JPS6211599B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、マイタケ属（Grifola）に属する微
生物を培養し、その培養物からフエニルアラニン
デカルボキシラーゼを生産する方法に関するもの
である。

【従来技術】

フエニルアラニンデカルボキシラーゼは、フエ
ニルアラニンに作用する脱炭酸酵素で、フエニル
アラニンからフエニルエチルアミンと二酸化炭素
とを生成させる。 従来、このフエニルアラニンデカルボキシラー
ゼは、仔ウシ甲状腺等の動物臓器に存在が認めら
れており、その他では細菌などに存在することも
知られている。［「酵素ハンドブツク」：朝倉書店
発行、1982年］例えば、シユウドモナス・エスピ
ー（Pseudomonus sp.）［Gerald R.Seaman；J.
Bacteriology、Vol.80、830−836（1960）］、ミク
ロコツカス・ペルシトレウス（Micrococcus
percitreus）［H.Nakazawa et al；Biochemical
and Biophysical Research Communications、
Vol.61(1)、75−82（1974）］、更にアクロモバクタ
ー属（Achromobacter）、ミクロコツカス属
（Micrococcus）、スタフイロコツカス属
（Staphylococcus）、サルシナ属（Sarcina）［H.
Nakazawa et al；Agric.Biol.Chem.、Vol.41、
2241−2247（1977）］等の微生物に、フエニルア
ラニンデカルボキシラーゼの存在が知られてい
る。 これらの中で、動物起源のものは数量的に生産
が限定され、また、それら動物の成長に長期間を
要するので、産業的に生産し供給するには非常に
不安定な状態であつた。また細菌起源のフエニル
アラニンデカルボキシラーゼは、それら細菌の培
養によつて生産されるが、低フエニルアラニン食
の調製等に使用するにはその生産菌体及びその分
泌物の安全性に留意し高精製度が要求され、菌種
によつては食品製造に不適な場合もある。 更にまた、従来の細菌起源のフエニルアラニン
デカルボキシラーゼはフエニルアラニンのみでな
く、チロシンやトリプトフアンなどにも活性を有
するため、フエニルアラニンの定量にこの酵素を
利用するとチラミンやトリプタミンも生成され、
フエニルアラニンから生成されるβ−フエニルエ
チルアミンの光学的測定の際これらも併せて計測
されていた。そのため、フエニルアラニンの定量
においては、生成β−フエニルエチルアミンの計
測の際、予めチラミンやトリプタミンの除去を必
要とし、定量操作を煩雑なものとすると同時に、
この除去程度によつて定量精度も大きく影響を受
けていた。

【発明が解決しようとする問題点】

上述したように、従来はフエニルアラニンデカ
ルボキシラーゼの生産・供給が極めて不安定であ
り、また低フエニルアラニン食等の調製において
は高度の精製を必要としているので、製造工程を
複雑にし製造コストの上昇を結果していた。 また、フエニルアラニンの定量では、操作の煩
雑化、定量精度の不安定化をもたらしていた。本
発明者らは、上述の如き問題点を解消して、産業
的に生産が安定的で容易であり、かつ、低フエニ
ルアラニン食調製にも使用でき、また、フエニル
アラニンの定量においては定量操作の簡便化及び
定量精度の安定向上を実現できるところのフエニ
ルアラニンデカルボキシラーゼの製造方法を提供
することを目的としている。

【問題点を解決するための手段】

本発明者らは、上述の如き目的を達成するため
にフエニルアラニンデカルボキシラーゼの製造方
法に関する研究を行つた結果、マイタケ属
（Grifola）に属する微生物が優れた酵素的性質を
有する新規なフエニルアラニンデカルボキシラー
ゼを生産する新知見を見出し、本発明の完成に至
つた。 すなわち、本発明のフエニルアラニンデカルボ
キシラーゼの製造方法は、マイタケ属
（Grifola）に属するフエニルアラニンデカルボキ
シラーゼ生産微生物を培地に培養し、その培養物
からフエニルアラニンデカルボキシラーゼを採取
することより成る。 マイタケ属に属する微生物としては、マイタケ
［Grifola frondosa（Fr.）］、チヨレイマイタケ
［Grifola umbellata］、シロマイタケ［Grifola
albicans Imazeki］、トンビマイタケ［Grifola
gigantea］の４種あり、これらはミズナラ、クリ
などの根際や切株、枝枯れ部分に自生するほか、
広葉樹のオガクズを使用して人為的に栽培もされ
ている。 本発明で使用するフエニルアラニンデカルボキ
シラーゼ生産微生物は、上記の如き市販もされて
いる天然あるいは人工栽培されたマイタケ属微生
物であり、更に、例えばマイタケ［Grifola
frondosa（Fr.）］IFO7040などが利用される。 上記微生物は、財団法人発酵研究所に標準株と
してIFO番号で保存されており、「インステイチ
ユート・フオア・フアーメンテイシヨン・オーサ
カ；リスト・オブ・カルチヤーズ」（Institute
for Fermentation Osaka；List of Cultures）
第７版（1984）に記載されている。 本発明で用いられる微生物の培養に際しては、
微生物が同化し得る炭素源、資化し得る室素源、
その他を有する培地が用いられる。炭素源として
は同化しうるものであれば何でもよいが、特に米
ヌカ、米粉、ふすま、大豆粉、トウモロコシカス
（コーンブラン）、穀物、でんぷんなどがよい。窒
素源としては、ペプトン、酵母エキス、アンモニ
ウム塩類、硝酸塩類、その他の有機又は無機の窒
素含有物が用いられる。その他、少量の無機塩
類、例えばリン酸塩類、カルシウム、マグネシウ
ム、マンガン、鉄などの金属塩類、チアミンなど
の微量栄養物質等も必要に応じて適宜に添加され
る。 培養は静置あるいは振とう培養のいずれでもよ
いが、好気的条件下に深部培養するのが一般に有
利である。 培養温度は10〜40℃の範囲が望ましく、液性を
PH３〜８、好ましくはPH６〜７の範囲に保持し、
５〜10日程度培養するのがよい。子実体を形成す
る場合は、通常用いられるオガクズ栽培法によつ
て子実体形成を行うことができる。オガクズは、
クリ、コナラ、ミズナラなどの広葉樹のオガクズ
を使用し、通気性を高めるためにチツプダストを
混入するとよい。栄養源として米ヌカ、トウモロ
コシカスなどを混入し、攪拌後、水を加えて培地
含水率約55〜68％として、これをオガクズ培地と
する。殺菌後のオガクズ培地に、マイタケ属微生
物の種菌を接種し、培養温度20〜30℃の範囲で60
〜120日程度培養し、次いで温度７〜20℃、湿度
80〜90％程度の環境下で子実体の分化、生長をさ
せるのがよい。子実体を形成しなくともオガクズ
培地で菌糸を培養し、伸長させて、これを使用す
ることもできる。更にまた、従来の人工栽培によ
つて培養されたマイタケを収穫した後の残された
廃培地からも、本酵素を採取することができる。
培養の結果得られた培養物中にはフエニルアラニ
ンデカルボキシラーゼが生成、蓄積されている。
フエニルアラニンデカルボキシラーゼは、液体培
養の場合は、培養菌体中に存在するので、培養物
を遠心分離あるいはろ過によつて菌体等の固形物
を分離捕集し、この固形物部分を水又は温水と共
にホモジナイズした後、遠心分離して、フエニル
アラニンデカルボキシラーゼの抽出された遠心上
澄液を得る。固体培養あるいはオガクズ培地によ
る培養の場合は、子実体あるいは菌糸の蔓延した
培地を水又は温水と共にホモジナイズして、遠心
分離後、フエニルアラニンデカルボキシラーゼの
抽出された遠心上澄液を得る。 この抽出液をフエニルアラニンデカルボキシラ
ーゼ粗酵素原液とし、酵素の一般的分別採取法、
すなわち、アルコール沈澱法、アセトン等の有機
溶媒沈澱法、硫安塩析法、イオン交換樹脂、セル
ロース等のクロマトグラフイー、ゲルろ過法等を
組合わせることにより、フエニルアラニンデカル
ボキシラーゼを採取することができる。 次に、本発明方法によつて得られるフエニルア
ラニンデカルボキシラーゼ（以下、本酵素と称
す）の性質について述べる。 (1) 作用 本酵素がフエニルアラニンに作用した場合、
β−フエニルエチルアミンが生成される。すな
わち、次のような反応を触媒する。 (2) 至適PHおよびPH安定性 本酵素の至適PHは第１図で示されるごとくPH
6.0付近に極めて高い活性を有している。PH3.0
〜9.0が作用PHである。本酵素を35℃において
それぞれのPHで24時間処理したときのPH安定性
を第２図に示した。第２図より明らかなように
本酵素は、PH3.0〜8.0で安定である。 (3) 至適温度および温度安定性 本酵素の至適温度は第３図で示されるごとく
約50℃付近に至適温度を有している。作用温度
は約20〜70℃である。本酵素をPH6.0において
それぞれの温度で10分間処理したときの温度安
定性を第４図に、また、同じくPH6.0において
各温度で処理したときの残存活性の経時変化を
第５図に示す。第４図に示すように、本酵素の
温度安定性は50℃以下で安定であつた。 (4) 分子量 セフアデツクスＧ−150を用いたゲルろ過法
により求めた本酵素の分子量は約120000であつ
た。 (5) 酵素活性測定法 酵素活性の測定は生成するβ−フエニルエチ
ルアミンの量を480nｍにおける吸光度の増加
から測定することによつて算出される。すなわ
ち、0.05Mフエニルアラニン（半井化学薬品
（株）販売）0.5ml、0.5Mリン酸緩衝液（PH
6.0）0.1mlおよび適当に希釈した酵素液0.1mlを
35℃、８分間反応させ、0.1N塩酸0.2mlを添加
した後、生成β−フエニルエチルアミンを薄層
クロマトグラフイー（薄層；シリカゲル、展開
溶媒；ｎ−ブタノール：酢酸：水＝７：１：
２）で分離し、ニンヒドリンで発色後、デンシ
トメーター（島津製作所製、CS−930型）にて
β−フエニルエチルアミンに基づく480nｍの
吸収を測定した。本酵素の活性単位は35℃で１
分間当たりに生成するβ−フエニルエチルアミ
ンのマイクロモル（μmole）数をその単位と
した。（生成１μＭで、活性１単位とした。） (6) 阻害剤および活性化剤 第１表に示す各種薬剤を加え活性を測定した
ところ、本酵素は、Ag⁺の金属イオンおよび
PCMB（パラクロロマーキユリ安息香酸）によ
つて活性が阻害された。またMn²⁺、Mg²⁺の金
属イオンによつて活性化を受ける。

【表】

【表】 (7) 基質特異性 アミノ酸分析機（日立製作所製、835−10
型）での測定において、酵素活性を基質（遊離
アミノ酸）の減少量であらわし、フエニルアラ
ニンを100として比較したところ、第２表に示
すごとく、本酵素はフエニルアラニン、メチオ
ニン、ロイシン、イソロイシンのアミノ酸に対
して作用し、基質特異性を有する。また、本酵
素と、他の微生物起源のフエニルアラニンデカ
ルボキシラーゼとをフエニルアラニンに対する
酵素活性を100として比較すると、第３〜４表
に示す如くとなり、本酵素は従来知られている
フエニルアラニンデカルボキシラーゼとは、性
質を異にするものである。すなわち、従来公知
のフエニルアラニンデカルボキシラーゼは、そ
の作用PHあるいは至適PHにおいて、チロシンお
よび／あるいはトリプトフアンに対し非常によ
く作用するが、これに対して本酵素は、その作
用PHのいずれにおいても、チロシンおよびトリ
プトフアンにはほとんど作用しない（第５表参
照）。

【表】

【表】

【表】

【表】

【実施例】

以下実施例をもつて、本発明方法の内容を更に
詳細に説明するが、これによつて本発明が限定さ
れるものではない。 実施例 １ GYP培地（グルコース50ｇ、イーストエクス
トラクト５ｇ、ペプトン４ｇ、KH₂PO₄1.0ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、CaCl₂・2H₂O0.1ｇを１
に溶解・調製）にマイタケIFO7040を接種し、25
℃で７日間振盪培養して種菌とした。 グルコース３ｇ、大豆粉２ｇ、米ヌカ0.5ｇ、
水100mlの組成の培地を500ml容三角フラスコに注
入し、このフラスコ20本を121℃で30分間殺菌
後、冷却し、これに上記の菌種を接種して、25℃
で20日間、毎分120回転で振盪培養した。培養終
了後、培養物を布ろ過して菌体を補集し、この菌
体を倍量の水と共にミキサーでホモジナイズした
後、遠心分離し、その遠心上澄液を限外ろ過して
本酵素抽出液24.5mlを得た。この抽出液のフエニ
ルアラニンデカルボキシラーゼ活性は、0.17単
位／mlであつた。 実施例 ２ 実施例１のGPY培地で培養したマイタケ
IFO7040種菌10mlを、広葉樹オガクズ４部、米ヌ
カ１部に水70〜80％添加した培地約500ｇを入れ
殺菌（120℃、40分間）した800ml容キノコ培養ビ
ンに接種し、25℃で60日間培養した。次いで、こ
の培養ビンを湿度90％以上、温度10〜15℃の発生
室に移し、この環境下で60日間静置して、マイタ
ケ菌糸が蔓延した発芽オガクズ培地を得た。この
発芽オガクズ培地60ｇに水120mlを加え、ミキサ
ーでホモジナイズし、遠心分離した後、この遠心
上澄液80mlに硫酸アンモニウムを80％飽和になる
ように加えて塩析を行い、得られた塩析物を大量
の蒸留水に対して72時間透析した。透析後、再
度、塩析及び透析を同様にしてくり返し、得られ
た透析内液を限外ろ過で濃縮し約７mlの粗酵素液
を得た。この粗酵素液のフエニルアラニンデカル
ボキシラーゼ活性は、0.305単位／mlであつた。 実施例 ３ 通常方法で栽培されたマイタケ子実体５Kgを水
10と共にホモジナイズし、遠心分離後、この上
澄液をろ過した、この濾液12に硫酸アンモニウ
ムを80％飽和になるように加えて塩析し、この塩
析物を大量の蒸留水で72時間透析した。透析後、
再度、塩析及び透析を同様にくり返し、得られた
透析内液を限外ろ過で濃縮し、約50mlの粗酵素液
を得た。こ粗酵素液を0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.4）に溶解し、あらかじめ同緩衝液で緩衝化し
たDEAE−セルロースのカラム（2.5×90cm）に
吸着させ、吸着物を0.3M塩化ナトリウム水溶液
で溶出した。 次いでこの溶出液を硫酸アンモニウム80％飽和
で塩析し、蒸留水に対して透析後、透析内液を限
外ろ過で濃縮し、この濃縮液を予め0.01M酢酸緩
衝液（PH4.0）で緩衝化したCMセルロースに吸着
させ、吸着物を1M塩化ナトリウム水溶液で濃度
勾配法で溶出した。この活性区分を予め0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）で緩衝化したセフアデツク
スＧ−150のカラム（2.2×80cm）に吸着させゲル
ろ過を行い、次いで吸着物を0.5Mリン酸二水素
カリウム・リン酸−水素二ナトリウム緩衝液（PH
7.0）で濃度勾配法によつて溶出した。この活性
区分を蒸留水に対して透析後、透析内液をコロジ
オンバツクによつて濃縮した。この活性区分は、
ゲルおよびバイオクロマト的に単一であり、本酵
素のフエニルアラニンデカルボキシラーゼ活性
は、4.92単位／mlであつた。

【発明の効果】

本発明によれば、従来では廃棄するか堆肥とす
るしか利用方法がなかつたマイタケ等の培養後オ
ガクズ（廃培地）を、更に利用して、これから本
酵素を採取することができるので、非常に安価に
本酵素を得ることができる。しかもまた、マイタ
ケ等は人工栽培によつて安定的に生産されるので
本酵素の製造供給も安定化できる。 また、従来のフエニルアラニンデカルボキシラ
ーゼは、フエニルアラニン以外にチロシンやトリ
プトフアン等にも脱炭酸酵素として作用し、チラ
ミンやトリプタミンを生成するので、フエニルア
ラニンから生成するβ−フエニルエチルアミンの
定量に大きな誤差を与えたり、また、チラミン等
の除去のために定量操作が煩雑化していた。これ
に対して、本発明によつて得られるフエニルアラ
ニンデカルボキシラーゼは、チロシンやトリプト
フアンに対しほとんど作用しないので、チラミン
やトリプタミンの影響を解消でき、フエニルエチ
ルアミンの定量が簡便かつ精確に行うことを実現
でき、したがつてフエニルアラニンの定量に好適
である。また、本発明方法においては、食用に供
されるマイタケ属に属する微生物、いわゆる「き
のこ」を利用するので、得られる酵素の食品的安
全性は高く、比較的低精製度であつても低フエニ
ルアラニン食等の製造に使用できる。 以上述べたように、本発明によつてより広範囲
に利用できるフエニルアラニンデカルボキシラー
ゼを得ることができ、産業上有益なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によつて得られるフエニルア
ラニンデカルボキシラーゼ（本酵素）のPHと活性
との関係を示し、第２図は、PH３〜９の各PHにお
いて35℃、24時間処理した後の本酵素の残存活性
を示す。第３図は、20〜70℃の各温度において、
PH6.0、８分間処理した後の本酵素の活性を示
し、第４図は、35〜65℃においてPH6.0、10分間
処理した後の残存活性を示す。第５図は、PH6.0
において35、45、65℃の各温度で各々処理した場
合の残存活性の経時変化を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ マイタケ属（Grifola）に属するフエニルア
   ラニンデカルボキシラーゼ生産微生物を培養し、
   培養物からフエニルアラニンデカルボキシラーゼ
   を採取することを特徴とするフエニルアラニンデ
   カルボキシラーゼの製造方法。