JPH03236777A - 酵素の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は多孔質セラくツクなどの固定化担体に酵素を固
定する方法に関する。

（従来の技術） 酵素反応の方式として、従来は基質（原料）と酵素とを
反応槽にいれ、温度およびＰＨを調整しながら反応せし
めて目的の生成物を得る回分法が利用されていたが、連
続して生成物を得ることができないので、最近では特公
昭８０−２０９９７号に示されるようにセルロースなど
の担体に酵素を固定した固定化酵素が利用されている。

特公昭６０−２０９９７号は特に酵素の固定化に特徴を
有するものであり、その内容は既に固定化されている酵
素を失活させ、この失活した酵素が固定化されている担
体を新たな酵素を固定化する担体として用いるというも
のである。

（発明が解決しようとするｌ１１り 上述した先行技術によれば、酵素の固定化量と活性収率
を高めることができるが、更なる固定化量と活性収率の
向上が望まれる。

（課題を解決するための手段） 上記課題を解決すべく本発明は、例えば担体に変性タン
パク質を結合し、この変性タンパク質の官能基に酵素の
官能基を共有結合させるようにした。

（作用） 担体に変性タンパク質を固定化すると、従来の固定化酵
素を失活させたものより、外側に多くの官能基を有する
ので、この官能基を酵素との結合に利用でき、より多く
の酵素を固定できる。この際、官能基の種類を調整する
ことで更に固定化量の向上が図れる。

（実施例） 以下に本発明の具体的な実施例をシリカ（Ｓｉ０２）担
体を例にとって説明する。尚α−アルミナ（Ａ１２０３
）担体の場合についも同様の方法によって酵素を固定化
した。

５ｉ０２担体６ｇに１％アミノプロピルトリメトキシシ
ラン水溶液１０■１を加え、３０分間超音波処理した後
３０分間はど室温に静置し、次いで６０℃で１２時間乾
燥させる。この処理により担体がシラン化される。即ち
、５ｉ０２の表面についているＯＨ基がシラン化してＮ
Ｈ２基となる。

一方、２％牛血清アルブくン（ＢＳＡ）２５ｍｌと、８
Ｍ尿素２．５ｍｌと、０．５ｇ２−メルカプトエタノー
ルとを混合し、３０分間程スターラで攪拌して牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を変性させ、この変性タンパク質を
前記シラン化担体に接触させて混合する。この後、５％
ウッドワード試薬に２．４ｍｌを入れて更に約１７時間
攪拌する０以上の処理により担体の周囲に変性ＢＳＡが
結合する。

次いで１％酒石酸５ｍｌと１％１．Ｅｌ−シア主ノヘキ
サン５ｍｌとをスタークで攪拌したものを上記の溶液に
加える。この処理により変性ＢＳＡ同志を架橋させ固定
化の強化と変性ＢＳＡの固定化量の増大を図る。

この後、５％ウッドワード試薬Ｋを１．０−１ずつ加え
て２時間程攪拌した後、蒸留水でよく洗浄する。

次いで上記の担体２．５ｇに１％ｌ、Ｅｌ−シアくノヘ
キサンＩＣ）＋１と５％ウッドワード試薬に１ｍｌを加
え、変性ＢＳＡのカルボキシル基の残基な全てアジノ化
する。

以上の担体２．５ｇに０．５ｍｇ／■ｌのプルラナーゼ
溶液（溶媒は酢酸、酢酸ナトリウム塩バッフｙ−５０ｍ
Ｍ％　ＰＨ５を使用する。）１０ｍｌを接触させ、５℃
の条件下で吸着操作する。即ち、よく攪拌した後、５％
ウッドワード試薬Ｋを約１〜＋３ｅｌ加えて酵素（プル
ラナーゼ）を固定化する。

以上の方法によって得られた固定化酵素を第１図に示す
。

即ち、固定化酵素はＳｉｎ、担体１の周囲に変性した牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）２・・・がペプチド結合し、
これらＢ５Ａ２・・・は互に架橋し、更にＢ５Ａ２のア
くノ基（Ｎ　Ｈｅ−）と酵素３のカルボキシル基（ＣＯ
ＯＨ−）とがペプチド結合している。

一方、本発明方法と物理結合させた場合を比較するため
、以下の条件で酵素をシリカ（ＳｉＯ２）及びα−アル
ミナ（Ａ　Ｉ２０　ａ）担体に固定化させた。

即ち、シラン化を行なう代りに、５％ＢＳＡ溶液９．５
１１を６ｇの担体に加え、３０分間超音波処理した後、
１２時間程６０℃で乾燥して固定化した。

以上の本発明方法によって固定化した酵素の吸着量と活
性とを従来方法（物理結合）と比較した結果を以下の［
表コ及び第２図に示す。

［表コ 実験条件 担体：０．５ｇ １．２５％プルラナーゼ；５ｍ１ 反応温度＝３０℃ 振とう回数：５０回／　ｍ　ｉ　ｎ 第３図は別実施例を示す第１図と同様の図であり、この
実施例にあっては、担体としてのα−アルミナ（Ａ　Ｉ
２０３）にタンパク質を物理吸着させ、このタンパク質
に変性タンパク質をペプチド結合させるとともに変性タ
ンパク質同志を架橋させて担体を取巻くようにし、この
変性タンパク質のカルボキシル基をアくノ基に変え、こ
の変性タンパク質のアミノ基と酵素のカルボキシル基と
をペプチド結合させる。

尚、本発明の実施に用いる担体としては、セルロース、
デキストラン、アガロース等の多糖類誘導体、ポリアク
リルアミドゲル、エチレン酢酸ビニル共重合体ケン化物
及びセラミック等が挙げられるが、セラくツクが強度の
点で最も優れている。

またタンパク質としてはアルダくン、グロブリン等の単
純タンパク質、糖タンパク質、核タンパク質等の複合タ
ンパク質を用い、これらは１種若しくは２種以上併用し
てもよい。

更に本発明方法によって固定する酵素は上記のプルラナ
ーゼに限らず以下の酵素にも適用できる。

（酸化還元酵素） アミノ酸オキシターゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシ
ターゼ、グルコース・オキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナーゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、６−ホスホグルコ
ン酸デヒドロナーゼ、リンゴ酸デヒドロナーゼ。

（転移酵素） アスパラギン酸アセチルトランスフェラーゼ、アスパラ
ギン酸アミノトランスフェラーゼ、グリシンアくノドラ
ンスフェラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミノト
ランスフェラーゼ、グルタミン酸−ピルビン酸、アシッ
ドランスフェラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒス
タミンメチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ
　フラクトキナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセ
チルトランスフェラーゼ、ロイシンアくノペプチダーゼ
。

（加水分解酵素） アスパラギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミ
ノアシラーゼ、アアミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アラ
ニンラセマ−ゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカ
ーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、ト
ロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダーゼ、パパイ
ン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミン、ペクチターゼ、ヘ
キソキナーゼ、ペプシン、ペニシリナーゼ、ペニシリン
アミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、ラクタ
ーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニ。

（リアーゼ） アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、アスパルターゼ、
クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、
ヒスチジンアンモニアニアリアーゼ、フェニルアラニン
アンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラタ
ーゼ、リンゴ酸シンテターゼ。

（異性化酵素） アラニンラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコ
ースホスフェートイソメラーゼ、グルタくン酸ラセマー
ゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼ。

（リガーゼ） アスパラギンシンターゼ、グルタチオンシンターゼ、ビ
ルヒン酸シンターゼ。

（効果） 本発明によれば、変性タンパク質中に存在する官能基を
介して酵素を担体に固定化するため、担体に結合する変
性タンパク質の量に比例して酵素の吸着量を増加させる
ことができ、特に変性タンパク質同志を架橋させること
で更に酵素の固定化量と活性収率を高めることができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の実施によって得た固定化酵素の模
式図、第２図はプルラナーゼとマルトトリオースの生成
量との関係を示すグラフ、第３図は、別実施例を示す第
１図と同様の図である。 なお、図面中１は担体、２は変性タンパク質、３は酵素
である。 特 代 許 理 同 同 出 人 願 人

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　担体または担体に結合させたタンパク質に変性タンパ
   ク質を結合し、この変性タンパク質の官能基に酵素の官
   能基を共有結合させるようにしたことを特徴とする酵素
   の固定化方法。