無水物成分を有する重合体は、この
種の無水物側基と酵素上の側基との共有結合を可
能にすることが見出された。
無水物側基を有する重合体又は式
〔式中、ｎは整数であり、Ｒは水素、アルキル、
アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリ
ール、アルカリ−ル、アラルキル及び から選択される基とすることができる〕 の構造単位を有する重合体は、酵素構造内におい
てたとえば構造内のアミノ基を介して蛋白質分子
と共有結合することができる。
アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリ
ール、アルカリ−ル、アラルキル及び から選択される基とすることができる〕 の構造単位を有する重合体は、酵素構造内におい
てたとえば構造内のアミノ基を介して蛋白質分子
と共有結合することができる。
本発明において有用なその他の重合体はポリア
クリル酸及びポリメタクリル酸の無水物である。
この種の重合体は別途に或いはその場で生成され
る中間体として調製することができる。たとえ
ば、この種の重合体の使用しうる構造は次の通り
である： 〔式中、ＲがＨである場合は重合体はポリアクリ
ル酸であり、ＲがCH3である場合は重合体はポリ
メタクリル酸である〕 この種の重合体に熱と減圧とをかけると、又は
たとえばジシクロヘキシルカルボジイミドのよう
な適当な脱水剤によりこの種の重合体を脱水する
と、次の構造を有する中間体がその場で生成され
る： 上記式を有する特に好適な重合体はエチレン−
無水マレイン酸である。エチレン−無水マレイン
酸共重合体は、EMA樹脂と称する製品としてモ
ンサントカンパニー社から市販されている。ここ
に開示した本発明の目的には、この種の市販のエ
チレン−無水マレイン酸樹脂が許容される。エチ
レン−無水マレイン酸共重合体は、約8000、
25000及び100000の平均分子量を有するものが市
販されている。さらに、架橋したエチレン−無水
マレイン酸共重合体も市販されており、この種の
架橋重合体も本発明の方法において有用である。
今回、高分子量のエチレン−無水マレイン酸共重
合体は、低分子量の無水マレイン酸重合体よりも
良好な安定性とより大きな活性の回収率とを与え
ることが見出された。しかしながら、低分子量の
無水物重合体を本発明の方法に使用して、許容し
うる安定性と活性回収率とを与えることもでき
る。
クリル酸及びポリメタクリル酸の無水物である。
この種の重合体は別途に或いはその場で生成され
る中間体として調製することができる。たとえ
ば、この種の重合体の使用しうる構造は次の通り
である： 〔式中、ＲがＨである場合は重合体はポリアクリ
ル酸であり、ＲがCH3である場合は重合体はポリ
メタクリル酸である〕 この種の重合体に熱と減圧とをかけると、又は
たとえばジシクロヘキシルカルボジイミドのよう
な適当な脱水剤によりこの種の重合体を脱水する
と、次の構造を有する中間体がその場で生成され
る： 上記式を有する特に好適な重合体はエチレン−
無水マレイン酸である。エチレン−無水マレイン
酸共重合体は、EMA樹脂と称する製品としてモ
ンサントカンパニー社から市販されている。ここ
に開示した本発明の目的には、この種の市販のエ
チレン−無水マレイン酸樹脂が許容される。エチ
レン−無水マレイン酸共重合体は、約8000、
25000及び100000の平均分子量を有するものが市
販されている。さらに、架橋したエチレン−無水
マレイン酸共重合体も市販されており、この種の
架橋重合体も本発明の方法において有用である。
今回、高分子量のエチレン−無水マレイン酸共重
合体は、低分子量の無水マレイン酸重合体よりも
良好な安定性とより大きな活性の回収率とを与え
ることが見出された。しかしながら、低分子量の
無水物重合体を本発明の方法に使用して、許容し
うる安定性と活性回収率とを与えることもでき
る。
エチレン−無水マレイン酸重合体は酵素構造か
ら突出するアミノ側基と反応すると思われ、これ
は次の反応順序で示される： 充分には判明していないが、この重合体は酵素
に対し共有結合してその活性配置を維持すると信
じられる。本発明の方法によりもたらされる可溶
性酵素の安定化理論を第３図乃至第５図に示す
が、この理論のみに拘束されるものではない。第
３図に関し、酵素１０は活性部位１２を持つて示
されている。酵素は、この酵素に共有結合しうる
側基を有する重合体１４と反応する。重合体を酵
素と反応させると、共有結合１６が重合体と酵素
との間に形成される。得られる酵素と重合体との
反応生成物は、この種の重合体を含まない酵素の
溶液よりも大きな安定性を示すことが実験的に示
された。重合体の存在は酵素の第３構造を保持す
る傾向を有し、したがつて酵素の活性を維持する
ことができると信じられる。
ら突出するアミノ側基と反応すると思われ、これ
は次の反応順序で示される： 充分には判明していないが、この重合体は酵素
に対し共有結合してその活性配置を維持すると信
じられる。本発明の方法によりもたらされる可溶
性酵素の安定化理論を第３図乃至第５図に示す
が、この理論のみに拘束されるものではない。第
３図に関し、酵素１０は活性部位１２を持つて示
されている。酵素は、この酵素に共有結合しうる
側基を有する重合体１４と反応する。重合体を酵
素と反応させると、共有結合１６が重合体と酵素
との間に形成される。得られる酵素と重合体との
反応生成物は、この種の重合体を含まない酵素の
溶液よりも大きな安定性を示すことが実験的に示
された。重合体の存在は酵素の第３構造を保持す
る傾向を有し、したがつて酵素の活性を維持する
ことができると信じられる。
しかしながら、重合体はその側基を介して酵素
の側基と反応しうるので、重合体がたとえばアロ
ステリツク阻止により活性部位をブロツクするか
又は活性部位を有効に閉鎖するような位置で、こ
の重合体が酵素と反応する可能性もある。第４図
に関し酵素１０を示すが、ここでは重合体１４が
酵素と反応して活性部位を有効にブロツクし、基
質が酵素と反応するのを阻止している。酵素に対
する活性の抑制剤としての重合体の存在は、酵素
をこの種の重合体と反応させた際の低活性収率に
より確認された。重合体と反応した酵素はこの種
の重合体と反応していない酵素よりも大きな安定
性を示すが、得られる反応酵素の活性収率は反応
前の酵素の初期活性に比較して一般に低いもので
ある。しかしながら、重合体と反応した後の酵素
の活性は未反応酵素よりも安定である。
の側基と反応しうるので、重合体がたとえばアロ
ステリツク阻止により活性部位をブロツクするか
又は活性部位を有効に閉鎖するような位置で、こ
の重合体が酵素と反応する可能性もある。第４図
に関し酵素１０を示すが、ここでは重合体１４が
酵素と反応して活性部位を有効にブロツクし、基
質が酵素と反応するのを阻止している。酵素に対
する活性の抑制剤としての重合体の存在は、酵素
をこの種の重合体と反応させた際の低活性収率に
より確認された。重合体と反応した酵素はこの種
の重合体と反応していない酵素よりも大きな安定
性を示すが、得られる反応酵素の活性収率は反応
前の酵素の初期活性に比較して一般に低いもので
ある。しかしながら、重合体と反応した後の酵素
の活性は未反応酵素よりも安定である。
本出願人は、酵素と重合体との反応混合物に追
加物質を加えることにより可溶性酵素をより効率
的かつ効果的に安定化させうることを見出した。
さらに本出願人は、反応の順序を変化させること
により、得られる安定化可溶性酵素の活性収率及
び（又は）安定性をより大きくしうることを見出
した。さらにまた本出願人は、酵素と重合体との
反応混合物に加えうるその他物質が酵素用の基
質、酵素と基質との反応生成物、酵素用の活性剤
及び酵素の抑制剤よりなる群から選択される物質
を包含することを見出した。反応混合物に加えら
れる特定の基質、生成物、活性剤及び（又は）抑
制剤は、安定化させるべき酵素に依存する。ここ
で、酵素と基質との酵素反応は生成物を与える可
逆反応であるため、基質、生成物、活性剤及び
（又は）抑制剤の存在は活性部位を開放状態に保
つと共に、重合体が酵素と反応して活性部位をブ
ロツクし又は他の何らかの悪影響を及ぼすのを防
止又は抑制すると信じられる。
加物質を加えることにより可溶性酵素をより効率
的かつ効果的に安定化させうることを見出した。
さらに本出願人は、反応の順序を変化させること
により、得られる安定化可溶性酵素の活性収率及
び（又は）安定性をより大きくしうることを見出
した。さらにまた本出願人は、酵素と重合体との
反応混合物に加えうるその他物質が酵素用の基
質、酵素と基質との反応生成物、酵素用の活性剤
及び酵素の抑制剤よりなる群から選択される物質
を包含することを見出した。反応混合物に加えら
れる特定の基質、生成物、活性剤及び（又は）抑
制剤は、安定化させるべき酵素に依存する。ここ
で、酵素と基質との酵素反応は生成物を与える可
逆反応であるため、基質、生成物、活性剤及び
（又は）抑制剤の存在は活性部位を開放状態に保
つと共に、重合体が酵素と反応して活性部位をブ
ロツクし又は他の何らかの悪影響を及ぼすのを防
止又は抑制すると信じられる。
酵素と重合体との反応混合物に加えるべき基
質、生成物、活性剤及び（又は）抑制剤の量の選
択は酵素の種類及び基質と重合体との酵素反応に
依存する。たとえば、生成物を過多に添加すれば
酵素と基質との反応の平衡が変化し、この添加生
成物をたとえば透析により安定化酵素から分離し
ない限り、本発明の方法で製造された安定化可溶
性酵素溶液を用いて行なわれる臨床診断分析の時
間が増大する。
質、生成物、活性剤及び（又は）抑制剤の量の選
択は酵素の種類及び基質と重合体との酵素反応に
依存する。たとえば、生成物を過多に添加すれば
酵素と基質との反応の平衡が変化し、この添加生
成物をたとえば透析により安定化酵素から分離し
ない限り、本発明の方法で製造された安定化可溶
性酵素溶液を用いて行なわれる臨床診断分析の時
間が増大する。
さらに、重合体上の可使側基とも反応しうる組
成物を反応混合物に加えることにより、可溶性酵
素をさらに安定化させかつ活性回収率を高めうる
ことが見出された。この種のその他物質は、重合
体上の側基と反応しうる任意の物質とすることが
できる。たとえば、アルブミン、ゼラチンのよう
な他の蛋白質様物質及びたとえばデキストランの
ような重合体を加えて、重合体の側基と反応させ
ることができる。基質、生成物、活性剤及び（又
は）抑制剤も重合体上の側基と直接に反応するこ
とができる。勿論、この種の物質が重合体と反応
するかどうかは基質、生成物、活性剤及び（又
は）抑制剤の性質に依存する。重合体上の側基と
反応しうるこの種の物質は、酵素をその第３構造
に維持することにより酵素を安定化させるのに役
立つと信じられる。さらに、この種の物質は重合
体と反応して、酵素の第３構造を保持するマトリ
ツクス状の環境を形成することができる。第５図
に、この種のマトリツクス状環境の略図を示す。
第５図において、酵素１０は活性部位１２を有
し、酵素と重合体１４との反応によりその第３構
造に維持されている。重合体１４は側基を介して
酵素に共有結合し、重合体と酵素との間に結合１
６を形成する。基質、生成物、活性剤及び（又
は）抑制剤の存在は、酵素と重合体との反応の
間、活性部位１２を開放状態に保つことができ
る。代案として、反応性物質Ｒ、R1及びR2を反
応混合物に加えて重合体と反応させることができ
る。このような付加的反応性物質は、マトリツク
ス状環境を形成するのに役立つ。
成物を反応混合物に加えることにより、可溶性酵
素をさらに安定化させかつ活性回収率を高めうる
ことが見出された。この種のその他物質は、重合
体上の側基と反応しうる任意の物質とすることが
できる。たとえば、アルブミン、ゼラチンのよう
な他の蛋白質様物質及びたとえばデキストランの
ような重合体を加えて、重合体の側基と反応させ
ることができる。基質、生成物、活性剤及び（又
は）抑制剤も重合体上の側基と直接に反応するこ
とができる。勿論、この種の物質が重合体と反応
するかどうかは基質、生成物、活性剤及び（又
は）抑制剤の性質に依存する。重合体上の側基と
反応しうるこの種の物質は、酵素をその第３構造
に維持することにより酵素を安定化させるのに役
立つと信じられる。さらに、この種の物質は重合
体と反応して、酵素の第３構造を保持するマトリ
ツクス状の環境を形成することができる。第５図
に、この種のマトリツクス状環境の略図を示す。
第５図において、酵素１０は活性部位１２を有
し、酵素と重合体１４との反応によりその第３構
造に維持されている。重合体１４は側基を介して
酵素に共有結合し、重合体と酵素との間に結合１
６を形成する。基質、生成物、活性剤及び（又
は）抑制剤の存在は、酵素と重合体との反応の
間、活性部位１２を開放状態に保つことができ
る。代案として、反応性物質Ｒ、R1及びR2を反
応混合物に加えて重合体と反応させることができ
る。このような付加的反応性物質は、マトリツク
ス状環境を形成するのに役立つ。
本出願人は、或る酵素に関し、重合体と反応し
うるこの種のその他物質と重合体とを、この重合
体と酵素との反応前に反応させるのが好ましいこ
とを見出した。重合体をこの種のその他物質と最
初に反応させることにより、重合体上の可使活性
側基の幾つかが反応し、それによりこれらが酵素
上の可使側基と反応することが阻止される。重合
体上のこのような反応性側基を酵素との反応前に
結合させることにより、重合体が過度に反応して
酵素の活性部位に悪影響を及ぼす機会を減少させ
ることができる。他の酵素の場合は、各種物質の
反応順序は酵素活性の安定性又は回収率に対し実
質的に影響を与えない。
うるこの種のその他物質と重合体とを、この重合
体と酵素との反応前に反応させるのが好ましいこ
とを見出した。重合体をこの種のその他物質と最
初に反応させることにより、重合体上の可使活性
側基の幾つかが反応し、それによりこれらが酵素
上の可使側基と反応することが阻止される。重合
体上のこのような反応性側基を酵素との反応前に
結合させることにより、重合体が過度に反応して
酵素の活性部位に悪影響を及ぼす機会を減少させ
ることができる。他の酵素の場合は、各種物質の
反応順序は酵素活性の安定性又は回収率に対し実
質的に影響を与えない。
本発明の方法により安定化された酵素は可溶性
の安定化酵素である。酵素は可溶型であるため、
臨床診断分析に容易に使用することができる。安
定化された可溶性酵素は、従来の酵素溶液と比較
して、比較的長い寿命と活性保持とを示す。酵素
と重合体との間の反応が起こる液体媒体環境は、
酵素と重合体とが溶解しうる任意適当な液体環境
とすることができる。好適な液体環境はジメチル
スルホキシド、アセトン、ジメチルホルムアミド
及びピリジンよりなる群から選択される有機溶剤
の水溶液を包含する。特定有機溶剤の選択は酵素
の種類に依存する。たとえば、幾種かの酵素は、
たとえばアセトンのような特定の有機溶剤と混合
するとその活性を喪失することがある。しかしな
がら、本発明の方法により得られる全体的な安定
性と活性回収率とは、特定酵素に対する特定有機
溶剤の悪影響より勝れている。上記有機溶剤のう
ち好適な有機溶剤は、酵素と反応させる重合体が
エチレンと無水マレイン酸との共重合体である場
合にはジメチルスルホキシドである。ジメチルス
ルホキシドは、酵素と重合体とに対する良好な溶
剤であつてしかも酵素の活性に対し実質的に悪影
響を与えない。
の安定化酵素である。酵素は可溶型であるため、
臨床診断分析に容易に使用することができる。安
定化された可溶性酵素は、従来の酵素溶液と比較
して、比較的長い寿命と活性保持とを示す。酵素
と重合体との間の反応が起こる液体媒体環境は、
酵素と重合体とが溶解しうる任意適当な液体環境
とすることができる。好適な液体環境はジメチル
スルホキシド、アセトン、ジメチルホルムアミド
及びピリジンよりなる群から選択される有機溶剤
の水溶液を包含する。特定有機溶剤の選択は酵素
の種類に依存する。たとえば、幾種かの酵素は、
たとえばアセトンのような特定の有機溶剤と混合
するとその活性を喪失することがある。しかしな
がら、本発明の方法により得られる全体的な安定
性と活性回収率とは、特定酵素に対する特定有機
溶剤の悪影響より勝れている。上記有機溶剤のう
ち好適な有機溶剤は、酵素と反応させる重合体が
エチレンと無水マレイン酸との共重合体である場
合にはジメチルスルホキシドである。ジメチルス
ルホキシドは、酵素と重合体とに対する良好な溶
剤であつてしかも酵素の活性に対し実質的に悪影
響を与えない。
さらに、液体媒体は適当な緩衝溶液で緩衝する
こともできる。たとえば、液体媒体は約５〜約10
のPHを与える水性緩衝剤からなることができる。
緩衝剤はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、イミダゾール、トリエタノールアミン及び燐
酸緩衝剤よりなる群から選択することができる。
緩衝剤のうち、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンの水溶液からなる緩衝剤を使用するのが
好適である。この種の緩衝剤は酵素に対し許容し
うる安定性を与え、しかも酵素の可溶性と活性並
びに重合体の可溶性に対し悪影響を与えない。緩
衝溶液を使用して、反応混合物と液体媒体との全
体のPHを約５〜約10の範囲内に保つ。重合体が無
水物である場合PHが変動しうるので、緩衝溶液の
使用が望ましい。たとえば、水溶液においては、
適切に緩衝されていないと、無水物が加水分解し
て溶液のPHに作用を及ぼす。
こともできる。たとえば、液体媒体は約５〜約10
のPHを与える水性緩衝剤からなることができる。
緩衝剤はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、イミダゾール、トリエタノールアミン及び燐
酸緩衝剤よりなる群から選択することができる。
緩衝剤のうち、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンの水溶液からなる緩衝剤を使用するのが
好適である。この種の緩衝剤は酵素に対し許容し
うる安定性を与え、しかも酵素の可溶性と活性並
びに重合体の可溶性に対し悪影響を与えない。緩
衝溶液を使用して、反応混合物と液体媒体との全
体のPHを約５〜約10の範囲内に保つ。重合体が無
水物である場合PHが変動しうるので、緩衝溶液の
使用が望ましい。たとえば、水溶液においては、
適切に緩衝されていないと、無水物が加水分解し
て溶液のPHに作用を及ぼす。
可溶性安定化酵素の製造方法を以下の例でさら
に説明し、これらの例は特定の酵素及び酵素系に
関して方法を説明するものであるが、これらのみ
に限定されない。
に説明し、これらの例は特定の酵素及び酵素系に
関して方法を説明するものであるが、これらのみ
に限定されない。
例 １
アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼに関
し臨床診断分析に有用な安定化可溶性酵素溶液を
次の反応順序で調製した： Ｌ−ASP＋α−KgAST GLU＋OAA OAA＋NADHMDH リンゴ酸＋NAD この分析に使用した酵素MDHは不安定な酵素
である。溶液の場合、これは本発明の方法により
次のように安定化される。
し臨床診断分析に有用な安定化可溶性酵素溶液を
次の反応順序で調製した： Ｌ−ASP＋α−KgAST GLU＋OAA OAA＋NADHMDH リンゴ酸＋NAD この分析に使用した酵素MDHは不安定な酵素
である。溶液の場合、これは本発明の方法により
次のように安定化される。
0.225重量％のゼラチンと0.1重量％の窒化ナト
リウム（NaN3）と500mg／dlのNADHと500
mg／dlのNADとを1.1容量％のトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンからなる水性緩衝溶液中
で混合することにより第１溶液を調製した。
リウム（NaN3）と500mg／dlのNADHと500
mg／dlのNADとを1.1容量％のトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンからなる水性緩衝溶液中
で混合することにより第１溶液を調製した。
平均分子量約100000を有するエチレン無水マレ
イン酸重合体（EMA−31、モンサントカンパニ
ー社から市販されている）をジメチルスルホキシ
ド（DMSO）と混合することにより第２溶液を
調製した。エチレン、無水マレイン酸重合体を加
えて、約10mg／mlのこの重合体の濃度を有する溶
液を作つた。
イン酸重合体（EMA−31、モンサントカンパニ
ー社から市販されている）をジメチルスルホキシ
ド（DMSO）と混合することにより第２溶液を
調製した。エチレン、無水マレイン酸重合体を加
えて、約10mg／mlのこの重合体の濃度を有する溶
液を作つた。
等容量（各１ml）の第１溶液と第２溶液とを混
合し、約2.5分間静置させた。この時間は、エチ
レン無水マレイン酸重合体と第１溶液における幾
つかの成分との間の反応を可能にした。
合し、約2.5分間静置させた。この時間は、エチ
レン無水マレイン酸重合体と第１溶液における幾
つかの成分との間の反応を可能にした。
50容量％のグリセリンと50容量％の水とからな
る溶剤に溶解させたMDHの溶液を、第１溶液と
第２溶液との混合により生成された混合物に加え
た。MDH溶液は約13000IU／mlの活性を有した。
約10分間後、酵素とエチレン無水マレイン酸との
間の実質的に全ての結合が完結した。
る溶剤に溶解させたMDHの溶液を、第１溶液と
第２溶液との混合により生成された混合物に加え
た。MDH溶液は約13000IU／mlの活性を有した。
約10分間後、酵素とエチレン無水マレイン酸との
間の実質的に全ての結合が完結した。
得られた溶液はMDHにつき約130〜330IU／ml
の活性を示した。得られた溶液の安定性は、これ
に600mgのＬ−ASPと0.3重量％のゼラチンとから
なるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの
0.3％緩衝水溶液中における約PH7.8の溶液を加え
ることによりさらに改善することができた。
の活性を示した。得られた溶液の安定性は、これ
に600mgのＬ−ASPと0.3重量％のゼラチンとから
なるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの
0.3％緩衝水溶液中における約PH7.8の溶液を加え
ることによりさらに改善することができた。
得られた溶液は、従来のMDH溶液よりも大き
な活性保持を示した。一般に、この種の従来の
MDH溶液は、約41℃に２時間加熱するとその全
活性を喪失する。この例で調製されたMDH溶液
は、約41℃にて93時間まで加熱しても、約50％の
活性保持を示した。
な活性保持を示した。一般に、この種の従来の
MDH溶液は、約41℃に２時間加熱するとその全
活性を喪失する。この例で調製されたMDH溶液
は、約41℃にて93時間まで加熱しても、約50％の
活性保持を示した。
例 ２
例１の手順をあらゆる主要点において反復した
が、ただしMDH酵素溶液を、第１溶液をDMSO
中のエチレン無水マレイン酸重合体の第２溶液と
混合して反応させる前に、この第１溶液と反応さ
せた。
が、ただしMDH酵素溶液を、第１溶液をDMSO
中のエチレン無水マレイン酸重合体の第２溶液と
混合して反応させる前に、この第１溶液と反応さ
せた。
得られた溶液は例１で調製した溶液よりも低い
活性を示し、例１の酵素溶液における10〜25％収
率と比較し、約５％という活性収率であつた。
活性を示し、例１の酵素溶液における10〜25％収
率と比較し、約５％という活性収率であつた。
例 ３
例１の手順をあらゆる主要点において反復し
た。安定化した可溶性酵素はクレアチンキナーゼ
であり、これは熱及びその他因子に対し一般に極
めて不安定である。
た。安定化した可溶性酵素はクレアチンキナーゼ
であり、これは熱及びその他因子に対し一般に極
めて不安定である。
0.225重量％のゼラチンと0.1重量％のNaN3と
５重量％のアルブミンと１重量％のデキストラン
と１重量％のADPと0.1重量％のメルカプトエタ
ノールとを1.1容量％のトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンの緩衝剤水溶液中に溶解させて
第１溶液を調製した。
５重量％のアルブミンと１重量％のデキストラン
と１重量％のADPと0.1重量％のメルカプトエタ
ノールとを1.1容量％のトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンの緩衝剤水溶液中に溶解させて
第１溶液を調製した。
DMSO中のEMA−31の第２溶液は例１と同様
に調製した。
に調製した。
第１溶液と第２溶液とを等容量で配合し、静置
させた。次いで、クレアチンキナーゼ（CK）を
約5000IU／mlの量で加えた。
させた。次いで、クレアチンキナーゼ（CK）を
約5000IU／mlの量で加えた。
得られた溶液はゲル状のコンシステンシーを有
した。得られた溶液におけるCKの活性は初期活
性に対比して計算して約500IU／mlであり、１対
１希釈を考慮して計算すると活性は約250IU／ml
であつた。
した。得られた溶液におけるCKの活性は初期活
性に対比して計算して約500IU／mlであり、１対
１希釈を考慮して計算すると活性は約250IU／ml
であつた。
もしメルカプトエタノールを除去すれば、得ら
れる溶液は同等なゲル状コンシステンシーを示さ
ないことが判つた。
れる溶液は同等なゲル状コンシステンシーを示さ
ないことが判つた。
さらに、酵素の添加順序は最終的に示される活
性に影響を及ぼさないことも決定された。たとえ
ば酵素は、第１溶液と第２溶液との混合前に第１
溶液に加えた場合、この例に示したとほぼ同じ安
定性を示した。
性に影響を及ぼさないことも決定された。たとえ
ば酵素は、第１溶液と第２溶液との混合前に第１
溶液に加えた場合、この例に示したとほぼ同じ安
定性を示した。
得られた溶液は、約41℃に72時間加熱した場
合、その酵素活性の約60％の保持という安定性を
示した。通常、CKの溶液は、約41℃に加熱され
ると約１時間以内にその酵素活性のほぼ全部を失
なう。
合、その酵素活性の約60％の保持という安定性を
示した。通常、CKの溶液は、約41℃に加熱され
ると約１時間以内にその酵素活性のほぼ全部を失
なう。
例 ４
例１の手順をあらゆる主要点において反復し
た。安定化した酵素は血清グルタミン酸オキザル
酢酸トランスアミナーゼ（SGOT）であつた。
た。安定化した酵素は血清グルタミン酸オキザル
酢酸トランスアミナーゼ（SGOT）であつた。
約0.225重量部のゼラチンと１重量％のＬ−
ASPと１重量％のα−ケトグルタン酸（α−Kg）
と５重量％のアルブミンとを1.1容量％のトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンの緩衝剤水溶
液中に溶解して第１溶液を調製した。
ASPと１重量％のα−ケトグルタン酸（α−Kg）
と５重量％のアルブミンとを1.1容量％のトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンの緩衝剤水溶
液中に溶解して第１溶液を調製した。
第２溶液は例１の手順によりDMSO中にエチ
レン無水マレイン酸を溶解して調製した。
レン無水マレイン酸を溶解して調製した。
第１溶液と第２溶液とを等容量（各／ml）で混
合し、得られた第３溶液を約２分間静置させた。
合し、得られた第３溶液を約２分間静置させた。
約1000IU／mlの活性を有するSGOT溶液約0.1
mlを第３溶液に加えた。約10分間後、得られた酵
素溶液は約100〜150IU／mlの活性を示した。
mlを第３溶液に加えた。約10分間後、得られた酵
素溶液は約100〜150IU／mlの活性を示した。
この得られた酵素溶液を、アルブミン溶液（ひ
と血清アルブミン、牛血清アルブミン）若しくは
ゼラチンにより、約５〜約10のPHを与える緩衝剤
溶液中で希釈することができる。
と血清アルブミン、牛血清アルブミン）若しくは
ゼラチンにより、約５〜約10のPHを与える緩衝剤
溶液中で希釈することができる。
得られた溶液は、約41℃に72時間加熱した場
合、酵素活性の約100％の保持を示した。通常、
この酵素の水溶液は、約41℃に約５時間加熱され
ると、その活性の約50％を保持する。
合、酵素活性の約100％の保持を示した。通常、
この酵素の水溶液は、約41℃に約５時間加熱され
ると、その活性の約50％を保持する。
燐酸ピリドキサールの活性剤を第１溶液に加え
ることにより活性収率の増加を達成することがで
きた。
ることにより活性収率の増加を達成することがで
きた。
例 ５
例４の手順をあらゆる主要点において反復した
が、ただし酵素をアスパラギン酸アミノトランス
フエラーゼ（AST）とした。
が、ただし酵素をアスパラギン酸アミノトランス
フエラーゼ（AST）とした。
例 ６
例４の手順をあらゆる主要点において反復した
が、ただしＬ−ASPの代りにＬ−アラニンを使
用しかつSGOTの代りにグルタミン酸ピルビン酸
トランスアミナーゼ（GPT）又は（SGPT）を
使用した。
が、ただしＬ−ASPの代りにＬ−アラニンを使
用しかつSGOTの代りにグルタミン酸ピルビン酸
トランスアミナーゼ（GPT）又は（SGPT）を
使用した。
例 ７
例４の手順をあらゆる主要点において反復した
が、ただしＬ−ASPの代りにＬ−アラニンを使
用した。
が、ただしＬ−ASPの代りにＬ−アラニンを使
用した。
例 ８
例１の手順をあらゆる主要点において反復し
た。この実験で安定化させた酵素は乳酸デヒドロ
ゲナーゼ（LDH）であつた。一般にLDHは、約
7.0±２のPHに緩衝すれば50％グリセリン溶液中
で安定である。しかしながら、この種のLDH酵
素溶液はたとえばアルブミンのような緩衝された
蛋白質様マトリツクスで希釈すると失活する。た
とえば、約400IU／の活性を有する正常に希釈
されたLDH溶液は、約41℃に24時間加熱される
と約50〜100IU／の活性を示す。
た。この実験で安定化させた酵素は乳酸デヒドロ
ゲナーゼ（LDH）であつた。一般にLDHは、約
7.0±２のPHに緩衝すれば50％グリセリン溶液中
で安定である。しかしながら、この種のLDH酵
素溶液はたとえばアルブミンのような緩衝された
蛋白質様マトリツクスで希釈すると失活する。た
とえば、約400IU／の活性を有する正常に希釈
されたLDH溶液は、約41℃に24時間加熱される
と約50〜100IU／の活性を示す。
0.225重量％のゼラチンと５重量％のアルブミ
ンと0.1重量％のNaN3とを1.1容量％のトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンからなる緩衝
水溶液中に溶解して第１溶液を調製した。
ンと0.1重量％のNaN3とを1.1容量％のトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンからなる緩衝
水溶液中に溶解して第１溶液を調製した。
DMSO中のエチレン無水マレイン酸の第２溶
液は例１におけると同様に調製した。
液は例１におけると同様に調製した。
第１溶液と第２溶液とを１：１の容量比で混合
し、約２分間静置して反応させた。約5000IU／
の活性を有するLDHの緩衝原液約0.1mlを加え
た。得られた溶液を緩衝された蛋白質様マトリツ
クス中に希釈しかつこの希釈酵素溶液を約41℃に
加熱したが、約72時間後にその活性の実質的に全
部を保持した（約400IU／）。
し、約２分間静置して反応させた。約5000IU／
の活性を有するLDHの緩衝原液約0.1mlを加え
た。得られた溶液を緩衝された蛋白質様マトリツ
クス中に希釈しかつこの希釈酵素溶液を約41℃に
加熱したが、約72時間後にその活性の実質的に全
部を保持した（約400IU／）。
さらに、活性の収率は、NAD及び（又は）
NADHを第１溶液に加えることにより増大され
ることも決定された。
NADHを第１溶液に加えることにより増大され
ることも決定された。
例 ９
例８の手順をあらゆる主要点において反復した
が、ただし酵素LDHの代りに酵素γ−GTPを使
用した。
が、ただし酵素LDHの代りに酵素γ−GTPを使
用した。
同様な安定性試験において、γ−GTPの安定
性酵素溶液は、約41℃に72時間加熱したが、その
活性の実質的に全部を保持した（約400IU／）。
性酵素溶液は、約41℃に72時間加熱したが、その
活性の実質的に全部を保持した（約400IU／）。
例 10
例８の手順をあらゆる主要点において反復した
が、ただし酵素LDHの代りに酵素ALK−PHOS
を使用した。
が、ただし酵素LDHの代りに酵素ALK−PHOS
を使用した。
得られた酵素溶液は同様な安定性を示した。
しかしながら、第１溶液に対するNAD及び
（又は）NADHの添加は活性に対し何ら認めうる
程度に作用を及ぼさなかつた。活性剤マグネシウ
ム（マグネシウムの可溶性塩）の添加は酵素活性
の収率及び安定性を増大させることが決定され
た。
（又は）NADHの添加は活性に対し何ら認めうる
程度に作用を及ぼさなかつた。活性剤マグネシウ
ム（マグネシウムの可溶性塩）の添加は酵素活性
の収率及び安定性を増大させることが決定され
た。
例 11〜24
これらの例の全てにおいて、例１の手順をあら
ゆる主要点において反復したが、ただし下記の酵
素を使用した。
ゆる主要点において反復したが、ただし下記の酵
素を使用した。
例No. 酵素
11 アミラーゼ
12 Ｇ−６−PDH
13 ヘキソキナーゼ（HK）
14 グルコースデヒドロゲナーゼ
15 グルコースオキシダーゼ
16 ペルオキシダーゼ
17 コレステロールエステラーゼ
18 コレステロールオキシダーゼ
19 グリセリンデヒドロゲナーゼ
20 リパーゼ
21 ウリカーゼ
22 ウレアーゼ
23 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
24 グリセリンキナーゼ
第１図は酵素の略図であり、第２図は第１図の
酵素の略図であつてその活性部位をブロツクする
酵素自身を示し、第３図は第１図の酵素と反応性
修飾基を有する重合体との反応の略図であり、第
４図は第３図の酵素の略図であつて、どのように
重合体が活性部位をブロツクするかを示し、第５
図はどのように追加組成物が重合体と反応しかつ
活性部位を基質と自由に反応させうるよう維持す
るかを示す略図である。 １０……酵素、１２……活性部位、１４……重
合体、１６……共有結合。
酵素の略図であつてその活性部位をブロツクする
酵素自身を示し、第３図は第１図の酵素と反応性
修飾基を有する重合体との反応の略図であり、第
４図は第３図の酵素の略図であつて、どのように
重合体が活性部位をブロツクするかを示し、第５
図はどのように追加組成物が重合体と反応しかつ
活性部位を基質と自由に反応させうるよう維持す
るかを示す略図である。 １０……酵素、１２……活性部位、１４……重
合体、１６……共有結合。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 臨床検査に使用される不安定な酵素の可溶性
かつ安定な溶液を製造するにあたり、 (a) 該酵素のための基質、生成物、活性剤及び
（又は）抑制剤である少なくとも１種の物質の
水性第１溶液を形成し、 (b) 該酵素上の側基と共有結合しうる側基を含有
する重合体を有機溶媒に溶解してなる重合体第
２溶液を形成し、 (c) 前記水性第１溶液を前記重合体第２溶液及び
酵素と混合し、 (d) 該酵素の側基と該重合体の側基を該物質の存
在下に共有結合反応させる 工程からなる不安定酵素の可溶性かつ安定な溶液
の製造方法。 ２ 水溶液がジメチルスルホキシド、アセトン、
ジメチルホルムアミド及びピリジンよりなる群か
ら選択される有機溶剤の水溶液からなる特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ３ 水溶液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、イミダゾール、トリエタノールアミン
及び（又は）燐酸緩衝剤であつて約５〜約10のPH
を与えるのに足る量で存在する緩衝剤を含む特許
請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 蛋白質様物質を存在させる特許請求の範囲第
１項乃至第３項のいずれかに記載の方法。 ５ 蛋白質様物質がアルブミン又はゼラチンであ
る特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 重合体が無水物側基を有する特許請求の範囲
第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法。 ７ 重合体が式 ［式中、Ｒはアルキル、アルケニル、アルキニ
ル、シクロアルキル、アリール、アルカリール、
アラルキル又は であり、ｎは整数である］ の構造単位を有する特許請求の範囲第１項乃至第
６項のいずれかに記載の方法。 ８ 重合体がエチレンと無水マレイン酸との共重
合体である特許請求の範囲第１項乃至第４項のい
ずれかに記載の方法。 ９ 重合体がポリアクリル酸からなる特許請求の
範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法。 １０ 重合体がポリメタクリル酸からなる特許請
求の範囲第９項記載の方法。 １１ 重合体が式 ［式中、ｎは整数であり、Ｒは水素又はメチルか
ら選択される基である］ の少なくとも幾つかの構造単位を有する 特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記
載の方法。 １２ 重合体が式 ［式中、ｎは整数である］ の少なくとも幾つかの構造単位を有する 特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記
載の方法。 １３ 酵素がオキシドレダクターゼ、トランスフ
エラーゼ、ヒドラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、イ
ソメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスアミナ
ーゼ又はペプチターゼである特許請求の範囲第１
項乃至第１２項のいずれかに記載の方法。 １４ 酵素が、 １ リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）、 ２ クレアチンキナーゼ（CK、CPK）、 ３ アリカリホスフアターゼ（AP、ALP、ALK
−Phos）、 ４ アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼ
（AST、OT、GOT、SGOT）、 ５ アラニンアミノトランスフエラーゼ（ALT、
PT、GPT、SGPT）、 ６ γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γGT、γGTP）、 ７ α−アミラーゼ、 ８ β−アミラーゼ、 ９ 乳酸デヒドロゲナーゼ（LD、LDH、ラクチ
ツクデヒドロゲナーゼ）、 10 グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ
（G6PDH）、 11 ヘキソキナーゼ（HK）、 12 グルコースデヒドロゲナーゼ、 13 グルコースオキシダーゼ、 14 ペルオキシダーゼ（HRP、HPO、PO）、 15 グリセリンデヒドロゲナーゼ、 16 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、 17 コレステロールオキシダーゼ、 18 コレステロールエステラーゼ、 19 リパーゼ、 20 ウリカーゼ、 21 ウレアーゼ、又は 22 グリセリンキナーゼ である特許請求の範囲第１項乃至第１２項のいず
れかに記載の方法。 １５ (a) 約0.225重量％までのゼラチンと約0.1
重量％までのNaN3と約500mg／dlまでの
NADHと約500mg／dlまでのNADとを約1.1容
量％のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンを含む水中で混合することにより第１溶液を
生成させ、 (b) エチレン無水マレイン酸の重合体をジメチル
スルホキシド１ml当り約10mgのエチレン無水マ
レイン酸重合体の濃度で溶解して第２溶液を生
成させ、 (c) 第１溶液と第２溶液とを混合して第３溶液を
生成させ、 (d) 50容量％のグリセリンと50容量％の水とから
なる溶剤中に溶解されたMDHの第４溶液を第
３溶液に加えて、可溶化された安定酵素溶液を
生成させる ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 １６ MDHの第４溶液を、第２溶液と第１溶液
との混合前に第１溶液に加えて混合する特許請求
の範囲第１５項記載の方法。 １７ 約7.8のPHを有するトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンの緩衝剤水溶液に溶解させた
600ｍＭのＬ−ASPと0.3重量％のゼラチンとから
なる第５溶液を加える工程をさらに含む特許請求
の範囲第１５項又は第１６項記載の方法。 １８ (a) 約0.225重量％までのゼラチンと0.1重
量％のNaN3と少なくとも約５重量％のアルブ
ミンと少なくとも約１重量％のデキストランと
少なくとも約１重量％のADPと少なくとも約
0.1重量％のメルカプトエタノールとを約1.1容
量％のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンからなる水溶液中に溶解してなる第１溶液を
生成させ、 (b) エチレン無水マレイン酸の重合体をジメチル
スルホキシド中に約10mg／mlの濃度で溶解して
なる第２溶液を生成させ、 (c) 第１溶液と第２溶液とを混合し、 (d) 酵素クレアチンキナーゼを加えて可溶性の安
定化酵素溶液を生成させる ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 １９ (a) 約0.225重量％までのゼラチンと１グ
ラム％のＬ−ASPと１重量％のα−ケトグル
タル酸塩と５重量％のアルブミンとを1.1容量
％のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
からなる緩衝水溶液中に溶解して第１溶液を生
成させ、 (b) エチレン無水マレイン酸の重合体をジメチル
スルホキシド中に10mg／mlの濃度で溶解して第
２溶液を生成させ、 (c) 第１溶液と第２溶液とを混合して第３溶液を
生成させ、 (d) AST及びSGOTから選択される酵素を第３
溶液に加えて安定化された可溶性酵素の溶液を
生成させる ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ２０ 燐酸ピリドキサールを第１溶液に加える特
許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１ (a) 約0.225重量％までのゼラチンと１グ
ラム％のＬ−アラニンと１重量％のα−ケトグ
ルタル酸塩と５重量％のアルブミンとを1.1容
量％のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンからなる緩衝水溶液中に溶解して第１溶液を
生成させ、 (b) エチレン無水マレイン酸の重合体をジメチル
スルホキシド中に10mg／mlの濃度で溶解して第
２溶液を生成させ、 (c) 第１溶液と第２溶液とを混合して第３溶液を
生成させ、 (d) AST及びSGOTから選択される酵素を第３
溶液に加えて安定化された可溶性酵素の溶液を
生成させる ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ２２ (a) 約0.225重量％までのゼラチンと１グ
ラム％のＬ−アラニンと１重量％のα−ケトグ
ルタル酸塩と５重量％のアルブミンとを1.1容
量％のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンからなる緩衝水溶液中に溶解して第１溶液を
生成させ、 (b) エチレン無水マレイン酸の重合体をジメチル
スルホキシド中に10mg／mlの濃度で溶解して第
２溶液を生成させ、 (c) 第１溶液と第２溶液とを混合して第３溶液を
生成させ、 (d) GPT及びSGPTから選択される酵素を第３
溶液に加えて安定化された可溶性酵素の溶液を
生成させる ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ２３ (a) 約0.225重量％までのゼラチンと約５
重量％までのアルブミンと約0.1重量％のNaN3
とを約1.1容量％のトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンからなる緩衝剤水溶液中に溶解し
て第１溶液を生成させ、 (b) エチレン無水マレイン酸の重合体をジメチル
スルホキシド中に約10mg／mlの濃度で溶解して
第２溶液を生成させ、 (c) 第１溶液と第２溶液とを混合して第３溶液を
生成させ、 (d) LDH、γ−GTP及びALK−PHOSよりなる
群から選択される酵素を第３溶液に加えて安定
化された可溶性酵素の溶液を生成させる ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ２４ NAD及びNADHから選択される少なくと
も１種の酵素を第１溶液に加えることをさらに含
んでなる特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５ 酵素がALK−PHOSからなり、可溶性マ
グネシウム塩を第１溶液に加える特許請求の範囲
第２３項記載の方法。 ２６ 酵素を、第１溶液と第２溶液との混合前に
第１溶液に加える特許請求の範囲第１８項乃至第
２５項のいずれかに記載の方法。 ２７ 液状媒質中で、マレイン酸デヒドロゲナー
ゼ、クレアチンキナーゼ、アリカリホスフアター
ゼ、アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼ、
アラニンアミノトランスフエラーゼ、γ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ、α−アミラーゼ、β
−アミラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコー
ス−６−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グリセリンデヒ
ドロゲナーゼ、ゲルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエ
ステラーゼ、リパーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ
及びグリセリンキナーゼよりなる群から選ばれる
酵素の側基と、ポリアクリル酸、ポリメタクリル
酸、次式 ［式中、ｎは整数であり、Ｒは水素又はメチルか
ら選択される基である］ の構造単位を有する重合体及び次式 ［式中、ｎは整数である］ の構造単位を有する重合体よりなる群から選ばれ
る重合体の側基とを反応させて該酵素の側基と該
重合体の側基との間で共有結合を形成させ、この
反応を酵素の活性に作用を及ぼす少なくとも１種
の物質の存在下で行い、そしてこの物質が前記酵
素に対する基質、生成物、活性剤及び抑制剤より
なる群から選ばれることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。
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