JPS62190086A - 核酸配列の検出に有効な分子 - Google Patents

核酸配列の検出に有効な分子

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 現行のＤＮＡプローブ方法では基本的に、標的ＤＮＡを
ニトロセルロースフィルターと直接接触させるか又はア
ガロースゲルから５ｏｕｔｈｅｒｎ　トランスファー技
術を介することによって標的ＤＮＡをニトロセルロース
フィルターに結合させる。次にＤＮＡを変性し、フィル
ターをベーキングして強固な結合を確保する。一般にＤ
ＮＡの調製とゲルの泳動とは時間及び費用のかかるプロ
セスでありしかもかなり高度な技術レベルを要する。
次のステップで、プローブＤＮＡを調製する。ブロー７
’　ＤＮＡの調製には、ニックトランスレーション、ポ
リヌクレオチドキナーゼによりＤＮＡを放射性標識する
か又はｓｔｐ標識ヌクレオチドを使用するその他のポリ
メラーゼタイプのコピー反応を用いる。調製したプロー
ブＤＮＡは、結合した標的ＤＮＡとハイブリダイズし得
る。ハイブリダイゼーションは適当な温度で典型的には
数時間行なわれる。
ＤＮＡプローブは、相補的塩基配列をもつ結合標的ＤＮ
Ａのいずれかとハイブリッド二重体を形成するように結
合する。次に、未結合プローブを含む外来材料をフィル
ターから洗浄除去し、フィルターを放射性ラベルに感受
性のフィルムに露光する。
国際特許出願第Ｗ０８４１０３５２０（Ｍａｌｃａｌｍ
等）は、核酸プローブと酵素含有マーカーとのタンデム
ハイブリダイゼーションを使用する核酸配列の検出方法
を開示している。該方法では、ハイブリダイズ条件下で
相補的標的配列を含むザンブルとプローブとを接触させ
る。標的配列とのハイブリダイゼーション以前又は以後
に、プローブの配列と相補的な配列をもつ酵素標識マー
カーポリヌクレオチドとプローブとをハイブリダイゼー
ションによって結合する。
米国特許第４３５！１１５３５号（Ｆａｌｋｏｗ等）は
、該当する標的核酸配列に相補的な放射性標識ヌクレオ
ヂドブローブを開示しまた、標的核酸配列が由来する病
原体の存在をこれらプローブの使用によって検出する方
法を開示している。該方法では先ず、標的核酸配列をプ
ローブとのハイブリダイゼーション以前に不活性支持体
上に固定する。次に、ハイブリダイズ条件下で固定核酸
を放射性標識プローブと接触させ、固体支持体上でハイ
ブリダイゼーションを生起する。次に、不活性支持体上
でラベルの存在を検出することによって標的核酸配列の
存在を検出する。かかる系の欠点はプローブ自体を固定
できないことである。標的核酸配列でなくＦａｌｋｏｗ
等のプローブが固定されると、固定されたプローブのラ
ベル分子はプローブが標的核酸配列にハイブリダイズし
たか否かにかわりなく固体支持体に結合するであろう。
その結果、標的核酸の存在を検出することができない。
欧州特許出願第０１１７４４０号は、非放射性の化学的
標識ポリヌクレオチドプローブと該プローブを使用する
方法とを開示している。該方法で、標的核酸配列がハイ
ブリダイゼーション以前に固体支持体に固定されること
はＦａｌｋｏｗ等の方法と同様である。
最近、蛍光タッグまたは変色酵素系の如き別の検出系が
開発された。しかし乍らかかる系は、感度及びバックグ
ラウンド（ノイズ）レベルにかなりの問題がある。
米国特許第４３６２８６７号（Ｐａｄｄｏｃｋ）は、二
重鎖螺旋構造を形成すべくハイブリダイズされる２つの
相補的デオキシヌクレオチド配列を含むハイブリッド核
酸構造を開示している。２つのデオキシヌクレオチドの
間に１つのりボヌクレオチド配列が共有結合している。
この構造が、単一ユニットを形成しており、該ユニット
内でヌクレオチド配列の反復は全く存在しない。
本発明は、被検（標的）ＤＮＡ溶液中の特異的ＤＮＡ又
はＲＮＡ配列の検出方法を提供する。該方法は、相補的
標的ＤＮＡ配列に結合しない検出可能なリポーター分子
を完全に除去しこれにより検出系のシグナル対ノイズ比
を向上せしむべく、少なくとも１つの点でプローブの核
酸配列を特異的に開裂する手段を提供する。かかる系で
はハイブリダイゼーション反応を進行させるために極め
て高゛いプローブ濃度を使用し得、対応するバックグラ
ウンドノイズレベルに増加は生じない。
発明の概要 本発明は、構造 ［ＮＡ、−−−８−−−ＮＡ、　）。
〔式中、ＮＡ、及びＮＡｔは非相補的核酸配列、−−−
Ｓ−−−は開裂可能結合、ｎは１〜１，０００の整数〕
をもつ天然産生でない合成分子に係る。
本発明によれば、構造 〔ＮＡドビー−−−ＮＡ、　）。
〔式中、ＮＡ、及びＮＡｔは核酸配列、−−−Ｓ−−−
は開裂可能結合、ｎは２〜ｉ、ｏｏｏの整数〕をもつ天
然産生でない合成分子が提供される。
また、構造 Ｘ−Ｌ−ｆ−ＮＡ、　−−−３−−−ＮＡｆＭ〔式中、
ＮＡ＋及びＮＡ、は核酸配列、−−−Ｓ−−−は開裂−
可能結合、ｎは１〜ｔ、ｏｏｏの整数、実線は化学結合
、Ｘは固体支持体、ＬはＮＡ、を固体支持体に結合する
化学物質及びＭはマーカー〕をもつ分子が提供される。
また、構造 Ｙ（−ＮＡ、−−−６−−−ＮＡｒ＋ｒＺ〔式中、ＮＡ
、及びＮＡｔは核酸配列、−−−Ｓ−−−は開裂可能結
合、ｎは１〜ｉ、ｏｏｏの整数、Ｙは存在しないか又は
特有の同定特性を与える化学物質、２は存在しないか又
は異なる特有の同定特性を与える化学物質を示す〕をも
つ分子が提供される。
サンプル中の対象核酸配列の存在を検出する方法は、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的であり検出可能マ
ーカーと結合している核酸配列を含む本発明の非固定分
子とサンプルとをハイブリダイズ条件下で接触させ、 （ｂ）得られた分子を固体支持体上に固定し、（ｃ）開
裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、（ｄ）固定
分子を分離回収し、 （ｅ）固定分子におけるマーカーの存在を検出し、これ
により対ｉ核酸配列の存在を検出することを含む。
サンプル中の対象核酸配列の存在を検出する別の方法は
、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的であり検出可能マ
ーカーと結合している核酸配列を含む本発明の固定分子
とサンプルとをハイブリダイズ条件下で接触させ、 （ｂ）開裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、（
ｃ）固定分子を分離回収し、 （ｄ）固定分子におけるマーカーの存在を検出し、これ
により対象核酸配列の存在を検出することを含む。
発明の詳細な説明 本発明は、構造 〔ＮＡ、　−−−Ｓ−−−ＮＡ、　）。
〔式中、ＮＡ、及びＮＡｚは非相補的核酸配列、−−−
Ｓ−−−は開裂可能結合、ｎは１〜１，０００の整数〕
をもつ天然産生でない合成分子に係る。
本発明によれば、構造 〔ＮＡ、　−−−８−−−ＮＡｆ　）。
〔式中、ＮＡ、及びＮＡｔは核酸配列、−−−Ｓ−−−
は開裂可能結合、ｎは２〜１，０ｆｆＯの整数〕をもつ
天然産生でない合成分子が提供される。
本発明の分子中、開裂可能結合の点線は化学結合を示し
、該化学結合は共有結合又は水素結合のいずれでもよい
。
本発明の分子中のＮＡ１及びＮＡｔはＤＮＡ配列でもよ
く、この配列は同じでもよく異なっていてもよい。
又は、分子がＲＮＡ配列から構築されてもよく、このＲ
ＮＡ配列も同じ配列又は異なる配列のいずれでもよい。
又は、ＮＡ、及びＮＡｔが、ｒｌＮＡ配列とＤＮＡ配列
との組み合わせでもよい。使用されるＤＮＡ配列又はＲ
ＮＡ配列は、天然産生配列でもよく又は合成によって形
成されてもよい。ＮＡｔ及びＮＡ、の各々は約８〜１０
，０００塩基の長さでよい。８塩基より短いと７１イブ
リダイゼーシヨンが有効に生じない。約５，０００塩基
の長さの配列が好ましい。
本発明の分子は、核酸配列ＮＡ、又はＮＡ、の１つ以上
に検出可能マーカーを結合してもよい。このマーカーは
検出可能な任意の分子又は試薬でよい。
かかる検出可能分子の例は、放射性同位体、放射性ラベ
ル分子、蛍光分子、蛍光抗体、酵素又は化学発光触媒で
ある。別の適当なマーカーは酵素、蛍光分子又はその他
の検出可能分子でタッグされた特異的タンパク質に結合
し得る配位子である。
適当な配位子の例は、アビジン又はストレプトアビジン
に結合するビオチンである。別の適当な配位子はカタラ
ーゼのアポ酵素部分に結合するヘミン分子である。
本発明は更に、固体支持体と該支持体上に固定された本
発明の分子とを含む組成物に係る。固定分子は検出可能
マーカーに結合されていてもよい。
本発明の分子は、分子自体の核酸配列又は標的核酸配列
の開裂又は分裂を全く生起しないで開裂又は分裂し得る
開裂可能結合をもつ。本文中の開裂可能結合なる用語は
、２つの核酸配列を接合し得、それが結合している核酸
配列に開裂を生じることなく選択的に開裂し得る結合性
化学構造を意味する。開裂可能結合は単結合でもよく又
は多数ユニット配列でもよい。かかる化学構造の一例は
、ＲＮＡ配列である。開裂可能結合として適当な別の化
学構造は、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列、非塩基性ヌクレ
オ、チド配列又は非塩基性ヌクレオチド又は任意の炭水
化物ポリマー、例えばセルロース又は澱粉である。開裂
可能結合が核酸配列のとき、該配列はＮＡ、及びＮＡｔ
の核酸配列と同じではない。
ｎが１より大きい本発明の分子においてはユニッ）　Ｎ
Ａ、−−−ｓ−−−ＮＡｔが反復する。各反復内のユニ
ットは同じでもよく又はランダムもしくは所定パターン
の変異が存在してもよい。ユニットの変異は、各反復内
でＨＡ、もしくはＮＡ、又は双方が異なっているような
変異でもよい。ＮＡ、又はＮＡ、の変異は、これらが１
つの反復ユニットと次の反復ユニットとの間で異なる核
酸配列をもつような変異でもよい。
この変異がランダムに生じて各反復ユニット内のＮＡ、
とＮＡ、とが異なっていてもよい。また変異が所定パタ
ーンで生じ、ユニットの所定倍数毎に変異が反復しても
よい。また、ＮＡ、とＮＡｔとの変異が、１つの反復ユ
ニットと次の反復ユニットとの閂でのＨＡ、及びＮＡ、
の各々の塩基の数の違い、例えば増加または減少であっ
てもよい。この変異もランダムに発生してもよく又はパ
ターン化していてもよい。ｎ＝３でＮＡ、及びＮＡ、の
双方が変異をもつときのランダム変異の例は、ＮＡビー
５−−−ＮＡｔ−ＮＡ、’　−−−Ｓ−−−ＮＡｔ’　
　ＮＡｔ”−３−−−ｇ、１１である。
ｎ＝４でＮＡｔとＮＡｔとの双方が変異をもつときのパ
ターン化した変異の例は、ＮＡ、　−〔ＮＡ１−−−Ｗ
ＡＲ−ＮＡ１°−−−Ｓ−−−ＮＡｔ’　　　ＮＡ、−
−−８−−−ＮＡｔ　　　ＮＡ＋’−−−８−−−ＮＡ
、°である。
前記例の双方において、各ユニットを結合する実線は水
素結合又は共有結合の如き化学結合を示す。
また、反復ユニットの変異が開裂可能結合の変異、即ち
１つのユニットの開裂可能結合がアミノ酸であり別のユ
ニットの開裂可能結合がＲＮＡ配列であるような変異で
もよい。開裂可能結合の変異も前記同様にランダムでも
よく又はパターン化されていてもよい。また、反復ユニ
ットの変異が、前記の如きＮＡ、、ＮＡｔの違い、又は
開裂可能結合の違いの組み合わせでもよく、これら変異
がランダムでもよくパターン化されてもよい。
本発明によれば、構造 Ｘ　　Ｌ（−ＮＡ１〜−−Ｓ−−−ＮＡｔ−１ＴＭ〔式
中、ＮＡｔ及びＮＡｔは核酸配列、−−−Ｓ−−−は開
裂可能結合、ｎは１〜１，０００の整数、実線は化学結
合、Ｘは固体支持体、ＬはＮＡ、を固体支持体に結合す
る化学物質及びＭはマーカー〕をもつ分子が提供される
。
前記分子中のＸは、石英質、セルロースもしくはプラス
チック材料又は調整多孔ガラスでよい。実線で示される
化学結合は共有結合又は水素結合のいずれでもよい。開
裂可能結合の煮２線も化学結合を示し、これもまた共有
結合又は水素結合でよい。
Ｍは放射性同位体、放射性ラベル分子、蛍光分子又は適
当な配位子の如き検出可能マーカーである。
ＭはまたＮＡ、内部の配列に相補的なマーカー核酸配列
でもよい。ＬはＮＡ、の配列に実質的に相補的な配列を
もつ核酸でもよく、この場合のしは、相補的核酸配列間
の水素結合を介して固体支持体にＮＡ。
を結合する。
本発明はまた、構造 Ｙ−ｆ−ＮＡ、−−−Ｓ−−−ＮＡｔす「２〔式中、Ｎ
Ａ、及びＮＡｔは核酸配列、−−−Ｓ−−−は開裂可能
結合、実線は化学結合、ｎは１〜１，０００の整数、Ｙ
は存在しないか又は特有の同定特性を与える化学物質、
２は存在しないか又は異なる特有の同定特性を与える化
学物質〕をもつ分子を提供する。
分子に特有の同定特性を与えるＹ及び２をもつ本発明の
この具体例は、二相濃度系での使用に適している。かか
る分子において、Ｙの同定特性が疎水性のとき２の同定
特性は親水性てあり、Ｙの同定特性が親水性のときＸの
同定特性は疎水性である。
また、Ｙ又は２の一方が欠失していてもよく、この場合
、他方は疎水性物質である。この場合、Ｙ又は２を結合
していない核酸配列ＮＡ、又はＮＡｔは分子の親水性部
分として機能する。または、Ｙ又はＺ基の一方が同定マ
ーカーであり他方が疎水性基でもよい。または、Ｙ又は
２が、分子を固体支持体に結合するリンカ−物質として
機能してもよい。
上記の分子において、実線で示される化学結合は共有結
合又は水素結合のいずれでもよい。開裂可能結合の点線
も化学結合を示し、この結合も共有結合又は水素結合の
いずれでもよい。この分子はＮＡ、又はＮＡｔに結合さ
れた検出可能マーカーを有していてもよい。
本発明の分子は、細菌ＤＮＡ、例えばサルモネラ菌Ｓａ
１ｍｏｎｅｌ　ｌａ及び大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ、ウィルスＤＮＡ、例えば単純庖疹ウィルス
Ｉ型及び■型、アデノウィルス、サイトメガロウィルス
の如き標的ＤＮＡの検出に有効である。細菌ＤＮＡ又は
ウィルスＤＮＡの検出はヒト、植物又は動物の病気の診
断に有効である。特に有利な用途は、ヒト感染性疾患、
例えば淋病の検出である。別の用途はヒト遺伝病、例え
ば綿状赤血球貧血の診断である。
本発明の分子は核酸配列検出用プローブとじて有効であ
り、２つの異なる形態、即ち（１）不均一系に適した固
体支持体に固定された形態又は（２）均一系に適した非
固定形態で使用され得る。固定形態では、自由末端をも
つ核酸配列に検出可能マーカーが結合されている。プロ
ーブを固定する適当な固体支持体の例は、石英質材料、
セルロース材料、プラスチック材料例えばポリスチレン
又は調整多孔ガラス（ｃＰＧ）である。好ましい固体支
持体は、本発明の分子に結合し得る反応性の基、例えば
ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノ基をもついかな
る固体でもよい。また、本発明の分子は支持体への接着
によって固体支持体に結合し得る。
非固定形態では、予め固定された配列に相補的な核酸配
列が、マーカーを結合していない分子の自由末端に結合
している。
本発明の固定分子は、該分子の３°端と支持体との反応
を介して固体支持体に直接結合されてもよく、又は分子
の３°端と反応して共有結合を形成しかっ固体支持体と
反応して別の共有結合を形成することによって分子を支
持体に結合する化学物質りを介して間接的に固定されて
もよい。結合性物質の別の例は、本発明の分子の３′端
の配列に相補的な核酸配列であり且つ該分子と水素結合
を形成し得る第１反応部位をもち、同時に固体支持体と
の共有結合又は水素結合を形成し得る第２反応部位をも
つ物質である。本発明ではまた、本発明の新規な分子を
ジアゾカップリングによって固体支持体に結合してもよ
い。
適当な結合性化学物質は、分子の核酸機能を損傷しない
で本発明の分子を固体支持体に結合し得るいかなる反応
性核酸−結合配位子でもよい。かかる結合性物質の例は
、欧州特許出願公開第０１３０５２３号に記載されてお
り、以下の種類の核酸挿入化合物（ｆｎｔｅｒｃａｌａ
ｔｏｒ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の誘導体から任意に選択
され得る；アクリジン色素、フエナントリジン、フェナ
ジン、フェノチアジン、キノリン、アフラトキシン、多
環炭化水素及びそれらのオキシラン誘導体、アクチノマ
インン、アントラサイクリノン、チアキサンテノン、ア
ントラマイシン、マイトマイシン、白金錯体、フルオレ
ン、フルオレノン及びフロクマリン。
本発明によれば、サンプル中の対象核酸配列の存在を検
出する方法が、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的で検出可能マーカ
ーを結合した核酸配列を含む本発明の非固定分子とサン
プルとをハイブリダイズ条件下で接触させ、 （ｂ）得られた分子を固体支持体上に固定し、（ｃ）開
裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、（ｄ）固定
分子を分離回収し、 （ｅ）固定分子におけるマーカーの存在を検出しこれに
より対象核酸配列の存在を検出するステップを含む。
サンプル中の対象核酸配列の存在を検出する別の方法は
、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的で検出可能マーカ
ーを結合した核酸配列を含む本発明の固定分子とサンプ
ルとをハイブリダイズ条件下で接触させ、 （ｂ）開裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、（
ｃ）固定分子を分離回収し、 （ｄ）固定分子におけるマーカーの存在を検出しこれに
より対象核酸配列の存在を検出するステップを含む。
サンプル中の対象核酸配列を検出するための別の方法は
、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的で検出可能マーカ
ーを結合している核酸配列を含み疎水性物質Ｙと親水性
物質２とを含む構造 Ｙ−！−ＮＡ、−−−９−−−ＮＡ　ｒ＋Ｔ−２で示さ
れる分子を含む水溶液とサンプルとをバイブＩＩ）ｆＡ
’ズ冬社下−？−培針六什、（ｂ）得られた溶液を非極
性溶媒と混合して、二相溶液の相界面に分子が存在しＹ
が一方の相に配向され２が他方の相に配向された二相溶
液を形成し、（ｃ）開裂可能結合を開裂すべく分子を処
理し、（ｄ）このように処理された分子を回収し、（ｅ
）マーカーの存在を検出しこれにより対象核酸配列を検
出するステップを含む。
サンプル中の対象核酸配列を検出する別の方法は１ 、（ａ）対象核酸配列に実質的に相補的で検出可能マー
カーを結合した核酸配列を含む本発明の非固定分子とサ
ンプルとをハイブリダイズ条件下で接触させてハイブリ
ダイズ生成物を形成し、（ｂ）ステップ（ａ）の非固定
分子の配列に相補的であるが塩基の数が約１〜１０個少
なく該分子にハイブリダイズしたときに該分子を検出不
能にする核酸配列とステップ（ａ）の生成物とをハイブ
リダイズ条件下で接触させて、該分子に相補的な核酸配
列を非ハイブリダイズ分子とハイブリダイズさせ、（ｃ
）マーカーの存在を検出しこれによりハイブリダイズ生
成物の存在、従って対象核酸配列の存在を検出するステ
ップを含む。
本発明はまた、サンプル中の外米病原体の存在を定量的
に検出するために、本発明方法のいずれかを使用して病
原体に特有の核酸配列を検出する方法を提供する。本発
明はまた、サンプル中の外米病原体の量を検出するため
に、本発明方法のいずれかを使用して病原体に特有の核
酸配列を検出する定量方法を提供する。
サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に測定する方法
は、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的で検出可能マーカ
ーと結合した核酸配列を含む所定量の本発明の非固定分
子とサンプルとをハイブリダイズ条件下で接触させ、 （ｂ）得られた分子を固体支持体上に固定し、（ｃ）固
定分子を処理して開裂可能結合を開裂し、（ｄ）固定分
子を分離回収し、 （ｅ）固定分子上に存在するマーカーの量を定量的に測
定しこれにより対象核酸配列の量を定量的に測定するス
テップを含む。
サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に測定する別の
方法は、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的で検出可能マーカ
ーを結合している核酸配列を含む所定量の本発明の固定
分子とサンプルとをハイブリダイズ条件下で接触させ、 （ｂ）固定分子を処理して開裂可能結合を開裂し、（ｃ
）固定分子を分離回収し、 （ｄ）固定分子に存在するマーカーの量を定量的に測定
しこれにより対象核酸配列の量を定量的に測定するステ
ップを含む。
サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に測定する更に
別の方法は、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的で検出可能マーカ
ーを結合した核酸配列を含み疎水性物質Ｙと親水性物質
２とを含む構造 Ｙ（−ＨＡ、−−−Ｓ−−−ＮＡｔ÷ｙＺで示される分
子を含む水溶液とサンプルとをハイブリダイズ条件下で
接触させ、 （ｂ）得られた溶液を非極性溶媒と混合して、二相溶液
の相界面に分子が存在しＹが一方の相に配向され２が他
方の相に配向された二相溶液を形成し、（ｅ）開裂可能
結合を開裂すべく分子を処理し、（ｄ）このように処理
された分子を回収し、（ｅ）マーカーの量を定量的に測
定しこれにより対象核酸配列の量を定量的に測定するス
テップを含む。
本発明の分子はＤＮＡ又はＲＮＡのプローブとして有効
である。ハイブリダイゼーション以前にプローブ分子を
適当な固体支持体上に固定してもよい。
振議、１ｍｍ中凸−１飴シー酔　す代汁しムヱ小Ｑ−ｍ
＾ＤＮＡ配列の一方との結合によって行なわれるか又は
分子と固体支持体との単なる接着によって行なわれる。
分子に含まれた他方のＤＮＡ配列は検出可能マーカーを
含む。分子のＤＮＡ配列と対象ＤＮＡ配列とのハイブリ
ダイズ後に、分子の固定ＤＮＡ配列と検出可能マーカー
を含む分子のＤＮＡ配列との間の゛結合を分裂し、固定
しなかった材料を例えば洗浄によって完全に除去し、ハ
イブリダイズ分子の検出可能マーカーだけを検出可能マ
ーカーとして残す。検出可能マーカーを含む非ハイブリ
ダイズ配列はリンカ−又はハイブリダイゼーションによ
って固定配列に結合していないので除去される。従って
、検出可能マーカーの存在が対象配列の存在を指示する
。
ハイブリダイゼーション以前にプローブ分子を固定する
と対象ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるために
プローブ分子を高い有効濃度で使用し得る７この具体例
の有効プローブ濃度は、ハイブリダイゼーションステッ
プ以前にプローブでなく対象配列を固定する従来の方法
で得られるより乙かなり高い。この具体例の固定プロー
ブと対象配列を含有すると推定される材料とを接触させ
、プローブ分子を適当な試薬、例えば開裂可能結合かＲ
ＮＡのときはりボヌクレアーゼと適当な条件下で接触さ
せ、結合の開裂又は消化を行うか又はその他の方法でプ
ローブのＤＮＡ配列間の結合を分裂する。固定プローブ
が対象配列とハイブリダイズしていないと、ＤＮＡ配列
はりボヌクレアーゼによって開裂され、対象配列から分
離するので洗浄によって除去される。従って、洗浄後の
検出可能マーカーの存在が対象配列の存在を指示する。
本発明の分子は、ホモポリマーチイル、例えば、ポリｄ
Ａ又はポリｄＴ又は予め固定した配列に相補的な任意の
所定配列を含有し得る。対象ヌクレオチド配列に分子を
ハイブリダイズする以前又は以後にポリｄ＾テイルを使
用し、予め固定されたポリｄＴ断片に分子を（ハイブリ
ダイゼーションによって）結合してもよい。従って、分
子は溶液中で対象配列にハイブリダイズされてもよく、
非ハイブリダイズ分子を検出以前に除去するために固定
されてもよい。
本発明の別の特徴は二相濃縮系の使用にある。
かかる系は核酸構造の分配挙動を修飾するために有効で
ある。二相濃縮系では、開裂可能結合をもち一端に親水
性基をもち他端に親油性基をもつプローブ分子が構築さ
れる。これらの基はいずれも検出分子として機能でき、
また一端に付加的に検出分子を結合してもよい。望まし
い分子へのハイブリダイゼーションが生じない場合には
、二相溶液中で開裂可能配列が開裂することによって親
水性基と親油性基とが夫々の最適溶解度まで分散する。
しかし乍ら、ハイブリダイゼーションが生じると親水性
基と親油性基とが互いに橋かけされ界面に濃縮する。し
たかってこの界面を単離し、使用した特定マーカー用の
適当なビジュアライザーに露光する。
疎水性／親水性開裂可能結合プローブ系は以下のごとく
構築され得る。短い核酸プローブを親油性分子（これは
マーカー分子として機能してもよく機能しなくてもよい
）に結合する。プローブは水性条件に難溶性で非極性溶
媒に易溶性である。
水性条件下でハイブリダイゼーションを行う。次に非極
性非混和相を添加すると、ハイブリダイズしなかったプ
ローブがこの相に分配する。他方、ハイブリダイズした
プローブは親水性ＤＮＡの付加的ハイブリダイズ成分に
よって界面に濃縮する。
この構築は本発明の他の分配構築と違って開裂可能結合
を必要としない。
かかる二相濃縮系は水性容量の大きいサンプルから少量
の標的核酸を単離するのに有効である。
サンプルを二相濃縮系で処理し標的材料を二相の界面に
濃縮させる。２つの相の容量に比較すると界面の容量が
比較的小さい。系から界面を分離すると少量の界面中に
比較的高い濃度の標的核酸が存在する。
二相濃縮系はまたサンプルからｍＲＮＡを単離するため
にも有効である。ポリｄＴテイルをもつ二相プローブ分
子を使用しｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、次に本発明
の溶媒分配方法を使用してｍＲＮＡを単離する。かかる
系はポリｄＴカラムに比較して、単離時間が速い、外来
材料がカラムを閉塞するという問題がない、等の利点を
もつ。
本発明の目的はサンプル中の特異的ＤＮＡ配列又はＩ？
ＮＡ配列の検出方法を提供することである。方法は相補
的標的ＤＮＡ配列に結合しない検出可能なマーカー分子
を完全に除去しこれにより検出系のシグナル対ノイズ比
を改良すべく、少なくとも一点でプローブのＤＮＡ配列
を特異的に開裂する手段を提供する。
不均一系では開裂可能結合がＲＮＡ部分のとき本発明の
目的を達成するためにＤＮＡとＲＮＡとの不安定性の差
を利用する。本発明のＤＮＡプローブを相補的ＤＮＡｔ
ｆｆｌ的配列及び非相補的ＤＮＡ配列に夫々接触させた
ときの異なる結果を示す第１図を参照するとよい。相補
的標的ＤＮＡ配列はプローブのＤＮＡ鎖とハイブリダイ
ズし、固体支持体に結合したＤＮＡ鎖と検出可能マーカ
ーをもつＤＮＡ鎖とを開裂可能結合の分裂後にも接続し
ている。プローブが非相補的ＤＮＡと接触した場合には
、開裂可能結合が分裂するとマーカーがプローブから分
離する。かかる構成の結果、プローブが相補的標的ＤＮ
Ａ配列とハイブリダイズしたときにのみマーカーがプロ
ーブと結合状態で残存する。ハイブリダイズしなかった
プローブの開裂マーカーは系から溶出する。これにより
高いバックグラウンドノイズの原因になる未反応検出成
分が系から除去される。標的ＤＮＡ分子にハイブリダイ
ズした検出系成分だけが残存する。検出系の残りの成分
を添加するとハイブリダイズした材料だけが反応する。
これによりハイブリダイゼーション反応を進行させるた
めに極めて高いプローブ濃度を使用でき対応するバック
グラウンドノイズレベルの上昇を生じない。
開裂可能結合かＲＮＡ配列のとき結合はＤＮＡ分裂酵素
によって開裂され得る。ＲＮＡリンクの開裂のために種
々のりボヌクレアーゼを使用し得る。リボヌクレアーゼ
Ａを使用するとき、−重鎖（即ちハイブリダイズしてい
ない）ＲＮＡだけか切断され、ハイブリダイズしなかっ
たプローブ分子から検出成分が除去されるがハイブリダ
イズしたプローブ分子は元の状態で残存する。リボヌク
レアーゼＨを使用すると、ＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖ハイ
ブリッド中のＲＮＡだけが開裂される。このためハイブ
リダイズしたプローブ分子の一重鎖ＤＮＡギャップが残
存し、これを利用して検出系の別の成分と再度ハイブリ
ダイズし得る。この種の不安定性の差を利用した種々の
検出系の使用が可能である。
開裂可能結合はまた、１つ又は一連の非塩基性（ａｂａ
ｓ　ｉｃ）ヌクレオチドによって形成されてもよい。
デオキシ（＾、Ｔ、Ｇ、Ｃ）とは相違するものにし得る
いかなる修飾塩基も、ＤＮＡ配列の開裂可能点の形成用
基質として機能し得る。即ち、デオキシリボヌクレオシ
ド又はリボヌクレオシドの塩基部分をプローブの合成以
前又は以後に除去し得る。プローブ配列中の開裂可能結
合は、非塩基性前駆分子の使用によって合成されてもよ
く、又は合成後の酵素による塩基の除去によって合成さ
れてもよい。
後者の例を以下に示す。合成中にリンカ−物質としてデ
オキシウリジンを使用するときには、酵素Ｎ−ウラシル
ＤＮＡグリコシラーゼで処理してウラシル塩基をデオキ
シウリジンから除去し得る。この結果、デオキシウリジ
ンが存在するところには常に非塩基性リンクが形成され
る。このリンクは塩基性条件下で開裂するか、又は任意
の非塩基性部位で開裂し得る所ｉＡｐエンドヌクレアー
ゼ酵素のグループに属する酵素で処理して開裂され得る
。
注目すべきはプローブ配列のウリジン部分が直接合成に
よるか又はシトシン部分の化学的脱アミノ反応によって
形成され得ることである。この脱アミノ反応が亜硫酸水
素ナトリウムによる適当な処理によって行なわれること
が文献に記載されている。シトシンの脱アミノ反応後に
、得られたウリジン部分をＮ−ウラシルＩ）ＮＡグリコ
シラーゼの作用によって非塩基性リンクに変換する。次
に、塩基性条件を与えるか又はＡｐエンドヌクレアーゼ
を作用させて開裂を生起する。後者の方法は、予め存在
するＤＮＡ中に開裂可能結合を形成し得るので、合成で
ない即ち天然のＤＮＡ配列を開裂可能リンク系のプロー
ブとして使用し得る。
ＡＩ）エンドヌクレアーゼ活性に関しては、その活性の
目的生成物が末端糖部分であるように酵素を選択し得る
。これはその後の検出反応の基質を提供する。
本発明の検出系は、ルシフェラーゼの如き発光酵素系の
サブユニットたるマーカー成分を利用する系である。別
のサブユニットと適当な補因子と基質とを添加すると発
光が生じる。これを増幅して検出する。
本発明の別の検出系は、酵素がプローブに結合された「
ディツプスティックｊ系として形成される固体プローブ
マトリクスをもつ系である。プローブマトリクスを標的
１）ＮＡ溶液に所定温度で所定時間浸漬する。次にリボ
ヌクレアーゼに浸漬し、ハイブリダイズしなかったプロ
ーブからプローブ酵素を開裂する。最後に簡単に洗浄し
、マトリクスを酵素基質溶液に浸漬すると検出可能反応
（例えば呈色反応）が生じる。
上記の如き不安定性の差を利用する方法及び開裂可能リ
ンクを開裂する方法は均−系及び不均一系の双方で使用
し得る。プローブが固体支持体に固定されていない均一
系での主要な問題は、ハイブリダイズしなかった検出成
分の検出を阻止しバラ−フグラウンドノイズを許容範囲
に抑えることである。この問題は、検出可能マーカーの
反応を阻害する試薬の使用によって解決できる。ハイブ
リダイゼーションが生じた後に、その後のいかなる検出
反応においても非ハイブリダイズマーカーを立体阻害又
は遮断する結合を含む競合核酸カウンタープローブ配列
を添加し得る。検出反応に必要な第２成分の添加以前に
立体阻害剤を添加すると、非ハイブリダイズ検出マーカ
ーが阻害される。ＲＮＡ相補的配列を介して阻害剤を導
入すると、手順が逆になり阻害剤はりボヌクレアーゼの
添加によって有効に除去され得る。
カウンタープローブ自体はプローブの核酸よりもやや短
く例えば約１〜５塩基対短く構築される。
これによりカウンタープローブは標的配列よりもプロー
ブ核酸とハイブリダイズしにくく、従ってプローブ核酸
に対して標的配列と競合しない。
開裂可能リンクのテストに使用されるプローブ分子は氷
解可能結合又は永久（氷解不能結合）を使用し固体支持
媒体（シリカゲル又は調整多孔ガラス）に構築された。
この合成には公知の化学的方法を使用し得る（Ａｌｖａ
ｒａｄｏ−Ｌｌｒｂｉｎａ、Ｇ、、Ｇ、Ｍ、５ａｔｈｅ
。
Ｗ、Ｃ，Ｌｉｕ、　Ｍ、ＦＪｉｌｌａｎ、　Ｐ、Ｄ、Ｄ
ｕｃｋＳＲ，Ｂｅｎｄｅｒ、及びに、に、０ｇ１ｌｖｉ
ｅ（１９８１）、遺伝子断片の自動合成（Ａｕｔｏｍａ
ｔｅｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａ
ｇｍａｎｔｓ）、５ｃｉｅｎｃｅ２１４：２７０−２７
４；Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、Ｍ、、Ｒ，Ｃｒｅａ、　Ｍ
。
１！ａｌｅｃｈａＳＧ、Ａｌｖａｒａｄｏ−ＩＪｒｂｉ
ｎａ、　Ｒ，Ｈ，Ｃｈｉａｒｅｌｌｏ、　Ｄ。
Ｍ、Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ（１９８５）、部位特異的突然
変異のために設計されたカルモジュリン遺伝子の化学合
成及び発現（ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　
ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆａ　Ｃａｌｍｏｄ
ｕｌｉｎ　ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　ａ　
５ｉｔｅ−３ｐｅｃｉ−ｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、印刷中；ＶａｎＢｏ
ｏｍ、　Ｊ　、　ＩＩ　、及びＣ，Ｔ、Ｗｒｅｅｓｉｌ
ａｎ（１９８４）、溶液中での＋−１〜＋１＋／＋１ｆ
ｆｌＷｂ＋−ト＜Ｌ’ｒｈ／しＡシＡ、ｒ＃Ｎ’ｈｏｍ
＋ｐ＊１Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　　ｏｆ　Ｓｍａｌｆ　　
Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　　１ｎＳ
ｏｌｕｔｔｏｎ）、Ｉｎ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ−−ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ　
Ａｐｐｒｏａｃｈ、　１５３−１８３ページ、Ｍ、Ｊ、
Ｇａ１ｔ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）。標準保護デオキシ
ヌクレオシドモノマーは市販のソースから得られた。ま
た保護デオキシウリジン及びリボヌクレオシドモノマー
は公知の方法で調製された（ＴｉＳＧ、Ｓ、、Ｂ、Ｌ、
Ｇａｆｆｎｅｙ。
Ｒ，Ａｊｏｎｅｓ（１９８２）、一時的保護：保護ヌク
レオシドの有効な−フラスコ合成（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ
　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｏｎｅ
　Ｆ１ａ５ｋ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｃ
ｔｅｄＮｕｃ　１ｅｏｓ　１ｄｅｓ）、Ｊ、ＡＭ、Ｃｈ
ｅｍ、Ｓｏｃ、１０４：１３１６）。合成には、ＢＩＯ
ＬＯＧＩＣＡＬＳ自動シンセサイザーを使用し、各ＤＮ
Ａの縮合のサイクル時間１０分及び各ＲＮＡの縮合のサ
イクル時間約１２分を用いた。
以下の構築プローブを使用し種々のテストを実施した。
開裂可能リンクプローブ Ｔ’、Ｌ、一固体支持体に対する永久結合＋ｔ　、　Ｌ
　、一固体支持体に対する加水分解可能結合１　、ＭＲ
ＣＯ４６： ５’　ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）ｒ（ＵＵＵＵＵＵ）
ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）３’　−Ｐ、Ｌ。
２　、ＭＲＣＯ５９： ５’　ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）ｒ（ＵＵＵＵ）ｄ（
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）３°−Ｈ，Ｌ。
３　、ＭＲＣＯ６０： ５’　ｄ　（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）　ｒ　（ＵＵ
ＵＵ）ｄ　（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）　３°−Ｈ，Ｌ。
４　、ＭＲＣＯ６４： ５’　ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）ｄ（ＵＵＵＵＵ
ＵＵＵ）ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）３’　−Ｈ，Ｌ。
５　、ＭＲＣＯ６８＋ ５’　ｃｔ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）ｒ（ＵＵ
［ＩＵＵＵｔｌ［１）ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）３’
　　−Ｈ，Ｌ。
６　、ＭＲＣＯ６９： ５°ｄ（ＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧ）ｒ（ＧＧＵＵＵυ
）ｄ（ｃＣＣＡＧＴＣＡＣ）３’　−）！、Ｌ。
７　：ＭＲＣＯ７０： ５°ｄ（ＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧ）ｒ（ＧＧＩＩＩ］
ＵＵ）ｄ（ｃＣＣＡＧＴＣＡＣ）３′−Ｐ、Ｌ。
８　、ＭＲＣＯ７１： ５°ｄ　（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　）　ｒ　
（ＵＵ）　ｄ　（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）　３’　−Ｉ
Ｉ　、　Ｌ　。
カウンタープローブ ９　、ＭＲＣＯ４３： ５°ｄ（ＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡ）３°
−Ｈ，Ｌ。
１０、ＭＲＣＯ４５： ５’　ｄ（ＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡ）
３’　−Ｐ、Ｌ。
１１、ＭＲＣＯ５８： ５’　ｄ（ＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴ
）３’　−Ｐ、Ｌ。
１２、ＭＲＣＯ６２： ５°ｄ（ｃＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣ
ＴＴＴＴＴＴＴ）３’　−）！、Ｌ。
１３、　ＭＢＣ（１６３： ５°ｄ（ｃＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣ
ＴＴＴＴＴＴＴ）３’　−Ｐ、Ｌ。
１４、ＭＲＣＯ６７：　　　　　’ ５°ｄ（ｃＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）−３°−Ｐ、Ｌ。
１５、ＭＲｃＤ７２： ５°ｄ（ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）−３°−Ｐ、Ｌ。
１Ｂ、ＭＲｃＯ７３： ５°ｄ　（ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ
ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）−３°−１１，Ｌ。
実施例１ 開裂可能リンクプローブの構築 プローブ分子１〜３及び５〜８は膵臓リボヌクレアーゼ
の如き多数のりボヌクレアーゼ及び塩基性条件（例えば
０．５Ｍ　Ｎａ０Ｉｌ）によってリボヌクレオチドで開
裂可能であることが判明した。リボヌクレアーゼによる
開裂の最も一般的な方法及びその他の常用手順に関して
はＭａｎｊａｔｉｓ等を参照するとよい（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、　Ｔ、、Ｅ、Ｆ、Ｐｒ１ｔｓｃｈ及びＪ　、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋｌ（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｊｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ。
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）。プローブ４をＮ−ウラシルグリコシラー
ゼで処理し、ウリジン部分からウラシル塩基を除去して
非塩基性結合を残した。続いて、ＡＩ）エンドヌクレア
ーゼ又は弱塩基によって処理し、該結合を開裂した。判
りおいように実験中に検出分子をＰ３″標識した。ｐ３
ｔはポリヌクレオチドキナーゼでプローブの５゛端に結
合し開裂可能リンクプローブ（例えばＭＲＣＯ６ｇ）を
、合成に用いた固体支持体上に結合したままでｐ３ｔを
キナーゼで結合した。膵臓リボヌクレアーゼで開裂後、
固体支持体をＭｉｃｒｏｆｕｇｅで数秒間遠心し、上清
を乾燥し、少量に再度懸濁させて２０％ポリアクリルア
ミドゲルで検査した。残りの固体支持体には放射能がほ
とんど又は全く結合していないことが判明した。全ての
放射能カウントがリボヌクレアーゼによって水解され除
去されていた。これらカウントを電気泳動で検査すると
、これらカウントがＲＮＡリンクに対して遠位５゛の１
４塩基断片に存在することが判明した。ときには１つ又
は２つのりボヌクレオチドが結合状態で維持されていた
。
残りの配列を濃水酸化アンモニウムで固体支持体から加
水分解しキナーゼでＰ！ｆｆｉと結合すると、３゜遠位
ｌＯ塩基ＤＮＡに対応することが判明した。これにも１
つ又は２つのりボヌクレオチドが結合していてもよい。
他方、５°標識開裂可能リンクプローブを膵臓リボヌク
レアーゼで処理する以前に（未知物質として）過剰のオ
リゴｄＡにハイブリダイズすると、プローブが結合して
いる固体支持体から放射性ラベルはほとんど又は全く遊
離しなかった。リボヌクレアーゼ１１を使用しＲＮＡリ
ンクが開裂したと推定されるときにも同様であった。オ
リゴｄＡ断片は３゛のｌＯ塩基ＤＮＡと５°の１４塩基
ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションブリッジとして
作用し、５゛のＰ３！ラベル１４塩基配列が上清に遊離
することを阻止する。
このようにして非ハイブリダイズプローブ材料をハイブ
リダイズプローブ材料から識別し得る。別の実験では、
−重鎖ＤＮＡファーシト１３の領域に相同のＭＲＣＯ７
０の５’−Ｐ３！ラベルプローブを用い、同様の結果を
得た。これらの場合には、ト１３を未知物質として使用
しＭＲＣＯ７０にハイブリダイズした。リボヌクレアー
ゼで処理後、非ハイブリダイズプローブを洗浄によって
固体支持体から除去した。固体支持体に結合した残留放
射能カウントはＭＲＣＯ７０プローブにハイブリダイズ
したト１３の量を反映する。
カウンタープローブ９〜１６を使用した実験で適当なハ
イブリダイゼーション条件を測定した。配列９〜１４は
一重鎖ＤＮＡファーシト１３の短い領域と同じ配列をも
つ。配列１５〜１６はこのト１３領域に相補的である。
最初の実験では、ト１３からの短い合成配列をＰａｌで
標識した（５”Ｐ”　’　−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣ
ＡＣＧＡＣＧＴＴＧ）。この配列に相補的で固体支持体
に結合しているカウンタープローブを使用し溶液から標
識配列を除去した。種々のハイブリダイゼーション条件
を試験し、条件の許容範囲がかなり広いことを知見した
。カウンタープローブとプローブとの結合効率にかなり
影響を与える要因は、固体支持体と相補的配列の３°端
との間の非特異的アームの長さであることが判明した。
一般に、１２−Ｔアームは約４０００Ｘの過剰で３０分
以内に溶液からほぼ全部の標識プローブを分離する。固
体支持体と相補的配列との間にＴアームが存在しないと
標識プローブの約６０％しか溶液から除去されない。競
合試験に関する重要な点はプローブに相補的なカウンタ
ープローブ配列をプローブよりも１〜５塩基短くする必
要がある。カウンタープローブが標的配列と同じ配列な
ので、カウンタープローブが標的配列からプローブを奪
取しないように標的配列とカウンタープローブとの間の
競合を最小にすることが重要である。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の核酸プローブと、このプローブを相補
的標的ＤＮＡ配列（図の左側）及び非相補的非標的ＤＮ
Ａ配列（図の右側）の夫々に接触させることによって得
られた夫々の結果とを示す。 Ｆｉｑｕｒｅ　１ ■■■■■■■■■　：　　ＤＮＡ　ＴＡＲＧＥＴ　Ｓ
ＥロＵＥＮＣＥロ＝：＝＝＝＝＝コ　：　　ＤＮＡ　Ｐ
ＲＯＥＩＥ　ＳＥロＵＥＮＣＥロ＝＝＝＝コ　：　ＤＮ
Ａ　Ｎ０Ｎ−ＴＡＲＧＥＴ　５ＥＯＵＥＮＣＥ＋　：　
５ＣＩＳＳＩＬＥＬＩＮＫ Ｃｅ、ｑ、　　ＲＮＡ）

Claims (62)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）構造 〔ＮＡ＿１−−−Ｓ−−−ＮＡ＿２〕＿ｎ 〔式中、ＮＡ＿１及びＮＡ＿２は非相補的核酸配列、−
    −−Ｓ−−−は開裂可能結合、ｎは１〜１，０００の整
    数〕をもつ天然産生でない合成分子。
  2. （２）点線が化学結合を示すことを特徴とする特許請求
    の範囲第１項に記載の分子。
  3. （３）化学結合が共有結合であることを特徴とする特許
    請求の範囲第２項に記載の分子。
  4. （４）化学結合が水素結合であることを特徴とする特許
    請求の範囲第２項に記載の分子。
  5. （５）開裂可能結合がＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、アミノ
    酸配列、非塩基性核酸配列又は炭水化物ポリマーから成
    るグループから選択されることを特徴とする特許請求の
    範囲第１項に記載の分子。
  6. （６）開裂可能結合が核酸配列であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項に記載の分子。
  7. （７）核酸配列がＮＡ＿１及びＮＡ＿２とは異なる配列
    であることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の
    分子。
  8. （８）固体支持体上に固定されていることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項に記載の分子。
  9. （９）ＮＡ＿１及びＮＡ＿２がＤＮＡ配列であることを
    特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の分子。
  10. （１０）ＮＡ＿１及びＮＡ＿２がＲＮＡ配列であること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の分子。
  11. （１１）ＮＡ＿１がＲＮＡ又はＤＮＡ配列であり、ＮＡ
    ＿２がＲＮＡ又はＤＮＡ配列であることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項に記載の分子。
  12. （１２）ＮＡ＿１又はＮＡ＿２が天然産生核酸配列でな
    いことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の分子
    。
  13. （１３）ＮＡ＿１又はＮＡ＿２が天然産生核酸配列であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の分子
    。
  14. （１４）マーカーがＮＡ＿１又はＮＡ＿２のいずれかに
    結合されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項
    に記載の分子。
  15. （１５）固体支持体上に固定されていることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１４項に記載の分子。
  16. （１６）マーカーが放射性同位体、放射性ラベル分子、
    蛍光分子、ビオチン、酵素又は配位子であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１４項に記載の分子。
  17. （１７）ＮＡ＿１及びＮＡ＿２の各々が８〜１０，００
    ０個のヌクレオチドを含むことを特徴とする特許請求の
    範囲第１項に記載の分子。
  18. （１８）ｎが１より大きく、〔ＮＡ＿１−−−Ｓ−−−
    ＮＡ＿２〕ユニットの各々が同じであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項に記載の分子。
  19. （１９）ｎが１より大きく、〔ＮＡ＿１−−−Ｓ−−−
    ＮＡ＿２〕ユニットの各々が異なることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項に記載の分子。
  20. （２０）構造 〔ＮＡ＿１−−−Ｓ−−−ＮＡ＿２〕＿ｎ 〔式中、ＮＡ＿１及びＮＡ＿２は核酸配列、−−−Ｓ−
    −−は開裂可能結合、ｎは２〜１，０００の整数〕をも
    つ天然産生でない合成分子。
  21. （２１）マーカーがＮＡ＿１又はＮＡ＿２のいずれかに
    結合されていることを特徴とする特許請求の範囲第２０
    項に記載の分子。
  22. （２２）固体支持体上に固定されていることを特徴とす
    る特許請求の範囲第２０項に記載の分子。
  23. （２３）構造 Ｘ−Ｌ−〔ＮＡ＿１−−−Ｓ−−−ＮＡ＿２〕−＿ｎＭ
    〔式中、ＮＡ＿１及びＮＡ＿２は核酸配列、−−−Ｓ−
    −−は開裂可能結合、ｎは１〜１，０００の整数、実線
    は化学結合、Ｘは固体支持体、ＬはＮＡ＿１を固体支持
    体に結合する化学物質及びＭはマーカー〕をもつ分子。
  24. （２４）Ｘが石英質、セルロースもしくはプラスチック
    材料又は調整多孔ガラスであることを特徴とする特許請
    求の範囲第２３項に記載の分子。
  25. （２５）化学結合が共有結合であることを特徴とする特
    許請求の範囲第２３項に記載の分子。
  26. （２６）化学結合が水素結合又は共有結合であることを
    特徴とする特許請求の範囲第２３項に記載の分子。
  27. （２７）ＭがＮＡ＿２内部の記載に相補的なマーカー核
    酸配列を含むことを特徴とする特許請求の範囲第２３項
    に記載の分子。
  28. （２８）Ｍが放射性同位体、放射性ラベル分子、蛍光分
    子又は配位子であることを特徴とする特許請求の範囲第
    ２３項に記載の分子。
  29. （２９）点線が化学結合を示すことを特徴とする特許請
    求の範囲第２３項に記載の分子。
  30. （３０）化学結合が共有結合であることを特徴とする特
    許請求の範囲第２９項に記載の分子。
  31. （３１）化学結合が水素結合であることを特徴とする特
    許請求の範囲第２９項に記載の分子。
  32. （３２）開裂可能結合がＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、アミ
    ノ酸配列、非塩基性ヌクレオチド配列又は炭水化物ポリ
    マーから成るグループから選択されることを特徴とする
    特許請求の範囲第２３項に記載の分子。
  33. （３３）ＮＡ＿１及びＮＡ＿２の各々が８〜１０，００
    ０個のヌクレオチドを含むことを特徴とする特許請求の
    範囲第２３項に記載の分子。
  34. （３４）ｎが１より大きく、〔ＮＡ＿１−−−Ｓ−−−
    ＮＡ＿２〕ユニットの各々が同じであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第２３項に記載の分子。
  35. （３５）ｎが１より大きく、〔ＮＡ＿１−−−Ｓ−−−
    ＮＡ＿２〕ユニットの各々が異なることを特徴とする特
    許請求の範囲第２３項に記載の分子。
  36. （３６）ＬがＮＡ＿１の配列に実質的に相補的な配列を
    もつ核酸を含み、Ｌが固体支持体に化学結合され、Ｌが
    相補的核酸配列間の水素結合を介してＮＡ＿１を固体支
    持体に結合していることを特徴とする特許請求の範囲第
    ３３項に記載の分子。
  37. （３７）構造 Ｙ−〔ＮＡ＿１−−−Ｓ−−−ＮＡ＿２〕−＿ｎＺ〔式
    中、ＮＡ＿１及びＮＡ＿２は核酸配列、−−−Ｓ−−−
    は開裂可能結合、実線は化学結合、ｎは１〜１，０００
    の整数、Ｙは存在しないか又は特有の同定特性を与える
    化学物質、Ｚは存在しないか又は異なる特有の同定特性
    を与える化学物質〕をもつ分子。
  38. （３８）化学結合が共有結合であることを特徴とする特
    許請求の範囲第３７項に記載の分子。
  39. （３９）化学結合が水素結合であることを特徴とする特
    許請求の範囲第３７項に記載の分子。
  40. （４０）Ｙの同定特性が疎水性でＺの同定特性が親水性
    であるか又はＹの同定特性が親水性でＺの同定特性が疎
    水性であることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に
    記載の分子。
  41. （４１）Ｙ又はＺの一方が存在せず他方が疎水性である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の分子
    。
  42. （４２）点線が化学結合を示すことを特徴とする特許請
    求の範囲第３７項に記載の分子。
  43. （４３）化学結合が共有結合であることを特徴とする特
    許請求の範囲第４２項に記載の分子。
  44. （４４）化学結合が水素結合であることを特徴とする特
    許請求の範囲第４２項に記載の分子。
  45. （４５）開裂可能結合がＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、アミ
    ノ酸配列、非塩基性ヌクレオチド配列又は炭水化物ポリ
    マーから成るグループから選択されることを特徴とする
    特許請求の範囲第３７項に記載の分子。
  46. （４６）Ｙ又はＺの一方がマーカーであり他方が疎水性
    であることを特徴とする、特許請求の範囲第３７項に記
    載の分子。
  47. （４７）マーカーがＮＡ＿１又はＮＡ＿２の一方に結合
    されていることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に
    記載の分子。
  48. （４８）ＮＡ＿１及びＮＡ＿２がＤＮＡ配列であること
    を特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の分子。
  49. （４９）ＮＡ＿１及びＮＡ＿２がＲＮＡ配列であること
    を特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の分子。
  50. （５０）ＮＡ＿１がＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列であり、
    ＮＡ＿２がＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列であることを特徴
    とする特許請求の範囲第３７項に記載の分子。
  51. （５１）ＮＡ＿１及びＮＡ＿２が天然産生核酸配列でな
    いことを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の分
    子。
  52. （５２）ＮＡ＿１又はＮＡ＿２が天然産生核酸配列であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の分
    子。
  53. （５３）固体支持体と該支持体上に固定された特許請求
    の範囲第１項の分子とを含むことを特徴とする組成物。
  54. （５４）サンプル中の対象核酸配列の存在を検出するた
    めに、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を含む
    特許請求の範囲第１４項の分子とサンプルとをハイブリ
    ダイズ条件下で接触させ、 （ｂ）得られた分子を固体支持体上に固定し、（ｃ）開
    裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、（ｄ）固定
    分子を分離回収し、 （ｅ）固定分子におけるマーカーの存在を検出しこれに
    より対象核酸配列の存在を検出することを特徴とする方
    法。
  55. （５５）サンプル中の対象核酸配列の存在を検出するた
    めに、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を含む
    特許請求の範囲第２３項の分子とサンプルとをハイブリ
    ダイズ条件下で接触させ、 （ｂ）開裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、（
    ｃ）固定分子を分離回収し、 （ｄ）固定分子におけるマーカーの存在を検出しこれに
    より対象核酸配列の存在を検出することを特徴とする方
    法。
  56. （５６）サンプル中の対象核酸配列を検出するために、 （ａ）対象核酸配列に相補的な核酸配列を含み疎水性物
    質Ｙと親水性物質Ｚとを含む特許請求の範囲第４７項の
    分子を含む水溶液とサンプルとをハイブリダイズ条件下
    で接触させ、 （ｂ）得られた溶液を非極性溶媒と混合して、二相溶液
    の相界面に分子が存在しＹが一方の相に配向されＺが他
    方の相に配向された二相溶液を形成し、（ｃ）開裂可能
    結合を開裂すべく分子を処理し、（ｄ）このように処理
    された分子を回収し、（ｅ）マーカーの存在を検出しこ
    れにより対象核酸配列を検出することを特徴とする方法
    。
  57. （５７）サンプル中の対象核酸配列を検出するために、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を含む
    特許請求の範囲第１４項の分子とサンプルとをハイブリ
    ダイズ条件下で接触させてハイブリダイズ生成物を形成
    し、 （ｂ）特許請求の範囲第１４項の分子の配列に相補的で
    あるが塩基の数が約１〜１０個少なく該分子にハイブリ
    ダイズしたときに該分子を検出不能にする核酸配列とス
    テップ（ａ）の生成物とをハイブリダイズ条件下で接触
    させて、該分子に相補的な核酸配列を非ハイブリダイズ
    分子とハイブリダイズさせ、 （ｃ）マーカーの存在を検出しこれによりハイブリダイ
    ズ生成物の存在、従って対象核酸配列の存在を検出する
    ことを特徴とする方法。
  58. （５８）サンプル中の外来病原体の存在を検出するため
    に特許請求の範囲第５４項から第５７項のいずれかに記
    載の方法を使用して病原体に特有の核酸配列を検出する
    診断方法。
  59. （５９）サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に測定
    するために、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を含む
    特許請求の範囲第１４項の所定量の分子とサンプルとを
    ハイブリダイズ条件下で接触させ、（ｂ）得られた分子
    を固体支持体上に固定し、（ｃ）固定分子を処理して開
    裂可能結合を開裂し、（ｄ）固定分子を分離回収し、 （ｅ）固定分子に存在するマーカーの量を定量的に測定
    しこれにより対象核酸配列の量を定量的に測定すること
    を特徴とする方法。
  60. （６０）サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に測定
    するために、 （ａ）対象核酸配列に実質的に相補的な核酸配列を含む
    特許請求の範囲第２３項の所定量の分子とサンプルとを
    ハイブリダイズ条件下で接触させ、（ｂ）固定分子を処
    理して開裂可能結合を開裂し、（ｃ）固定分子を分離回
    収し、 （ｄ）固定分子に存在するマーカーの量を定量的に測定
    しこれにより対象核酸配列の量を定量的に測定すること
    を特徴とする方法。
  61. （６１）サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に測定
    するために、 （ａ）対象核酸配列に相補的な核酸配列を含み疎水性物
    質Ｙと親水性物質Ｚとを含む特許請求の範囲第４７項の
    分子を含む水溶液とサンプルとをハイブリダイズ条件下
    で接触させ、 （ｂ）得られた溶液を非極性溶媒と混合して、二相溶液
    の相界面に分子が存在しＹが一方の相に配向されＺが他
    方の相に配向された二相溶液を形成し、（ｃ）開裂可能
    結合を開裂すべく分子を処理し、（ｄ）このように処理
    された分子を回収し、（ｅ）マーカーの量を定量的に測
    定しこれにより対象核酸配列の量を定量的に測定するこ
    とを特徴とする方法。
  62. （６２）サンプル中の外来病原体の量を測定するために
    特許請求の範囲第５９項から第６１項のいずれかに記載
    の方法を使用して病原体の核酸を検出する診断方法。
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