JPS6214782A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は固定化酵素に関する。更に詳細には、カルボキ
シル基含有の水溶性高分子化合物と酵素を結合させた水
溶性固定化酵素に無機の金属塩を添加して水不溶性固定
化酵素となし、更に該水不溶性固定化酵素にキレート剤
を添加して再度該水溶性固定化酵素となす水溶性、水不
溶性の可逆的形態をとることを特徴とする固定化酵素に
関する。

近年、酵素の触媒活性を保持したまま一定空間内に閉じ
込める固定化技術の研究開発が盛んに行われている。こ
の固定化を利用して、食品分野。

医薬製造、臨床化学分析、センサー、治療、環境分野、
バイオマス等巾広い方面で応用がなされている。

従来の技術 酵素反応は、従来は水に溶解した状態で基質と反応させ
ていた為、その反応終了液から酵素を、活性の保持した
まま回収したり再利用することは困難であった。このよ
うなバッチ法による酵素反応は、反応ごとに酵素を消費
してしまう為非常に不経済である。

固定化酵素は上記の欠点を補うものとして、既に多くの
報告がなされ、実用化されている。

酵素を固定化する方法としては、セルロース、デキスト
ラン、アガロース、デンプン、アルギン酸等の多糖類、
ゼラチン、アルブミン、コラーゲン等の蛋白質、ポリア
クリルアミド、スチレン系樹脂、エチレン−マレイン酸
誘導体、多孔性ガラスのアミノシラン誘導体等の担体に
、共を結合、吸着、格子、マイクロカプセル化などの方
法によって固定化される。

固定化酵素は、通常は不溶性の担体に結合されている為
不溶性となっているが、一方水熔性の担体−酵素結合体
も報告されている（　Ｂｉｏｃｈｉｍ、ＢｉｏｐｈｙＳ
、八ｃ　ｔａ　、　２５０巻、５２２頁、　　１９７１
年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、、　　１３
巻、　　３１９頁、　　１９７１年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒｓ　＋９巻、４０１頁、　１９７０年）。これらは
、可溶性のデキストラフ、ＣＭ−セルロースに酵素を結
合させたり、或いはセファデックスＧ−２００（登録商
標）のような不溶性の担体に酵素をあらかじめ固定化し
た後、デキストラナーゼにより不溶性担体を可溶性とす
るものである。又、最近新しい可逆的な固定化方法も試
みられている（発酵と工業、３５巻、１１頁、　１９７
７年、Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｅｎｇ、　２５巻、　２
２０９頁、　１９８３年）。

これは、酵素と担体をジスルフィド結合させるか或いは
クーロン力を利用して担体であるポリウレタンでコーテ
ィングしたポリテトラフルオロエチレン膜に酵素を結合
させ、酵素反応を行い、次に酵素を担体から離脱させて
安定な状態に保存し、酵素を反復利用するものである。

しかし、この報告は固定化操作を可逆的に行うものであ
って固定化酵素の可逆性に関するものではない。

このように従来から固定化酵素は、水不溶性であるか又
は水溶性のいずれかの形態しかとりえなかったのであり
、水に不溶性で固定化された状態と水に熔けて固定化さ
れた状態を可逆的に作りうる固定化酵素は全く知られて
いない。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、上記の事情を考慮して水溶性固定化酵素と水
不溶性固定化酵素の利点を共に具備し、酵素反応を効率
的に行うことのできる全く新規な固定化酵素を提供する
ことを目的とする。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、従来の水不溶性固定化酵素の反応が不均
一で反応に長時間を要することや、酵素と基質の親和性
が低下し酵素反応が効率的でないことに注目し、かかる
欠点を補うべく鋭意検討を重ねた。そして、その研究の
過程で全く意想外にもカルボキシル基含有の水溶性高分
子化合物と酵素を結合させた可溶性固定化酵素に無機の
金属塩を添加することによって該水溶性固定化酵素は水
不溶性となり、更にこのものにキレート剤を添加すれば
再び水溶性となることを見い出し、本発明を完成するに
至った。

本発明者らの研究によれば、水溶性固定化酵素はその担
体中に遊離のカルボキシル基が残存しており、これらが
無機の金属塩とキレートを生成することにより水不溶性
となるのである。更に、強固に結合した金属を除去して
再び水溶性固定化酵素とするには、キレート剤を添加す
ることにより容易に実施される。このようにして固定化
酵素は水溶性にも水不溶性にもなりうるのである。

ところで、固定化酵素は酵素の安定性を向上したり、酵
素の再利用９反応の連続化１反応の調節。

制御等多くの利点を有している。しかしながら、この固
定化酵素は水に不溶性となっている為、元の可溶性の酵
素と異なり反応が不均一になる他、動力学的な変化もみ
られるようになる。即ち、酵素の高次構造の変化が起き
たり、固定化に伴い担体との影響を受は静電気、拡散の
ような物理的因子が働き、多くの場合ミカエリス定数（
Ｋｍ値）は変化する。

この問題点を解決する為、酵素反応においては比表面積
を増大させることにより該反応を効率的に進め、次いで
不溶化することによって酵素と他の生成物、基質等と分
離でき、固定化酵素は反復利用される。

即ち、本発明は可逆的な形態をとりうる固定化酵素であ
って、反応系に於いて固定化酵素表面への基質′の拡散
を容易ならしめるものである。

本発明の詳細な説明すると、あらかじめカルボキシル基
含有の水溶性高分子化合物と酵素を共有結合により固定
化するが、本発明を特徴づける可逆性の固定化酵素とな
すには、この段階における固定化に担体−酵素結合体が
可溶性である必要がある。即ち、多糖類が固定化終了時
に水に可溶性の残基であるカルボキシル基が残っていな
ければならない。これは、固定化の際に反応する担体の
官能基がカルボキシル基以外であるか、又は固定化に用
いる反応試薬の量、ｐＨを調節することにより可能とな
る。ここで用いられる結合様式は共有結合であり、本発
明における特に好適な方法としてはペプチド法である。

酵素を担体に結合する際に関与する官能基は、アミン基
、カルボキシル基。

水酸基、スルフヒドリル基等であり、担体をアジド、ク
ロリド、カルボジイミド、イソシアナート等の誘導体と
なし、これに酵素蛋白を結合せしめる。

担体であるカルボキシル基含有の水溶性高分子化合物と
しては、ポリオール類、ポリアクリル酸類。

ポリメタクリル酸類であり、例えばカルボキシメチルセ
ルロース、アルギン酸、ペクチン酸、カルボキシメチル
スターチ等の多糖類、ポリアクリル酸、ポリメタクリル
酸及びこれらの共重合体、ポリビニルアルコールのカル
ボキシメチル化誘導体等が挙げられ、これらを単独で又
は二種以上組み合わせて用いることができる。一方、酵
素としては特に限定されることなく任意に使用されうる
が、例えばアミノ酸オキシダーゼ、チトクロムＣオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼの
ような酸化還元酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、グ
ルタミン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸
アミントランスフェラーゼ。

クレアチンホスホキナーゼ等の転移酵素、アスパラギナ
ーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、アミノアシラーゼ、ウレ
アーゼ、インベルターゼ、ペクチナーゼ、リボヌクレア
ーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素、アスパルターゼ
、フマラーゼ等のりアーゼ、グルコースイソメラーゼ、
乳酸ラセマーゼ等の異性化酵素、アシルＣｏ−Ａシンセ
ターゼ、アスパラギンシンセターゼのようなりガーゼを
挙げることができる。

上記の方法により得られた水溶性固定化酵素を用いて酵
素反応を行うことによって、均一な反応ができると共に
効率の高い反応を実現することが可能となる。次に、反
応を終了した液から酵素を生成物や基質と分離する為、
水溶性固定化酵素を水不溶性としなければならない。こ
の為、該水溶性固定化酵素を含む溶液に担体であるカル
ボキシル基含有の水溶性高分子化合物と結合して水不溶
性となりうる無機の金属塩を添加する。この無機の金属
塩としては、カルシウム、マグネシウム゛。

鉄、銅等の塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、炭酸塩であり例え
ば塩化カルシウム、炭酸カルシウム、塩化マグネシウム
、硫酸第一鉄、硝酸銅等が挙げられ、酵素の種類によっ
て不安定化させるものでなければ任意に使用しえる。上
記金属塩は、通常水溶性高分子化合物に対し５０％（重
量％）以上、好ましくは１００％〜５００％（重量％）
添加する。このようにして得られた水不溶性の固定化酵
素は、通常適当なカラムに充項し用いた反応試薬、生成
物、固定化されていない酵素を分離する。再び酵素を利
用する為に、水不溶性固定化酵素を適当な溶液で懸濁し
これにキレート剤を添加する。ここで用いられるキレー
ト剤としては、ポリオキシカルボン酸類及び／又はオキ
シカルボン酸類であり、例えばエチレンジアミン四酢酸
、イミノジ酢酸、ニトリロ三酢酸、１、２−ジアミノシ
クロヘキサン四酢酸、オキシエチルエチレンジアミン三
酢酸、エチレンジアミンニ酢酸、クエン酸、酒石酸等が
挙げられ、これらを単独で又は二種以上組み合わせて用
いることができる。

又、キレート剤は添加した金属塩に対し当量を加えれば
よい。

この操作で、固定化酵素は再び水溶性となる。

かくして、得られた可逆的形態を有する固定化酵素はそ
の反応効率の高さ、酵素安定性の付与。

反復再利用が可能なことなど優れた利点を有するバイオ
リアクターである。

以下、実施例及び試験例により本発明をより具体的なも
のとするが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

実施例１ カルボキシメチルセルロースナトリウム（重合度０．６
５．第一製薬０荀製）　１０ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩
衝液２．０ｍｌに溶解し、これに水溶性カルボジイミド
（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド、バイオランド・ラボ製、以下ＷＳＣと
略す）　０．００１５ｇを添加して充分攪拌したのち、
溶液のｐＨを４．７０に調整し４°Ｃで６時間反応を行
わせた。反応終了後、セファデックスＧ−２５＜ファル
マシア製、登録商標）によるゲルろ適法で未反応カルボ
キシメチルセルロース、余剰−３Ｃを除去した後、加水
分解酵素であるリパーゼ（微生物リボプロティンリパー
ゼ、大野製薬■製）　０．０２５　ｇを添加した。この
溶液のｐＨを６にＮ　−ＨＣＩで調整しながら４℃で２
４時間反応させた。得られた水溶性固定化酵素は、ゲル
ろ過（セファデックスＧ−２００、ファルマシア製、登
録商標）により未反応のカルボキシメチルセルロース、
反応試薬１反応生成物、酵素と分離、精製した。この水
溶性固定化酵素４　ｍｅ　（ｐＨ４，７０）に塩化カル
シウム溶液（２０Ｗ／Ｖ％）０．５−を加え、沈澱させ
水不溶性固定化酵素を調製した。次に、このものにエチ
レンジアミン四酢酸（和光純薬■製）水溶液（５，０％
）１−を加えると再び固定化酵素は水溶性となった。

この得られた固定化酵素酵素（酵素濃度０．２４５％）
に、リパーゼの基質溶液（パラニトロフェニルラウレー
ト（ｒ’ＮＦＬ）　２．５　ｍＭ　（最終濃度）、２％
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５，６０）に溶解）を添加し、３７℃で１５分反応させ
、アセトンを添加し反応を停止し、遊離のパラニトロフ
ェノールを波長４２０ｎｍにおける吸光度で測定しリパ
ーゼ活性をみた。このものの比活性は、４７．５％であ
った。

実施例２ カルボキシメチルセルロースナトリウム（置換度０．６
５．第一製薬０零製）　２０ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩
衝液４−に溶解し、これに−ＳＣ１５ｍｇを添加して充
分攪拌した。溶液のｐＨを７．４０に調整し、４℃で６
時間反応させた。セファデックスＧ−２５＜ファルマシ
ア製、登録商標）によりゲルろ過後、加水分解酵素であ
るアシラーゼ（大野製薬側製）　４０ｍｇを添加し溶液
のｐＨを４．７０に調整した。反応は４℃で２４時間行
った。以下、実施例１と同様に操作して固定化酵素を得
た。

実施例３ 実施例２で得られた固定化酵素３　ｍｆ！に塩化マグネ
シウム溶液（２０％〉　１−を加え、水不溶性固定化酵
素を得た。次に、該固定化酵素にイミノジ酢酸（和光純
薬ａ製）溶液（１０％）１−を加え、水溶性固定化酵素
を得た。この酵素固定化量は３１．４％、比活性２５．
８％であった。

実施例４〜５ 担体の活性化時間をそれぞれ３時間、１２時間とし、以
下実施例２と同様の方法で固定化酵素を得た。その酵素
固定化量はそれぞれ８．９％、　２６．１％であった。

実施例６ アクリルアミド／アクリル酸共重合体（酸２９．２％）
　２０ｍｇを０．０５Ｍリン酸ｒｉ衝液（ｐＨ６，０）
に溶解し、これにＷＳＣ１５ｍｇを添加して充分攪拌し
た。これを２４℃で１．５時間反応させ、加水分解酵素
であるアシラーゼ（大野製薬■製）　４０ｍｇを添加し
、２４℃で１．５時間反応させた。得られた固定化酵素
は実施例１と同様に操作して可逆性を確認した。又、得
られた固定化酵素の酵素固定化量は２５．０％、比活性
は２１．５％であった。

実施例７ カルボキシメチルポリビニルアルコール５ｒｎ１を２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ１２）　１０ｍｅに溶解し、水２０
ｍｆｆを添加した後臭化シアン（片山化学Ｉｌｌ製）を
−当リ１００　ｍｇ加え、これを５℃にて１０分間反応
させた。

その後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア製。

登録商標）でゲルろ過し、ブロムシアン活性化カルボキ
シメチルポリビニルアルコールを得た。このものに、加
水分解酵素であるアミラーゼ（大野製薬■製）　１０ｍ
ｇを添加して５°Ｃで６時間反応させ、固定化酵素を得
た。以下実施例１と同様に行い固定化酵素の可逆性を確
かめた。得られた固定化酵素の酵素固定化量は４７．２
％、比活性は３０．０％であった。

実施例８ ペクチン酸く和光純薬■製）３ｇを０．６Ｎ−水酸化ナ
トリウム溶液１００−に熔解した後、エピクロルヒドリ
ン２−を加え４０℃で２時間反応させた。

このものをセファデックスＧ−２５（ファルマシア製、
登録商標）で脱塩した後、酸化還元酵素であるグルコー
スオキシダーゼ（大野製薬（１１１）　２０ｍｇを加え
て攪拌し、２５℃で一晩反応させた。生成した固定化酵
素と他の夾雑物はセルロファインＧＣ−７００Ｍ　（生
化学工業■製、登録商標）で分離した。

以下、実施例２と同様に操作して固定化酵素の可逆性を
確認した。

試験例１ 実施例１で得た固定化酵素を反復使用し、その耐久度を
試験した。結果を表１に示す。なお、表中の酵素固定化
量とは、酵素の残存活性をも計算に含めた値である。表
１から明らかなように、この固定化酵素は十分な実用性
を兼ね備えていることがわかる。

表１ 試験例２ 実施例１で得た水溶性固定化酵素と水不溶性固定化酵素
の反応効率を、リパーゼ活性を測定することにより試験
した。結果を表２に示す。表２から明らかなように、水
不溶性の場合に比べて水溶性のものは著しく反応速度が
高く、反応効率が優れていることが判る。

表中の数値は、反応速度■（μｍｏｌ　／　ｍｉｎ　）
を表す。

表２ 試験例３ 実施例８で得た固定化グルコースオキシダーゼの水溶性
及び水不溶性の場合の反応効率を、グルコースオキシダ
ーゼ活性を測定することにより試験した。その結果を表
３に示す。表３から明らかなように、水溶性のものは水
不溶性に比べて反応効率が非常に優れていることが：ｔ
ｆｆする。

表中の数値は、波長５００ｎｍにおける吸光度を示し活
性を表すものである。

表３ 本発明の可逆的形態を有する固定化酵素は、従来にない
反応の高効率化が得られる為経済的に生成物の製造が可
能である。又、産業上の利用分野における酵素反応に利
用でき、巾広い用途をもつものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水溶性と水不溶性の可逆的形態をとることを特徴と
   する固定化酵素。 ２、水溶性形態がカルボキシル基含有の水溶性高分子化
   合物と酵素を結合せしめて得られる水溶性固定化酵素で
   ある特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 ３、可逆的形態が、水溶性固定化酵素に無機の金属塩を
   添加せしめ、水不溶性固定化酵素となし、更に該水不溶
   性固定化酵素にキレート剤を添加して再度該水溶性固定
   化酵素となす特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 ４、水溶性高分子化合物がポリオール類、ポリアクリル
   酸類、ポリメタクリル酸類よりなる群から選ばれる特許
   請求の範囲第２項記載の固定化酵素。 ５、無機の金属塩がカルシウム、マグネシウム、鉄、銅
   の塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、炭酸塩のいずれかである特
   許請求の範囲第３項記載の固定化酵素。 ６、キレート剤がポリアミノカルボン酸類及び／又はオ
   キシカルボン酸類である特許請求の範囲第３項記載の固
   定化酵素。 ７、結合が共有結合である特許請求の範囲第２項記載の
   固定化酵素。