JPS6212232B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なβ―ラクタマーゼ・インヒビ
ターM4854―ならびにその製法に関するもので
ある。 本発明者らは、静岡県浜北市のトウモロコシ畑
より採取した土壌から分離した真菌M4854株が、
その培養物中に、種々のペニシリン系抗生物質、
セフアロスポリン系抗生物質であるβ―ラクタム
系抗生物質に対してそのβ―ラクタム構造の開裂
を行なわせしめるβ―ラクタマーゼを生産してな
る耐性菌のβ―ラクタマーゼに対して阻害作用を
有する、β―ラクタマーゼ・インヒビター作用を
有する物質を産生することを見い出し、またこの
β―ラクタマーゼ・インヒビター作用を有する物
質は２種類見い出され、かつ後述する通り新規物
質であることから、β―ラクタマーゼ・インヒビ
ターM4854―（以下単にM4854―と称す）、
β―ラクタマーゼ・インヒビタ―M4854―（以
下単にM4854―と称す）と各々命名し、さらに
本真菌M4854株がケトメラ（Chaetomella）属に
属する微生物であることを知つた。 本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
であつて、M4854―、またはその塩およびケト
〓〓〓〓〓
メラ属に属するM4854―生産菌を培地に培養
し、その培養物からM4854―を採取することを
特徴とするＭ―4854―の製造法である。その目
的はβ―ラクタム系抗生物質に作用してそのβ―
ラクタム構造の開裂を行なわせしめるラクタマー
ゼを良好に阻害せしめてなる物質およびその製造
法を提供するものである。 次に、本発明のM4854―、および参考として
Ｍ―4854―の有する物理化学的性状について
は、以下の通りである。

【表】

【表】 さらに本発明のM4854―、および参考例とし
てのＭ―4854―の有するβ―ラクタマーゼ・イ
ンヒビター作用の活性を、種々のβ―ラクタマー
ゼに対して示す。 〓〓〓〓〓

【表】 なお、このβ―ラクタマーゼ・インヒビター作
用の活性測定法としては、適当な濃度に稀釈した
M4854―、M4854―の溶液0.25mlと、基質と
して使用するβ―ラクタム系抗生物質量の約80％
を分解するβ―ラクタマーゼ含有β―ラクタマー
ゼ生産菌の菌体破砕液（PH7.0、0.1Mリン酸緩衝
液）であるβ―ラクタマーゼ液0.25mlを混合し、
30℃、10分間放置し、これに基質たるβ―ラクタ
ム系抗生物質0.5mgを含むPH7.0、0.1Mリン酸緩衝
液0.5mlを加え、30℃、60分間反応させた後、
0.0166Nヨード―澱粉溶液１mlを添加し、ヨード
澱粉反応を行なわせしめ、残存ヨードを0.0166N
ハイポ溶液にて滴定し、そのβ―ラクタマーゼを
50％阻害するM4854―、M4854―の濃度（μ
ｇ／ml）を求めたものである。また基質として使
用するβ―ラクタム系抗生物質において、セフア
ロリジンの場合はＣ、ベンジルペニシリンの場合
はＰ、として示したものである。さらにまた、こ
の測定法はその活性分画の確認、判定の一手段と
して用いられるものである。 以上の通り、本発明のM4854―はβ―ラクタ
マーゼ・インヒビター作用を有するもので、従来
公知のβ―ラクタマーゼ・インヒビター作用を有
する化合物としては、MM4550、M13902、クラ
ブラン酸などの天然由来のβ―ラクタム構造有す
るβ―ラクタム系抗生物質およびその誘導体
〔The Journal of Antibiotics29(6)668―669
（1976）〕、蛋白様の高分子化合物系のラクタマー
ゼ・インヒビター〔The Journal of Antibiotics
25(8)473―474（1972）〕、クロキサシリンなどの半
合成ペニシリンのある種の化合物、などが知られ
ているが、まず本発明のM4854―と、これらを
比較すれば本発明のこれらはβ―ラクタム構造を
有しないことから、MM4550、M13902、クラブ
ラン酸、クロキサシリンなどのβ―ラクタム構造
を有する化合物と明瞭に区別されるもので、また
本発明のこれらはその構成元素において窒素元素
を有してないことから、窒素元素を有している蛋
白様高分子化合物とも明瞭に区別される。一方、
本物質と類似の構造を持ち、β―ラクタマーゼ阻
害作用もあると予想される酵素のインヒビター、
Panosialin〔The Journal of Antibiotics24
（12）860（1971）〕とはその赤外部吸収スペクト
ルの1600〜1800cm^-1の吸収領域でのパターンより
明らかに異なることより、本発明のM4854―
は、公知のいずれのβ―ラクタマーゼ・インヒビ
ター作用を有する化合物とも異なる新規な化合物
である。 さらに、本発明の新規なβ―ラクタマーゼ・イ
ンヒビター作用を有するM4854―は、真菌
M4854株の培養により得られるものであるか、本
菌M4854株の肉眼的および顕微鏡的観察に基く各
種培地上における培養の特徴は次に記載する通り
である。 Ａ 肉眼的観察 麦芽エキス寒天培地 生育は非常に速く、26℃で７日以内に内径85mm
のペトリ皿全面に生育する。集落表面は平担。培
養初期は白色の空中菌系で覆われるが、柄子穀
（pycinidia）が形成され、成熟するにつれて白色
〓〓〓〓〓
菌糸は退化し、集落表面の色は無数の柄子穀によ
りダークブラウン（Dark Brown：3nl）とな
る。柄子穀は多数形成され、初期には白色〜ライ
ト・タン（Light Tan：3gc）であるが、10日目
を過ぎると、しだいに、ダーク・ブラウンとな
る。裏面の色はダーク・ブラウンである。 ジヤガイモ・ブドウ糖寒天培地 生育は速く、26℃、10日間で68〜70mmに達す
る。空中菌糸の発育は悪く、ほとんど形成され
ず、白色の菌糸が薄く培地上をはう様に生育する
のみである。集落表面の色は中心部付近はライ
ト・タン〜クローブ・ブラウン（Clove Brown：
3pl）で周辺部は白色に近い。柄子穀はほとんど
形成されない。裏面の色は無色で、中心部付近の
みライト・タンである。 ツアペツク寒天培地 生育は遅く、26℃、10日間で19〜22mmに達する
にすぎない。菌糸の生育は悪く、白色の菌糸が薄
く培地をはうように生育するのみで、空中菌糸は
形成されない。集落中心部の色はライト・タン。
柄子穀は中心部付近にわずかに形成されるのみで
ある。色はクローブ・ブラウン。裏面の色は無色
で、中心部付近のみライト・タンである。 なお、色の標示は、Color Harmony Manual
（Container Corporation of America1958）の標
示法に従つた。 Ｂ 顕微鏡的観察 柄子穀は楕円形ないし腎臓形。大きさ270〜370
×150〜220μ。色は初期に白色ないし、クリーム
色で成熟すると暗褐色ないし黒色となる。160〜
200×100〜150μの短い軸上に形成される。十分
成熟すると頂上に縦の裂け目を生じ、乳白色の分
生胞子（conidia）が噴出してくる。外壁の周囲
に剛毛（setae）を有する。剛毛は直線で、とき
に先端で曲線または輪をえがく。20〜70×25〜６
μで、１〜３個の隔壁を有する。表面は平滑、色
は褐色、先端部は薄い。分生胞子柄
（conidiophors）は細長く、不規則に分岐する。
25〜60×１〜２μ。無色。分生胞子は分生胞子形
成細胞の先端にヒアロスポア型（phialosporae）
で形成される。無色１細胞、５〜７×２〜2.5
μ、紡鍾形または船形。平面は平滑。 Ｃ 生育条件 生育の温度は12〜40℃、PHは１〜10で、最適生
育の温度は28〜30℃、PHは５〜９である。 上記の詳しい観察の結果、本菌は柄子穀を形成
し、その内部に無性的に分生胞子を作り、増殖す
ることから不完全菌（Deuteromycotina）のケロ
ミセテス網（Coelomycetes）スフエロプシダレ
ス目（Sphaeropsidales）に属するもので、さら
に柄子穀は楕円または腎臓形で、暗色で、比較的
硬い外壁を有し、成熟すると中央部に縦に裂け目
を生じ、また外壁周辺に剛毛を有することからケ
トメラ属（Chaetomella）に分類される。ケトメ
ラ属は1869年Fuckelによつて設立された属であ
るが、その後、1976年SuttonとSarbhoyにより４
種１変種が認められている。分生胞子、剛毛など
の特徴から本菌はケトメラ・ラフイゲラ
（Chaetomella raphigera）の記載によく似ている
もので、オランダの微生物寄託機関であるCBSよ
りCBS12057株を取り寄せ、比較検討した結果、
一致したことから、本菌はケトメラ・ラフイゲ
ラ・スウイフト（Chaetomella raphigera
Swift）と同定された。なお、ケトメラ・ラフイ
ゲラは1930年Swiftにより設けられた種であり、
比較的近い種としてケトメラ・シルシノセタ・ス
トーク（Chaetomella circinoseta stolk）が有る
が、分生胞子の大きさ、剛毛の形、大きさなどか
ら区別される。以上の通り、本菌はケトメラ・ラ
フイゲラに属する菌と同定されたもので、ケトメ
ラ・ラフイゲラM4854（Chaetomella
raphigeraM4854）と命名し、この菌は工業技術
院微生物工業技術研究所に「微工研菌寄第4277号
（FERM―ＰNo.4277）」として寄託されている。 次いで、本発明を実施するに当りその一例を述
べる。 まず、本発明における使用菌としては、上記の
ケトメラ・ラフイゲラM4854はその一例であつ
て、この菌のみでなく、本発明のM4854―を産
生する菌で、天然または人工変異株もすべて本発
明において使用することができる。 本発明においてケトメラ属に属するM4854―
生産菌を培養するに当つては真菌の培養に関する
一般的知識が適用されるもので、培養の形態は液
体培養でもよいが、工業的には該生産菌の胞子懸
濁液または２〜３日間培養した培養液を生産用培
地に接種し、深部通気撹拌培養を行なつてもよ
い。 〓〓〓〓〓
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用され得る。炭素源として
は同化可能な炭素化合物であればよく、例えばブ
ドウ糖、シヨ糖、乳糖、麦芽糖、澱粉、デキスト
リン、糖蜜、グリセリンなどが使用される。窒素
源としては利用可能な窒素化合物であればよく、
例えばコーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実
粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン加水分解物、アンモニウム塩、硝
酸塩などが使用される。その他、リン酸塩、硫酸
塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナト
リウム、鉄、亜鉛、マンガンなどの塩類が必要に
応じて使用される。 培養温度は菌が発育し、M4854―を生産する
範囲内で適宜変更し得るが、特に好ましくは24〜
28℃程度であり、培養時間は条件によつて異なる
が、通常48〜72時間程度であつて、M4854―が
最高力価に達する時期をみはからつて適当な時期
に培養を終了すればよい。 かくして得られるM4854―生産菌の培養中に
おいて、M4854―は大部分その液体部分に含有
されているものである。 このようにして得られたM4854―生産菌の培
養物あるいはこれから固形分を除去した培養液
からM4854―を採取するのであるが、M4854―
は水溶性であり、酢酸エチルなどの一部の有機
溶媒に不溶性である性質を利用して分離精製を行
なうが、またこれらは活性炭やスチレン―ジビニ
ルベンゼン共重合体系多好性吸着樹脂（例えばア
ンバーライトXAD―２：ローム・アンド・ハス
社製、ハイポーラス樹脂HP―20，HP―10；三菱
化成社製）に吸着される性質を利用し、この吸着
体を水洗いし、含水アセトンなどにて溶出せしめ
て分解するか、さらに該培養液よりブタノール
にて抽出せしめてもよい。さらに、このようにし
て得られた粗物質は一般的な有機化合物の精製法
であるゲル過やクロマトグラフイーの手段を組
合せて行なうことができるもので、アルミナまた
はシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフイー
による精製が有効である。また、この精製におい
て得られる活性分画を減圧乾燥して目的物を回収
してもよく、さらにこれを再結晶化するか、また
は該活性分画に２―エチルヘキサン酸ナトリウ
ム、カリウム、乳酸ナトリウムカリウムなどの有
機酸アルカリ金属塩溶液を加えて直接そのアルカ
リ金属塩として回収してもよい。 このようにして、本発明のM4854―は、上記
の通りの、薄層クロマトグラフイーにおける単一
スポツトを有する純品が得られるものである。 さらに、本発明のM4854―は優れたβ―ラク
タマーゼ・インヒビター作用を有しているもので
あつて、有用なβ―ラクタム系抗生物質であるペ
ニシリン系抗生物質、セフアロスポリン系抗生物
質と個別または混合して使用することによりこの
β―ラクタム系抗生物質のβ―ラクタマーゼによ
る劣化を防止するものである。 次に実施例を挙げて本発明を具体的に述べる
が、本発明は何んらこれらの実施例により限定さ
れるものではない。 実施例 １ ブドウ糖２％、ポリペプトン１％、コーン・ス
チープ・リカー１％、KH₂PO₄0.2％、MgSO₄0.1
％を含有する培地（PH6.5）100mlを500ml容三角
フラスコに分注し、120℃、15分間加熱殺菌し、
本培地10本に、ケトメラ・ラフイゲラM4854
（FERM―ＰNo.4277）株の斜面培養液よりの１白
金耳を接種し、26℃で48時間振盪培養を行なつ
た。次いで、これを上記と同一組成の加熱殺菌し
た培地20を含有する30容ジヤーフアーメンタ
ーに移植し、26℃、72時間、250rpm、毎分20
の無菌空気の条件下通気撹拌培養し、培養物約15
を得た（β―ラクタマーゼ・インヒビター作用
を有する物質の含量は1000〜1500r／mlであつ
た）。以下、この培養物を、後述実施例２、実施
例３、実施例４、実施例５の如く処理して目的物
を得るものである。 実施例 ２ 実施例１で得られた培養物約15をバケツト遠
心機にてその菌体を除去して、その液を得、こ
れに200ｇの活性炭を加え、約30分間撹拌して充
分吸着せしめた後活性炭を取し、水洗した後、
これに５の50％含水アセトンを用いて２回溶出
せしめる。得られた溶出液を併合し、減圧濃縮
し、さらに凍結乾燥して黒褐色の粗物質50ｇ（β
―ラクタマーゼ・インヒビター作用を有する物質
の含量は約１％である）を得た。さらに、これ
は、後述実施例の如くして分画し、回収される。 実施例 ３ 〓〓〓〓〓
実施例１と同様にして得られた培養物約15
を、バケツト遠心機で菌体を除去した後、これに
約６のｎ―ブタノールを加えて、２回抽出し、
得られた抽出液はシラツプ状になるまで濃縮す
る。次いでこのシラツプにエタノールを加え、こ
れを、あらかじめエタノールにて充填したアルミ
ナカラム約１（径7.5×90cm）にチヤージして
吸着せしめた後、約４のエタノールで洗浄し、
次いでエタノール：水（５：３）にて、１フラク
シヨン20ｇにて溶出、分画した。各フラクシヨン
は、β―ラクタマーゼ・インヒビター作用の有無
および薄層クロマトグラフイーにて判定して、粗
M4854―分画（フラクシヨンNo.35〜55）と粗
M4854―分画（フラクシヨンNo.56〜80）を得、
それぞれの分画を濃縮乾固し、さらに凍結乾燥し
て粗M4854―８ｇ（含量約20％）と粗M4854―
６ｇ（含量約15％）を得た。さらに、これら
は、以下の実施例の如くして精製される。 実施例 ４ 実施例３で得られた粗M4854―1.5ｇを少量
のクロロホルム：メタノール（２：１）混合溶媒
に溶解し、これを、あらかじめ同一組成の溶媒で
充填したシリカゲルカラム150ml（２×50cm）に
チヤージし、次いでクロロホルム：メタノール
（２：１）にて、１フラクシヨン５mlで溶出、分
画し、その活性フラクシヨンNo.85〜95を回収し、
併合し、これを減圧乾固した後、酢酸エチル：メ
タノール（４：１）混合溶媒に溶解し、これに２
―エチルヘキサン酸カリウムの酢酸エチル溶液を
加えてM4854―のカリウム塩を析出、沈澱せし
め、これを取してM4854―・カリウム塩15mg
を得た。本品はまた、薄層クロマトグラフイーな
どにより純品であることが確認された。 参考例 １ 実施例３で得られた粗M4854―20ｇを少量の
クロロホルム：メタノール（２：１）混合溶媒に
溶解し、これを、あらかじめ同一組成の溶媒で充
填したシリカゲルカラム150ml（２×50cm）にチ
ヤージせしめ、次いでクロロホルム：メタノール
（２：１）にて、１フラクシヨン20mlで溶出、分
画し、その活性フラクシヨンNo.15〜35を回収し、
併合し、これを濃縮乾固した後酢酸エチル：メタ
ノール（４：１）混合溶媒に溶解し、これに２―
エチルヘキサン酸カリウムの酢酸エチル溶液を加
えてM4854―のカリウム塩を析出、沈澱せし
め、これを取してM4854―・カリウム塩40mg
を得た。本品はまた、薄層クロマトグラフイーな
どにより純品であることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図は本発明のM4854
―の紫外部吸収スペクトルを示し、第４図は本
発明のM4854―の赤外部吸収スペクトルを示
し、第５図は本発明のM4854―の核磁気共鳴ス
ペクトルを示し、第６図、第７図および第８図は
参考としてのM4854―の紫外部吸収スペクトル
を示し、第９図はM4854―の赤外部吸収スペク
トルを示し、第１０図はM4854―の核磁気共鳴
スペクトルを示す。 〓〓〓〓〓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも、下記の物理化学的性状を有する
   β―ラクタマーゼ・インヒビターM4854―また
   はその塩。 （カリウム塩として） 融点；191.5℃（分解） 元素分析；Ｃ＝44.39％、Ｈ＝6.14％、Ｓ＝6.08
   ％、Ｋ＝11.27％、 紫外部吸収スペクトル；λmax266mμ、シヨル
   ダーλmax273mμ（水中）、 赤外部吸収スペクトル（KBr）；第４図に示す通
   り、 呈色反応；バニリン硫酸反応、アンモニア性バナ
   ジン硫酸反応は陽性、フエーリング反応、モー
   リツシユ反応、塩化第二鉄反応、ニンヒドリン
   反応は陰性、 色性状；白色、 溶解性；水、ジメチルスルホキサイドに可溶性、
   メタノール、エタノール中程度可溶性、酢酸エ
   チルに不溶性、 ２ ケトメラ属に属するβ―ラクタマーゼ・イン
   ヒビターM4854―生産菌を培地に培養し、その
   培養物からβ―ラクタマーゼ・インヒビター
   M4854―を採取することを特徴とするβ―ラク
   タマーゼ・インヒビターM4854―の製法。