JPS62134100A - ペルオキシダ−ゼ活性測定用薬剤およびその製法 - Google Patents

ペルオキシダ−ゼ活性測定用薬剤およびその製法

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JPS62134100A
JPS62134100A JP61280951A JP28095186A JPS62134100A JP S62134100 A JPS62134100 A JP S62134100A JP 61280951 A JP61280951 A JP 61280951A JP 28095186 A JP28095186 A JP 28095186A JP S62134100 A JPS62134100 A JP S62134100A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は呈色反応によるペルオキシダーゼ活性の測定の
ための薬剤ならびにその製法およびその使用に関する。
その検出感度に関しては放射免疫検定法に匹敵しうる酵
素免疫検定法の尊人についての重要な前提条件は安定な
標識酵素およびこれらの標識酵素の触媒活性を測定技術
的に簡単な方法を用いて記録できる対応する高感度の発
色試薬が利用しうるかどうかであった。
その際特に適当な標識酵素としては酸化還元酵素である
グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼが良い
ことが判明した。ペルオキシダーゼ反応は一般に最もし
ばしば用いられる酵素による検出反応に属する。例えば
「Ｍｅｔｈ・）ｄｓＯｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ　Ｊ　Ｈ，、Ｕ、　　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ（
４４、第３版、第１巻、第２１０〜２２１頁、Ｖ６ｒｌ
ａｇＣｈｅｍｉ　ｅ出版、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　（１９８
３年）に記載されたすべての方法は、グルコースオキシ
ダーゼを用いるグルコース測定と同様にａ酸化水素の化
学世論的生成に基づくものである。この過酸化水素はペ
ルオキシダーゼにより触媒された無色基色の酸化反応を
行って着色した生成物を生成させることができ、このも
のが簡単に分光測光により定量的に測定されうる。
それゆえペルオキシダーゼにより触媒されるこの反応に
とって適当な色原体系は多数研究され記載されている（
　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ参照）。酵素免疫検定法における
ペルオキシダーゼ活性の測定には少数が特に検出感度に
関する必要条件を満たすのみである。一般に色原体基質
は高い反応速度を有するべきでそして高いモル吸光率を
有する色の安定した生成物を生成すべきである。
さらにその取扱いが何ら健康上の危険を伴わない物質が
優先されるべきである。ペルオキシダーゼに基づく酵素
免疫検定用の商業的な試験キットにおいては特に０−フ
二二レンジアミン（以下○ＰＤと略記する）および２．
２′−アジノジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホネート）（以下ＡＢＴＳと略記する）が用いられ
る。ＯＰＤ　モＡＢＴＳも大抵のペルオキシダーゼ基質
と同様に突然変異原である。しばしば用いられる基質の
群の１つはテトラメチルベンジジン（以下ＴＭＢと略記
する）を包含するベンジジン型の群である。ＴＭＢは癌
原性ペルオキシダーゼ基質に代わる特にベンジジン、ジ
アミノベンジジンのようなベンジジン型の安全な突然変
異原性のない代替物である。多数の研究においてはこれ
らベンジジン誘導体が突然変異原性質を有することの何
らの証拠も与えられなかった（　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ　５０．３２９９（１９７３）　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｌ
ｅｔｔ。
工、３９（１９７５）およびＪ、　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　
Ｓｃｉ、　２１　）８１６（１９７３）参照）。ＴＭＢ
は１９７４年以来柚々の使用者によりヘモグロビンまた
はチトクロームＰ４５０のプソイドペルオキシダーゼ活
性の測定に使用されてきてお）そしてすでにリエム（Ｌ
ｉｅｍ　）氏他（［ＡｎａＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　９
８．３８８〜３９３（１９７９））　　により免疫ペル
オキシダーゼ染色法において免疫複合体のペルオキシダ
ーゼ活性の検出に使用された。これらの著者は３９２頁
の結論において、ＴＭＢは良好な染色性質を有するが、
しかしながらまた通常用いられる緩衝系中への溶解度が
低くかつＴＭＢは重化的分解を受は易いことを指摘して
いる。
しかしながら、酵素免疫検定にＴＭＢ　’ｉ使用する場
合、試験条件下におけるこの色原体の水溶性が低いので
非常に試験が制限されることが判った。それゆえオラン
ダ特許出願第８００１９７２号および米国特許第４，５
０３，１４３号には溶解度を増大させる措置が記載され
ている。この両刊行物において有機溶媒の使用により溶
解度の改善が得られている。ジメチルスルホキシドの添
加により（使用準備ずみの混合物中１％ヅＶ）、オラン
ダ特許第８００１９７２号の記載によればＴＭＢ　７１
３度１００ｒｎ９／／、すなわち０．４２ミリ％　、Ｉ
Ｌ／１または米国特許第４．５　［１３，１４３号の記
載における４６■／ｌすなわち０．１８ミリモル／ｌが
得られる。
これに対し通常ＯＰＤおよびＡＢＴＳは５ｏ〜１００倍
高ｂモル濃度で酵素に提供される。＃素試験におけるテ
トラアルキルベンジジンの濃度の変化は、最大反応速度
の達成に必要な基質によるペルオキシダーゼの飽和は前
記したＴＭＢ濃度では達成されないことを示している。
それゆえ、ペルオキシダーゼの測定に適する、テトラア
ルキルベンジジンを含有するがしかし前記した欠点を有
しない調製物を見出す必要があった。本発明はかかる調
製物、その製造およびその使用を目的とする。
驚くべきことに、テトラアルキルベンジジンまたはその
誘々７体を含有する溶液を適当な過酸化水素濃度を有す
る水性な衝液を用いて−２．５〜３．９に調整すること
にょシ検出感度に関し相当に改良されたテトラアルキル
ベンジジンの調製物が得られうろことが見出された。慣
用のペルオキシダーゼ用基質にとってはＴＭＢにとって
と同じく酵素活性の至適ｐＨは５〜６にあると記載され
ているとしても（米国特許第４，５０３，１４５号およ
び「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎ
ａｌｙｓｉ、ｓＪ　。
Ｈ，Ｕ、　　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　ＦＪＪ、第６版、第
■巻、第２８６〜２９６頁、Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉ
ｅ出版、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８３年）参照）、本発
明にょるル８製物は、実施例２および乙に示されるよう
に異常に低い州値特にｐＨ３，１〜６．６で従来記載さ
れたｍｋ物に比較して改善された検出感度を示す。
本発明は主に水溶液中に０．６〜４．Ｏミ’）モル／ｌ
の含量のテトラアルキルベンジジンまたはそのｍ、０．
５〜５０ミリモル／！の金星のペルオキシダーゼ用基質
としての過酸化物、およびｐｔＩ値全２．５〜３．９の
範囲に調整する緩衝物質を含有するところの、ペルオキ
シダーゼの検出および測定のための液体調製物の形態を
した薬剤に関する。
この薬剤はまた西ドイツ特許出願Ｐ３５４１９７９号明
：ａ書に記載されるように、ペニシリンまたはその酸加
水分解によυ生成する分解産物をも含有しうる。
この薬剤は固形８１４＃物、例えば凍結乾燥物、顆粒ま
たは錠剤全溶解させることにより製造でき、その際液体
調製物に用いられる成分であるテトラアルキルベンジジ
ン、ペニシリンまたはその分解産物、過酸化物および緩
衝物質は所定黴の主に水性浴媒中に溶解させた場合に各
成分が前記した６度において存在するような量比で含有
される。固形調製物はさらに潤滑剤、充填剤および崩壊
剤のような添加物、例えばポリエチレングリコール、尿
素および重炭ｍｋＪＸｔ付加的に含有しうる。
テトラアルキルベンジジンとしては特に、アルキル部分
中に１〜６個の炭素原子を含有するもの、好ましくは３
．３’、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
またはそのジ塩酸塩が使用されうる。過酸化物としては
過硼酸ナトリウム、液体状または固形尿素付加物として
の過酸化水素、ならびにＤ−グルコースおよびグルコー
スオキシダーゼからなる過酸化水素発生系が適当で、そ
の場合６度は０．５〜１ｏミリモル／ｌに１３整される
。俵衝物質としてはクエン酸塩および酢を浚塩のような
離液物質が好ましい。
′液体形の調製物を製造する場合、テトラアルキルベン
ジジンｋｐ８１．５〜２．０′ｔ−有する希塩酸または
蟻酸の第一〇〇溶液中に溶解させる。ペニシリンまたは
その酸加水分解にょシ生成する分解産物がこの溶液中に
添加されるのが好ましい。
第二の、よシ酔性の少ない溶液は、例えばその声値が水
酸化ナトリウムを用いて６〜乙に調整されうる酢Ｑまた
はクエン酸モノナトリウムあるいはモノガリウム塩の溶
液中に過酸化物を溶解させることによるか、または過酸
化水素の溶Ｉｋ使用する場合はそれ金加えることにより
製造される。
所定の割合の両溶液を混合することにより使用ｌｐ、備
のできた調製物が得られる。
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、本発明
はそれらに限定されるものではない。
実施例 １、　使用準備のできたＴＭＢ−基質調製物の製造原液
１　：　ＴＭＢジ塙醐瓜を再蒸留水中に５１１／Ｉｔ。
すなわち１６ミリモル／１１の濃度で攪拌下に溶解させ
そして５　ｎ　ＨＣＩ　’に用いてｐＨ１，５に調整し
た。この溶液にペニシリンＧを攪拌下に最終濃度２００
ｍ９／ｌ、すなわち０．５６ミリモル／ノとなるように
添加した。
原液２：再蒸留水９００づ中に氷酢酸１．４　ｍ、１　
ｎ　　ＮａＯＨ１，５−および尿素−過酸化水素付加物
２５０〜、すなわちＨ２Ｏ２３ミリモルを加えた。
完全に溶解したのち再蒸留水を加えて１１となした。
使用溶液：原液１の１容量部および原液２の１０容量部
を混合した。
かくして調製された使用溶液はｐＨ３，３を有していた
。このものは６５０ｎｍで光学１度０．０２５を示した
。５倍量の０．５ｎ硫酸を添加した後では４５０ｎｍで
測定した吸光はｏ、ｏｏｓであった。
２、　ペルオキシダーゼ活性の力学的検定西洋わさびペ
ルオキシダーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ社製、西ドイツ）および家兎の抗ヒ）　１ｇＦ抗体（
Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ製、マールプルグ西ドイツ）
からなる「Ｊ、　Ｈｌｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈ
ｅｍＪ２２．１０８４〜１０９１（１９７４）記載の方
法に従い調製された複合物ｔ−１０■／−の牛血清アル
ブミンが添加され尼燐酸塩緩衝された食塩溶液（以下Ｐ
ＢＳと略記する）中に希釈した。この溶液２０ゴをキュ
ベツトに入れそして実施例１に従い調製された使用溶液
１−量を加えた。混合したのち６５０ｎｍでの当初の吸
光変化を記録した。０．９９％（Ｖ／Ｖ　）ジメチルス
ルホキシド水溶液中の９９〜／ｌ、すなわち０．４１ミ
リモル／ｌのＴＭＢおよび８．７５１／／Ｉｔのクエン
酸トリナトリウムＸｌＨ２Ｏを含有し、燐酸でｐＨ６，
０に調整されたものであるオランダ特許第８００１９７
２号、実施例１ｃの記載により調製された使用溶液中に
おける、酵素複合物によ＃）惹起された１分画シの１汲
元変化を同様にして記録した。
二重ｌｌｌ！ｌ定の平均値として、実施例１記載のＴＭ
Ｂ使用溶液については１分当りの吸光変化１．３１８そ
してオランダ特許第８００１９７２号記載のＴＭＢ使用
溶液については０．１９３なる値が得られた。
３、　総ＩｇＥ測定のための酵素免疫検定における使用 ポリスチレン製マイクロテストプレート（Ｎｕｎｃ　、
　Ｒｏｓｋｉｌｄｅ　、デンマーク、Ｃａ　ｔ　、Ａ　
２６２１７０）’ｊｉＶｏｌｌｅｒ氏他の「Ｂｕｌｌ　
、　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ−Ｏｒｇａｎ、　Ｊ１互
、５５−６５（１９７３）記載の方法に従い被覆した。
この目的には、Ｖｏｌｌｅｒ氏他の方法に記載された被
覆用緩衝液中における１０μＩ／−の濃度の実施例２記
載の抗ＩｇＥ抗体の溶液１５０μｌずつを各ウェル中室
温で１５−２０時間インキュベーションした。溶液を吸
引ｐ過しそしてＰＢＳ中のツイーン２０とも呼ばれるポ
リオキシエチレン（２０）ソルピタンモノラウレー）　
（ＰＢＳ　−ツイーン（Ｔｖｒｅｅｎ戸）１ｇ／ｌ溶液
で洗ったのち、１０〜／ｍｌの牛血清アルブミンが添加
されたＰＢＳ中の種々の希釈度の工ｇＥ含有ヒト血清試
料１００μｌずつを８個のウェルに入れそして室温で１
時間インキュベーションした。これらの試料において希
釈工程により生ずるＩｇＥ濃度は１０００．５００．１
００．２５および１０ＩＵ／−であった。ＰＢＳ　−ツ
イーンで２回洗浄後、１０Ｔｒ９／ｍの牛血清アルブミ
ンが添加されたＰＢＳ−ツイーン中の実施例２記載の俣
合物の適当な希釈物１００μｌずつを用いられているす
べてのウェルに加えそして室温で１時間インキュベーシ
ョンした。さらに２回洗浄したのち各濃度レベルで用い
られる８個のウェルのうちの４個に実施例１記載の使用
溶ｌｅｉ、１００μｌずつをそれぞれピペットで加えそ
して室温で３０分間インキュベーションした。
同様にして、残る４個のウェルそれぞれにオランダ特許
第８００１９７２号記載の７１皿調製物１００μｔずつ
を使用した。インキュベーション期間経過後０．５　ｎ
　Ｈ２ＳＯ４１００μｔを加えそれにより酵素反応を停
止させた。得られた着色した溶液の吸光をＢｅｈｒｉｎ
ｇ　ＥＬＩＳＡ−プロセッサー装置（Ｂｅｈｒｉｎｇｗ
ｅｒｋｅ社製、Ｍａｒｂｕｒｇ、西ドイツ）を用いて測
定しそしてその結果を下記の表に示す。
表

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）テトラアルキルベンジジンまたはその塩、および過
    酸化物または過酸化水素を発生する系を包含するペルオ
    キシダーゼ活性の検出および測定のための薬剤であつて
    、このものがＰＨ値を２．５〜３．９の範囲に調整する
    １種類またはそれ以上の緩衝物質を含有することからな
    る薬剤。 ２）テトラアルキルベンジジンがアルキル部分中に１〜
    ３個の炭素原子を含有することからなる前記特許請求の
    範囲第１項記載の薬剤。 ３）テトラアルキルベンジジンが３，３′，５，５′−
    テトラメチルベンジジンであることからなる前記特許請
    求の範囲第１項記載の薬剤。 ４）テトラアルキルベンジジンおよび場合によりペニシ
    リンまたはその酸加水分解により得られる分解産物をｐ
    Ｈ１．５〜２の溶液中に添加しそして得られた溶液を、
    過酸化物および混合後にｐＨ値を２．５〜３．９となす
    緩衝物質を含有するもう一つの溶液と混合することから
    なるペルオキシダーゼ活性の検出および測定用の薬剤の
    製法。 ５）ペルオキシダーゼ活性またはプソイドペルオキシダ
    ーゼ活性を検出または測定する分析法における前記特許
    請求の範囲第１項記載の薬剤の使用。
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