JPS6212995B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水溶液からアスコルビン酸を除去す
るための方法及びこの方法を実施するために適し
た用具に関する。

水溶液、特に生理学的起源の水溶液及び植物の
液汁にはアスコルビン酸が存在することが多い。
アスコルビン酸は、周知のように強還元剤であつ
て、このものは特に水溶液の他の内容物が分析的
に測定されなければならない場合に場合によつて
妨害となることがある。すなわちアスコルビン酸
は、尿を病理学的成分に分析する際に例えば極め
て妨害的に出現しうる。多くの定量法、しかし特
にグルコース、血液、亜硝酸塩、ウロビリノーゲ
ン、及びビリルビンを定量するための迅速診断法
は、アスコルビン酸によつて低濃度に欺かれると
いう意味で程度の差こそあれ著しく妨害される。
それに対してフエーリングのグルコース試験の場
合にはグルコースの存在がアスコルビン酸によつ
て誤認されて、実際とは違う高すぎる値が測定さ
れる。

豊富な栄養摂取によつてもたらされた尿中のア
スコルビン酸の出現は極めて頻繁なので、求めら
れた成分の分析前に尿からアスコルビン酸を除去
することはすでにいろいろ試みられた。以下の方
法はすでに公知である： ヨウ素溶液で酸化して、過剰ヨウ素をチオ硫酸
溶液で除去する；二酸化マンガンで酸化して、使
用されなかつた酸化剤を濾取する；アルカリ性
H₂O₂で酸化する；陰イオン交換体で尿を処理す
る。

これらすべての方法は、煩雑な尿の処理を必要
とする結果、実地においては成功することはでき
なかつた。更にこの場合被検出物質が場合によつ
ては分解されるか又は誤認される。

また試験紙も公知であり、この場合には尿が先
づ酸化性物質又は陰イオン交換体（西独特許出願
公告第1598008号）を含む帯域によつてクロマト
グラフイーを受けねばならず（この際アスコルビ
ン酸が分離される）、次いで継続過程の本来の試
薬帯域で妨害されずに反応する。この種の試験紙
はグルコース及びガラクトース用として市販され
ている。しかし試験紙は複雑な構造を有する。更
に必要なクロマトグラフイー時間によつて時間消
費も著しく高められる。

アスコルビン酸をアスコルビン酸酸化酵素を加
えることによつて除去することは、西独特許出願
公告第2625834号からすでに公知である。この方
法は成程有用であるが、妨害を除去するために、
特に多量のアスコルビン酸の存在を予想しなけれ
ばならない場合には多量のアスコルビン酸酸化酵
素を必要とする。したがつて多くの場合、前記方
法又はこの方法に従う有効な試験紙を使用するこ
とは、多量のアスコルビン酸酸化酵素の使用を必
要とするために不経済である。この方法のもう一
つの欠点は、アスコルビン酸を除去しなければな
らない溶液を、反応にとつて必要な酸素が溶液中
に入るように強力に振盪しなければならない点に
ある。

従つて本発明の基礎には、水溶液中のアスコル
ビン酸を除去するに当り、前記の公知の方法手段
の欠点を除去し、迅速に、確実にかつ特定の補助
手段なしに実施できかつ経済的に負担することの
できる方法を創作するという課題がある。

この課題は、アスコルビン酸酸化酵素を加えて
水溶液からアスコルビン酸を除去するための方法
において、該溶液に更にカタラーゼ及びH₂O₂を
加えることを特徴とする方法によつて解決され
る。

本発明による方法によれば、尿のような水溶液
からアスコルビン酸を迅速にして確実に除去する
ことができる。この事実は意外である、それとい
うのもこの場合溶液中には、水溶液中の酸素の溶
解度を遥かに越える酸素発生が惹起するので、生
成した酸素が大部分ガス発生によつて逸失すると
いうことが予想されたからである。また多くの研
究においてアスコルビン酸酸化酵素によるアスコ
ルビン酸の酸化の最終生成物としてH₂O₂が見出
されたことにより、反応の平衡状態に及ぼす
H₂O₂の否定的影響も危惧された。しかし予想に
反して本発明により、同量のアスコルビン酸酸化
酵素をもつて、H₂O₂及びカタラーゼの不在にお
けるよりも遥かに多量のアスコルビン酸を分解す
ることができるか又は一定量のアスコルビン酸を
除去するために必要なアスコルビン酸酸化酵素を
著しく減少させることができる。

更に、該方法が、引続いて、生成H₂O₂が測定
パラメーターを成す反応を実施する場合にも適用
されうることは特に意外である。これは例えば生
成H₂O₂を４―アミノフエナゾン及びフエノール
で測定しつつグルコースオキシダーゼでグルコー
スを定量する場合に該当する。

カタラーゼは、本発明による方法の範囲内では
有利に市販の製剤の形で使用される。H₂O₂はそ
のままで使用してもよい。しかし有利には固体の
付加物、すなわち他の物質に対するH₂O₂の付加
化合物の形で使用される。この有利な例は過ホウ
酸塩、尿素過酸化水素化物及びマンニツト過酸化
水素化物である。

本発明の他の対象は、アスコルビン酸酸化酵素
の含浸された固体支持材料を基礎とする、水溶液
中のアスコルビン酸を除去するため用具におい
て、該支持材料がカタラーゼ及びH₂O₂ならびに
場合により安定剤又は／及び緩衝物質も含有する
ことを特徴とする前記用具である。

支持材料としては、アスコルビン酸酸化酵素、
カタラーゼ及びH₂O₂又は固体のH₂O₂付加物の含
浸されうる不活性物質、特に試験バンドの製造の
ために知られた支持材料が適当である。この代表
的な例は、天然又は合成もしくは人工繊維を基礎
とする吸着性の紙及び紙様物質、フリース、開放
気泡を有する発泡材料、多孔質ガラス、ガラスの
ような無機材料より成る繊維マツト等である。

支持材料は、個々の、つまり空間的に相互に分
離された部分に試薬を含有するか又はH₂O₂とは
別個に酵素混合物を含む。後者の実施形が有利で
ある、それというのもアスコルビン酸酸化酵素と
カタラーゼの両酵素が相互に安定化し合う効果を
有し、そのために含浸支持材料の貯蔵能力が著し
く改善されるからである。従つて両酵素を補助的
安定剤なしに一緒に支持材料上に施すことができ
る。しかしまた、有利には両酵素の安定性にとつ
て適当なPH値を与える常用の酵素安定剤又は／及
び緩衝物質を同様に支持材料に一体化させる。

同様に、有利には前記のような固体付加物の形
で支持材料内に存在するH₂O₂も有利に安定化さ
れ、この際常用のH₂O₂安定剤を使用してもよ
い。極めて良好な安定効果はペクチン、ポリビニ
ルピロリドン又はデキストランもしくはこれらの
混合物をもつて達成される。

含浸支持材料の製造は、同材料に施すべき物質
又は物質混合物の溶液を含浸させ、次いで乾燥す
ることによつて簡単に行なわれる。例えば適当な
紙にアスコルビン酸酸化酵素、カタラーゼ、安定
剤及び緩衝物質を含有する溶液を含浸させて乾燥
し、他方の支持材料には同様に有利には安定剤を
含有するH₂O₂付加物の溶液を含浸させて同様に
して乾燥する。次に、このように製造された含浸
支持材料の有利に配分された細片を適当な基礎支
持材料に、例えば接着によつて固定することがで
きる。このようにして、コンパクトな第一支持材
料を有し、この第一支持材料に１又は数種の前記
作用物質の含浸された第二の多孔質吸着性支持材
料が固定されていることより成る前記種類の用具
が得られる。この際コンパクトな第一支持材料は
有利にはバンド又は棒状である。次に例えばこの
ような棒状支持材料をアスコルビン酸を含有する
溶液中に浸漬することができ、その結果試薬が第
二の多孔質支持材料から溶出される。溶出試薬は
単に撹拌する（この際コンパクトな第一支持材料
が握りとして役立つ）ことによつて混合され、反
応の進行が加速される。この種の撹拌のために適
当な棒状又はバンド状体はしばしばまた“プリユ
ンパー（Plｕ¨mper）”とも称される。コンパクト
な第一支持材料は任意の不活性材料より成つてい
てよく、有利にはガラス又はプラスチツクが使用
される。例えばコンパクトな第一支持材料として
のプラスチツク製棒状体に、アスコルビン酸酸化
酵素とカタラーゼとの含浸された帯状紙と、
H₂O₂が含浸された帯状紙との２枚の帯状紙を貼
付ける。次いでこのようにして得られたプリユン
パーを、水溶液、例えば尿中に浸漬して短時間撹
拌すると、試薬が溶出され、十分に混合されかつ
アスコルビン酸は短時間で完全に分解される。

本発明による用具が緩衝物質を含有する場合に
は、有利には、５〜8.5のPH値を維持することの
できる緩衝物質が使用される。この際トリス―ク
エン酸塩緩衝剤又は／及びクエン酸が緩衝物質と
して特に適当であることが判つた。後者は強アル
カリ性反応を呈する固体H₂O₂付加物の存在する
際に特に適当である。

本発明による用具内の試薬の量は、先づ第一に
は予定された用途によつて特定される。尿中のア
スコルビン酸を除去するためのプリユンパーとし
て使用しようとする場合には、アスコルビン酸酸
化酵素量が少なくとも30U、有利には35〜40Uで
ある時が有利であると判明した。他の水溶液、例
えば果汁に関しては期待されうるアスコルビン酸
含有量に応じた量が選択される。

次に図面により本発明による用具を説明する。

第１及び２図に図示した本発明による用具の実
施形は“ブリユンパー”として構成されている。
コンパクトな第一支持材料を表わす帯状プラスチ
ツク１はその下方端近傍に35μmolのH₂O₂の含浸
された帯状紙２及び36Uのアスコルビン酸酸化酵
素と10000Uのカタラーゼの含浸された帯状紙４
を支持する。両帯状紙２と４の間には着色マーキ
ングを施した予定折れ目３が存在する。帯状プラ
スチツクはこの予定折れ目で折り曲げることによ
つて良好に撹拌可能なへらの形を得る。多孔質吸
着性の両支持材料２及び４は接着剤５によつて帯
状プラスチツク１に固定されている。

本発明は、尿、血清及び血漿のような体液なら
びにアスコルビン酸塩を含有する他の水溶液、例
えば果実等の植物の液汁に対して適している。

次に本発明を実施例により詳述する。

例１ （比較例） 振盪して及び振盪しないで尿中から多量のアス
コルビン酸塩を除去する： 尿を、アスコルビン酸で100ml当り20mgのアス
コルビン酸塩の含有量に高める。同試料の10mlづ
つに10Uのアスコルビン酸酸化酵素を加える。一
方の試料をわずかに混合し、10分の放置後にアス
コルビン酸塩の含有量を測定する。加えたアスコ
ルビン酸塩のまだ67％が存在している。他の試料
を10分間激しく振盪する。この振盪時間後試料中
にはアスコルビン酸塩はもはや検出できない。ア
スコルビン酸酸化酵素を加えない他の２試料中に
は、振盪する場合及び振盪しない場合も10分後に
は加えたアスコルビン酸がまだ殆ど完全に存在し
ている。

例 ２ H₂O₂及びカタラーゼによる酸素の供給 尿を50mg／100mlのアスコルビン酸塩の含有量
に高める。このような尿の10mlづつに、10Uのア
スコルビン酸酸化酵素と10000Uのカタラーゼを
加える。次に6mmolのH₂O₂を加えて短時間撹拌
する。もはやアスコルビン酸塩は確認することは
できない。H₂O₂は加えず、アスコルビン酸酸化
酵素とカタラーゼのみを加えたもう一つの試料に
は、加えたアスコルビン酸塩のまで80％が存在し
ている。

例 ３ アスコルビン酸酸化酵素を含むへら状体の製造 ａ 含浸溶液１の製造： アスコルビン酸酸化酵素83000U（10000〜
160000U）； カタラーゼ83Mio Ｕ（40〜160Mio Ｕ）； マンニツト15ｇ； 0.2mol／宛のトリス―クエン酸塩（PH
7.6）を水中に溶かし、この溶液に水を補充し
て100mlにする。

この溶液を適当な紙に含浸させる。乾燥後に同
紙を切断して、プラスチツク支持体に付着される
幅６mmのストリツプにする。再び切断した後生じ
る６×６mmの区域はそれぞれアスコルビン酸酸化
酵素36U及びカタラーゼ10000U（5000〜
15000U）を含有している。

ｂ 含浸溶液２の製造： 溶液Ａ：ペクチン５ｇを再蒸留水100ml中に溶
かす。

溶液Ｂ：コリドン25 33.4ｇ、水66.6mlを混合
する。

溶液Ａ及びＢを混合し、その中に尿素過酸化水
素化物40ｇとコリドン25 50ｇを溶かす。

この溶液を適当な紙に含浸させて、幅６mmのス
トリツプに切断する。これらのストリツプを、す
でにアスコルビン酸酸化酵素を含有する紙を有す
る同一プラスチツク支持体に接着させる。切断後
に生ずる６×６mmの大きさの試験区域は尿素過酸
化水素化物60μmol（50〜100μmol）を含有して
いる。

プラスチツク支持体はアスコルビン酸酸化酵素
の試験区域及び尿素過酸化水素化物の試験区域の
間に予定折れ目を有し、この折れ目を使用前に折
り曲げて撹拌可能のへら状体を作る。このように
して形成されたへら状体をもつて、アスコルビン
酸50mg／100mlを含有する尿10mlを短時間撹拌
し、このへら状体を10分間尿中に放置する。10分
後に同へら状体を取出して、アスコルビン酸の残
量を測定する。アスコルビン酸塩はもはや検出で
きない。このように障害内容物の除去された尿
は、試験棒でもつて亜硝酸塩、PH値、タンパク、
グルコース、ケトン体、ビリルビン、ウロビリノ
ーゲン及び血液を検査するのに適している。

例 ４ オレンジ汁液からアスコルビン酸塩を除去す
る。

例３で記載した支持体をもつて、アスコルビン
酸塩350mg／の含有量のオレンジ汁液10mlを、
例３の記載と同様にして処理する。この場合にも
もはやアスコルビン酸塩は確認できない。

例 ５ グルコース150〜250mg／100mlとアスコルビン
酸塩50mg／100mlを含有する尿15ml中のグルコー
スを、西独特許出願公告第2625834号公報、例８
による試験バンドをもつて検査する。反応は、ア
スコルビン酸塩が完全に抑制するので否定的であ
る。次に例３によるへら状体で撹拌すると、アス
コルビン酸が除去される。前記の試験バンドで再
びグルコースを試験すると、相応する信号が得ら
れる。これは意外である、それというのもカタラ
ーゼがグルコース検出において発生されたH₂O₂
を分解することが当然予想されたからである。

例 ６ アスコルビン酸塩は、GOD，POD、フエノー
ル及び４―アミノフエナゾンとの反応を基礎とす
るグルコースの光度定量を妨害する。従つてまた
該へら状体はGOD―PAP法によるグルコース定
量のための試料からアスコルビン酸塩を除去する
ためにも使用される。それには例３によるへら状
体で尿15mlを処理し、このようにして最高50mgま
でのアスコルビン酸が除去される。次にこの尿
0.02mlの次の試薬混合物に入れる： リン酸塩緩衝剤 0.12mmol／，PH7.0 POD 1.5U／ml GOD 19U／ml ４―アミノフエナゾン 0.92mmol／ フエノール 11mmol／ 試料供給前にはE₁を測定し、試料供給後には
40分保温しかつE₂を測定する。同様にしてグル
コース標準を測定し、それから尿のグルコース含
有量を定量する。カタラーゼでプロベヌリンを処
理することによつて最高1000U／mlまでのカタラ
ーゼを上記光度試験に使用することができ、試験
紙障害は起らない。

【図面の簡単な説明】

第１図は水溶液中のアスコルビン酸を除去する
ための本発明による用具の平面図であり、第２図
は第１図による用具の側面図である： １……帯状プラスチツク、２……H₂O₂の含浸
された帯状紙、３……予定折れ目、４……アスコ
ルビン酸酸化酵素とカタラーゼの含浸された帯状
紙、５……接着剤。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスコルビン酸酸化酵素を加えて水溶液から
   アスコルビン酸を除去するための方法において、
   該溶液に更にカタラーゼ及びH₂O₂を加えること
   を特徴とする前記方法。 ２ H₂O₂を、H₂O₂を含有する付加物の形で使用
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 付加物として過ホウ酸塩、尿素過酸化水素化
   物又はマンニツト過酸化水素化物を使用する特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ４ アスコルビン酸酸化酵素の含浸された固体支
   持材料を基礎とする、水溶液中のアスコルビン酸
   を除去するための用具において、該支持材料がカ
   タラーゼとH₂O₂ならびに場合により安定剤又
   は／及び緩衝物質も含有することを特徴とする前
   記用具。 ５ 支持材料がアスコルビン酸酸化酵素とカタラ
   ーゼを一緒に含有し、H₂O₂をこれらの酵素とは
   別個に含有する特許請求の範囲第４項記載の用
   具。 ６ H₂O₂が固体付加物として存在する特許請求
   の範囲第４又は５項記載の用具。 ７ 支持材料がH₂O₂の安定剤としてペクチン、
   ポリビニルピロリドン又はデキストランあるいは
   これらの混合物を含有する特許請求の範囲第４〜
   ６項のいづれかに記載の用具。 ８ 支持材料がコンパクトな第一支持材料より成
   り、この第一支持材料に１又は数種の作用物質の
   含浸された第二の多孔質吸着性支持材料の固定さ
   れている特許請求の範囲第４〜７項のいづれかに
   記載の用具。 ９ 第一支持材料がバンド又は棒状を有する特許
   請求の範囲第８項記載の用具。 １０ 第一支持材料がガラス又はプラスチツクよ
   り成る特許請求の範囲第８又は９項記載の用具。 １１ 第二支持材料が紙又はフリースである特許
   請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記載の用
   具。 １２ ５〜8.5のPH値で働く緩衝物質を含有する
   特許請求の範囲第４〜１１項のいずれかに記載の
   用具。 １３ トリス―クエン酸塩緩衝剤又は／及びクエ
   ン酸を含有する特許請求の範囲第１２項記載の用
   具。 １４ 少なくとも30Uのアスコルビン酸酸化酵素
   を含有する特許請求の範囲第４〜１３項のいづれ
   かに記載の用具。