JPS6219088A - 新規ベクタ−プラスミド - Google Patents
新規ベクタ−プラスミドInfo
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- JPS6219088A JPS6219088A JP61168975A JP16897586A JPS6219088A JP S6219088 A JPS6219088 A JP S6219088A JP 61168975 A JP61168975 A JP 61168975A JP 16897586 A JP16897586 A JP 16897586A JP S6219088 A JPS6219088 A JP S6219088A
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- dna
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- vector plasmid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、組み換えＤＮＡ技術に用いる新規ベクープラ
スミド、及びこのプラスミドの構築法と使用、イしてこ
れが取込まれる微生物（特に大腸菌）に関する。
スミド、及びこのプラスミドの構築法と使用、イしてこ
れが取込まれる微生物（特に大腸菌）に関する。
最近数年間に多くの組み換えＤＮＡ分子が作成され、そ
の中にはユニークな生物学的機能が一緒になってＤＮＡ
クローニングやＤＮＡ操作の重要な手段となっているも
のもいくつかある（Ｏｌｄ ＆Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、 １
９８２年）。これらのベクターは、挿入不活性化により
表現型を変化させることができる遺伝的決定因子が存在
することが特徴である。
の中にはユニークな生物学的機能が一緒になってＤＮＡ
クローニングやＤＮＡ操作の重要な手段となっているも
のもいくつかある（Ｏｌｄ ＆Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、 １
９８２年）。これらのベクターは、挿入不活性化により
表現型を変化させることができる遺伝的決定因子が存在
することが特徴である。
さらにこれらのベクターは複数の制限酵素の単一切断部
位を有し、多くの制限断片を直接クローニングできる。
位を有し、多くの制限断片を直接クローニングできる。
最近、レプリカ平板法を用いることなく組み換えクロー
ンの直接的同定を可能にするクローニングベークルが作
成された。これらのベクターのうち最も多機能のものは
、適当な宿主株のｌ ａｃ７突然変異の相補性を利用す
る繊維状ファージベクターとｐｔＪｃプラスミドである
（Ｖｉｅｉｒａ ＆Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９８２年； （
Ｈｅｓｓｉｎｏ 、１９８３年）。（１ｌｅｎｔｅら、
１９８３年）は、１）ＬＪＣプラスミドとＭ１３１Ｉｌ
ｐファージの性質が組合わさった一連のクローニングベ
クターの構築を報告している。Ｆｆファージｆ１の機能
性複製開始点と形態形成シグナルを含む断片をｐＵＣプ
ラスミドにクローニングして、新規プラスミドベクター
（ｐＥＭＢＩ−プラスミド）が得られた。ヘルパーファ
ージの存在しないところではこれらのプラスミドの複製
はＧＯＩ Ｆｌ複製開始点に依存する。
ンの直接的同定を可能にするクローニングベークルが作
成された。これらのベクターのうち最も多機能のものは
、適当な宿主株のｌ ａｃ７突然変異の相補性を利用す
る繊維状ファージベクターとｐｔＪｃプラスミドである
（Ｖｉｅｉｒａ ＆Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９８２年； （
Ｈｅｓｓｉｎｏ 、１９８３年）。（１ｌｅｎｔｅら、
１９８３年）は、１）ＬＪＣプラスミドとＭ１３１Ｉｌ
ｐファージの性質が組合わさった一連のクローニングベ
クターの構築を報告している。Ｆｆファージｆ１の機能
性複製開始点と形態形成シグナルを含む断片をｐＵＣプ
ラスミドにクローニングして、新規プラスミドベクター
（ｐＥＭＢＩ−プラスミド）が得られた。ヘルパーファ
ージの存在しないところではこれらのプラスミドの複製
はＧＯＩ Ｆｌ複製開始点に依存する。
このプラスミドを有する細胞をファージＩＲ１（ｆｌの
誘導体）で感染させると、プラスミドはＦｆ型の複製を
開始し、１つの鎖（Ｆ鎖）がファージ様粒子中に選択的
にパッケージされる。
誘導体）で感染させると、プラスミドはＦｆ型の複製を
開始し、１つの鎖（Ｆ鎖）がファージ様粒子中に選択的
にパッケージされる。
Ｍ１３ｍｐファージと１） Ｅ Ｍ Ｂ Ｌプラスミド
は、大量の１本鎖ＤＮＡ （これは例えばＦ）ＮＡ配列
解析に利用できる）の調製に特に適１ノでいるが、１つ
大きな欠点を有する。このベクターを用いた場合ｒ’）
ＮＡ鎖の１つのみ（すなわちウィル、ス鎖複製開始点が
存在する鎖）がパッケージされる。普通ＤＮＡ断片の両
鏡のヌクレオチド配列を求める必要があるため、目的の
断片は同じベクター内で２つの配向でクローン化しなけ
ればならない。比較的釜石のＤＮＡ分子の配列は、ラン
ダムに作成した断片のショットガンクローニング法で求
められることが多い（５ａｎｏｅｒら、１９８０年）；
（Ｈｅｓｓｉｎｏら、１９８１年） ； （ｐｅｅｔｅ
ｒｓら、１９８５年）。この場合両鏡の配列決定には、
配向が逆になった重複断片を含むりＯ−ンのＤＮＡライ
ブラリーが存在する必要がある。もしこの条件が満たさ
れない場合、特定の組み換えプラスミドから目的の断片
を回収して反対の方向に再クローニングする必要がある
。あるいは２本鎖ＤＮＡを用いて直接又はエキソヌクレ
アーぜ■で処理後、配列解析によりヌクレオチド配列を
決めなければならなイ（ＷａＮａｃｅら、１９８１年）
； （Ｇｕｏ ＆旧１．１９８２年）。このいずれの
方法も細胞内プラスミドＤＮＡの単離と精製が必要であ
り、これは特に大量のクローンが関与する場合特に時間
がかかる。さらに２本鎖ＤＮＡを用いて行う配列前析は
、１本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて行う方法に比べ結果が劣る
（ｒｌｅｉｎｉｎｇｅｒ 、１９８３年）。
は、大量の１本鎖ＤＮＡ （これは例えばＦ）ＮＡ配列
解析に利用できる）の調製に特に適１ノでいるが、１つ
大きな欠点を有する。このベクターを用いた場合ｒ’）
ＮＡ鎖の１つのみ（すなわちウィル、ス鎖複製開始点が
存在する鎖）がパッケージされる。普通ＤＮＡ断片の両
鏡のヌクレオチド配列を求める必要があるため、目的の
断片は同じベクター内で２つの配向でクローン化しなけ
ればならない。比較的釜石のＤＮＡ分子の配列は、ラン
ダムに作成した断片のショットガンクローニング法で求
められることが多い（５ａｎｏｅｒら、１９８０年）；
（Ｈｅｓｓｉｎｏら、１９８１年） ； （ｐｅｅｔｅ
ｒｓら、１９８５年）。この場合両鏡の配列決定には、
配向が逆になった重複断片を含むりＯ−ンのＤＮＡライ
ブラリーが存在する必要がある。もしこの条件が満たさ
れない場合、特定の組み換えプラスミドから目的の断片
を回収して反対の方向に再クローニングする必要がある
。あるいは２本鎖ＤＮＡを用いて直接又はエキソヌクレ
アーぜ■で処理後、配列解析によりヌクレオチド配列を
決めなければならなイ（ＷａＮａｃｅら、１９８１年）
； （Ｇｕｏ ＆旧１．１９８２年）。このいずれの
方法も細胞内プラスミドＤＮＡの単離と精製が必要であ
り、これは特に大量のクローンが関与する場合特に時間
がかかる。さらに２本鎖ＤＮＡを用いて行う配列前析は
、１本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて行う方法に比べ結果が劣る
（ｒｌｅｉｎｉｎｇｅｒ 、１９８３年）。
本発明は以下の点でこれらの欠点を克服した新規ベクタ
ープラスミドを与える：すなわちこのベクタープラスミ
ドは、 ａ）Ｆ１毛を有する大腸菌のｍ絹状バクテリオファージ
の複製開始点＋形態形成シグナル、又はそれらの活性突
然変異体；及び ｂ） Ｎ１１ｉ毛を有する大腸菌のｌ１ｆｆ状バクテ
リオフアージの複製開始点＋形態形成シグナル、又はそ
れらの活性突然変異体を、互いに反対の配向で組み込ん
でいる出発ベクターから作成される。
ープラスミドを与える：すなわちこのベクタープラスミ
ドは、 ａ）Ｆ１毛を有する大腸菌のｍ絹状バクテリオファージ
の複製開始点＋形態形成シグナル、又はそれらの活性突
然変異体；及び ｂ） Ｎ１１ｉ毛を有する大腸菌のｌ１ｆｆ状バクテ
リオフアージの複製開始点＋形態形成シグナル、又はそ
れらの活性突然変異体を、互いに反対の配向で組み込ん
でいる出発ベクターから作成される。
さらに詳しくは、本発明は、
ａ）繊維状バクテリオファージＦｆ（Ｍ１３、ｆｄ及び
ｆ１）又はその突然変位体の複製開始点＋形態形成シグ
ナル、又はそれらの活性突然変異体；及び ｂ）繊繍状バクテリオファージＩＫｅ又はその突然変異
体の複製開始点＋形態形成シグナル、又はその活性突然
変異体を含有するベクタープラスミドに関する。
ｆ１）又はその突然変位体の複製開始点＋形態形成シグ
ナル、又はそれらの活性突然変異体；及び ｂ）繊繍状バクテリオファージＩＫｅ又はその突然変異
体の複製開始点＋形態形成シグナル、又はその活性突然
変異体を含有するベクタープラスミドに関する。
好ましくは新規ベクタープラスミドは、ｐＵＣプラスミ
ド（ざらに好ましくはｐ ＬＪ Ｃ９）を出発ベクター
とする。
ド（ざらに好ましくはｐ ＬＪ Ｃ９）を出発ベクター
とする。
このような新規のベクタープラスミドの１つの態様はｐ
ｔＪ Ｃ９に基づいており、ここでは（２）は制限酵
素ＮａｒＩの甲−の認識配列に挿入され、０は制限酵素
ＮｄｅＩの単一の認識配列に挿入されているか、又はこ
の逆になっている。
ｔＪ Ｃ９に基づいており、ここでは（２）は制限酵
素ＮａｒＩの甲−の認識配列に挿入され、０は制限酵素
ＮｄｅＩの単一の認識配列に挿入されているか、又はこ
の逆になっている。
本明細書ではその様なプラスミドの例、すなわち第１図
に示す構造を有ＪるプラスミドｐＫＬＩＮ９を与える。
に示す構造を有ＪるプラスミドｐＫＬＩＮ９を与える。
もう１つの例は、第２図に示す構造を有するＩ’）ＫＵ
Ｎ９由来プラスミドｐＫＵＮ１９である。
Ｎ９由来プラスミドｐＫＵＮ１９である。
本発明は又、１つの２本鎖ＤＮＡが適当な位置に挿入さ
れた上記のベクタープラスミドを包含する。
れた上記のベクタープラスミドを包含する。
本発明は又、本発明のベクタープラスミドを含有する微
生物、特に大腸菌に関する。このベクターは、Ｆｔｒａ
及び／又はＮｔｒａ３ｍ１仏子が存在するために、Ｆ−
特異的及び／又はＮ−特異的繊維状バクテリオファージ
の感染に対し感受性のある大引りすなわちＦ繊毛及び／
又はＮ繊毛を有する大腸菌に導入されることが好ましい
。
生物、特に大腸菌に関する。このベクターは、Ｆｔｒａ
及び／又はＮｔｒａ３ｍ１仏子が存在するために、Ｆ−
特異的及び／又はＮ−特異的繊維状バクテリオファージ
の感染に対し感受性のある大引りすなわちＦ繊毛及び／
又はＮ繊毛を有する大腸菌に導入されることが好ましい
。
本発明はさらに、本発明の新規プラスミドの使用と、本
発明の新規ベクタープラスミドの構築法に関する。
発明の新規ベクタープラスミドの構築法に関する。
従って本発明は、Ｆ−特異的繊維状バクテリオファージ
による感染に対して感受性がある本発明のベクタープラ
スミドを含有する大腸菌を、Ｆ−特異的繊維状バクテリ
オファージで感染させインキュベートした後、ファージ
様形質導入粒子を単離するか、及び／又はＮ−特異的繊
維状バクテリオファージによる感染に対して感受性があ
る本発明のベクタープラスミドを含有する大腸菌を、Ｎ
−特異的繊維状バクテリオファージで感染させインキュ
ベートした後、ファージ様形質導入粒子をｌ１１１１１
１するか、又はＦ−特異的かつＮ−特異的繊維状バクテ
リオファージに対して感受性がある本発明のベクタープ
ラスミドを含有する大腸菌集団の一部をＦ−特異的繊維
状バクテリオファージで感染させ、この集団の別の一部
をＮ−特異的１維状バクテリオフアージで感染さＶイン
キュベートした後、生成したファージ様形質導入粒子を
単離することより成る、１つの２本鎖ＤＮＡの鎖の１本
又は２本を、ファージ様粒子を含有する１本鎖ＤＮＡに
選択的にパッケージする方法を与える。
による感染に対して感受性がある本発明のベクタープラ
スミドを含有する大腸菌を、Ｆ−特異的繊維状バクテリ
オファージで感染させインキュベートした後、ファージ
様形質導入粒子を単離するか、及び／又はＮ−特異的繊
維状バクテリオファージによる感染に対して感受性があ
る本発明のベクタープラスミドを含有する大腸菌を、Ｎ
−特異的繊維状バクテリオファージで感染させインキュ
ベートした後、ファージ様形質導入粒子をｌ１１１１１
１するか、又はＦ−特異的かつＮ−特異的繊維状バクテ
リオファージに対して感受性がある本発明のベクタープ
ラスミドを含有する大腸菌集団の一部をＦ−特異的繊維
状バクテリオファージで感染させ、この集団の別の一部
をＮ−特異的１維状バクテリオフアージで感染さＶイン
キュベートした後、生成したファージ様形質導入粒子を
単離することより成る、１つの２本鎖ＤＮＡの鎖の１本
又は２本を、ファージ様粒子を含有する１本鎖ＤＮＡに
選択的にパッケージする方法を与える。
本発明は、こうして得られたＤＮＡの合鏡の配列決定方
法と、さらに一般的にはＤＮＡ又はメツセンジャーＲＮ
Ａのクローニング、ＤＮＡ配列決定、部位特巽的突然変
異誘発、Ｓ１マツピング、クローン化Ｄ Ｎ Ａの発現
、及び１重鎖ハイブリダイゼーションブ日−ブのＩ！ｆ
Ｊのために２本鎖ＤＮＡが挿入された、本発明のベクタ
ープラスミドの使用に関する。
法と、さらに一般的にはＤＮＡ又はメツセンジャーＲＮ
Ａのクローニング、ＤＮＡ配列決定、部位特巽的突然変
異誘発、Ｓ１マツピング、クローン化Ｄ Ｎ Ａの発現
、及び１重鎖ハイブリダイゼーションブ日−ブのＩ！ｆ
Ｊのために２本鎖ＤＮＡが挿入された、本発明のベクタ
ープラスミドの使用に関する。
広くいうと、本発明のプラスミドは、親ベクターの制限
酵素認識配列で（ａ）又は（ｂ）をクローン化し、形質
転換体を選択し、親ベクターの別の制限酵素認識配列で
０又は（ａ）をクローン化し、形質転換体を選択するこ
とにより構築される。
酵素認識配列で（ａ）又は（ｂ）をクローン化し、形質
転換体を選択し、親ベクターの別の制限酵素認識配列で
０又は（ａ）をクローン化し、形質転換体を選択するこ
とにより構築される。
さらに訝しくはこの方法は、ｐＵＣ９の制限酵素Ｎａｒ
Ｉ又は制限酵素ＮｄｅＩの単一の認識配列で（２）又は
（ｂ）をクローン化し、［−特異的又はＮ−特異的繊維
状バクテリオファージで感染さけた大腸菌のｐｏｌＡ突
然変異体の方法により形質転換体を選択し、次に未使用
の単一の認識配列で、得られた組み換えプラスミドの１
つで（ｂ）をり０−ン化し、Ｎ−特異的又はＦ−特異的
繊維状バクテリオファージで感染させた大腸菌のｐｏｌ
Ａ突然変異体の方法により形質転換体を選択することよ
り成る。
Ｉ又は制限酵素ＮｄｅＩの単一の認識配列で（２）又は
（ｂ）をクローン化し、［−特異的又はＮ−特異的繊維
状バクテリオファージで感染さけた大腸菌のｐｏｌＡ突
然変異体の方法により形質転換体を選択し、次に未使用
の単一の認識配列で、得られた組み換えプラスミドの１
つで（ｂ）をり０−ン化し、Ｎ−特異的又はＦ−特異的
繊維状バクテリオファージで感染させた大腸菌のｐｏｌ
Ａ突然変異体の方法により形質転換体を選択することよ
り成る。
実験の項で詳述Ｊる本発明の好適な態様は、ベクタープ
ラスミドＤＫＵＮ９の構築法であり、これはプラスミド
ｐｔＪ Ｃ９を制限酵素Ｎ［）ｅ Ｉとクレノウ［ＩＮ
Ａポリメラーゼｌで処理して平滑末端線状２本鎖ＤＮＡ
を形成させ、この線状ＤＮＡを平滑末端線状２本鎖ＤＮ
Ａ （これはプラスミドｐＩＫｏｒｉ ２ｂ（１）を
制限酵素ＦＣＯＲ１とＢａｍ１−１１で処理し、Ｉ ｋ
ｅ （７） （＋ ） 複製ｆｉｔｌＱｆｉ点＋形態
形成シグナルを有する断片を単離し、これをクレノウＤ
ＮＡポリメラーぜ１で処即して作成する）と結合させ、
Ｉｋｅ又はその突然変異体で感染させた大腸菌のｒ）Ｏ
ＩＡ突然変異株の形質転換とアンピシリン耐性］ロニー
の選択により、ｐＬＪ Ｃ９のＮｄｅＩ部位にＩｋｅの
複製開始点十形前形成シグナルが挿入された形質転換体
を選択し、ｐ ＬＪ Ｃ９のｌ ａｃ７遺伝子と同じ配
向でＩｋｅの（＋）複ＩＩＩ開始点を含有する組み換え
プラスミドを単離し、このプラスミドを制限酵素Ｎａｒ
ＩとクレノウＩ）ＮＡポリメラーゼＩで処即して平滑末
端線状２本鎖ＤＮＡを形成され、この線状ＤＮＡを平滑
末端線状２本鎖ＤＮＡ （これはプラスミドｐ Ｅ Ｍ
Ｂｌ−８を制限酵素Ｒ６ａ■で処即し、ｆｌの（＋）
複製開始点＋形態形成シグナルを含有する断片を単離し
、これをクレノウＤＮＡポリメラーゼＩで処理して作成
Ｊる）と結合させ、Ｆｆ又はその突然変異体で感染させ
た大腸菌のｒ）ＯＩＡ突然変異株の形成転換とアンピシ
リン耐性］ロニーの選択により、ｐＵＣ９のＮａｒ１部
位にｆｌの複製開始点＋形態形成ジグナルが挿入された
形質転換体を選択することにより成る。
ラスミドＤＫＵＮ９の構築法であり、これはプラスミド
ｐｔＪ Ｃ９を制限酵素Ｎ［）ｅ Ｉとクレノウ［ＩＮ
Ａポリメラーゼｌで処理して平滑末端線状２本鎖ＤＮＡ
を形成させ、この線状ＤＮＡを平滑末端線状２本鎖ＤＮ
Ａ （これはプラスミドｐＩＫｏｒｉ ２ｂ（１）を
制限酵素ＦＣＯＲ１とＢａｍ１−１１で処理し、Ｉ ｋ
ｅ （７） （＋ ） 複製ｆｉｔｌＱｆｉ点＋形態
形成シグナルを有する断片を単離し、これをクレノウＤ
ＮＡポリメラーぜ１で処即して作成する）と結合させ、
Ｉｋｅ又はその突然変異体で感染させた大腸菌のｒ）Ｏ
ＩＡ突然変異株の形質転換とアンピシリン耐性］ロニー
の選択により、ｐＬＪ Ｃ９のＮｄｅＩ部位にＩｋｅの
複製開始点十形前形成シグナルが挿入された形質転換体
を選択し、ｐ ＬＪ Ｃ９のｌ ａｃ７遺伝子と同じ配
向でＩｋｅの（＋）複ＩＩＩ開始点を含有する組み換え
プラスミドを単離し、このプラスミドを制限酵素Ｎａｒ
ＩとクレノウＩ）ＮＡポリメラーゼＩで処即して平滑末
端線状２本鎖ＤＮＡを形成され、この線状ＤＮＡを平滑
末端線状２本鎖ＤＮＡ （これはプラスミドｐ Ｅ Ｍ
Ｂｌ−８を制限酵素Ｒ６ａ■で処即し、ｆｌの（＋）
複製開始点＋形態形成シグナルを含有する断片を単離し
、これをクレノウＤＮＡポリメラーゼＩで処理して作成
Ｊる）と結合させ、Ｆｆ又はその突然変異体で感染させ
た大腸菌のｒ）ＯＩＡ突然変異株の形成転換とアンピシ
リン耐性］ロニーの選択により、ｐＵＣ９のＮａｒ１部
位にｆｌの複製開始点＋形態形成ジグナルが挿入された
形質転換体を選択することにより成る。
り成る。
本発明のさらに好適な態様（これも実験の項で詳述する
）は、ｐｕｃ９から得られるベクタープラスミドｐＫＵ
Ｎ１９の構築方法であり、これはプラスミドｐ ＬＪ
Ｃ１９を制限酵素ＥｃｏＲＩ。
）は、ｐｕｃ９から得られるベクタープラスミドｐＫＵ
Ｎ１９の構築方法であり、これはプラスミドｐ ＬＪ
Ｃ１９を制限酵素ＥｃｏＲＩ。
Ｈｉ ｎｄＩ［ｌで処理し次に制限酵素１−１８ ｅ
Ｉで処理して、この消化生成物を単離し、ここにプラス
ミドｐＫＵＮ９をＮ１１１限酵素ＦｃｏＲＩ、 １」ｉ
ｎｄＴＩｌ及びＰｓｔＩで消化して得られる断片を添
加し、この混合液にリガーゼを加え、生成した［）ＮＡ
分子を大腸菌ＪＭ８３に形質転換し、これをアンピシリ
ンとｘ−ｇａｌを含有する寒天平板上で選択することよ
り成る。
Ｉで処理して、この消化生成物を単離し、ここにプラス
ミドｐＫＵＮ９をＮ１１１限酵素ＦｃｏＲＩ、 １」ｉ
ｎｄＴＩｌ及びＰｓｔＩで消化して得られる断片を添
加し、この混合液にリガーゼを加え、生成した［）ＮＡ
分子を大腸菌ＪＭ８３に形質転換し、これをアンピシリ
ンとｘ−ｇａｌを含有する寒天平板上で選択することよ
り成る。
ｐＫＵＮ９由来のプラスミドｐ Ｋ ＬＪ Ｎ １９は
、ｒ）ＬＪＣ１９プラスミドのポリリンカー配列を有す
るため、ＤＫＵＮ１９に対して４個余分の甲−の制限酵
素切断部位を、従ってｌ ａｃ７遺伝子中にクローニン
グ位置を有する。
、ｒ）ＬＪＣ１９プラスミドのポリリンカー配列を有す
るため、ＤＫＵＮ１９に対して４個余分の甲−の制限酵
素切断部位を、従ってｌ ａｃ７遺伝子中にクローニン
グ位置を有する。
公知の様に、Ｎ−特異的（Ｉｋｅ）及びＦ−特異的（Ｍ
１３、ｆｄ及びｆｌ、ここではまとめてＦｆとする）繊
維状バクデリオファージの１本鎖（ＳＳ）ＤＮＡゲノム
は、複製型（ＲＦ）と呼ばれる２本鎖中間体を介して複
製される。ｌ’）ＮＡ複製サイクルは、３段階に区別さ
れる（ Ｄｅｎｈａｒｄｔら、１９７８年）の総説を参
照）。第１段階ではウィルス５ＳＤＮＡはＲＦに変換さ
れる。これは、宿主に］−ドされる機能と、１本鎖ファ
ージゲノム中に存在する（相補的鎖）複製開始点（（−
）−複製開始点）に完全に依存する。第２段階ではＲＦ
が何回も複製され、大量の子孫ＲＦ分子が産生される。
１３、ｆｄ及びｆｌ、ここではまとめてＦｆとする）繊
維状バクデリオファージの１本鎖（ＳＳ）ＤＮＡゲノム
は、複製型（ＲＦ）と呼ばれる２本鎖中間体を介して複
製される。ｌ’）ＮＡ複製サイクルは、３段階に区別さ
れる（ Ｄｅｎｈａｒｄｔら、１９７８年）の総説を参
照）。第１段階ではウィルス５ＳＤＮＡはＲＦに変換さ
れる。これは、宿主に］−ドされる機能と、１本鎖ファ
ージゲノム中に存在する（相補的鎖）複製開始点（（−
）−複製開始点）に完全に依存する。第２段階ではＲＦ
が何回も複製され、大量の子孫ＲＦ分子が産生される。
この工程はファージの］−ドする遺伝子■蛋白の作用で
開始され、ウィルス鎖の特異的な位置くウィルス鎖複製
開始点又は（＋）−複製開始点）にニックが導入され（
Ｎｅｖｅｒら、１９７９年）、その結果ローリングリ−
クル（ｒｏＮｉｎｇｃｉｒｃｌｅ） １！構に従いＤＮ
Ａポリメラーゼによる複製のためのプライマーとして作
用する３′−〇［］末端ができる。複製が１回終了した
後、遺伝子■蛋白は再び、別れたウィルス鎖を全く同じ
位置で切断して、親（＋）鎖を新に合成された（＋）鎖
から分離する。同時に、得られたＲＦと５ｓＤＮＡ分子
は、共有結合で閉じられて円形分子が産生される（Ｎｅ
ｖｅｒ ＆ Ｇｅ１ｄｅｒ１１９８２年）。
開始され、ウィルス鎖の特異的な位置くウィルス鎖複製
開始点又は（＋）−複製開始点）にニックが導入され（
Ｎｅｖｅｒら、１９７９年）、その結果ローリングリ−
クル（ｒｏＮｉｎｇｃｉｒｃｌｅ） １！構に従いＤＮ
Ａポリメラーゼによる複製のためのプライマーとして作
用する３′−〇［］末端ができる。複製が１回終了した
後、遺伝子■蛋白は再び、別れたウィルス鎖を全く同じ
位置で切断して、親（＋）鎖を新に合成された（＋）鎖
から分離する。同時に、得られたＲＦと５ｓＤＮＡ分子
は、共有結合で閉じられて円形分子が産生される（Ｎｅ
ｖｅｒ ＆ Ｇｅ１ｄｅｒ１１９８２年）。
感染の初期では新に合成された５ｓＤＮＡは、複製の第
１段階と同様にＲＦに変換される。しかし感染の後１ｆ
ｌ（第３段階）では、５ｓＤＮＡはファージのコードす
る５ｓＤＮＡ結合蛋白（遺伝子Ｖ蛋白）にカバーされＲ
Ｆへの変換が妨げられるため、子孫５ｓＤＮＡが合成さ
れる。５ｓＤＮＡと遺伝子■蛋白の核蛋白複合体は、宿
主細胞膜へ輸送され、そこで成熟ファージ粒子へのパッ
ケージングが行われる。この■稈にはく＋）−複製開始
点に連続する特異的なｌ’）ＮＡ配列（形態形成シグナ
ル）が必要であル（Ｄｏｔｔｏ ＆ Ｚｉｎｄｅｒ、１
９８３年）。
１段階と同様にＲＦに変換される。しかし感染の後１ｆ
ｌ（第３段階）では、５ｓＤＮＡはファージのコードす
る５ｓＤＮＡ結合蛋白（遺伝子Ｖ蛋白）にカバーされＲ
Ｆへの変換が妨げられるため、子孫５ｓＤＮＡが合成さ
れる。５ｓＤＮＡと遺伝子■蛋白の核蛋白複合体は、宿
主細胞膜へ輸送され、そこで成熟ファージ粒子へのパッ
ケージングが行われる。この■稈にはく＋）−複製開始
点に連続する特異的なｌ’）ＮＡ配列（形態形成シグナ
ル）が必要であル（Ｄｏｔｔｏ ＆ Ｚｉｎｄｅｒ、１
９８３年）。
本発明者らは、ＩｋｅとＦｆの遺伝子■蛋白の生物学的
機能は相互に交換できないことを見出【ノた。さらに我
々は、ウィルス鎖複製の複製開始点の配向がお互いに反
対の場合、ＩｋｅとＦｆの（」−）−複製間９ｆｌ〆１
を含有する組み換えプラスミドは、ＩｋｅとＦｆの遺伝
子■蛋白により複製され得るをさらに見出（）た。Ｉｋ
ｅ遺伝子■蛋白が存在する場合、Ｉｋｅ（＋）−複製開
始点のみが使用され、「ｆ（７）Ｉ伝子■蛋白が存在１
′る場合Ｆｆの遺伝子■蛋白が使用される。さらにプラ
スミドがファージ形態形成シグナルを有する場合、プラ
スミドがファージ様粒子に効果的にパッケージされる。
機能は相互に交換できないことを見出【ノた。さらに我
々は、ウィルス鎖複製の複製開始点の配向がお互いに反
対の場合、ＩｋｅとＦｆの（」−）−複製間９ｆｌ〆１
を含有する組み換えプラスミドは、ＩｋｅとＦｆの遺伝
子■蛋白により複製され得るをさらに見出（）た。Ｉｋ
ｅ遺伝子■蛋白が存在する場合、Ｉｋｅ（＋）−複製開
始点のみが使用され、「ｆ（７）Ｉ伝子■蛋白が存在１
′る場合Ｆｆの遺伝子■蛋白が使用される。さらにプラ
スミドがファージ形態形成シグナルを有する場合、プラ
スミドがファージ様粒子に効果的にパッケージされる。
このシグナルの機能は、同じｆ）ＮＡ鎖上の機能上ファ
ージの（＋）−複製開始点の存在に対してシス（ｃｉｓ
）で結合している（ Ｄｏｔｔｏら、１９８１年）
； （ｎｏｔｔｏ ＆ ７ｉｎｄｅｒ、 １９８３年）
。
ージの（＋）−複製開始点の存在に対してシス（ｃｉｓ
）で結合している（ Ｄｏｔｔｏら、１９８１年）
； （ｎｏｔｔｏ ＆ ７ｉｎｄｅｒ、 １９８３年）
。
従って組み換λプラスミドで、複製開始点と形態形成シ
グナルの両方を含有するＩｋｅとＦｆの断片の配向がお
互いに反対の場合、ファージ様粒子にパッケージされる
ＤＮＡ鎖は、これらのプラスミドを有する細胞をＩｋｅ
又はＦｆで感染させて選択し得る。
グナルの両方を含有するＩｋｅとＦｆの断片の配向がお
互いに反対の場合、ファージ様粒子にパッケージされる
ＤＮＡ鎖は、これらのプラスミドを有する細胞をＩｋｅ
又はＦｆで感染させて選択し得る。
これらの粒子様性質は、本発明の多機能ベクタープラス
ミドの作成に用いられる。
ミドの作成に用いられる。
２０一
本発明のプラスミドは、好ましくは１） ｊＪ Ｃ９に
基づく。このプラスミドはクローニングのためのいくつ
かの特異な性質を有するため、そのプラスミドの使用が
好ましい（Ｖｉｅｉｒａ ＆ Ｈｅ５ｓｉｎｏ、１９８
２年）。
基づく。このプラスミドはクローニングのためのいくつ
かの特異な性質を有するため、そのプラスミドの使用が
好ましい（Ｖｉｅｉｒａ ＆ Ｈｅ５ｓｉｎｏ、１９８
２年）。
本発明の方法ではＡＣＣＩの例外を除いて、ρＵＣ９中
にｆｌとＩｋｅ配列が導入されているにもかかわらず、
ｌ ａｃＺＤＮＡの全てのクローニング部位は単一であ
る。さらに別の利点は、このプラスミドは比較的サイズ
が小さいこととベクタープラスミドの組み換えクローン
がプラスミドとして増殖できる能力のため、Ｍ１３ｍｐ
シリーズのファージを用いる場合より遥かに多量のＤＮ
Ａ断片が安定的に挿入かつパッケージされることである
（ Ｄｅｎｔ（３ら、１９８３年）。
にｆｌとＩｋｅ配列が導入されているにもかかわらず、
ｌ ａｃＺＤＮＡの全てのクローニング部位は単一であ
る。さらに別の利点は、このプラスミドは比較的サイズ
が小さいこととベクタープラスミドの組み換えクローン
がプラスミドとして増殖できる能力のため、Ｍ１３ｍｐ
シリーズのファージを用いる場合より遥かに多量のＤＮ
Ａ断片が安定的に挿入かつパッケージされることである
（ Ｄｅｎｔ（３ら、１９８３年）。
本発明のプラスミド（例えばｐ Ｋ ｊＪ Ｎ ９とｐ
Ｋ ＬＪ Ｎ １９ ）は、１本鎖ファージベクターと
ｐＵＣプラスミドの全ての特異な性質を持っているだけ
でなく、その使用を拡張して１つの組み換えプラスミド
の両方のＤＮＡ鎖を１本鎖型で別々に得ることが可能に
なることである。この性質は、比較的大きなりＮＡ分子
の配列決定のための散弾銃りｎ−ニングを使用する際特
に有用である。本発明のプラスミドを用いることにより
、１つのクローンから２倍の配列情報が得られるため、
目的の配列を集めるために必要な時間は大幅に減少でき
る。又は比較的小断片をクローニングすることにより、
両鏡のヌクレオチド配列が同時に決定できる。１つの鎖
の配列解析では決定困難な場合、この方法は特に有効で
ある。
Ｋ ＬＪ Ｎ １９ ）は、１本鎖ファージベクターと
ｐＵＣプラスミドの全ての特異な性質を持っているだけ
でなく、その使用を拡張して１つの組み換えプラスミド
の両方のＤＮＡ鎖を１本鎖型で別々に得ることが可能に
なることである。この性質は、比較的大きなりＮＡ分子
の配列決定のための散弾銃りｎ−ニングを使用する際特
に有用である。本発明のプラスミドを用いることにより
、１つのクローンから２倍の配列情報が得られるため、
目的の配列を集めるために必要な時間は大幅に減少でき
る。又は比較的小断片をクローニングすることにより、
両鏡のヌクレオチド配列が同時に決定できる。１つの鎖
の配列解析では決定困難な場合、この方法は特に有効で
ある。
本発明のプラスミドは、クローニング及びＤＮＡ配列決
定法（ｓａｎｇｅｒら、１９８０年）、部位特異的突然
変異誘発（、？ｏＮｅｒ ＆ Ｓｍ１ｔｈ、 １９８２
年）、Ｓ１マツピング（Ｃｉ Ｉ １ｂｅｒｔｏら、１
９８３年）、ｍＲＮＡクローニング（１ｌｅｉｄｅｃｋ
ｅｒ ＆Ｍｅｓｓｉｎｇ 、１９８３年）、クローン化
ＤＮＡの発現（Ｓｌｏｃｏｍｈｅら、１９８２年）、及
び１本鎖ハイブリダイゼーションプローブの産生（旧１
＆ｔ４ｅｓｓｉｎｏ 、 １９８２年）に有効なベクタ
ーである。
定法（ｓａｎｇｅｒら、１９８０年）、部位特異的突然
変異誘発（、？ｏＮｅｒ ＆ Ｓｍ１ｔｈ、 １９８２
年）、Ｓ１マツピング（Ｃｉ Ｉ １ｂｅｒｔｏら、１
９８３年）、ｍＲＮＡクローニング（１ｌｅｉｄｅｃｋ
ｅｒ ＆Ｍｅｓｓｉｎｇ 、１９８３年）、クローン化
ＤＮＡの発現（Ｓｌｏｃｏｍｈｅら、１９８２年）、及
び１本鎖ハイブリダイゼーションプローブの産生（旧１
＆ｔ４ｅｓｓｉｎｏ 、 １９８２年）に有効なベクタ
ーである。
添付図面において、
第１図は、プラスミドｐ ＬＪ Ｃ９から出発して本発
明のプラスミドｐＫｔＪＮ９を作成Ｊ−る方法を示す。
明のプラスミドｐＫｔＪＮ９を作成Ｊ−る方法を示す。
第２図は、Ｉ）ＫＵＮ９から本発明のプラスミドｐＫＵ
Ｎ１９を作成する方法を示す。
Ｎ１９を作成する方法を示す。
第３図は、感染細胞から単離された形質導入粒子中に存
在するｌ ａｃＺ遺伝子のヌクレオチド配列の一部を示
す。こうして得られるｌ ｋｅ９で感染後の１本鎖ＤＮ
Ａの配列は、マスタープライマーによってのみ決定され
（上側の配Ｔ１１１）、ＩＲｌで感染させて得られる粒
子のＤＮＡ配列決定には、逆のプライマーを使用しなｔ
−Ｊればならない（下側の配列）。
在するｌ ａｃＺ遺伝子のヌクレオチド配列の一部を示
す。こうして得られるｌ ｋｅ９で感染後の１本鎖ＤＮ
Ａの配列は、マスタープライマーによってのみ決定され
（上側の配Ｔ１１１）、ＩＲｌで感染させて得られる粒
子のＤＮＡ配列決定には、逆のプライマーを使用しなｔ
−Ｊればならない（下側の配列）。
本発明を以下の実験の項で説明するが、これは例示を目
的とするものであり、決して本発明を限定づるものでは
ない。
的とするものであり、決して本発明を限定づるものでは
ない。
Ａ、材料と方法
（２）細菌、ファージ及びプラスミド
使用した細菌株は、大腸菌Ｊ Ｍ ８３、（ａ）８０Ｉ
ａｃ７ ＤＭｌ ５、ａｒａ 、旧ａｃｐｒＯ，５
ｔｒＡ１ｔｈｉ ） （Ｈｅｓｓｉｎｇ、１９７９年）
、Ｎ４１５６及びＮ４１５６／Ｆ’ （ｐｏｌＡＳｅ
ｎｒｌ、ｔｈｙ、０ＶｒＡ） （Ｇｅ１ｌｅｒｔら、
１９７７年）である。ＪＭ８３をＩｋｅ９とＦｆの感染
に対し感受性とするために、接合により和合性のある接
合性プラスミドＮ３とＦ’ ｔｓｌａｃ ： Ｔ ｎ
５をこの株に導入した（Ｉｌｅｎｎｉｓｏｎ ＆ Ｂａ
ｕｍｂｅｒｇ 、１９７５年）。
ａｃ７ ＤＭｌ ５、ａｒａ 、旧ａｃｐｒＯ，５
ｔｒＡ１ｔｈｉ ） （Ｈｅｓｓｉｎｇ、１９７９年）
、Ｎ４１５６及びＮ４１５６／Ｆ’ （ｐｏｌＡＳｅ
ｎｒｌ、ｔｈｙ、０ＶｒＡ） （Ｇｅ１ｌｅｒｔら、
１９７７年）である。ＪＭ８３をＩｋｅ９とＦｆの感染
に対し感受性とするために、接合により和合性のある接
合性プラスミドＮ３とＦ’ ｔｓｌａｃ ： Ｔ ｎ
５をこの株に導入した（Ｉｌｅｎｎｉｓｏｎ ＆ Ｂａ
ｕｍｂｅｒｇ 、１９７５年）。
機能性ｆ１複製開始点を有するプラスミドの陰性妨害に
対しバクテリオファージＩＲ１（ｆｌの誘導体）は耐性
なため、プラスミドｐ Ｋ Ｕ Ｎ ９のＥ鎖のパッケ
ージングにＩＲＩを使用した（ａ）０ｔｔＯら、１９８
１年）。バクテリオファージＩｋｅ−９はｗｔ Ｉｋ
ｅの変種（にａｔｈｏｏｎら、１９７２年） ； （Ｐ
ｅｅｔｅｒｓら、１９８５年）であり、このファージで
感染させるとｗｔ Ｉｋｅの場合より形質導入粒子が
高収率で得られるため、プラスミドＦ）ＫＵＮ９の１鎖
のパッケージングにこのファージを使用した。
対しバクテリオファージＩＲ１（ｆｌの誘導体）は耐性
なため、プラスミドｐ Ｋ Ｕ Ｎ ９のＥ鎖のパッケ
ージングにＩＲＩを使用した（ａ）０ｔｔＯら、１９８
１年）。バクテリオファージＩｋｅ−９はｗｔ Ｉｋ
ｅの変種（にａｔｈｏｏｎら、１９７２年） ； （Ｐ
ｅｅｔｅｒｓら、１９８５年）であり、このファージで
感染させるとｗｔ Ｉｋｅの場合より形質導入粒子が
高収率で得られるため、プラスミドＦ）ＫＵＮ９の１鎖
のパッケージングにこのファージを使用した。
プラスミドＤＩＫｏｒｉ−２ｂ（１）はＩｋｅＤＮＡ断
片を有し、この上に１本鎖ＤＮＡのファ−ジ様粒子への
パッケージングに必要なＩｋｅの複製開始貞と形態形成
シグナルが存在する。プラスミドｐＥＭＦ３Ｌ８、ｐ
ＬＪ Ｃ９及びｐＵＣ１９は既に記載されている（ ｌ
１ｅｎｔｅら、１９８３年）；（Ｖｉｅｉｒａ ＆ Ｈ
ｅ５ｓｉｎｏ、１９８２年） ； （Ｙａｎｉｓｃｈ−
Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５年）。
片を有し、この上に１本鎖ＤＮＡのファ−ジ様粒子への
パッケージングに必要なＩｋｅの複製開始貞と形態形成
シグナルが存在する。プラスミドｐＥＭＦ３Ｌ８、ｐ
ＬＪ Ｃ９及びｐＵＣ１９は既に記載されている（ ｌ
１ｅｎｔｅら、１９８３年）；（Ｖｉｅｉｒａ ＆ Ｈ
ｅ５ｓｉｎｏ、１９８２年） ； （Ｙａｎｉｓｃｈ−
Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５年）。
０酵素と生化学品
全ての制限酵素、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリ
メラーぜ■（クレノウ断片）は、ベセスダリサーチラボ
ラトリーズ社、二］、−イングランドバイオラボズ社又
はベーリンガーマンハイム社から入手し、Ｈａｎｉａｔ
ｉｓら（１９８２年）の３＝緩衝液系又は供給元の指示
する緩衝液で使用した。
メラーぜ■（クレノウ断片）は、ベセスダリサーチラボ
ラトリーズ社、二］、−イングランドバイオラボズ社又
はベーリンガーマンハイム社から入手し、Ｈａｎｉａｔ
ｉｓら（１９８２年）の３＝緩衝液系又は供給元の指示
する緩衝液で使用した。
平滑末端を作成するため、１μ９のＤＮＡを、２０ｎＨ
トリス−１−ＩＣＩ 、１１１１１８．０．７５＋ｎＨ
ＫＣＩ、５ｗ＋ＨＭ９ＣＩ 、１ｍＨジチオスレイト
−ル（ＤＴＴ）中１単位のクレノウ［）ＮＡポリメラー
ゼ■と、１１００ＩＩの４種のデオキシヌクレオチド三
リン酸で３７℃で３０分間処理し、セファデックスＧ−
５０スーパーフアインカラムを通して遠心分離し、エタ
ノールで沈澱させた。
トリス−１−ＩＣＩ 、１１１１１８．０．７５＋ｎＨ
ＫＣＩ、５ｗ＋ＨＭ９ＣＩ 、１ｍＨジチオスレイト
−ル（ＤＴＴ）中１単位のクレノウ［）ＮＡポリメラー
ゼ■と、１１００ＩＩの４種のデオキシヌクレオチド三
リン酸で３７℃で３０分間処理し、セファデックスＧ−
５０スーパーフアインカラムを通して遠心分離し、エタ
ノールで沈澱させた。
、１． ｖａｎ Ｂｏｏｍ博士と共同研究者（ライデン
大学、有機化学科）の合成した２つのデオキシオリゴヌ
クレオチド配列決定用プライマー５’ ｄＧ−Ｔ−Ａ−
Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ｔ−Ｇ３’ （（）又はマスタープライマー）と５
′（Ｉ＾−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−＾−Ｔ−Ｇ−Ａ−
Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ３ ’ （＋）又は逆ブライマー）を
彼等から人手した。マスター（−）プライマーは、］ド
ジＴニック（ｃｏｒｌｏｇｅｎｉｃ ）鎖に対して相補
的であり、逆（＋）プライマーはｌ ａｃ７遺伝子の非
コドジ丁ニック（ｎｏｎ−ｃｏｄｏｇｅｎｉｃ ）鎖に
対して相補的である（第２図参照）。
大学、有機化学科）の合成した２つのデオキシオリゴヌ
クレオチド配列決定用プライマー５’ ｄＧ−Ｔ−Ａ−
Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ｔ−Ｇ３’ （（）又はマスタープライマー）と５
′（Ｉ＾−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−＾−Ｔ−Ｇ−Ａ−
Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ３ ’ （＋）又は逆ブライマー）を
彼等から人手した。マスター（−）プライマーは、］ド
ジＴニック（ｃｏｒｌｏｇｅｎｉｃ ）鎖に対して相補
的であり、逆（＋）プライマーはｌ ａｃ７遺伝子の非
コドジ丁ニック（ｎｏｎ−ｃｏｄｏｇｅｎｉｃ ）鎖に
対して相補的である（第２図参照）。
使用した他の生化学品の入手元は既に示されている（に
ｏｎｉｎｏｓ 、 １９８０年） ； （Ｐｅｅｔｅｒ
ｓら、１９８３年、１９８５年）。
ｏｎｉｎｏｓ 、 １９８０年） ； （Ｐｅｅｔｅｒ
ｓら、１９８３年、１９８５年）。
（へ）形質転換および、ファージと
形質導入粒子の数のｌ算
Ｈａｎｉａｔｉｓら、１９８２年の記載するＨａｎｄｅ
ｌ ＆１１ｉｒ＋ａ１１９７０年の方法により、大腸菌
をコンピタントにし形質転換させた。必要な場合には、
Ｃａ Ｃｌ ２処理１０分前に細胞をＩｋｅ又はＦｆで
感染させた。
ｌ ＆１１ｉｒ＋ａ１１９７０年の方法により、大腸菌
をコンピタントにし形質転換させた。必要な場合には、
Ｃａ Ｃｌ ２処理１０分前に細胞をＩｋｅ又はＦｆで
感染させた。
形質転換した細胞を、適宜１００μｇ／ｉ＋ｌのアンピ
シリンと０．００４％のｘ−ｇａｌを含有する２ＹＴ寒
天平板（ミラー（ＭｉＮｅｒ）ら、１９７２年）上に広
げた。
シリンと０．００４％のｘ−ｇａｌを含有する２ＹＴ寒
天平板（ミラー（ＭｉＮｅｒ）ら、１９７２年）上に広
げた。
１００μｌの培養液を１ツペンドルフ遠心分離機で５分
間遠心分離して、感染ファージとアンピシリン耐性形質
導入粒子の数を求めた。次に５０Ｈｌの上澄液を別の試
験管に移し、６５℃で２分間インキコベートして残存す
る細菌を殺した。次に適当に希釈した液を１００ ｔｔ
Ｉ採り、指数増殖している大腸菌細胞１００μｍ中に
添加して３７℃で１０分間インキュベートとした。この
混合液をアンピシリン（１００１１９／ｗ＋ｌ＞含有２
ＹＴ寒天平板上に広げ、３７℃で一晩インキコベートし
た。元々の培養液中に存在する形質導入粒子の数を求め
るため、生成したアンピシリン耐性１ロ二−の数を用い
た。同様に適当な指示株−りに、連続希釈液を広げて、
感染ファージの数を求めた。
間遠心分離して、感染ファージとアンピシリン耐性形質
導入粒子の数を求めた。次に５０Ｈｌの上澄液を別の試
験管に移し、６５℃で２分間インキコベートして残存す
る細菌を殺した。次に適当に希釈した液を１００ ｔｔ
Ｉ採り、指数増殖している大腸菌細胞１００μｍ中に
添加して３７℃で１０分間インキュベートとした。この
混合液をアンピシリン（１００１１９／ｗ＋ｌ＞含有２
ＹＴ寒天平板上に広げ、３７℃で一晩インキコベートし
た。元々の培養液中に存在する形質導入粒子の数を求め
るため、生成したアンピシリン耐性１ロ二−の数を用い
た。同様に適当な指示株−りに、連続希釈液を広げて、
感染ファージの数を求めた。
（へ）１本鎖ＤＮＡの単離と配列解析
プラスミドｐ Ｋ ＬＪ Ｎ ９を有するＪＭ８３／Ｎ
３／Ｆ’ を、培養密度が５×１０８細胞／１に達する
まで３７℃で増殖させた。次に感染倍率２０ｆ８で１Ｉ
ＮＹ＆をバクテリオファージＩｋｅ−９又はＩＲｌで感
染させた。−晩インキユベートした後、培養液１．５１
をエツベンドルフ微＠遠心機（Ｆｐｔ＋ｅｎｄｏｒｆ
１ｉｃｒｏｆｕｏｅ）中で５分間遠心分離シ、上澄液
１１を新しい試験管に移し、２５０ ｔｔ Ｉの２．５
Ｍ ＮａＣ１，２０％ポリエチレングリ］−ルー６０
０（ｂ）を加え混合した後、混合液を室温で１５分間放
置した。■ツペンドルフ微量遠心機で１０分間遠心分離
した後、上澄液を除去し沈殿物を１００μｍのＴＥ（１
０ＩＩ＋Ｈｔ−リス−１４Ｃ１、ｐＨ７，６，１ｗ＋ｔ
４ Ｆｌ’）ＴＡ）に溶解し、１００μｍのＴＦ−飽
和フェノールを用いて６５℃で１回、１００μｍのＴＥ
−飽和フェノール−クロロホルム（１：１）を用いて室
温で１回抽出した。
３／Ｆ’ を、培養密度が５×１０８細胞／１に達する
まで３７℃で増殖させた。次に感染倍率２０ｆ８で１Ｉ
ＮＹ＆をバクテリオファージＩｋｅ−９又はＩＲｌで感
染させた。−晩インキユベートした後、培養液１．５１
をエツベンドルフ微＠遠心機（Ｆｐｔ＋ｅｎｄｏｒｆ
１ｉｃｒｏｆｕｏｅ）中で５分間遠心分離シ、上澄液
１１を新しい試験管に移し、２５０ ｔｔ Ｉの２．５
Ｍ ＮａＣ１，２０％ポリエチレングリ］−ルー６０
０（ｂ）を加え混合した後、混合液を室温で１５分間放
置した。■ツペンドルフ微量遠心機で１０分間遠心分離
した後、上澄液を除去し沈殿物を１００μｍのＴＥ（１
０ＩＩ＋Ｈｔ−リス−１４Ｃ１、ｐＨ７，６，１ｗ＋ｔ
４ Ｆｌ’）ＴＡ）に溶解し、１００μｍのＴＦ−飽
和フェノールを用いて６５℃で１回、１００μｍのＴＥ
−飽和フェノール−クロロホルム（１：１）を用いて室
温で１回抽出した。
水層のＤＮＡを２．５倍量のエタノールで沈澱させ、遠
心分ｍｍ沈澱物を７０％エタノールで１同洗滌してから
、乾燥し２０μｍの■［に溶解した。
心分ｍｍ沈澱物を７０％エタノールで１同洗滌してから
、乾燥し２０μｍの■［に溶解した。
５−１０μｍの鋳型ＤＮＡを用いて（ｓａｎｇｅｒら、
１９７７年）の記載するジデオキシ法により、ＤＮＡ配
列解析を行った。ファージＴＲＩでパッケージングが指
令される場合は、逆（＋）配列決定用プライマーで配列
を決定し、１ｋｅ−９でパッケージされるＤＮＡ鎖（Ｉ
−鎖）の配列決定には、マスター（−）プライマーを使
用した。このために市販のプライマーを使用することも
できる。
１９７７年）の記載するジデオキシ法により、ＤＮＡ配
列解析を行った。ファージＴＲＩでパッケージングが指
令される場合は、逆（＋）配列決定用プライマーで配列
を決定し、１ｋｅ−９でパッケージされるＤＮＡ鎖（Ｉ
−鎖）の配列決定には、マスター（−）プライマーを使
用した。このために市販のプライマーを使用することも
できる。
Ｂ、プラスミドｐＫＵＮ９の構築
ｐＵＣ９ （Ｖｉｅｉｒａ ＆ Ｈｅ５ｓｉｎｏ、 １
９８２年）はクローニング用にいくつかの好ましい特徴
を有するため、我々はこれをプラスミドｐＫＵＮ９作成
の親ベクターとして選んだ。β−ガラクシダーゼのα−
ペプチドのコード配列中に存在する短いポリリンカーＤ
ＮＡ内の、種々の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に異
種ｔ）ＮＡを挿入できる。これにより、適当な指示平板
のレプリカ平板法を用いることなく組み換えクローンの
直接的同定が可能になる（Ｍｅｓｓｉｎｇ 、 １９８
３年）。
９８２年）はクローニング用にいくつかの好ましい特徴
を有するため、我々はこれをプラスミドｐＫＵＮ９作成
の親ベクターとして選んだ。β−ガラクシダーゼのα−
ペプチドのコード配列中に存在する短いポリリンカーＤ
ＮＡ内の、種々の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に異
種ｔ）ＮＡを挿入できる。これにより、適当な指示平板
のレプリカ平板法を用いることなく組み換えクローンの
直接的同定が可能になる（Ｍｅｓｓｉｎｇ 、 １９８
３年）。
プラスミドｐ Ｕ Ｃ９は、制限酵素ＮａｒＩとＮｄｅ
Ｉの各々に対する単一の認識配列を含有する。これらの
部位は、１ａｃＺ遺伝子（ｐ ｊＪ Ｃ９は完全なｌ
ａｃＺ″ｉＩＩ伝子を持たず、プロモーターとオペレー
ターを含む５′断片のみを含有する）とアンピシリン耐
性コード遺伝子の間に、お互いに接近して存在する（第
１図参照）。ｐＥＭＢＬプラスミドの作成にはＮａｒＩ
部位の使用が成功しているため（Ｄｅｎｔｅら、１９８
３年）、我々は異種ＤＮＡの挿入にプラスミドｐＵＣ９
の性質に影響を与えることなく両部位と６使用可能であ
ると予測した。
Ｉの各々に対する単一の認識配列を含有する。これらの
部位は、１ａｃＺ遺伝子（ｐ ｊＪ Ｃ９は完全なｌ
ａｃＺ″ｉＩＩ伝子を持たず、プロモーターとオペレー
ターを含む５′断片のみを含有する）とアンピシリン耐
性コード遺伝子の間に、お互いに接近して存在する（第
１図参照）。ｐＥＭＢＬプラスミドの作成にはＮａｒＩ
部位の使用が成功しているため（Ｄｅｎｔｅら、１９８
３年）、我々は異種ＤＮＡの挿入にプラスミドｐＵＣ９
の性質に影響を与えることなく両部位と６使用可能であ
ると予測した。
プラスミドｐＩＫｏｒｉ−２ｂ（１１は以下の様にシテ
作成した。プラスミドｐＬＪ Ｒ２２２（Ｒｕｅｔｈｅ
ｒら、１９８１年）中では、Ｉ ａｃＺ遺伝子中の小ｐ
Ｖ ＩＪ ＩＴ断片（複数のクローニング部位を含む
）を、ファージＭ１３＋１１１’）９の１ａｃ２遺伝子
の対応する断片で置き換えた。こうして得られるプラス
ミド（ｐＢＰ９と呼ぶ）は、ｌ−） Ｕ Ｒ２２２中に
存在するクローニング部位以外にＳｍａ Ｉ（Ｘｍａ１
）とｌ−１ｉ ｎ ｄ ｍの単一部位を有する。
作成した。プラスミドｐＬＪ Ｒ２２２（Ｒｕｅｔｈｅ
ｒら、１９８１年）中では、Ｉ ａｃＺ遺伝子中の小ｐ
Ｖ ＩＪ ＩＴ断片（複数のクローニング部位を含む
）を、ファージＭ１３＋１１１’）９の１ａｃ２遺伝子
の対応する断片で置き換えた。こうして得られるプラス
ミド（ｐＢＰ９と呼ぶ）は、ｌ−） Ｕ Ｒ２２２中に
存在するクローニング部位以外にＳｍａ Ｉ（Ｘｍａ１
）とｌ−１ｉ ｎ ｄ ｍの単一部位を有する。
次にプラスミドｐＢＰ９の３ｍａ １位のＩｋｅの遺伝
子開領域のＡＩＬＪＩ−Ｂ断片（８０７ｎ）をクローン
化した。このプラスミドをｐＩＫＯｒｉ−２と呼ぶ。最
後にプラスミドｐ（）（ｏｒｉ−２から、Ｒａ１−３１
欠失突然変異体（ここではＩｋｅ挿入体の３′末端は６
６２１位にある）を得た。このプラスミドｐＩＫｏｒｉ
−２ｂ（１１は、このバクテリオファージの１ｋｅＮ能
牲（＋）−複製開始点と形態形成シグナルを含有する（
第１図を参照）。
子開領域のＡＩＬＪＩ−Ｂ断片（８０７ｎ）をクローン
化した。このプラスミドをｐＩＫＯｒｉ−２と呼ぶ。最
後にプラスミドｐ（）（ｏｒｉ−２から、Ｒａ１−３１
欠失突然変異体（ここではＩｋｅ挿入体の３′末端は６
６２１位にある）を得た。このプラスミドｐＩＫｏｒｉ
−２ｂ（１１は、このバクテリオファージの１ｋｅＮ能
牲（＋）−複製開始点と形態形成シグナルを含有する（
第１図を参照）。
このプラスミドをＥＣ０ＲＩと１３ａｍＮｌで消化し、
クレノウＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端を作
成してＩｋｅ挿人偉人体き、次にあらかじめクレノウＤ
ＮＡポリメラーゼ■で処理した１）ＬＩＣ９ＯＮｄｅＩ
部位にクローン化した。
クレノウＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端を作
成してＩｋｅ挿人偉人体き、次にあらかじめクレノウＤ
ＮＡポリメラーゼ■で処理した１）ＬＩＣ９ＯＮｄｅＩ
部位にクローン化した。
１）ＬＪＣ９のＮｄｅ■部位にＩｋｅ断片を挿入した場
合選択可能な表現型の変化は起きないから、ｐ Ｌ）
Ｃ９のＣｏ ｌ Ｆ １複製開始点はＤＮＡポリメラー
ゼ■の欠如する細胞中では機能を示されないという事実
を利用して組み換えプラスミドを選択した（ Ｂｏｌ
１ｖａｒら、１９７７年）。この酵素が存在しない細胞
（ＰｏｌＡ突然変異体）中では、機能性複製開始点が存
在しない場合はｐＵＣ９由来組み換えプラスミドは複製
できない。従ってＩｋｅで感染させたＰｏ１Ａを形質転
換させるためこの結合混合液を用いて、トランス（ｔｒ
ａｎｓ ）で遺伝子■蛋白の供給源を与えた。アンピシ
リン耐性コロニーが得られたため、Ｉｋｅ（＋）−複製
開始点はうま＜２０−ン化されていることを示していた
。いくつかのコロニーのプラスミドＤＮＡを単離し、Ｊ
Ｍ８３株を形質転換させるために使用した。アンピシリ
ンとｘ−ｇａｌを含有する平板上で選択した後、いくつ
かの青いコロニーのプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵
素消化により解析した。結果はＩｋｅ断片が両配向でク
ローン化されていることを照明していた。ｐｔＪｃ９の
ｌ ａｃＺ遺伝子と同じ配向でＩｋｅの（＋）−複製開
始点を含有するプラスミドをｐｕｃｔ−２ｅと命名した
（第１図参照）。
合選択可能な表現型の変化は起きないから、ｐ Ｌ）
Ｃ９のＣｏ ｌ Ｆ １複製開始点はＤＮＡポリメラー
ゼ■の欠如する細胞中では機能を示されないという事実
を利用して組み換えプラスミドを選択した（ Ｂｏｌ
１ｖａｒら、１９７７年）。この酵素が存在しない細胞
（ＰｏｌＡ突然変異体）中では、機能性複製開始点が存
在しない場合はｐＵＣ９由来組み換えプラスミドは複製
できない。従ってＩｋｅで感染させたＰｏ１Ａを形質転
換させるためこの結合混合液を用いて、トランス（ｔｒ
ａｎｓ ）で遺伝子■蛋白の供給源を与えた。アンピシ
リン耐性コロニーが得られたため、Ｉｋｅ（＋）−複製
開始点はうま＜２０−ン化されていることを示していた
。いくつかのコロニーのプラスミドＤＮＡを単離し、Ｊ
Ｍ８３株を形質転換させるために使用した。アンピシリ
ンとｘ−ｇａｌを含有する平板上で選択した後、いくつ
かの青いコロニーのプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵
素消化により解析した。結果はＩｋｅ断片が両配向でク
ローン化されていることを照明していた。ｐｔＪｃ９の
ｌ ａｃＺ遺伝子と同じ配向でＩｋｅの（＋）−複製開
始点を含有するプラスミドをｐｕｃｔ−２ｅと命名した
（第１図参照）。
ＦＴファージｆ１の機能性（＋）−複製開始点＋形態形
成シグナルは、ファージ遺伝子開領域をほとんどカバー
するＲｓａ Ｔ断片中に含有されていた（ＮｉＮ ＆
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ 、 １９８２年）。
成シグナルは、ファージ遺伝子開領域をほとんどカバー
するＲｓａ Ｔ断片中に含有されていた（ＮｉＮ ＆
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ 、 １９８２年）。
ＤＥＭＢＩ−プラスミド中に存在するｆ Ｉ ＤＮＡ配
列中にも同じ断片が存在する（ Ｄｅｎｔｅら、１９８
３年）。プラスミドｐＥＭＢＬ８（−）をＲｓａ ｌで
消化した後、ｆｌ （＋）−複製開始点と形態形成シグ
ナルを含有する５１４塩基対断片をｉｍｔ、た。次にこ
の断片を、クレノウＤＮＡポリメラーゼ■で処理してプ
ラント末端を作成したｐＬＪｃＩ−２ｅのＮａｒ１部位
に結合さセタ。
列中にも同じ断片が存在する（ Ｄｅｎｔｅら、１９８
３年）。プラスミドｐＥＭＢＬ８（−）をＲｓａ ｌで
消化した後、ｆｌ （＋）−複製開始点と形態形成シグ
ナルを含有する５１４塩基対断片をｉｍｔ、た。次にこ
の断片を、クレノウＤＮＡポリメラーゼ■で処理してプ
ラント末端を作成したｐＬＪｃＩ−２ｅのＮａｒ１部位
に結合さセタ。
ＩＲＩ感染Ｐｏ１Ａ細胞を形質転換した後、アンピシリ
ン耐性コロニーを得て、プラスミドＩ）ＮＡを単離し、
ＪＭ８３株を形質転換するのに使用（）た。制限酵素消
化によりいくつかの青いアンピシリン耐性コロニーのプ
ラスミドＤＮＡの解析の結果、全てのプラスミドは同じ
構造を有しており、ＩｋｅとＩａｃＺ１１伝子の配向と
反対の配向でｆｌ（十）−複製開始点を含有していた。
ン耐性コロニーを得て、プラスミドＩ）ＮＡを単離し、
ＪＭ８３株を形質転換するのに使用（）た。制限酵素消
化によりいくつかの青いアンピシリン耐性コロニーのプ
ラスミドＤＮＡの解析の結果、全てのプラスミドは同じ
構造を有しており、ＩｋｅとＩａｃＺ１１伝子の配向と
反対の配向でｆｌ（十）−複製開始点を含有していた。
このプラスミド（ｐ Ｋ Ｕ Ｎ ９と呼ぶ）の作成と
構造を第１図にしめす。
構造を第１図にしめす。
Ｃ，ｐＫＵＮ１９の構築
親プラスミドはｐｕｃｉ ９である（ Ｖａｎｉｓｃｈ
−ＰｅｒｒＯｎら、１９８５年）。単離後プラスミドを
制限酵素ＦｃｏＲＩどＨｉｎｄｌ［［で切断しくこの操
作によりＩａｃＺ３１１伝子中のポリ伝力中が切断され
る）、次に制限酵素Ｈａ ｅ Ｔ［で切断する（この操
作により種々の部位でｐ ＬＪ Ｃ１９プラスミドが切
断される）ことにより不活性化される（第２図参照）。
−ＰｅｒｒＯｎら、１９８５年）。単離後プラスミドを
制限酵素ＦｃｏＲＩどＨｉｎｄｌ［［で切断しくこの操
作によりＩａｃＺ３１１伝子中のポリ伝力中が切断され
る）、次に制限酵素Ｈａ ｅ Ｔ［で切断する（この操
作により種々の部位でｐ ＬＪ Ｃ１９プラスミドが切
断される）ことにより不活性化される（第２図参照）。
消化後、この断片を、プラスミドｒ） Ｋ ｔＪ Ｎ
９を制限酵素Ｅｃｏ Ｒ１，Ｈｉｎｄｌ［Ｉ、Ｐ ｓ
１： Ｔで消化した得た断片に添加した。これらの酵
素はｐＫＵＮ９のポリリンカー配列を切断することによ
り不活性化させる。こうして得られる混合液にリガーゼ
を加えた。次に生成した組み換えＤＮＡ分子を大腸菌Ｊ
Ｍ８３．ｌ；ｔＪＭ１０１株中に形質転換させた（ ｖ
ａｎ；５ｃｈ−ｐｅｒｒｏｎら、１９８５年）。形質転
換後、細菌を選択マーカーとしてアンピシリンとＸ−ｇ
ａｌを含有する２ＹＴ寒天上に広げ１＝ 、いくつかの
青い］日ニーから得たプラスミドの制限酵素切断パター
ンを試験した結果、ｐＵＣ９に帰因するポリリンカー配
列が、プラスミドｐＵＣ１９のポリリンカー配列に置き
換えられていることが結論できた。この交換のためベク
タープラスミド１）ＫＬＩＮ １９は、プラスミドｐＫ
ＵＮ９に比較して４つの単一の制限酵素切断部位を得た
（Ｎ素Ｓｐｈ Ｉ 、Ｘｂａ Ｉ、Ｋｐｎ Ｔｅｎ
５ｓｔ１）結果、そのクローニングベクターとしての有
用性がさらに増大した。
９を制限酵素Ｅｃｏ Ｒ１，Ｈｉｎｄｌ［Ｉ、Ｐ ｓ
１： Ｔで消化した得た断片に添加した。これらの酵
素はｐＫＵＮ９のポリリンカー配列を切断することによ
り不活性化させる。こうして得られる混合液にリガーゼ
を加えた。次に生成した組み換えＤＮＡ分子を大腸菌Ｊ
Ｍ８３．ｌ；ｔＪＭ１０１株中に形質転換させた（ ｖ
ａｎ；５ｃｈ−ｐｅｒｒｏｎら、１９８５年）。形質転
換後、細菌を選択マーカーとしてアンピシリンとＸ−ｇ
ａｌを含有する２ＹＴ寒天上に広げ１＝ 、いくつかの
青い］日ニーから得たプラスミドの制限酵素切断パター
ンを試験した結果、ｐＵＣ９に帰因するポリリンカー配
列が、プラスミドｐＵＣ１９のポリリンカー配列に置き
換えられていることが結論できた。この交換のためベク
タープラスミド１）ＫＬＩＮ １９は、プラスミドｐＫ
ＵＮ９に比較して４つの単一の制限酵素切断部位を得た
（Ｎ素Ｓｐｈ Ｉ 、Ｘｂａ Ｉ、Ｋｐｎ Ｔｅｎ
５ｓｔ１）結果、そのクローニングベクターとしての有
用性がさらに増大した。
Ｄ、ｐＫＬＪＮ９のＤＮＡ鎖の選択的かつ効率的パッケ
ージング Ｉｋｅ−９と１１１１の双方の指令下Ｆ １） Ｋ ｊ
Ｊ Ｎ９の１本鎖ＤＮＡが効率的にアンピシリン耐性形
質導入粒子中にパッケージされているという証拠を得る
ため、ｒ） Ｋ Ｕ Ｎ ９を有するＪＭ８３（Ｎ３／
Ｆ′）細胞を５Ｘ１０８細胞／１になるまで増殖させた
後、Ｉｋｅ−９又はＩＲｌで感染させた（感染倍率２０
倍）。１２時間感染させた後、感染ファージと形質転換
導入粒子の数を求めた。その結果■ｋｅ−９とＩＲｌの
両方で感染させた細胞の一１二澄液に存在する形質転換
導入粒子の数は、実質的に感染ファージ粒子の数と同じ
であった。
ージング Ｉｋｅ−９と１１１１の双方の指令下Ｆ １） Ｋ ｊ
Ｊ Ｎ９の１本鎖ＤＮＡが効率的にアンピシリン耐性形
質導入粒子中にパッケージされているという証拠を得る
ため、ｒ） Ｋ Ｕ Ｎ ９を有するＪＭ８３（Ｎ３／
Ｆ′）細胞を５Ｘ１０８細胞／１になるまで増殖させた
後、Ｉｋｅ−９又はＩＲｌで感染させた（感染倍率２０
倍）。１２時間感染させた後、感染ファージと形質転換
導入粒子の数を求めた。その結果■ｋｅ−９とＩＲｌの
両方で感染させた細胞の一１二澄液に存在する形質転換
導入粒子の数は、実質的に感染ファージ粒子の数と同じ
であった。
培養上澄液から１本鎖ＤＮＡを１ｌ１１ｔＬアガロース
ゲル上で分画した場合も同様の結果が得られた。
ゲル上で分画した場合も同様の結果が得られた。
各ＤＮＡ調製物において、２つの１本鎖ＤＮＡ分子が大
体等量存在しており、１つはファージＤＮＡにもう１つ
はプラスミドＤＮＡに対応していた。これらのデータか
らｌ ｋｅ−９とＩＲｌの双方の指令下でｐ Ｋ ＬＪ
Ｎ ９の１重鎖ＤＮＡが効率的にファージ用粒子中に
パッケージされていることが結論できた。
体等量存在しており、１つはファージＤＮＡにもう１つ
はプラスミドＤＮＡに対応していた。これらのデータか
らｌ ｋｅ−９とＩＲｌの双方の指令下でｐ Ｋ ＬＪ
Ｎ ９の１重鎖ＤＮＡが効率的にファージ用粒子中に
パッケージされていることが結論できた。
１ｋｅ−９の遺伝子■蛋白はＦｆのく＋）−複製開始点
のみを含むＤＮＡ分子を複製できない（イの逆も真であ
る）という事実は、１ｋｅ−９感染細胞中ではＩ鎖がぞ
してＴＲ１感染細胞中ではＦ＃１４が、形質導入ファー
ジ様粒子中に選択的にパッケージされていることを示唆
している。この仮定が正しいという証拠を得るために、
Ｉｋｅ−９及びＩＲ１感染ｐＵＣ９含有細胞の培養−Ｌ
澄液から単離した１本鎖ＤＮＡ中のＩ ａｃＺ遺伝子の
ヌクレオチド配列を、マスター及び逆配列決定プライマ
ーを用いて決定した（（ｂ）（ａ）参照）。これらのプ
ライマーはｌ ａｃＺ遺伝子の１つの鎖（これはｐＫＵ
Ｎ９の１及びＦ鎖の両方に存在するがファージＤＮＡ中
には存在しない）のみに相補的であるため、これらのプ
ライマーを使用する配列解析により１本鎖［）ＮＡＩ製
物中物中ＫＵＮ９の１つの鎖のみ又は２本の鎖が存在す
るか否かがわかる。第３図に示すように、Ｉｋｅ−９感
染細胞により産生きれる形質導入粒子から単離される１
本鎖ＤＮＡ中のＩ ａｃ７遺伝子のヌクレオチド配列は
マスタープラマーを使用する場合のみ求められるが、Ｔ
ＲＩ感染細胞により産生される形質導入粒子から単離さ
れる１重鎖ｒｌＮＡ中に存在するＩ ａｃＺ遺伝子のヌ
クレオチド配列の解析には逆ブライマーを使用しなけれ
ばならない。同じプライマーをプローブとして用いる１
本鎖ＤＮＡ調製物のドツトブロン１〜ハイブリダイゼー
シヨンにより同様の結論が得られた。すなわちマスター
プライマーはＩｋｅ−９によりパッケージされた１重鎖
Ｄ”ＮＡとのみハイブリダイゼーションしたが、逆プラ
イマーはＩＲｌ組み立てＤＮＡとのみハイブリダイゼー
ションした。
のみを含むＤＮＡ分子を複製できない（イの逆も真であ
る）という事実は、１ｋｅ−９感染細胞中ではＩ鎖がぞ
してＴＲ１感染細胞中ではＦ＃１４が、形質導入ファー
ジ様粒子中に選択的にパッケージされていることを示唆
している。この仮定が正しいという証拠を得るために、
Ｉｋｅ−９及びＩＲ１感染ｐＵＣ９含有細胞の培養−Ｌ
澄液から単離した１本鎖ＤＮＡ中のＩ ａｃＺ遺伝子の
ヌクレオチド配列を、マスター及び逆配列決定プライマ
ーを用いて決定した（（ｂ）（ａ）参照）。これらのプ
ライマーはｌ ａｃＺ遺伝子の１つの鎖（これはｐＫＵ
Ｎ９の１及びＦ鎖の両方に存在するがファージＤＮＡ中
には存在しない）のみに相補的であるため、これらのプ
ライマーを使用する配列解析により１本鎖［）ＮＡＩ製
物中物中ＫＵＮ９の１つの鎖のみ又は２本の鎖が存在す
るか否かがわかる。第３図に示すように、Ｉｋｅ−９感
染細胞により産生きれる形質導入粒子から単離される１
本鎖ＤＮＡ中のＩ ａｃ７遺伝子のヌクレオチド配列は
マスタープラマーを使用する場合のみ求められるが、Ｔ
ＲＩ感染細胞により産生される形質導入粒子から単離さ
れる１重鎖ｒｌＮＡ中に存在するＩ ａｃＺ遺伝子のヌ
クレオチド配列の解析には逆ブライマーを使用しなけれ
ばならない。同じプライマーをプローブとして用いる１
本鎖ＤＮＡ調製物のドツトブロン１〜ハイブリダイゼー
シヨンにより同様の結論が得られた。すなわちマスター
プライマーはＩｋｅ−９によりパッケージされた１重鎖
Ｄ”ＮＡとのみハイブリダイゼーションしたが、逆プラ
イマーはＩＲｌ組み立てＤＮＡとのみハイブリダイゼー
ションした。
これらの観察は、ｐ Ｋ ｔＪ Ｎ ９含有細胞による
感染後はＩ鎖が、ＴＲＩによる感染後は相補的（Ｆ鎖）
が効率的かつ選択的にファージ様形質導入粒子中にパッ
ケージされることを結論的に証明している。さらにこの
結果は、これらの粒子から単離される１本鎖ＤＮＡは、
ヌクレオチド配列解析に容易に使用できることを証明し
ている。
感染後はＩ鎖が、ＴＲＩによる感染後は相補的（Ｆ鎖）
が効率的かつ選択的にファージ様形質導入粒子中にパッ
ケージされることを結論的に証明している。さらにこの
結果は、これらの粒子から単離される１本鎖ＤＮＡは、
ヌクレオチド配列解析に容易に使用できることを証明し
ている。
文献
ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｆ ） 、ロドリゲス（Ｒ
ｏｄｏｒｉｇｕｅｚ、 Ｒ，１，、）、グリーン（Ｇｒ
ｅｅｎｅ、 Ｐ、Ｊ、）、ベララッチ（Ｂｅｔｌａｔｃ
ｈ、Ｈ，Ｃ，） 、ハイネツカー（１ｌｅｉｎｅｃｋｅ
ｒ、 Ｉｌ、 １．、 ）とボイヤー（Ｂｏｙｅｒ、
ｔｌ、 Ｗ、 ）（１９７７年）ジーン（Ｇｅｎｅ）第
２巻、９５−１１３頁 チリベルト（Ｃｉｌｉｈｅｒｔｏ、Ｇ、 ） 、ラウゲ
イ（ＲａＮ（ｌｅｉ、Ｇ、 ） 、Ｄスタンツオ（Ｃｏ
５ｔａｎｚｏ、 Ｆ、 ）、デンテ（Ｄｅｎｔｅ、 Ｌ
、 ）と］ルテセ（Ｃｏｒｔｅｓｅ、 Ｒ，）（１９８
３年）セル（ＣｅＮ）第３２巻、７２５〜７３３頁 デイニンガー（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ Ｐ、Ｌ、）（１９
８３年）アナリテイカルバイオケミストリ−（Ａｎａｌ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）第１３５巻、２４７−２６３＠
デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ、Ｄ、Ｔ、 ） 、ドレ
スラー（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ、Ｄ、 ）とレイ（Ｒａｙ
、１１．Ｓ、） ＦＡ （１９７８年）１本鎖ＤＮＡフ
ァージ、］−］ルドスブリングハーバー （Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ）研究所、］−］ルドス
プリングハーバー （Ｃｏｌｄ Ｓｔ＋ｒｉｎＯＨａｒ
ｂｏｒ＞ 、ニー’１−ヨーク デニソン（Ｄｅｎｎｉｓｏｎ、Ｓ、 ）とバウムバーグ
（Ｂａｕｉ＋ｕｈｅｒｏ、Ｓ、 ） （１９７５年）、
モル・ジエン・ジエネット（Ｍｏ１． ｇｅｎ、 Ｇｅ
ｎｅｔ、 ）第１３８巻、３２１−３３１頁 デンテ（Ｄｅｎｔｅ、１．） 、セサレニ（Ｃｅｓａｒ
ｅｎｉ、Ｇ、 ）と］ルテセ（Ｃｏｒｔｅｓｅ、Ｒ，）
（１９８３年）ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎ
ｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）第１１巻、１６４５
−１６５５頁 ドツト−（Ｄｏｔｔｏ、 Ｇ、 Ｐ、 ）とシンダー（
７ｉｎｄｅｒ、Ｎ。
ｏｄｏｒｉｇｕｅｚ、 Ｒ，１，、）、グリーン（Ｇｒ
ｅｅｎｅ、 Ｐ、Ｊ、）、ベララッチ（Ｂｅｔｌａｔｃ
ｈ、Ｈ，Ｃ，） 、ハイネツカー（１ｌｅｉｎｅｃｋｅ
ｒ、 Ｉｌ、 １．、 ）とボイヤー（Ｂｏｙｅｒ、
ｔｌ、 Ｗ、 ）（１９７７年）ジーン（Ｇｅｎｅ）第
２巻、９５−１１３頁 チリベルト（Ｃｉｌｉｈｅｒｔｏ、Ｇ、 ） 、ラウゲ
イ（ＲａＮ（ｌｅｉ、Ｇ、 ） 、Ｄスタンツオ（Ｃｏ
５ｔａｎｚｏ、 Ｆ、 ）、デンテ（Ｄｅｎｔｅ、 Ｌ
、 ）と］ルテセ（Ｃｏｒｔｅｓｅ、 Ｒ，）（１９８
３年）セル（ＣｅＮ）第３２巻、７２５〜７３３頁 デイニンガー（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ Ｐ、Ｌ、）（１９
８３年）アナリテイカルバイオケミストリ−（Ａｎａｌ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）第１３５巻、２４７−２６３＠
デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ、Ｄ、Ｔ、 ） 、ドレ
スラー（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ、Ｄ、 ）とレイ（Ｒａｙ
、１１．Ｓ、） ＦＡ （１９７８年）１本鎖ＤＮＡフ
ァージ、］−］ルドスブリングハーバー （Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ）研究所、］−］ルドス
プリングハーバー （Ｃｏｌｄ Ｓｔ＋ｒｉｎＯＨａｒ
ｂｏｒ＞ 、ニー’１−ヨーク デニソン（Ｄｅｎｎｉｓｏｎ、Ｓ、 ）とバウムバーグ
（Ｂａｕｉ＋ｕｈｅｒｏ、Ｓ、 ） （１９７５年）、
モル・ジエン・ジエネット（Ｍｏ１． ｇｅｎ、 Ｇｅ
ｎｅｔ、 ）第１３８巻、３２１−３３１頁 デンテ（Ｄｅｎｔｅ、１．） 、セサレニ（Ｃｅｓａｒ
ｅｎｉ、Ｇ、 ）と］ルテセ（Ｃｏｒｔｅｓｅ、Ｒ，）
（１９８３年）ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎ
ｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）第１１巻、１６４５
−１６５５頁 ドツト−（Ｄｏｔｔｏ、 Ｇ、 Ｐ、 ）とシンダー（
７ｉｎｄｅｒ、Ｎ。
ｌｂ、）（１９８３年）ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｏｙ
）第１３０巻、２５２−２５６頁 ドツト−（Ｄｏｔｔｏ、 Ｇ、 Ｐ、 ） 、ホリウチ
（ＮＯｒｉＮｃｈｉ。
）第１３０巻、２５２−２５６頁 ドツト−（Ｄｏｔｔｏ、 Ｇ、 Ｐ、 ） 、ホリウチ
（ＮＯｒｉＮｃｈｉ。
Ｋ、）、！ニーシンダー（７ｉｎｄｅｒ、Ｎ、Ｄ、 ＞
（１９８１年）ピロロジー（ＶｉｒｏｌｏＯＶ）第
１１４巻、４６３−４７３頁 ゲラート（ＧｅＮｅｒｔ ）ら（１９７７年）、プＯシ
ーデイングズオブナショナルアカデミーオブサイエンシ
ーズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）米
国、第７４巻、４７７２−４７７６頁 グオ（Ｇｕｏ、 Ｌ−１ｆ ）とウー（ＩＪｕ、Ｒ，）
（１９８２年）ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄＲｅｓ、 ）第１１巻、４８９Ｌ
−４９０６頁ヒル（ＮｉＮ、Ｄ、Ｆ、 ）とビータ−セ
ン（ｐｅｔｅｒｓｅｎＧ、Ｂ、＞（１９８２年）ジャー
ナルオブビロロジ−（，１，Ｖｉｒｏｌ、）第４４巻、
３２−４６６頁ツー１０＋、Ｎ、 ）とメツシンダ（Ｈ
ｅｓｓｉｎｏ、Ｊ、） （１９８２年）ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）第１７巻、２７１−２７７頁 ＝ ４０− カスーン（ＫａｔｈｏＯｎ、 Ｉｆ、）、アイヤー（ｒ
ｙｅｒ、Ｒ，Ｖ、）とアイヤー（Ｉｙｅｒ、Ｖ、 ）
（１９７２年）ピロロジー （ｖ＋ｒｏ＋ｏｇｙ）第
４８巻、１４５−１５５頁コニングズ（にｏｎｉｎｇｓ
、Ｒ，Ｎ、Ｎ、）（１９８０年）メソツズインエンザイ
モロジー（ｔ４ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ）第６５巻
、７９５−８１１頁 マンデ／Ｌ／ （Ｈａｎｄｅｌ、Ｈ，）とヒガ（旧ｇａ
、＾、）（１９７０年）ジャーナルオブモレキュラーバ
イオロジー（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 ）第５３巻、１
５１−１６１頁 マニアテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、 ） 、フリッ
チ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、 ）サンプルーフ（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、 ）（１９８２年）モレキュラーク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｏ） 、
−］−ルドスプリングハーバー（Ｃ１ｏｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ｔｌａｒｈｏｒ） 、ニューヨークメツシンダ（Ｈ
ｅｓｓｉｎｏ、Ｊ、 ） （１９７９年）リコンビナ
ントテクニカルプルティン（Ｒｅｃｏｍｂ ｉ ｎａｎ
ｔＴｅｃｈｎｉｃａｌ ＢｕＮｅｔｉｎ）第２巻、４３
−４８頁メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、） 、フレ
ア（Ｃｒｅａ、 Ｒ，）とシーバーブ（Ｓｅｅｂｅｒｏ
、Ｐ、１１． ） （１９８１年）ヌクレイツクアシッ
ドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄＲｅｓ、 ）第
９巻、３０９−３２１頁メツシング（Ｈｅｓｓｉｎ（１
，Ｊ、 ） （１９８３年）メソツズインエンザイモ
ロジー（Ｈｅｔｈ、ＥｎＺＶＲＩＯｌ、 ）第１０１巻
、２０−７８頁 メイヤー（）ｌｅｙｅｒ、 Ｔ、 Ｆ、 ） 、ゲイジ
ー（Ｇｅ１ｄｅｒ、 Ｋ、 ）、クルゾ（Ｋｕｒｚ、
Ｃ，）とシャクー（ＳｃｈａＮｅｒ、Ｉｆ、 ）（１９
７９年）ネーチャー第２７８巻、３６５−３６７頁 メイヤー（Ｎｅｖｅｒ、 Ｔ、 Ｆ、 ）とゲイジー（
Ｇｅ１ｄｅｒ、に、）（１９８２年）ネーチャー第２９
６巻、８２８−８３２頁 ミラー（旧ｔｉｅｒ、Ｊ、１１． ） （１９７２年）
エクスペリメンツインモレキュラージエニテイツクス（
［ｘｐｅｒｉＩＩｌｅｎｔｓ ｉｎ Ｈｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ） ｍｌ−ルドスプリングハー
バー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂＯｒ）、ニ
ューヨーク オールド（Ｏｌｄ、Ｒ，４４，）とブリムローズ（Ｐｒ
ｉｍｒｏｓｅ、 Ｓ、Ｂ、） （１９８２年）遺伝子
操作の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅ
Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ） 、第２版、ブラックウ
エルサイエンティフィックパブリケイションズ（Ｂｌａ
ｃｋｗｅＮ ｓｃ＋ｅｎｔｔｒｔｃＰｕｂｌｉｃａ口ｏ
ｎｓ）、ロンドンピ ーターズ（ＰｅｅｔｅｒＳ、Ｂ、Ｐ、１１．） 、コニ
ングズ（にｏｎｉｎｏｓ、Ｒ，Ｎ、１１． ）とシエー
ンメーカーズ（Ｓｃｈｏｅｒｖａｋｅｓ、Ｊ、Ｇ、Ｇ、
） （１９８３年）ジャーナルオブモレキュラーバイ
オロジー（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ。）第１６９巻、１９
７−２１５頁 ビーターズ（Ｐｅｅｔｅｒｓ、Ｂ、Ｐ、１１．） 、ピ
ーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ、Ｒ，Ｈ，） 、シエーンメー
カーズ（５ｃｈｏｅｎａｉａｋｅｓ、 Ｊ、 Ｇ、 Ｇ
、 ）とコニングズ（にｏｎｉｎｏｓ ）（１９８５年
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ｏ１． Ｂｉｏｌ、 ）第１８１巻、２７−３９頁 ルーサー（Ｒｕｅｔｈｅｒ、 ＩＩ、）、ケーネン（に
ｏｅｎｅｎ。
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（１９８２年）ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕ
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ン（ｐｅｔｅｒｓｅｎＧ、Ｂ、＞（１９８２年）ジャー
ナルオブビロロジ−（，１，Ｖｉｒｏｌ、）第４４巻、
３２−４６６頁ツー１０＋、Ｎ、 ）とメツシンダ（Ｈ
ｅｓｓｉｎｏ、Ｊ、） （１９８２年）ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）第１７巻、２７１−２７７頁 ＝ ４０− カスーン（ＫａｔｈｏＯｎ、 Ｉｆ、）、アイヤー（ｒ
ｙｅｒ、Ｒ，Ｖ、）とアイヤー（Ｉｙｅｒ、Ｖ、 ）
（１９７２年）ピロロジー （ｖ＋ｒｏ＋ｏｇｙ）第
４８巻、１４５−１５５頁コニングズ（にｏｎｉｎｇｓ
、Ｒ，Ｎ、Ｎ、）（１９８０年）メソツズインエンザイ
モロジー（ｔ４ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ）第６５巻
、７９５−８１１頁 マンデ／Ｌ／ （Ｈａｎｄｅｌ、Ｈ，）とヒガ（旧ｇａ
、＾、）（１９７０年）ジャーナルオブモレキュラーバ
イオロジー（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 ）第５３巻、１
５１−１６１頁 マニアテイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、 ） 、フリッ
チ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、 ）サンプルーフ（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、 ）（１９８２年）モレキュラーク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｏ） 、
−］−ルドスプリングハーバー（Ｃ１ｏｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ｔｌａｒｈｏｒ） 、ニューヨークメツシンダ（Ｈ
ｅｓｓｉｎｏ、Ｊ、 ） （１９７９年）リコンビナ
ントテクニカルプルティン（Ｒｅｃｏｍｂ ｉ ｎａｎ
ｔＴｅｃｈｎｉｃａｌ ＢｕＮｅｔｉｎ）第２巻、４３
−４８頁メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、） 、フレ
ア（Ｃｒｅａ、 Ｒ，）とシーバーブ（Ｓｅｅｂｅｒｏ
、Ｐ、１１． ） （１９８１年）ヌクレイツクアシッ
ドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄＲｅｓ、 ）第
９巻、３０９−３２１頁メツシング（Ｈｅｓｓｉｎ（１
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ロジー（Ｈｅｔｈ、ＥｎＺＶＲＩＯｌ、 ）第１０１巻
、２０−７８頁 メイヤー（）ｌｅｙｅｒ、 Ｔ、 Ｆ、 ） 、ゲイジ
ー（Ｇｅ１ｄｅｒ、 Ｋ、 ）、クルゾ（Ｋｕｒｚ、
Ｃ，）とシャクー（ＳｃｈａＮｅｒ、Ｉｆ、 ）（１９
７９年）ネーチャー第２７８巻、３６５−３６７頁 メイヤー（Ｎｅｖｅｒ、 Ｔ、 Ｆ、 ）とゲイジー（
Ｇｅ１ｄｅｒ、に、）（１９８２年）ネーチャー第２９
６巻、８２８−８３２頁 ミラー（旧ｔｉｅｒ、Ｊ、１１． ） （１９７２年）
エクスペリメンツインモレキュラージエニテイツクス（
［ｘｐｅｒｉＩＩｌｅｎｔｓ ｉｎ Ｈｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ） ｍｌ−ルドスプリングハー
バー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂＯｒ）、ニ
ューヨーク オールド（Ｏｌｄ、Ｒ，４４，）とブリムローズ（Ｐｒ
ｉｍｒｏｓｅ、 Ｓ、Ｂ、） （１９８２年）遺伝子
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Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ） 、第２版、ブラックウ
エルサイエンティフィックパブリケイションズ（Ｂｌａ
ｃｋｗｅＮ ｓｃ＋ｅｎｔｔｒｔｃＰｕｂｌｉｃａ口ｏ
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ンメーカーズ（Ｓｃｈｏｅｒｖａｋｅｓ、Ｊ、Ｇ、Ｇ、
） （１９８３年）ジャーナルオブモレキュラーバイ
オロジー（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ。）第１６９巻、１９
７−２１５頁 ビーターズ（Ｐｅｅｔｅｒｓ、Ｂ、Ｐ、１１．） 、ピ
ーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ、Ｒ，Ｈ，） 、シエーンメー
カーズ（５ｃｈｏｅｎａｉａｋｅｓ、 Ｊ、 Ｇ、 Ｇ
、 ）とコニングズ（にｏｎｉｎｏｓ ）（１９８５年
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ｏ１． Ｂｉｏｌ、 ）第１８１巻、２７−３９頁 ルーサー（Ｒｕｅｔｈｅｒ、 ＩＩ、）、ケーネン（に
ｏｅｎｅｎ。
Ｈ９）、オツトー（ａ）ｔｔｏ、に、）とミュラー−ヒ
ル（ＨｕｅＮｅｒ−１１ｉ１１．８） （１９８１年）
ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄ、Ｒｅｓ、 ）第９巻、４０８７−４０９８頁 サンガー（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、）、ニツクレン（Ｎｉ
ｃｋｌｅｎ、Ｓ、）とクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ
、Ｒ，） （１９７７年）プロシーデイングズオブナシ
ョナルアカデミーオブサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）米国第７４巻、５４６３
−５４６７頁 サンガー（Ｓａｎｏｅｒ、Ｆ、 ） 、クールソン（Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ。
ル（ＨｕｅＮｅｒ−１１ｉ１１．８） （１９８１年）
ヌクレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄ、Ｒｅｓ、 ）第９巻、４０８７−４０９８頁 サンガー（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、）、ニツクレン（Ｎｉ
ｃｋｌｅｎ、Ｓ、）とクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ
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ョナルアカデミーオブサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）米国第７４巻、５４６３
−５４６７頁 サンガー（Ｓａｎｏｅｒ、Ｆ、 ） 、クールソン（Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ。
Ａ、Ｒ，）、バレル（Ｂａｒｒｅｌ、Ｂ、Ｇ、 ） 、
スミス（Ｓｍｉｔｈ、＾、Ｊ、１１． ）とルー（Ｒ
ｏｅ、 Ｂ、＾、）（１９８０年）ジャーナルオブモレ
キュラーバイオロジー（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 ）第
１４３巻、１６１−１７８頁スｎ］ンベ（ＳＩｏｃｏｍ
ｂｅ、Ｐ、 ） 、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ、Ａ、
） 、ボズリー（Ｂｏｓｅｌｅｖ、 Ｐ、 ）とブルク
（ＢＮｒｋｅ、口、Ｃ，）（１９８２年）プロシーデイ
ングズオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズ（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）米国第７
９巻、５４５５−５４５９頁 ピエイラ（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、 ）とメツシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ。
スミス（Ｓｍｉｔｈ、＾、Ｊ、１１． ）とルー（Ｒ
ｏｅ、 Ｂ、＾、）（１９８０年）ジャーナルオブモレ
キュラーバイオロジー（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、 ）第
１４３巻、１６１−１７８頁スｎ］ンベ（ＳＩｏｃｏｍ
ｂｅ、Ｐ、 ） 、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ、Ａ、
） 、ボズリー（Ｂｏｓｅｌｅｖ、 Ｐ、 ）とブルク
（ＢＮｒｋｅ、口、Ｃ，）（１９８２年）プロシーデイ
ングズオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズ（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）米国第７
９巻、５４５５−５４５９頁 ピエイラ（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、 ）とメツシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ。
Ｊ、Ｈ，） （１９８２年）ジーン（Ｇｅｎｅ ）第１
９巻、２６９−２７６頁 ウオレス（ＷａＮａｃｅ、Ｒ，Ｂ、 ） 、ジョンソン
（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｈ，Ｊ、） 、サツグズ（Ｓｕｇ（
Ｉｓ、Ｓ、Ｖ 、 ）、ミヨシ（Ｈｉｙｏｓｈｉ、に、
） 、ブハット（Ｂｈａｔｔ、 Ｒ，）とイタクラ（
Ｉｔａｋｕｒａ、に、 ） （１９８１年）ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）第１６巻、２１−２６頁 ヤニツシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、
Ｃ） 、ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、）とメツシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ）（１９８５年）ジーン（
ｃｅｎｅ）第３３巻、１０３−１１９頁 シラー（ＺｏＮｅｒ、Ｈ，Ｊ、 ）とスミス（Ｓｍｉｔ
ｈ、Ｈ，）（１９８２年）ヌクレイツクアシッドリサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ）第１０
巻、６４８７−６５００頁
９巻、２６９−２７６頁 ウオレス（ＷａＮａｃｅ、Ｒ，Ｂ、 ） 、ジョンソン
（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｈ，Ｊ、） 、サツグズ（Ｓｕｇ（
Ｉｓ、Ｓ、Ｖ 、 ）、ミヨシ（Ｈｉｙｏｓｈｉ、に、
） 、ブハット（Ｂｈａｔｔ、 Ｒ，）とイタクラ（
Ｉｔａｋｕｒａ、に、 ） （１９８１年）ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）第１６巻、２１−２６頁 ヤニツシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、
Ｃ） 、ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、）とメツシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ）（１９８５年）ジーン（
ｃｅｎｅ）第３３巻、１０３−１１９頁 シラー（ＺｏＮｅｒ、Ｈ，Ｊ、 ）とスミス（Ｓｍｉｔ
ｈ、Ｈ，）（１９８２年）ヌクレイツクアシッドリサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ）第１０
巻、６４８７−６５００頁
第１図は、プラスミドｐＬＩｃ９から出発して本発明の
プラスミドｐＫＬＪＮ９を構築する方法を示す。 第２図は、ｐ Ｋ Ｕ Ｎ ９から本発明のプラスミド
ｒ）ＫｔＪＮ１９を構築する方法を示す。 第３図は、感染ＩＩｌ胞から単離された形質導入粒子中
に存在する１ａｃＺ遺伝子のヌクレオチド配列の一部を
示す。
プラスミドｐＫＬＪＮ９を構築する方法を示す。 第２図は、ｐ Ｋ Ｕ Ｎ ９から本発明のプラスミド
ｒ）ＫｔＪＮ１９を構築する方法を示す。 第３図は、感染ＩＩｌ胞から単離された形質導入粒子中
に存在する１ａｃＺ遺伝子のヌクレオチド配列の一部を
示す。
Claims (17)
- （１）ベクタープラスミドにおいて： ａ）Ｆ繊毛を有する大腸菌の繊維状バクテリオファージ
の複製開始点＋形態形成シグナル、又はそれらの活性突
然変異体；及び ｂ）Ｎ繊毛を有する大腸菌の繊維状バクテリオファージ
の複製開始点＋形態形成シグナル、又はそれらの活性突
然変異体を、互いに反対の配向で組み込んでいる出発ベ
クターから作成される、上記ベクタープラスミド。 - （２）ａ）繊維状バクテリオファージＦｆ（Ｍ１３、ｆ
ｄ及びｆ１）又はその突然変異体の複製開始点＋形態形
成シグナル、又はそれらの活性突然変異体；及び ｂ）繊維状バクテリオファージＩＫｅ又はその突然変異
体の複製開始点＋形態形成シグナル、又はそれらの活性
突然変異体を含有する、特許請求の範囲第１項に記載の
ベクタープラスミド。 - （３）ｐＵＣプラスミドを出発ベクターとする、特許請
求の範囲第１項又は第２項に記載のベクタープラスミド
。 - （４）プラスミドｐＵＣ９を出発ベクターとする、特許
請求の範囲第３項に記載のベクタープラスミド。 - （５）（ａ）は制限酵素ＮａｒＩの単一の認識配列に挿
入されており、 （ｂ）は制限酵素ＮｄｅＩの単一の認識配列に挿入され
ているか、又はこの逆になつている、特許請求の範囲第
４項に記載のベクタープラスミド。 - （６）第１図に示す構造を有するベクタープラスミドｐ
ＫＵＮ９。 - （７）第２図に示す構造を有するベクタープラスミドｐ
ＫＵＮ１９。 - （８）１個の２本鎖ＤＮＡが適当な位置に挿入されてい
る、特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれか１
項に記載のベクタープラスミド。 - （９）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれか
１項に記載のベクタープラスミドを含有する微生物、特
に大腸菌。 - （１０）Ｆ−特異的及び／又はＮ−特異的繊維状バクテ
リオファージによる感染に対して感受性がありかつ、特
許請求の範囲第１項から第８項までのいずれか１項に記
載のベクタープラスミドを含有する大腸菌。 - （１１）１個の２本鎖ＤＮＡの鎖の１本又は２本を、フ
ァージ様粒子を含有する１本鎖ＤＮＡに選択的にパッケ
ージする方法において、Ｆ−特異的繊維状バクテリオフ
ァージによる感染に対して感受性がありかつ特許請求の
範囲第８項に記載のベクタープラスミドを含有する大腸
菌を、Ｆ−特異的繊維状バクテリオファージで感染され
、インキュベートした後、ファージ様形質導入粒子を単
離するか、及び／又はＮ−特異的繊維状バクテリオファ
ージによる感染に対して感受性がありかつ特許請求の範
囲第８項に記載のベクタープラスミドを含有する大腸菌
を、Ｎ−特異的繊維状バクテリオファージで感染させ、
インキュベートした後、ファージ様形質導入粒子を単離
するか、又はＦ−特異的かつＮ−特異的繊維状バクテリ
オファージに対して感受性がありかつ特許請求の範囲第
８項に記載のベクタープラスミドを含有する大腸菌集団
の一部をＦ−特異的繊維状バクテリオファージで感染さ
せ、この集団の別の一部をＮ−特異的繊維状バクテリオ
ファージで感染させ、インキュベートした後、生成した
ファージ様形質導入粒子を単離することより成る、上記
方法。 - （１２）２本鎖ＤＮＡの一片のヌクレオチド配列の決定
方法において、特許請求の範囲第１１項に記載の方法に
より別々に鎖を得た後、このＤＮＡ鎖の２本のそれぞれ
のヌクレオチド配列を公知の方法により決定することよ
り成る、上記方法。 - （１３）ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡのクローニン
グ、ＤＮＡ配列決定、部位特異的突然変異誘発、Ｓ１マ
ッピング、クローン化ＤＮＡの発現、及び１本鎖ハイブ
リダイゼーシヨンプローブの調製のための、特許請求の
範囲第８項に記載のベクタープラスミドの使用。 - （１４）特許請求の範囲第１項に記載のベクタープラス
ミドの構築法において、親ベクターの制限酵素認識配列
で（ａ）又は（ｂ）をクローン化し、形質転換体を選択
し、親ベクターの別の制限酵素認識配列で（ｂ）又は（
ａ）をクローン化し、そして形成転換体を選択すること
より成る、上記方法。 - （１５）特許請求の範囲第５項に記載のベクタープラス
ミドの構築法において、ｐＵＣ９の制限酵素Ｎａｒ I
又は制限酵素Ｎｄｅ I の単一の認識配列で（ａ）又は
（ｂ）をクローン化し、Ｆ−特異的又はＮ−特異的繊維
状バクテリオファージで感染させた大腸菌のｐｏｌＡ突
然変異体により形質転換体を選択し、次に未使用の単一
の認識配列で、得られた組み変えプラスミドの１つで（
ｂ）又は（ａ）をクローン化し、そしてＮ−特異的又は
Ｆ−特異的繊維状バクテリオファージで感染された大腸
菌のｐｏｌＡ突然変異体により形質転換体を選択するこ
とより成る、上記方法。 - （１６）ベクタープラスミドｐＫＵＮ９の構築方法にお
いて、プラスミドｐＵＣ９を制限酵素ＮＤｅ I とクレ
ノウＤＮＡポリメラーゼ I で処理して、平滑末端線状
２本鎖ＤＮＡを形成させ、この線状ＤＮＡを平滑末端線
状２本鎖ＤＮＡ（これはプラスミドｐＩＫｏｒｉ２ｂ（
１）を制限酵素ＥｃｏＲ I とＢａｍＨ I で処理し、Ｉ
ｋｅの（＋）複製開始点＋形態形成シグナルを有する断
片を単離し、これをクレノウＤＮＡポリメラーゼ I で
処理して作成する）と連結させ、Ｉｋｅ又はその突然変
異体で感染させた大腸菌のｐｏｌＡ突然変異株の形質転
換とアンピシリン耐性コロニーの選択により、ｐＵＣ９
のＮｄｅ I 部位にＩｋｅの複製開始点＋形態形成シグ
ナルが挿入された形質転換体を選択し、ｐＵＣ９のｌａ
ｃＺ遺伝子と同じ配向でＩｋｅの（＋）複製開始点を含
有する組み換えプラスミドを単離し、このこのプラスミ
ドを制限酵素素Ｎａｒ I とクレノウＤＮＡポリメラー
ゼ I で処理して、平滑末端線状２本鎖ＤＮＡを形成さ
せ、この線状ＤＮＡを平滑末端線状２本鎖ＤＮＡ（これ
はプラスミドｐＥＭＢＬ８を制限酵素Ｒｓａ I で処理
し、ｆ１の（＋）複製開始点＋形態形成シグナルを含有
する断片を単離し、これをクレノウＤＮＡポリメラーゼ
I で処理して作成する）と連結させ、Ｆｆ又はその突
然変異体で感染させた大腸菌のｐｏｌＡ突然変異株の形
質転換とアンピシリン耐性コロニーの選択により、ｐＵ
Ｃ９のＮａｒ I 部位にｆ１の複製開始点＋形態形成シ
グナルが挿入された形質転換体を選択することより成る
、上記方法。 - （１７）ベクタープラスミドｐＫＵＮ１９の構築法にお
いて、プラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＥｃｏＲ I 、
ＨｉｎｄIIIで処理し次に制限酵素ＨａｅIIで処理して
、この消化生成物を単離し、これを特許請求の範囲第６
項に記載のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ I 、Ｈｉｎ
ｄIII及びＰｓｔ I で消化して得られる断片に添加し、
この混合液にリガーゼを加え、生成したＤＮＡ分子を適
当な大腸菌に形質転換し、これをアンピシリンとｘ−ｇ
ａｌを含有する寒天平板上で選択することより成る、上
記方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8502061 | 1985-07-17 | ||
| NL8502061A NL8502061A (nl) | 1985-07-17 | 1985-07-17 | Nieuwe vectorplasmiden, hun constructie en toepassing, en micro-organismen waarin ze zijn opgenomen. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6219088A true JPS6219088A (ja) | 1987-01-27 |
Family
ID=19846329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61168975A Pending JPS6219088A (ja) | 1985-07-17 | 1986-07-17 | 新規ベクタ−プラスミド |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0209204A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6219088A (ja) |
| NL (1) | NL8502061A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8801805A (nl) * | 1988-07-15 | 1990-02-01 | Rijksuniversiteit | Dna sequencing methode en daarvoor bruikbare primer. |
| EP0354727A3 (en) * | 1988-08-08 | 1990-11-22 | Eli Lilly And Company | Novel single stranded phasmid vectors and methods for transforming streptomyces and other actinomycetes |
| GB2250290A (en) * | 1990-11-21 | 1992-06-03 | Astra Ab | Phasmid vectors |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2516094A1 (fr) * | 1981-11-06 | 1983-05-13 | Wellcome Found | Vecteur de clonage recombinant, micro-organisme transforme par ce vecteur, bacteriophage et procede pour produire un polypeptide heterologue |
| JPS6091984A (ja) * | 1983-10-22 | 1985-05-23 | Gakuzo Tamura | 新規プラスミドベクタ− |
-
1985
- 1985-07-17 NL NL8502061A patent/NL8502061A/nl not_active Application Discontinuation
-
1986
- 1986-07-16 EP EP86201252A patent/EP0209204A1/en not_active Withdrawn
- 1986-07-17 JP JP61168975A patent/JPS6219088A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0209204A1 (en) | 1987-01-21 |
| NL8502061A (nl) | 1987-02-16 |
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