JPS62116593A - インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法並びにそれに用いる試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はオリゴヌクレオチドのインビトロ合成に関する
。さらに詳しくは、組換え宿主−ベクター系に用いられ
るデオキシオリゴヌクレオチド、あるいは診断分析用の
標識化オリゴヌクレオチド調製における中間体として用
いられるデオキシオリゴヌクレオチドの合成に関するも
のである。

従来技術 今日、オリゴヌクレオチドは、一般的に普及している２
方法、即ち、ホスホラミダイト法（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　）　　［アダムスら（Ａ
ｄａｍ　ｓ　）１９８３’ジヤーナル・オブ・アメリカ
ン・ケミ力／Ｌ／　・Ｖすｆ−ティ（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅ
ｍ、Ｓｏｃ、　）’　１０５　：６６１およびフレーラ
ーら（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ　）　１９８３　’　テトラヘ
ドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｓ
、　）　’２４：３１７１等参照〕、並びにホスホトリ
エステル法〔ドイツ特許公開公報２６４４４３２）のい
ずれ刀きの方法によって製造されている。両方性共、有
効であって広く受は入れられているが、高価なモノマー
を大量に用いる方法である。またこれらの方法は複雑で
ある。ホスホラミダイト法は各縮合反応の後に水性の系
中での酸化工程を必要とし、他方、トリエステル法は、
失敗した（　ａｈｏｒｔｅｄ　）オリゴヌクレオチド（
ある反応サイクル内で七ツマ−が付加されなかったもの
）の亜集団（サブポピユレーション）ヲ、以後のサイク
ルにおいて、オリゴヌクレオチドを伸長させないために
、個々の段階で１キヤツプ（ｃａｐ　）する１必要があ
る。

本発明は、今日利用し得る方法よりも経済的であり、か
つ信頼性の高いオリゴヌクレオチド合成法を提供するこ
とを目的とするものである。

ヌクレオシドとりん酸とを、アリール・スルホニル・ク
ロリド〔セキネら（Ｓｅｋｉｎｅ　）　１９７９　’　
テトラヘドロンレターズ”　２０：１１４５３またはカ
ーポジイミド〔シヨフィールドら（５ｃｈｏｆｉｅｌｄ
　）、１９６１　’ジャーナル・オブ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサエティ１、ｐ２３１６　）を用いて縮合さ
せ、ヌクレオシドホスホネートを製造する方法は既知で
ある。バールら（Ｈａｌｌ）　［（ｆ９７５）’ジャー
ナル・オブ・ケミカル・ソサエティ１ヌクレオチド、パ
ートＸＬ■、ｐ、２３１６：ｌは、ヌクレオシドＨ−ホ
スホネートをジフェニルクロロホスフェ−トチ処理した
後、酸化して対応するジヌクレオチドホスフェートにす
ることにより、対応するジヌクレオチドホスホネートを
得た。この様に、１９５７年から、ジヌクレオチドホス
フェートの製造に関する知識が当該技術分野に存在して
おり、その間に、複雑で高価につく、オリゴヌクレオチ
ドの合成法が２種類間発されたにもかかわらす、このバ
ールらの開示内容はオリゴヌクレオチドの製造に利用さ
れていない。

ガレラグら（Ｇａｒｅｇｇ　）　（ｗケミ力・スフリプ
タ（ｃｈｅｍｉｃａ　５ｃｒｉｐｔａ　）　’　２５　
＋２８０−２８２（ｆ９８５）〕は、〕５′−〇−ジメ
トキシトリチルチミジン３′−ハイドロゲンホスホネー
と３’−０−ベンゾイルチミジンとは、ジフェニルホス
ホロクロリデート（ジフェニルクロロホスフェートとし
ても知られていル）、２，４．６−トリイソプロビルベ
ンゼンスルホニルクロライドまたは２，４．６−１−リ
イソプロピルベンゼンスルホニルテトラゾライドの如き
活性化剤の存在下において迅速に反応し、ホスホネート
ジエステル（りん酸ジエステル）結合を定量的に形成す
ることを見い出した。ガレラグらによると、３′−ホス
ホネートの安定性を対応する３′−ホスホラミダイトの
それと比較したとき、活性化した場合、それらがホスホ
ラミダイトに匹敵する反応性を有することをも伴わせて
考慮し、オリゴヌクレオチド合成の出発物質としてこれ
らの化合物は適当であるといえる。本発明の発明者らは
、ガレラグの活性化剤は得られる収率が低く、実際のオ
リゴヌクレオチド合成に適さないことを見出したが、こ
のことが、３０年間、オリゴヌクレオチド合成の対象と
してホスホネート化学が利用されなかったことを説明す
る上で役立つと思われる。

ヌクレオチド間ホ７．７エー１−　（ｆｎｔｅｒｎｕｃ
ｌｏｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ　）同族体含有ＤＮＡ
の合成は大きい関心の寄せられている分野である。ミラ
ー（Ｍｉｌｌｅｒ　）およびＴ’ｓｏはＤＮＡのメチル
ホスホネート同族体が細胞膜を容易に通り抜け、タンパ
ク合成を阻止することを見い出したが、これは、おそら
＜ｒｒＬＲＮＡの翻訳阻害によるものと思われている〔
ブレークら（Ｂｌａｋｅ）、バイオケミストリイ（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）２４　６１３９（ｆ９８５）
　、スミスら（Ｓｍ１ｔｈ　）　、プロシーディンゲス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
スイズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８３　２７８７（ｆ９８６）］。

ジヌクレオチドのホスホラミデート同族体は相補的なポ
リヌクレオチドと結合することから、種々のリガンドを
ＤＮＡに結合させるのに利用できることが知られている
〔レソトシンガーら（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　）、ヌクレ
イツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲ
ｅｓ、）１４．３４８７（ｆ９８６））。アミンの存在
下でジヌクレオシドＨ−ホスホネートを酸化スることに
より、対応するジヌクレオチドホスホラミデートを高収
率で得ることができる。〔不一マーら（Ｎｅｍｅｒ　）
　テトラヘドロ７Ｌｚターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ、）２１　４１４９（ｆ９８０））、アサ−ト
ンら（Ａｔｈｅｒｔｏｎ　）　、ジャーナル・オブ・ケ
ミカル・ソサエティ、６６０（ｆ９４５））。オリゴヌ
クレオチドのホスホラミデート、トリホスフェートおよ
びホス７工−トトリエステル同族体の簡便な製造方法が
必要とされている。

要約 本発明の目的は、（ａ）担体と結合したヌクレオシドを
調製し、（ｂ）脱水剤の存在下、保護したヌクレオシド
Ｈ−ホスホネートと、担体と結合したヌクレオシドの５
′ヒドロキシル基とを縮合サセ、（ｃ）ステップ（ｂ）
のヌクレオシドＨ−ホスホネートの５′保護基を除去し
、（ｄ）２以上のヌクレオチドを有するポリヌクレオチ
ドＨ−ホスホネートが得られるまで、選択したヌクレオ
シドＨホスホネートを用いてステップ（ｂ）および（ｃ
）を連続的に繰返し、（ｅ）ポリヌクレオチドＨ−ホス
ホネートを酸化して対応するポリヌクレオチドを形成さ
せ、次いで、（ｆ）ポリヌクレオチドを担体から分離す
ることからなるポリヌクレオチド合°成法により達成さ
れた。ポリヌクレオシドＨホスホネートはホスホラミデ
ート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ　）、チオホス
フェートおよびホスフェートトリエステルオリゴヌクレ
オチドの新規な合成における出発物質として有用である
。

詳しい記述 本発明方法を実施するに際しての出発物質は、担体と結
合したヌクレオシドモノマーと保護すしたヌクレオシド
Ｈホスホネートモノマーである。

担体、：！［合しているヌクレオシドの５／ヒドロ午シ
ル基は保護されていない。本発明に用いられるヌクレオ
シドはＲＮＡまたはＤＮＡのモノマー、あるいはそれら
の誘導体である。リボース含有ヌクレオシドには、例え
ば、アデノシン、グアノシン、イノシン、シチジン、チ
ミンリボヌクレオシドおよびウリジンか含まれる。デオ
キシリボース含有ヌクレオシドにはデオキシアゾ／シン
、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびチミ
ジンが含まれる。前者のヌクレオシド群は、ｍ　ＲＮ　
ＡやｔＲＮＡの合成に、後のヌクレオシド群は、ＤＮＡ
の製造に用いられる。

好適に保護したヌクレオシドＨホスホネートモノマーは
、核酸を構成しているヌクレオチドの同族体である。保
護基は、通常、リボース、あるいはデオキシリボースの
ヒドロキシ置換骨のトリフェニルメチルエステルである
。それらの機能は、縮合反応を、担体と結合したヌクレ
オシドまたはオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキンル基
に限定することである。オリゴデオキシヌクレオチドノ
製造出発物として好ましいホスホネート類並ひに対応す
るヌクレオシド類（括弧で表示）は、５′ジメトキント
リチル−３７−チミジンＨ−ホスホネート（チミジン）
、５′ジメトキシトリチル−３’−（−Ｎ６−ベンゾイ
ルデオキシアデノシン）Ｈホスホネート（デオキシア／
シン）、５′ジメトキシトリチル−３’−４Ｎ４−ベン
ゾイルシチジン）Ｈ−ホスホネート（デオキシシチジン
）、および５′ジメトキシトリチル−３′−〔Ｎ２−イ
ンブチルデオキシグア／シンＩＨホスホネート（デオキ
シグア／シン）である。同様に、オリゴリボヌクレオチ
ドの製造出発物質は、例えば、アデノシン、５′ジメト
キシトリチル−２′−ジメチル【−ブチルシリル−〔Ｎ
６−ペンゾイルアデノシン］−３’Ｈ−ホスホネートで
ある。ホスホネート出発物質は自体既知の方法で調製さ
れるし例、セキネら、１テトラヘドロンレターズ（Ｔｅ
ｔｒ、　Ｌｅｔｔ、　）　’　１６　：１７１１　（ｆ
９７３）参照〕。ホスホネート出発物質の他の製造方法
（好ましい方法である）では、トリス（ｆ，２，４−ト
リアゾイル）ホスファイト（”ｒＴＰ　）を用いる。

Ｔ　Ｔ　ｌ’　ハ三塩化リン（Ｐ（４’３）、１，２．
４−１−リアゾールおよびＮ−メチルモルホリンから、
無水塩化メチレン（ｃＨ２Ｃｅ２）中で、常法通り系中
で生成される。

担体は、オリゴヌクレオチドの合成（こ用いる試薬に不
溶性のものを選択し、各縮合サイクル後におけるポリヌ
クレオチドの回収の便宜を図る。また、担体は、反応体
が入り易く、また生産物並びに反応体が溶離し易い様、
充分多孔性のものを用いる。好ましい担体は調整（コン
トロールされた）多孔性ガラスであり、シリカゲルおよ
びポリスチレンも用いることができる。担体−結合ヌク
レオシドはチョウら（ｃｈｏｗ）’ヌクレイツク・アシ
ツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
）　’　９　：２８０７（ｆ９８１）　　の方法等、既
知の方法で調製される。

ヌクレオシドＨ−ホスホネートは、正（プラス）に荷電
している対イオンを伴なった陰イオンの形で存在してい
る。対イオンとしては、トリエチルアンモニウム（ＴＥ
ＡＨ”）や１，８−ジアザビシクロ［５，４，１ウンデ
カン−７エンーオニウム（ＤＢＵＨ＋）が好ましいっホ
スホネート類のＤＢＵＨ塩は、無水溶媒中での安定性が
増加されている。

担体と結合したヌクレオシドおよびヌクレオシド３′Ｈ
−ホスホネートは、３′ヌクレオシドを担体に結合させ
、予め定められた配列のオリゴヌクレオチドを合成する
ことができる様、順次（思ｓｅｒｉａｔｉｍ　）選択さ
れる。この予め定められた配列と一致させて順番に縮合
させ、オリゴマーに他のヌクレオシドを付加することに
より、オリゴヌクレオチド鎖の延長を行う。

聞合反応の第１回目は、担体結合ヌクレオシドと、オリ
ゴヌクレオチド中の第２番目のヌクレオシドとの縮合で
あるっこの、並ひに以後の反応において重要な試薬は脱
水剤である。適当な脱水剤は、一般に、ホスホリル化剤
またはアンル化剤のクラスに含まれ、それらには、イソ
ブチルクロロホルメート、ジフェニルクロロホスフェー
ト、無水酢酸、無水イ′ノ酪酸および無水トリメチル酢
酸の如き有機酸無水物、並ひにピバロイルクロライド、
ピバロイルブロマイドおよびベンゾイルクロライドの如
き有機酸ハロゲン化物が含まれる。ジフェニルクロロホ
スフェート、カーホンイミド、アリールスルホニルクロ
ライドおよびアリールスルホニルテトラゾライドは、本
発明者の行った実験では極めて低い収率しか与えなかっ
た。オリゴヌクレオチドの製造において最も重要なアシ
ル化剤およびホスホリル化剤の性質は、各サイクル毎に
、実質上、全ての新生（ｎａｓｃｅｎｔ　）担体−結合
鎖にヌクレオシドを付加させる能力である。もしも追加
のヌクレオシドが鎖の亜集団（５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉ
ｏｎ　）と結合しなかったならば、即ち、その亜集団に
ついて反応サイクルが失敗したならば、この亜集団に以
後の付加かなされた結果生成するオリゴヌクレオチドは
、塩基１個分短７１１）いことになる。このことは、該
オリゴヌクレオチドの、組換え培養中で発現されるべき
ＤＮＡ中の成分としての呵用件を失ｆ、＞わせるもので
ある。何故ならは、この様な欠失によってＤＮＡがリー
ディングフレームから外れることになると共に、長いオ
リゴヌクレオチド生産物中に混在する欠失突然変異体を
見出すことは困難であるからである。この様に、分子生
物学に用いるオリゴヌクレオチドを製造するには、鎖の
延長に高い忠実性を示す、即ち、各サイクルにおける付
加収率の高い脱水剤を選択することが重要である。本明
細書中に特に示したもの以外の、その様な優れた試薬の
選択は、スクリーニングアッセイによって行うことがで
きる。

採用されるスクリーニングアッセイについては、実施例
２にさらに詳しく述べられている。担体−結合ヌクレオ
シドに、４サイクルでヌクレオシドＨ−ホスホネート（
Ｎ）を縮合させ（最後のサイクルにおいては必ずＮ５を
得る）、次いで、担体からポリヌクレオチドＨ−ホスホ
ネートを分離してオリゴヌクレオチドに変換し、ＨＰＬ
Ｃにかけて分離し、Ｎ２ｐ）らＮ５までのオリゴマーの
分布を調へる。もしも選択した脱水剤が、オリゴマーの
吸光係数について修正した分光光度法に基つく吸収の測
定により、約８０モル％以上（通常、約９０％以上）の
Ｎ５を含むオリゴマー混合物を産生じているならば、こ
の試薬は本発明の目的に好ましいものとみなされる。あ
るいはまた、ステップｄ）を４９サイクル行った後、ス
テップｅ）およびｆ）を行い、得られた組成物中に所望
の５０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド組成物
を、他のオリゴヌクレオチド種よりも多量のモル数で含
有するオリゴヌクレオチド組成物か得られる様な脱水剤
を選択する。当該技術分野においてジヌクレオシドの製
造に用いられてきた試薬はホスホリル化剤またはスルホ
ニル化剤である。これら当業者に用いられてきた試薬、
とりわけ、ジフェニルクロロホスフェート、２，４．６
−　トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライドま
たは２，４．６−）リインプロピルベンゼンスルホニル
テトラゾライドの如き試薬は本発明の厳密な標準に合致
しない。

好ましい活性化剤はアシル化剤である。特に好ましいア
シル化剤は、式： 〔式中、Ａはアリールまたは、式： −Ｃ− （式中、Ｒは、好ましくは直鎖または分枝鎖状アルキル
、アリール、ヘテロアルキルまたはヘテロアリールから
選ばれる同一または異なる不活性な置換基を表わす） で示される基、Ｘはハロゲンあるいは異項環２級アミン
または活性エステル等の部位（ｐｓｅｕｄｏ）ハロゲン
を表わす〕 で示される構造を有するものである。Ｒはアルキルであ
ることが好ましく、Ｘは塩素または臭素であることが好
ましい。式中ＲｆＪＳＣＨ３であってＸが塩素である塩
化ピバロイルがアシル化剤として好ましい。

代表的な異項環アミンのＸ基はテトラゾールである。こ
の種の代表的な例は式： で示される化合物である。　　　　　　　　０このもの
は自体既知の方法に従い、Ｃ１３ＣＣＣｅとテトラゾー
ルとを反応させることにより、得られる。

代表的な活性エステルは、式： で示される化合物であって、Ｃ１３Ｃ−Ｃ−ＣＩ　　と
ヒドロキシベンズトリアゾールとの反応によって製造さ
れる。その他の適切な脱離基は当業者にとって自明であ
る。

通常、脱水剤は約２５ｍＭ−１００ｍＭの濃度で用いら
れる。塩化ピバロイルは、約５ＱｍＭの濃度、あるいは
ホスホネートモノマーに対し、塩化ピバロイルが５モル
当量存在する量で用いることが好ましい。１０当量を用
いるとオリゴヌクレオチドの収率が低下する。このこと
は、競合的アシル化によって収率が限定されること、お
よび余分のキャッピング工程を必要としないことを示唆
している。塩化ピバロイルは反応に失敗した鎖の小部分
と反応し、以後の縮合に関与し得ないピボレー１−　（
ｐｉｖｏｌａｔｅ　’）エステルを生成させる。この様
に、不完全な鎖は別の工程、または余分の試薬を加える
必要なしに、キャップ（閉鎖）されるのである。

縮合に必要なホスホネートの量は、一般に、約５　ｍ　
Ｍ〜２０　ｍ　Ｍの濃度域であり、約１０ｍＭ［相対的
に５’−ＯＨ成分の５ｅｑ、（当量）に相当〕が普通で
ある。これは、通常、約５ＱｍＭを要する既知のオリゴ
ヌクレオチド合成法で用いられるモノマー量に比べてか
なり少量である。

縮合反応の溶媒は無水有機溶媒、好ましくは無水ピリジ
ン／アセトニトリル（容量比１：１）の混合物である。

反応は、一般に、脱水剤と選択したホスホネート溶液と
を混合した後、得られた混合物を担体−結合オリゴヌク
レオチド鎖と接触させることにより行われる。通常、担
体は粒状であり、これをカラムに詰めた後、その上から
、モノマーと脱水剤の溶液を通す。接触時間は通常約０
．５〜５分間であり、約１．５分間か好ましい。反応温
度は約１０℃〜３０℃、好ましくは２０℃である。

各サイクルの後に、アセトニｌ−Ｕルの如き有機溶媒で
洗浄することにより担体から残存する脱水剤およびヌク
レオシドＨ−ホスホネート含有溶液を除去する。その後
、好ましくは、２．５Ｖ／Ｖ％のジクロロ酢酸／ＣＨ２
Ｃｅ２溶液で処理することにより付加されたヌクレオシ
ドを脱保護する（但し、ｌ　ｗ／ｖ　’ｌ、　トリクロ
ル酢酸／　ＣＨ２ＣＩ２またはＺｎＢｒ飽和ニトロメタ
ンも有用である）。その他の既知の保護基に関する適当
な脱保護法は当業者にとって自明であろう。次いて、好
ましくは担体を無水ピリジン／アセトニトリル（ｆ／１
　ｖ／′ｖ）で洗浄し、この縮合反応を、予め定められ
たオリゴヌクレオチドの製造に必要な回数、繰返して行
う。

必要な数の合成サイクルを行った後、ポリヌクレオチド
バーホスホネートを酸化して核酸にする。

ホスホラミデート・ヌクレオチド間結合を有スルオリゴ
ヌクレオチドを調製するために、１級または２級アミン
、並びに、好ましくは四塩化炭素の存在下で酸化を行う
。ヌクレオチド結合内にホスフェートジエステルを生成
させる上で好ましい酸化剤はヨウ素水である。その他、
代表的な酸化剤には、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−
ブロモスクシンイミド、または過ヨウ素酸の塩類が含ま
れる。次いで、オリゴヌクレオチドを担体から分離する
が、濃水酸化アンモニウムとインキュベーションした後
、残存するシリカゲルを戸去し、オリゴヌクレオチド−
含有溶液を蒸発させる方法によることが好ましい。所望
により、このオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ，ポリアク
リルアミドゲル電気泳動、あるいはその他の通常の方法
で精製し、核酸配列決定法によって生産物の忠実度を確
認する。

上記の議論はモノヌクレオシドホスホネートの逐次付加
についてなされているが、特定のサイクル（こおいては
、ポリ（ヌクレオシドホスホネート）、通常ジーまたは
トリーヌクレオシドホスホネートを用い、１以上のヌク
レオシドを付加することもできることは理解されるであ
ろうっこれらの反応物ハ、可溶性のヌクレオシド（担体
と結合していても、いなくても良い）を、上記の鎖の開
始におけるヌクレオシドホスホネート以外のヌクレオシ
ドホスホネートに縮合させることにより、容易に調製さ
れる。次いで、その様なジヌクレオシドジホスホネート
をモノヌクレオシドホスホネートの代りに用いる７：ｌ
）、あるいは、他のポリ（ヌクレオシドホスホネート）
の製造に用いる。これらの新規な中間体は、式： （式中、ＹはＤＢＵＨの如き対イオン、ｎは１またはそ
れ以上であって、通常２、〜１はヌクレオンドを表わす
） て示される構造式を有する。通常、ヌクレオシドは保護
される。その様な化合物の例として５′ジメトキシトリ
チル−３′−チミジル−５′−Ｈ−ホスホネート−３′
−チミジン−Ｈ−ホスホネートかアル。

これらの反応物は、精製し、無水固形物として保存すべ
きである。

以下に実施例を挙げ、本発明を説明するが、これらの実
施例は本出願の発明の範囲を制限するものと解釈される
べきでない。

実施例１　エイコサチミジル酸（Ｉ２０）およびテトラ
コンタチミジル酸（Ｉ４０）の製造５′−ジメトキシト
リチル−３′−チミジン−Ｈ−ホスホネート（ｆ）の合
成上の有用性は、シリカゲル上でのＩ２０およびＩ４０
の合成により示された。

５′−ジメトキシトリチル−３′−チミジン−Ｈ−ホス
ホネートを既述の如く製造し、３１ＰＮＭＲ（δ−０，
２７ＰＰｍ、Ｊ（Ｐ−Ｈ）＝６０５Ｈｚ）ＣＰＮＭＲス
ペクトルは無水Ｐｙｒ　（ピリジ７　）　／　ＣＨ３Ｃ
Ｎ　（ｆ／　１　）溶液中、で得られ、化学シフトは、
５％りん酸／Ｄ２０（外部基準）との相対関係に基つい
て示されている〕により特性化された。反応は下記の反
応式（ｆ）で示される。式中、ＤｋＩＴはジメトキシト
リチル、Ｐｙｒはピリジン、ＤＣＡはジクロロ酢酸、そ
して技はスクシニル・シリカを表わす。

尖 既述の如く（チョウら、＋」ＩｊＩＵ　）、シリカゲル
１ｙ当り３′−スクシニルチミジン２５μモルヲ用いて
ポリ７−支持体（シリカゲル）を誘導体化した。

この合成サイクルは、？、１０ｍＭの１（主の５′−Ｏ
Ｈ成分の５当債に相当）および５０ｍＭ塩化ピバロイル
ヲ無水ピリジン／アセトニトリル（ｆ／１）中、２０℃
で５分間縮合反応させた後、２．５６！６ＤＣＡ／ＣＨ
２Ｃｅ２を用いて（２分間）３のジメトキシトリチルを
脱保護することからなる。必要な回数、合成サイクルを
行った後、ポリチミジンＨホスホネート産物ジをテトラ
ヒドロ７ラン／Ｐｙｒ／Ｈ２Ｑ（９０１５１５）中０．
２　Ｍ　Ｉ２　　で酸化しく２分間）、ポリチミジル竣
工を得た。固体支持体７１１）ら工を除去しくａＮＨ４
０Ｈ１５時間１５５℃）、蒸発させた。粗生成物Ｔ２０
　を１（ＰＬＣ分析にかけたところ、この生成物のピー
クは、ホスホラミダイト法で調製したＴ２０標準品と同
時に溶離することが分った。Ｉ２０および゛ｒ４０粗生
成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｕ、
Ｖ、照射下に観察して評価した。分析データーから、Ｉ
２０およびＩ４０の両者が高収率で合成されることが明
らかにされた。Ｉ４０　　を、さらに、ポリヌクレオチ
ドＴ４キナーゼを用い、ｒ−３２ｐ−ＡＴＰによる５′
末端の標識化を行った後、ヘビ毒ホスホジェステラーゼ
により完全に分解することによって評価した。あらゆる
判断基準において、合成Ｔ４０はＴ４０標準品と同じで
あった。

実施例２　好ましい脱水剤の同定 ジフェニルクロロホスフェート（ＤＰＣＰ）を脱水剤と
する並行（パラレル）サイクルを行うと共に、ペンタチ
ミジル酸（Ｉ５）を得るまで、４サイクルまで反応を行
うことを除き、実施例１の方法を繰返して行った。カラ
ムからの粗溶出液を）（ＰＬＣ分析に付し、未成熟な鎖
で終っているオリゴヌクレオチドの割合（％）を調べた
。ＨＰＬＣ樹脂はゾルパックス（Ｚｏｒｂａｘ　）　−
ＮＨ２（商標）ヲ用いた。流速は２．５　ｍＭ　／分で
あり、１５ｖ／ｖ％Ｃ）（３ＣＮ中、２５　ｍ　Ｍ　〜
２５０　ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５，５）のリニアー
グラディエンドを用いた。１５分間、フラクションを集
め、２５４　ｎｍにおける吸収を測定した。ｆ（ｔ’　
Ｌ　Ｃチャートから、Ｉ２、Ｉ３　、Ｔ４およびＴ５各
々の１個の実質上対称的なピークの高さを測り、各オリ
ゴマーについての吸光度係数を補正しく各ピークの値に
、それぞれ２，５．１．７５．１．２５および１を掛け
る）、各粗溶出液中の全ポリチミジンに対する割合（％
）に変換した。結果を下記の表に示す。

Ｔ２　　　　２５　　　　　　２．５ Ｔ３　　　　２３　　　　　　３．５ Ｔ４　　　　４４　　　　　　５ Ｔ５　　　　　８　　　　　　８９ これらの結果は、塩化ピバロイルが、４サイクル反応に
おいて約１１％の未成熟に終結したオリゴマーを与える
にすきず、従って、好ましい脱水剤であることを証明す
るものである。

ＤＰＤＣを用いたＴ５の収率は塩化ピバロイルを用いた
場合の約１０％にすぎない。アリールスルホニルクロラ
イドおよびカーポジイミド類ではＴ５の生成を検出でき
なかった。この様に、好ましいアシル化剤を用いる本発
明の方法は、予想外の高い収率をもたらすと共に、未成
熟な鎖の終結を減少させる結果を与えた。

実施例３　　ヌクレオシドＨホスホネートの製造本発明
に用いるデオキシヌクレオンドの製造は下記の反応式２
に従って行われた。

反応式２ ％式％ 無水ＣＨ２Ｃ召。７５０ｍＱ中のＰＣｌ３（７５ミリモ
ル）およびＮ−メチルモルホリン（７５０ミリモル）の
撹拌溶液に１．２．４−　トＩＪアゾール（２５０ミリ
モル）を室温で加えた。３０分後、反応混合物を０℃に
冷却し、５′−ジメトキシトリチルチミジン（ｆａ１１
５ミリモル、ＣＨ３ＣＮから共沸蒸留して乾燥）を無水
ＣＨ２Ｃ６２２０ＯｍＱ中に入れ、これを２０分間で滴
下し、１０分間撹拌した後、１．０　Ｍ　ｌ−ＩＪエチ
ルアンモニウムビカーボネート水溶液（ＴＥＡＢ、ｐＨ
８，５）　６００　ｍＱ中に注き入れ、振盪した後、分
離させた。水層をＣＨ２Ｃ：　（ｆ２２００ｍＱで抽出
し、有機面を一緒にしてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発さ
せて泡状体とした。ソリ力ゲル力ラムクロマトグラフイ
−（２％Ｅ【３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２−〉２％Ｅｔ３Ｎ／１
０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃ７１！２）にかけた後、−ｒＥ
　Ａ　Ｂで抽出し、蒸留することにより、５′−ジメト
キシトリチル−３′−チミジンＨ−ホスホネート（ｆａ
）を収率９０％で得た。その他のデオキンヌクレオンド
Ｈ−ホスホネート類は全て同様の方法で得られた。

個々の収率と３’Ｐ　ＮＭＲデーターを表１に示す。

表１ ３１ＰＮＭＲ１） ８７．オッ、　　　　　　ヶえカフ、　　　　　　　収
率２）チミジン（ｌａ）　　　　　−０，３ｐｐｍ　　
６０５ｔ（ｚ　　９０デオキシアゾ／シン（ｆ６）　　
−０，３Ｐｐｍ　　６００Ｈｚ　　　８５デオキシシチ
ジン（ｌｃ）　　　−Ｑ、３ｐｐｍ　　６０３Ｈｚ　　
　８６デオキシグア／シン（ｌｄ）　　−０，６ｐｐｍ
　　６０５Ｈｚ　　　７７１　）　　３’Ｐ　ＮＭＲス
ペクトルは無水Ｐ　ｙ　ｒ　７’ＣＨＣＮ　（ｆ／１）
溶液中で得られ、ケミカルシフトは、５％りん酸／Ｄ２
０（外部基準）との相対値として示されている。

２）各々の収率は保護されたデオキシヌクレオソド（Ｉ
ａ−Ｉｄ）に基ついているっ 実施例４　デオキシオリゴヌクレオチドの合成ここに示
す方法は、本発明の実施における最も優れた方法である
。合成はバイオサーチモデル（Ｂ　１ｏｓｅａｒｃｈ　
Ｍｏｄｅｌ　）　８５　Ｑ　Ｑ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装置を
用いて行われた。トリメチルアセチルクロライド（塩化
ヒバロイル）を大気圧下で蒸留し、アルゴン（Ａ　ｒ　
）下に保存した。ピリジン（Ｐｙｒ）ヲｐ　−トルエン
スルホニルクロライドから蒸留した後、水素化カルシウ
ムから新らたに蒸留した。アセトニトリル（ｃＨ３ＣＮ
）を、活性化した３オングストロームのモレキュラーシ
ーブで乾燥した。デオキシ−ヌクレオシドＨ−ホスホネ
ート（ｌａ−１ｄ）を無水０（３ＣＮから共沸蒸留して
乾燥し、無水Ｐ　ｙ　ｒ　／ＣＨ２ＯＮ　（ｆ：１）中
で再構成した。合成は、調整（コントロール）多孔性ガ
ラス（０，１μモルのスケール）上で、以下のプロトコ
ールに従って行った。

合成サイクル（実施例１の反応式１） ％式％） ２）脱保護：２．５％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）／ＣＩ（
２０ｅ２（ｆ分間）。

３）洗浄：無水Ｐ　ｙ　ｒ　／ＣＨ３ＣＮ　（４５秒間
）。

４）結合（カップリング）：１０ｍＭデオキシヌクレオ
シドＨ−ホスホネート（ｌａ−１ｄ）、無水ＰＹｒ／Ｃ
Ｈ３ＣＮ（ｆ／Ｉ　Ｖ／Ｖ）中５ＱｍＭ塩化ピバロイル
（ｆ，５分間）。

５）ヌクレオチド配列が完成するまでステップ１−４を
繰返す。

６）　脱係ｉＪ　：　２．５％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｅ２（
ｆ分間）。

７）Ｈ−ホスホネートＤＮＡの酸化：■Ｐｙｒ／ＮＭＩ
／Ｈ２０／ＴＨＦ　　（容量比５／１１５／９０）中０
．１　Ｍ１２（２，５分間）　、（り　Ｅｔ３１’ｔＪ
／Ｈ２０／ＴＨＦ　（容量比５１５／９０　）中０、１
　Ｍ　Ｉ２　（２，５分間）による。ポリマーからＤＮ
Ａを除き、脱係ｉ　（ｉ！　ＮＨ４０）Ｉ、５５℃、５
時間）し、蒸留する。

デオキシヌクレオシドＨホスホネート（ｆａ−１ｄ）ヲ
、長さ１０７塩基までのデオキシオリゴヌクレオチド（
ＤＮＡ）の合成に用いたが、これが合成の許容範囲の上
限ではない。上記の合成プロトコールでは、簡便かつ迅
速な方法（４分／サイクル）に於いて、最少量のデオ牛
ジヌクレオシドＨホスホネート（２，５ｍ、Ｆ　／ｍ合
）を用いている。ヌクレオシド間のりん原子は、それが
酸化状態にあることで望ましくない副反応から保護され
ており、固有のホスフェートジエステルはヨウ素水によ
る酸化合成反応の後に生成する。

ポリ７−と結合したポリヌクレオシドＨホスホネート（
３）　（７）　Ｐｙ　ｒ　／Ｈ２０／ＴＨＦ　（５／　
５　／　９０　）中０．１Ｍ■２溶液による酸化は、首
尾一貫した結果を得るには不適当であった。ジアルキル
ホスホネートのヨウ素水による酸化には一般的な塩基性
触媒に委ねられており〔ルイス（Ｌｅｗｉｓ、　Ｅ、Ｓ
、）およびスヘアーズ（５ｐｅａｒｓ、　Ｌ、Ｇ、　）
　　ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ンサエ
テイ（Ｊ、Ａｍｅｒ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）１０７．３９１８（ｆ９８５））
、このことから、本発明者らは、Ｎ−メチルイミダゾー
ル（ＮＭＩ）またはより強力な塩基〔即ち、Ｎ−メチル
モルホリンまたはトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）〕を加
えると酸化速度が増大し、従って長いデオキシオリゴヌ
クレオシドＨホスホネート（３，＞４０塩基）の酸化に
それが必須であると断定した。ジアルキルＨ−ホスホネ
ートはアルカリ加水分解を受は易いとされており〔クメ
（Ｋｕｍｅ　、Ａ）、フジイ（Ｆｕｊｉｉ、Ｍ）　、（
Ｓｅｋｉｎｅ、　Ｍ、　）およびハタ（Ｈａｔａ　、　
Ｔ　）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリ
イ（Ｊ、Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ）　４９．２１３９　　（
ｆ９８４））、本発明者らはＥ　ｔ　ａＮを用いたポリ
ヌクレオシドＨホスホネート（３）の水中での酸化は競
合的加水分解により複雑化していることを見い出した。

長いデオキシオリゴヌクレオシドＨホスホネート（３）
　（＞　４０塩基）のヨウ素醒化においては、まず弱塩
基性溶液（Ｐｙｒ／ＮＭＩ）、次いで強塩基性溶液（Ｅ
ｔ３Ｎ）で酸化すると、生成物デオキシオリゴヌクレオ
チド（４）を最も高い収率で得ることができることが分
った。さらに、本発明者らは、ヨウ素（Ｉ２）水溶液は
■０３−と■−とに不均衡化されていることを見出した
が（ルイス、前掲）、このアルカリ性ＩＯ３−溶液はジ
ヌクレオ傘シトＨ−ホスホネート（３）を酸化しないで
あろうと思われるしブラウン（Ｂｒｏｗｎ、　Ｄ、ＭＪ
よびハモンＦ　（）（ａｍｍｏｎｄ　、　Ｐ、Ｒｏ）、
ジャーナル・オブ・ケミカル・′ノサエテイ（Ｊ、　Ｃ
ｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）４２２９　　（ｆ９６０））。従
って、別々の溶液を調製し［Ａ＝＝０、２　Ｍ　Ｉ２／
ＴＨＦ　、　Ｂ−塩基／　Ｈ２０／Ｔｔ（Ｆ　（、１／
１／８）’］、デオキンオリゴヌクレオシドＨ−ホスホ
ネート（３）の首尾一貫して迅速な酸化を行う直前にこ
れらを混合する必要かある。

デオキシオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートＭ合（３
）の、デオキシオリゴヌクレオチド合成に用いた試薬に
対する安定性を評価するための実験を行った。２４量体
を製造し、デオキシヌクレオンドＨ−ホスホネート（３
）の酸化に先立ち、固体支持体の一部を、１）無水Ｐｙ
　ｒ／ＣＨ３ＣＮ　（ｆ／１　）、２）無水ＣＨ３ＣＮ
、３）無水Ｐ　ｙ　ｒ　／ＣＨ３ＣＮ　（ｆ／１）中１
００ｍＭ塩化ピバｏイル、および４）２．５％ＤＣＡ／
ＣＨ２Ｃｅ２で４時間処理１．、次イテ、Ｃ）１３ＣＮ
洗浄、酸化、洗浄、脱保護（濃ＮＨ４０Ｈ１５時間１５
５℃）、および蒸留を行った。ポリヌクレオチドＴ４キ
ナーゼを用い、γ−３２Ｐ−ＡＴＰで５′末端を標識し
た後、試料をゲル電気泳動とオートラジオグラフィー（
データーは示されていない）によって分析した。これら
の条件下ではポリヌクレオシドＨホスホネート（３）の
検出し得る程度の分解は認められなかったか、ＣＨ３Ｃ
ＮまたはＰ　ｙ　ｒ／Ｃ）′１３ＣＮ　ｍ液に水を加え
て１％とすると４時間の間に、検出し得る分解が起きた
。これらの結果は、Ｈ−ホスホネート結合が、合成の間
中、りん保護基として作用することを示唆している。

３′または５′−ホスフェートリンエステルがデオキシ
アゾ／シンのグリコシド結合を、酸によって触媒される
脱プリン化１Ｊ）ら安定化することが示された〔タナ力
（Ｔａｎａｋａ　、　Ｔ、　）およびレツツインガ＝（
Ｌｅｔｓ　ｉｎｇｅｒ　、Ｒ，Ｌ、　）　ヌクＬ／イツ
’）−７’／ツ７：、　＋）　サーチ（Ｎｕｃｌ　、　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）　１０３２４９（ｆ９８２）
）。ヌクレオシド間Ｈ−ホスホネート結合（３）が脱プ
リン化速度に及ぼす影響を評価した。

Ｎ６−ベンゾイルアミド（３ｂ、ａ）またはＮ６−歩イ
ンブチルホルムアミジン（３ｅ、ａ）で保護された、ポ
リマーと結合している３′−チミジン−５′−デオキシ
アデノシンジスクレオシドＨ−ホスホネートを２．５％
ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２で２４時間処理し、分析した。Ｈ
−ホスホネートジエステル（３）とメチルホスフェート
トリエステルの間には脱プリン化速度において検出可能
な差異を認めなかった（データーは記載されていない。

また、この実験では、Ｎ６−ベンゾイルアミドで保護さ
れたデオキシアデノシンと比較して、Ｎ６−アミジンで
保護されたデオキシアデノシンの方がより安定であるこ
とが確認された。

記載のプロトコールを用いてＤＮＡの特定の配列を合成
し、粗生成物の特性を調べた。

表　合成されたデオキシオリゴヌクレオチド＊１ ７８ａ　　　　　　５’−ＡＧＣＴＣＴＣＧＴＡＡＡＡ
ＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＴＧＸＡＡＧＣＡＡ７８ｂ
　　　　　　３ｔ−ＧＡＧＣＡτ丁τττＣＣＣＡ丁Ａ
ＧＣＴＧτ丁ＡＣττＴＣＧττＡＡＡＡＧＣＡＴＧＡ
ＣＴττＣＣＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＴＡＡＧＡＣτ
τＴＧＡＡＴＧＡ　　　−３’ ＡＡＣτ丁ＡＣＴＣＴＡＧ−５’ ９９　　　　　　５’−ＡＧＴＡＧＣＡＡＧＣττＧＡ
ＧＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣτＡＴＣＣ
ＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴ
ＣＣＡＣＴＣＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣττＧＡＧＴＧＡＣ
ＡＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’ １０７ａ　　　５’−ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡ
ＡτＡτＣＧＣＡＴτＴＣＴＴＣτＴＧＣＡ１０７ｂ　
　　３’−ＧＴＡＣＴττττＣＴＴＡＴＡＧＣＧＴＡ
ＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧτＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧττττ
ττＣ丁ＡττＧＣＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＴＡＡＣｊＡ
ＴＡＣＡＡＧ（：ＡＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＴＧτ
τＴＧＣＧＣＡτＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＴＧＧＡＴＧＧ
ＡＧＧＡＡＧττＡＴＴＡＡＡττＡτＡＣＧＴＣＴＧ
ＡＧＴＡＣＣＴＡＣＣＴＣＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＴＴＡ
ＡＴＡＧＣ−３’ ＣＧＣＣＧＧ−５１ デオキシオリゴヌクレオチド７８ａ、７８ｂ　および９
９をメトキシジイソプロピルアミノホスホラミダイトを
用いて合成し、比較のために表に示した。アミダイト合
成は、存在し得るホスファイト−異頃環塩基生成物を酸
化して加水分解する前に３０秒間の水洗を行うことを除
き、標準的なプロトコールを用いて行った。表に示した
データーは、デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中
間体を用いて生産物デオキシオリゴヌクレオチドがＭ収
率で合成されることを明白に示している。この時点では
、Ｈ−ホスホネートＤＮＡの配列における忠実度は、ホ
スホラミダイト法により生産されたものよりも低いか、
この短所は、合成サイクルがより単純であり、合成に必
要なデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート濃度が低い
ということによって十分相殺される。

実施例５ まず、ジヌクレオチドホスホラミデート２ｅおよび２ｆ
（反応式３参照）を製造するため、ボリア〜と結合した
ジヌクレオシドＨ−ホスホネート１を、対応するアミン
（ｆ０％）とテトラヒドロフ５　：／　（Ｔｔ（Ｆ　）
　トノｇｉ中、０．０５　Ｍ　１２で５分間酸化した。

反応式３ ％式％） 生成したアミダイトを固体支持体から除去しく５０℃６
ｍ水酸化アンモニウム（ＮＨ４０Ｈ）７ジオキサン、８
時間、ｒ、ｔ、　）、蒸留した。両生酸物の３１Ｐ　Ｎ
ＭＲスペクトルは、略同量のジアステリオマー（ｄｉａ
ｓｔｅｒｉｏｒｍｅｒ　）が存在することを示シティた
［　３１ｐ　ＮＭＲスペクトルはＣＤＣＣ５中で得られ
、ケミカルシフトは５％りん酸／Ｄ２０（外部基準）と
の相対値で示されているＨ２ｅ　　δ−９，１、−８，
８ｐｐｍ　；　２ｆ　　δ−７，９、−７，６ｐｐｍ　
〕。〕Ｈ−ホスホ＊−トジエステのホスホラミデートへ
の酸化は、競合的加水分解によりジエステル２ａが生成
し複雑であった。Ｈ−ホスホネートジエステルを四塩化
炭素で酸化してホスホラミデートを得る方法〔アサ−ト
ンら（Ａｔｈｅｒｔｏｎ　）、ジャーナル・オブ・ケミ
カ／Ｌ／７サエテイ（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）
　６６０（ｆ９４５）、ツヴイアーザック（Ｚｗｉｅｒ
ｚａｋ　、　Ａ、）　’ｉンセシス（５ｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ　’）　５０７（ｆ９７５）］　　は、ＣＣｅ４への
水の溶解度が低いという利点がある。全てのジヌクレオ
チドホスホラミデート（２ｂ−ｇ）　　は、対応するア
ミンのＣＣｌ４中１０％溶液を用いて（５分間）調製し
た（対応するホスホラミデートを調製するには、ジオキ
サン／　ＣＣＶ４（ｆ／４　）　中、アンモニアまたは
メチルアミン飽和溶液を用いた）。

試料の高速液体クロ７トグラフイ＝（Ｈｌ）ＬＣ）　は
、競合的加水分解は極く少量で、生産物ホスホラミデー
トが高収率で得られていることを示していた（ンチミジ
ンホスフエートジエステル２ａく３％）。

ホスホラミデート結合の濃ＮＨ４ＯＨに対する安定性を
それぞれについて調へ、その結果、ホスホラミデート２
ｃｍ２ｇは、通常の異項環Ｎ−アシル保護基の除去に必
要な条件（５５℃、５時間）下に安定であることが示さ
れた。この様な条件下、ホスホラミデート２ｂは迅速に
分解（ｔｌ／２＝１５分）し、３′ホスホラミン酸モノ
ニステルト５′ホスホラミン酸モノエステルの混合物と
なった〔トマス（Ｔｏｍａｓｚ　、　Ｊ、）　、ヌクレ
オシドとスクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎ
ｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　）　２　５１　（ｆ９８
３）〕。ジヌクレオチドホスホラミデート（２ｈ−ｇ）
の、エキソヌクレアーゼによる酵素分解に対する安定性
を、膵臓のホスホジェステラーゼとヘビ毒のホスホジェ
ステラーゼを用いて調へた。ジヌクレオチド（２ａ−ｇ
）　　と対応する酵素／バッファー溶液とを３７℃で１
時間インキュベーションすると、ホス７エートジエステ
ル（２ａ）は完全に分解されたか、ホスホラミデー１−
　（２ｂ−ｇ）の分解は検出されなかった（逆相）ＩＰ
ＬＣによる評価）。

観察されたジヌクレオチドホスホラミデート２ｂの酵素
学的安定性は、オギルビー（Ｏｇｉｌｖｉｅ）　［ネー
マーら（Ｎｅｍｅｒ　）　、テトラヘドロン・レター（
Ｔｅｔｒａ　ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　）　２１４１
４９　（ｆ９８０））の説に反するが、レッシンガー（
Ｌｅｔｚｉｎｇｅｒ　）　〔レッシンガーら、ヌクレイ
ツク・アシツズ・リサーチ（ＮＬＩＣＩ、　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、　）１４　３４８７（ｆ９８６））の報告と
は一致する。

この酸化工程の範囲をさらに追求するために、１〜９個
のホスホモルホリゾート（ｐｈｏｓｐｈｏｒ　−ｍｏｒ
ｐｈｏｌ　１ｄａｔｅ　）結合を含有するウンデカチミ
ンル酸（Ｔｌｌ　）を調製した。上記のプロトコールを
用い、調整多孔ガラス上でポリチミジンＨ−ホスホネー
ト合成を行った。反応式４によってその概略か示されて
いる方法は、１個のホスフェート・ジエステル結合に付
随し、９個のホスホモルホリゾート結合を含有するＴｌ
ｌの合成に関するものである。この方法は、３′ホスホ
ラミデ一ト結合を含有するＴｌｌ産物の全てについて用
いられた。

反応式４１個のホスフェートジエステル結合（５′末端
）に付随する９個のホスホモルホリゾート結合（３′末
端）を含有するＴｌｌの合成（蓑はホスホモルホリゾー
ト結合を示す）３′−Ｔ　−ＯＤＭＴ　　　　　　　　
　　　　　［Ｔ１）５′−ＤＭＴ脱保護の繰返し、ヌク
レオシドビーホスホネートの縮合を繰返す。

ポリヌクレオシドＨ−ホスホネートを ＣＣｅ４で酸化（ｆ０分間）し、ポリヌクレオチド■］
−ホスホネートを得る。

１米　２米　３米　４漸　５米　６来　７米５′−ＤＮ
Ｔを脱保護し、ヌクレオシドビーホスホネートを縮合す
る。

５′−Ｄ〜［ｒ脱保護の後、最終生産物をＩ２水溶液で
酸化する。

ａＮ■−（４０■１（２時間／ｒ、ｔ、）によって生成
物を固体支持体から除去し、蒸留した。ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびＵ、Ｖ、像（シャ
ドウィング）は、各々の主生成物バンドを示唆していた
。バンドを切り取り、粉砕してＨ２０抽出し、逆相１−
ｔｐｔ、Ｃ（ｃＩＢ）によって単離した。

これらの生成物を１”４ポリヌクレオチドキナーゼとγ
−３２ＰＡＴＰで処理して５′末端を標識した後、ＰＡ
ＧＥ（ｆ７％ポリアクリルアミド／７Ｎ４尿素）に付し
てオートラジオグラムを得た。種々の”１１生成物の電
気泳動的易動度は極めて顕著であり、モルホリゾートか
付加される毎に質量か増太し、電荷か減少した。様々な
′ｒ１１生戎物生型物泳動的易動度は厳密には質量／電
荷比に依存してし１なし）という点は興味深い。多くの
ホスホラミデート結合を含有している生産物（高質量／
電荷比）は、ホスホラミデート結合のより少ないＴｌｌ
生産物の易動度に基つく予想よりも大きい易動度を有す
る。

こレタのポリチミジンホスホモルホリゾート類の各々を
８５％ギ酸で処理すると（９５℃、１５分間）、全ての
ジエステル結合を含有するＴ１１か生成した。

チオホスフェート同族体の前駆物質としてヌクレオシド
Ｈ−ホスホネートジエステルが用いられている〔フジイ
ら（Ｆｕｊｉｉ　）、テトラヘドロン・レター（”ｒｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　）　　２６．９３５
　（ｆ９８６）３゜この変換は、ポリ７−と結合したオ
リゴヌクレオシドＨ−ホスホネート・ジエステル（ｆ）
ヲｌ−リエチルアミ７（ＴＥＡ）／二硫化炭素（ｆ／９
　）中ｏ、１Ｍ５８　溶液で処理する（５分間）ことに
より、直接、高収率で達成された（〉９８％）。／％イ
ブリタイゼーンヨン用のプローブとして用いる上で極め
て高い比活吐を有する放射性向（ケ体で標識したオリゴ
ヌクレオチドを調製するために、　Ｓ　放射性同位体を
一部含むＳ８　を用いる。

酸素のトリエステルは、オリゴヌクレオシドバーホスホ
ネート（ｆ）と対応するアルカノール〔ＲＯＨ（ここに
、艮は通常、炭素原子数１０以下のアリール、アルキル
、ヘテロアルキルまたはへテロアリールを表わす）で示
され、好ましくはＭ　ｅＯＨまたは、ｎ−ＢｕＯＨであ
る〕の〕Ｎ−メチルイミダゾールＺＴＥＡ／ＣＣｅ４５
１５／９０）中１０％溶液とを反応させることにより得
られる。この反応は競合的那水分解を極めて受は易いの
で、無水条件下で行う様、注意する必要がある。

ｂ）−ｇ）の１級および２級アミン類は単なる例示であ
る。一般式−Ｎ−Ｘ　（式中、ＸおよびＹは■ 水素、アルキル、ヘテロアルキ／Ｌｚ、ヘテロア＋Ｊ−
ルまたはアリールからなる群から選ばれる同一または異
なる基であるか、あるいは−緒になってシクロアルケン
、シクロアルカンまたは異項環ヲ形成していてもよい）
で示される置換基を用いてもよく、これもまた本発明の
範囲内に含まれる・ＸまたはＹ、あるいはこれらが−緒
になってヘテロアルキルおよびヘテロアリール置換基を
形成している種は、インビトロでの７１イブリダイゼー
シヨンプローブとして用いるのに好ましく、ＸまたはＹ
かアルキルまたはアリール置換基である種は、インビボ
でのハイブリダイゼーションに好ましい。

ヘテロアリールＲＯＨ％ＸまたはＹ中のへテロ（異種）
原子はＳＳＮまたは０からなる群から選ばれ、ヘテロア
リール基中に約１〜５個存在している。インビトロでの
診断に特にを用なヘテロアリール種は螢光性であって、
例えば、パルス螢光に用いられる希土類金属のキレート
類や、偏光螢光ハイブリダイゼーションアッセイ゛に用
い得ることが分っている他の置換基である、ヘテロアリ
−ル基を有する種である。その様な螢光標識オリゴヌク
レオチドは、標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションに
際し、例えば、偏光の変化、発光の波長における変化、
発光強度の変化等の螢光の変化を検出することにより、
相の分離を行わずに７１イブリダイゼーシヨンアツセイ
を行うことができるので、このアッセイにおいて、特に
有用である。

本明細書に示した方法によれば、その様な螢光種でかな
りの程度に直換されており、従って高い比活性を示すオ
リゴヌクレオチドを容易に得ることができる。

以上に示した結果は、ポリヌクレオシドＨ−ホスホネー
トが種々のヌクレオチド間ホスフェート同族体の価値あ
る前駆体であることを証明するものである。アミンの存
在下、ポリヌクレオシドＨ−ホスフェートを酸化すると
、対応するポリヌクレオチドホスホラミデートが高収率
で得られる。

ＤＮＡ合成におけるＨ−ホスホネート法は、簡便７Ｊ’
つ迅速で試薬効率的な方法であり、ヌクレオチド間ホス
フェート同族体を含有するＤＮＡの迅速な合成に適用す
ることができる。この方法は、天然に存在するヌクレオ
チドを含有するＤＮＡの、種々のヌクレオチド間ホスフ
ェート同族体のための容易かつ有効な合成ルートを与え
るものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ポリヌクレオチドの合成法であって、（ａ）担体と
   結合したヌクレオシドを用意し、（ｂ）保護されたヌク
   レオシドＨ−ホスホネートと担体−結合ヌクレオシドの
   ５′ヒドロキシル基とを脱水剤の存在下において縮合さ
   せ、（ｃ）ステップ（ｂ）におけるヌクレオシドＨ−ホ
   スホネートの５′−保護基を担体から除去し、（ｄ）選
   択したヌクレオシドＨ−ホスホネートを用い、２以上の
   ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドＨ−ホスホネ
   ートが得られるまでステップ（ｂ）および（ｃ）を連続
   的に繰返し、（ｅ）ポリヌクレオチドＨ−ホスホネート
   を酸化して対応するポリヌクレオチドを形成させ、さら
   に（ｆ）該ポリヌクレオチドを担体から分離することか
   らなる方法。 ２、脱水剤がアシル化剤またはホスホリル化剤である第
   １項記載の方法。 ３、脱水剤がアリールスルホニルクロライドまたはアリ
   ールスルホニルテトラゾリド、ジフェニルクロロホスフ
   ェート、またはカーボジイミド以外のものである第２項
   記載の方法。 ４、脱水剤がアシル化剤である第２項記載の方法。 ５、アシル化剤が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ａはアリール、ヘテロアリールまたは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは互に独立して直鎖または分枝鎖状アルキル
   、ヘテロアルキル、アリールまたはヘテロアリールを表
   わす） で示される基、Ｘはハロゲン、あるいはアジド、異項環
   ２級アミンまたは活性エステル類からなる群から選択さ
   れる偽似ハロゲンを表わす〕 で示される構造を有する化合物である第４項記載の方法
   。 ６、Ｘが塩素である第５項記載の方法。 ７、アシル化剤が塩化ピバロイルである第５項記載の方
   法。 ８、脱水剤が、４サイクルの後に、未成熟な鎖終結を生
   成させる割合が全オリゴマー集団の内の少なくとも約２
   ０モル％以下である第１項記載の方法。 ９、脱水剤が有機酸ハロゲン化物である第１項記載の方
   法。 １０、ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである
   第１項記載の方法。 １１、ステップ（ｂ）および（ｃ）を通して、少くとも
   ２サイクル繰り返すことを含む第１項記載の方法。 １２、ステップ（ｂ）および（ｃ）を通して、約４〜１
   ２５サイクル繰り返すことを含む第１１項記載の方法。 １３、脱水剤が酸クロライドである第１項記載の方法。 １４、脱水剤が失敗したオリゴヌクレオチドホスホネー
   ト鎖をキャッピングし得るものである第１項記載の方法
   。 １５、完全にポリヌクレオチドＨ−ホスホネートが合成
   された後にのみステップ（ｅ）が行われる第１項記載の
   方法。 １６、４９サイクルのステップ（ｄ）に次いでステップ
   （ｅ）および（ｆ）を行った後、担体から分離された他
   のポリヌクレオチドよりも多量の５０ヌクレオチドのポ
   リヌクレオチドが存在している第１項記載の方法。 １７、ヌクレオシドＨ−ホスホネートが予め定められて
   いる第１項記載の方法。 １８、４サイクルのステップ（ｄ）に次いで、ステップ
   （ｅ）および（ｆ）を行った後、担体から分離されたポ
   リヌクレオチド中に、予め定められた５ヌクレオチドを
   含有するポリヌクレオチドが約８０モル％以上存在する
   第１７項記載の方法。 １９、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｙは対イオン、ｎは１またはそれ以上、そして
   Ｍはヌクレオシドを表わす） で示される組成物。 ２０、Ｍが保護されたヌクレオシドである第１９項記載
   の組成物。 ２１、保護基がジアルキルホルムアミジンである第１９
   項記載の組成物。 ２２、ポリヌクレオチドのヌクレオチド間ホスフェート
   同族体を製造する方法であって、 ａ）２以上のヌクレオチドを含有する、担体と結合した
   ポリヌクレオシドＨ−ホスホネートを用意し、 ｂ）ポリヌクレオシドＨ−ホスホネートと、ｉ）Ｓ＿８
   、ｉｉ）ＲＯＨ（式中、Ｒはアルキル、ヘテロアルキル
   、ヘテロアリールまたはアリールを表わす）、あるいは
   ｉｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｘ
   およびＹは互に独立して水素、アリール、ヘテロアリー
   ル、ヘテロアルキル、アルキルを表わすか、あるいは一
   緒になってシクロアルケン、シクロアルカンまたは異項
   環を形成していてもよい）で示される化合物からなる群
   から選択される試薬とを反応させ、次いで、 ｃ）ヌクレオチド間ホスフェート同族体を回収すること
   からなる方法。 ２３、ＲＯＨまたはＨ−Ｎ−Ｘが螢光性である第２２項
   記載の方法。 ２４、少くとも１個の置換されたヌクレオチド間ホスフ
   ェートを含有するポリヌクレオチドであって、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、 １）−Ｚは−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｏ−Ｒまたは−Ｎ−Ｘ、
   ａは約１０以上の整数であり； ２）少くとも１Ｚは−ＯＨでなく； ３）Ｒはアリール、ヘテロアリール、アルキルまたはヘ
   テロアルキルであり； ４）ＸまたはＹは水素、ヘテロアルキル、アルキル、ア
   リールまたはヘテロアリールであるか、あるいは一緒に
   なって異項環、シクロアルカンまたはシクロアルケンを
   表わしていてもよく；５）Ｍはヌクレオシドを表わす〕 で示されるポリヌクレオチドを含有する組成物。 ２５、ＸおよびＹが一緒になって含酸素ヘテロアリール
   置換体を形成している第２２項記載の組成物。 ２６、−ＯＲまたは−Ｎ−Ｘが螢光性である第２４項記
   載の組成物。