JPS62201584A - 多数のクロ−ニング部位を有するストレプトマイシン感受性遺伝子、それを含むプラスミドベクタ−およびそのベクタ−を含む微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の前頭〕 技術分野 本発明は、多数のクローニング部位を有するストレプト
マイシン感受性遺伝子（ｓｔｒＡ”、ｒＳｐｌ−＋また
はｓｍ”　＞およびこれを含むプラスミドベクターに関
する。また、本発明は、このプラスミドベクターを含む
微生物にｂｌＩｌする。

遺伝子操作において、希望する遺伝子の全体のクローニ
ングあるいは遺伝子の一部分のサブクローニングの技術
は最も繁用される重要な技術である。このクローニング
（サブクローニングも含む）の際に、用いられるプラス
ミドベクターの有する諸性質、具体的には、サイズ、細
胞あたりのコピー数、クローニング部位の種類と数、選
択のための薬剤耐性等のマーカー遺伝子の種類および宿
主（ｈｏｓｔ）の側の遺伝的性質に対する依存性等を検
討して、その使用法ないしは組み合わせを選択すること
は、実験の効率および成否を左右する大きな要因となり
つる。

これらのプラスミドベクターの性質の中で、特に外来Ｄ
ＮＡ断片が組み込まれたベクターのみを効率良く培地上
で選択する方法には、人別してネガティブな選択法とポ
ジティブな選択法の二つがあげられる。

ネガディプな選択法では、外来ＤＮＡ断片がプラスミド
ベクター上の特定の薬物耐性遺伝子をコードする領域の
クローニング部位に組み込まれ、この組み換えプラスミ
ドにより形質転換された宿主がその薬物に対して耐性か
ら感受性に表現形が変わることでその薬物を含む培地の
一ヒで生育できなくなるという性質を利用している。他
方、ポジディプな選択法では、外来ＤＮＡ断片が組み込
まれたプラスミドベクターを持つ宿主のみが特定の選択
培地で生育できることとか、あるいは生育してきたコロ
ニーのうら目的の組み換え体を右づ゛る菌体のみが色調
等の変化でたやすく識別できることなどの性質を利用し
ている。

この二つの方法を比較した場合、二段階の選別を必要と
するネガティブな選択より、ｖＡ者の一段階ですむポジ
ティブな選択方法が効率的である。

現在、繁用されているプラスミドベクターのうら前者の
代表例として、抗生物質のアンピシリンとテトラサイク
リンに対する耐性遺伝子をあわＵもつｐＢＲ３２２があ
げられ、またこのｐＢＲ３２２を母体として改良された
、さらにカナマイシンやクロラムフェニコールなどの薬
物耐性）ｎ伝子をも時には組み込んだ多くのプラスミド
ベクタ−があげられる。他方、後者の例としては、適当
な基質や誘発剤（１ｎｄＵｃｅｒ）の存在下で、外来Ｄ
ＮＡ断片を組み込んだプラスミドを右するコロニーのみ
が青色から白色に転換するｐＵＣ系のプラスミドベクタ
ーが汎用されている位で、その種類はまだ限られたもの
でしかない。

このＩごめ、新たな使いやすい、ポジティブ選択のでき
るプラスミドベクターの必要性は大ぎい。

友ユ亘薯 ポジティブな選択の可能なプラスミドベクターとして、
ストレプトマイシンに感受性を有する遺伝子（ＳｍＳ、
Ｓ　ｔ　ｒＡ　またはｒｐＳＬ　とよばれている）を含
むｐＮｏ１５２３と名づけられなプラスミドベクターが
既に作成されている（ジーン（Ｇｅｎｅ）　、第１５巻
、第９９〜１０２頁（１９８１年）〕。このプラスミド
ベクターはスウェーデン国ファルマシア社から現在市販
されていて、だれＣもが入手利用できる。

１）Ｎｏ１５２３は、選択のためのマーカーとして、ア
ンピシリンに対り−る耐性遺伝子（ΔｐＲ）とストレプ
トマイシン感受性の８１２リポソーム蛋白をコードづ°
る遺伝子（ｓｔｒＡ　　＞の両方を含んでいる。組換え
体ＤＮＡ実験において、繁用される宿主のひとつである
１ツシ、ｒリキア・コリ（［５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）　Ｋ　１２株に由来するたとえばＨ８１０１株
のようなｒｐｓｌ−座位に支配されるストレプトマイシ
ンに耐性の宿主をｐＮｏ１５２３により形質転換させる
と、この形質転換株（ｔｒａｎｓ４ｏｒｍａｎｔ　）は
ストレプトマイシンに感受性どなって、ストレプトマイ
シンを含む選択培地上では生育できなくなる。しかし、
ストレプトマイシン感受性遺伝子の内に存在するクロー
ニング部位に外来ＤＮＡＩＦｉ片を組み込んだ場合は、
このストレプトマイシン感受性遺伝子が破壊されて、形
質転換させた株はストレア１−マイシンに耐性となる。

このときに選択培地中にアンピシリンをし添加しておく
と、宿主自身およびｐＮｏ１５２３による形質転換株は
生育できず、外来ＤＮＡＴｌｆＩ片を組み込んだＩ）Ｎ
ｏ１５２３の組換え体のみが生育してくることになる。

こうした有用な性質を持っているにもかかわらず、ｐＮ
ｏ１５２３には外来ＤＮＡのクローニング部位として利
用できる制限酵素の認識部位が少ないという欠点がある
。すなわち、ｐＮ０１５２３のストレプトマイシン感受
性遺伝子は、ＨｐａＩ、ＰｖｕＩ［，５ｐｈＩ、Ｐｓｔ
Ｉ及びＳ　ｍ　ａ　Ｉの五つの制限酵素の認識部位を有
しているが、そのうちのＰｖｕＩ［、ｓｐｈ■およびＰ
ｓｔＩの三つは該遺伝子の外側部分にも存在するためこ
れをクローニング部位として利用することは困難である
。また、ＨｐａＩをＳｍａＩの二つのクローニング部位
はいずれも平滑末端（ｂｌｕ−ｎｔ　ｅｎｄ）であるの
でクローニングの効率は低く、きわめて限定された用途
にとどまっている。

λ匪匹且ｌ 要　　旨 本発明者らは、ポジティブな選択ができるという利点を
有するｐＮｏ１５２３のストレプトマイシン感受性゛遺
伝子の塩基配列を、ストレプトマイシン感受性の特性を
変更することなく、部分的に変更して、多数の制限酵素
の認識部位を導入した新しいストレプトマイシン感受性
遺伝子を得ることに成功した。

本発明はこの知見に塁づくものであって、このストレプ
トマイシン感受性遺伝子自身、それを含むプラスミドベ
クター、およびこのベクターを含む微生物、に関する。

すなわち、本発明によるストレプトマイシン感受性遺伝
子は、上記の三つの意味において、下記から選ばれた１
又は２以上の認識部位群を有するものである。

ＡＳｕ■、５ａｃＩ、Ｂａ１Ｉ及びＸｈｏＩよりなる制
限酵素認識部位群（Ｎｏ１の認識部位群）ＭｌｕＩ、５
ｎａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＭｓｔＩ及びＢＳｔＥ［よりなる
制限酵素認識部位群（Ｎｏ２の認識部位群）、 ＢｃｌＩ、ＮｏｔＩ及びＢｏｌＩＩよりなる制限酵素認
識部位群（Ｎｏ３の認識部位群）およびＫｐｎＩ、Ｓａ
Ｃ■、ＸｈｏＩ、３ａｌｌ。

Ｃ１ａＩ、ＰｖｕＩ及びＳｔｕＩｌ：りなる制限酵素認
識部位群（・Ｎｏ４の認識部位群）。

Ｎｏ３の認識部位群に含まれるＮｏｔＩ部位はＸｍａｍ
ににる認識部位でもあり、それぞれの認識部位群は少な
くとも四つの制限酵素によって開裂さぼられる。

これらの認識部位群には他の制限酵素による認識部位を
導入することができる。例えば、Ｎｏ２の認識部位群の
ＭｓｔＩとＢｓｔＥＩ［の間にはＨｉｎｄＩ［１部位が
、またＮｏ４の認識部位群のＫｐｎＩの隣（上流）にＢ
ａｍＨＩ部位が導入されることができる。本発明はその
ような他の制限酵素の認識部位を追加的に含む遺伝子並
びにそれを含むプラスミドＪ３よびこのプラスミドを含
む微生物をも包含するものである。

立−】 本発明によって得られるストレプトマイシン感受性遺伝
子をコードするＤＮＡは、多数の制限酵素による認識部
位を有している。そして、その認識部位に外来ＤＮＡが
組み込まれるときはストレプトマイシン感受性遺伝子が
破壊される性質を有している。このため、各種の外来１
）　Ｎ　Ａを豊富な制限酵素の認識部位に容易に組み込
むことが可能である。外来遺伝子が組み込まれた組み換
え体は、ストレプトマイシン感受性を失なっＣ、ストレ
プトマイシン添加培地で生育するから、この性質を利用
して容易に選択することができる。したがって、本発明
によって遺伝子組み換え作業に非常に有用なプラスミド
ベクターが提供される。

後述する本発明の実施例によって、（イ）Ｎ。

１　（７）　：ｍ　’ｔＡ　部位群（７）　ミｌｆｉ　
”１　人すｈ　タｌ）　ＨＳ　Ｇ　６６５、（ロ）Ｎ０
１とＮｏ４の認識部位群が導入されたｐ１６２６、（ハ
）Ｎｏｌ、Ｎｏ３及びＮｏ４の認識部位群が導入された
ｐ１６３０１　（ニ）Ｎ。

１、Ｎｏ３及びＮｏ４の認識部位群に更に３８ｍＨＩの
認識部位がＮｏ４の認識部位群のＫｐｎＩの隣り（上流
）に導入されているｐＨＳＧ６６６、（ホ）Ｎｏ１、Ｎ
ｏ２、Ｎｏ３及びＮｏ４の認識部位群とＢａｍＨＩの認
識部位が導入されているｐＨＳＧ６７１、及び（へ）Ｎ
０１、Ｎ０２、Ｎｏ３及びＮ　Ｏ４（７）　認識部位群
とＢａｍＨＩの認識部位に更にＨｉｎｄｌ［［の部位が
Ｎｏ２の認識部位群のＥｃｏＲＩとＢＳｔＥＩＩの間に
導入されているｐＨＳＧ６７０、がストレプトマイシン
感受性遺伝子を持った本発明プラスミドベクターの具体
例として製造される（本発明はこれら実施例によって限
定される訳ではなく、例えば、Ｎｏ１、Ｎｏ２、Ｎｏ３
及びＮｏ４の認識部位群のうちただ一つの認識部位群が
導入されているもの、それらのうちの任意の二つ、任意
の三つの認識部位群を含んだもの等も本発明に含まれる
。また、本発明で言及していない制限酵素の認識部位を
追加的に含むこともできる）。

本発明によって得られるプラスミドベクターのうちで最
も重要なものはｌ）　ＨＳ　Ｇ　６６６であり、その制
限酵素地図は第１１図（示されている。それは、ＮｏＩ
、Ｎｏ３及びＮｏ４の認識部位群とＢ　ａ　ｍ　ＨＩの
認識部位を右するストレプトマイシン感受性遺伝子、も
う一つの選択マーカーとしてのアンピシリン耐性項伝子
おにび１）ＵＣ９由来のレプリコンを袖っており、その
特性は次のとおりである。

（イ）　　ｐＮｏ１５２３に比較して約半分の大きさを
持つこと。このため、より人ぎなりＮＡ断片を組込むこ
とが容易になること。

（ロ）　ａ脂肉におけるコピー数が、ｐＮｏ１５２３に
比較して増加しており、１００Ｉｎ１程度の少黴の培養
液からでも容易に２００μび程度の、クローニングには
充分な量のプラスミドＤＮＡが精製できること。

（ハ）　　ｐＮｏ１５２３のストレプトマイシン感受性
の遺伝子の中に本来含まれているｐｖｕ　［，５ｐｈＩ
およびＰｓｔＩの３か所の制限酵素の認識部位をクロー
ニング部位として利用できるように、該遺伝子の外側に
存在していたこれら３種の制限酵素の認識部位が削除さ
れているので、クローニング上扱いやすい粘着性末端（
ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄ）を有する５ｐｈＩとＰｓｔ
Ｉ部位が利用できるＪ：うになったこと。また、Ｓ　ｐ
　ｈ　ＩどＰＳｔ■部位が利用できるようになったので
、ＧＣポリマー付着法により末端が修飾されたｃＤＮＡ
断片のクロ−ニングにも使用できるようになったこと。

（ニ）　上記の（ハ）以外に、合成りＮＡ断片により再
構築された改良型ストレプトマイシン感受性遺伝子の中
に、第１図で示すように新たに以下の１２種類のクロー
ニング部位、即ちＡＳＩＪＩＩ、５ａｃＩ、Ｂａ　Ｉ　
Ｌ　ＸｈｏＩ、ＢｃｌＩ、ＮｏｔＩ　（Ｘｍａｌ［［）
、ＢｑｌＩＩ、ＫｐｎＩ、５ａｃＩＩ、ＸｂａＩ、ＰＶ
ｕ工およびＳｔｕＩ、をアミノ酸残塁を変えずに塩基の
みを変えることによりつけ加えて、これらを利用できる
ようにしたこと。

（ホ）　上記の（ハ）と（ニ）に加えて、さらに合成り
ＮＡ断片により再構築された改良型ストレプトマイシン
感受性遺伝子中に、第１図で示すように新たにＢａｍＨ
Ｉ、５ａｌＩおよびＣｌａ工の３か所のクローニング部
位を、各々ストレプトマイシン感受性遺伝子の機能を損
うことなくアミノ酸残基を置換するように塩基配列を置
き換えることによって、つけ加えて、これらを利用でき
るようにしたこと。

従って、本発明により完成した上記の（イ）〜（ホ）の
特性を持ちかつ下記の実験例によりその効果の確かめら
れた改良型のストレプトマイシン感受性プラスミドベク
ターは、組換え体ＤＮＡ実験において効率の良いクロー
ニングのための手段を提供するものである。

なお、本発明で宿主として使用する微生物はエツジエリ
４ア・コリが典型的であって、Ｉｌｌ換ＤＮＡ実験指針
」　（科学技術汀線。昭和５７年８月３１日改訂）に定
められた生物学的封込めのＢルベルに相当するエツジエ
リ４ア・コリ　Ｋ−１２株およびこれに由来する各種の
株が対象となりうる。そのような株の代表的なものはＨ
８１０１株である。この株は組換え体ＤＮＡ実験におい
て内外の研究者の最もよく利用しているものであって、
入手の容易なもの（たとえば、アメリカ合衆国メリーラ
ンド州ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−（１３ｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｉｔｅｓ、　Ｌｏｂ、　）社から市販されて
いて（コード・ナンバー：ＢＲＬ＃８２６０ＳＡ）、だ
れでも容易に入手することができる〉である。

また、こうした宿主の該プラスミドベクターによる形質
転換は、一般にひろ〈実施されているカルシ・クム処理
法〔ジＶ−ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（
ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、）第５３巻、第　１５９−１０
２頁（１９７０年）〕によって行なうことができる。

従って、１−ＩＢｌｏｌ等の使い易いエツジエリ４ア・
コリの株を対象として比較的容易に形質転換株を得るこ
とができるということが本発明の一つの利点である。

本発明によるプラスミドベクターのうち最も重要なもの
の他の一つは、ｐＨＳＧ６７１である。

このベクターもｐＨ３Ｇ６６６の前記した（イ）〜（ホ
）と実質的に同じ利点を有し、さらにＭｌｕＩ、５ｎａ
Ｉ、ＥｃｏＲｌ、ＭｓｔＩおよび［３ｓｔＥＩ［の新た
な制限酵素認識部位を持つところからそれを利用するこ
とができるという利点を有する。また、その制限酵素切
断地図は、第１２図に示されている。

発明の詳細な説明 本発明は、多数のり［］−ニング部位をつ【プ加えた改
良型のストシブ１〜マイシン感受性遺伝子およびそれを
含むポジティブな選択のできる組換え体プラスミドベク
ターを提供するものである。

ＤＮＡ断片を切り出し、精製し、結合させ、その塩基配
列を決定する等のいわゆるＤＮＡ組換えの操作に関して
は、既に成書がいくつか知られているので、下記の本発
明についての具体的な説明以外に必要な情報に関しては
、それらの文献を参照されたい。適当な文献のいくつか
を挙げれば、たとえば、■　［モレキュラー・クローニ
ング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、　八しａｂｏｒａｉｒｙ　）ｌａｎｕａｌ）
　Ｊ　、？ニアテイス氏ら共著、米国コールド・スプリ
ング・ハーバ−ラボラトリ−出版、１９８２年および■
　「遺伝子操作実験法、１、高木康敬氏編著、講談社、
１９８０年、がある。

また、本発明における改良型プラスミドベクターを作成
する際に重要な工程となるＤＮＡ断片の合成および蹟製
の方法に関しては、下記の本発明についての具体的な説
明以外に、たとえば■ｒ−Ｌ−ｆ−ΦヒュＬ、ｔチア　
（Ｉｌｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）Ｊ　、第１３号、第
１−・２７頁（１９８４年）アメリカ国、アプライドバ
イオシステム礼服、を参照することができる。

本発明において使用する宿主はエツシエリキア−ｍｌす
に１２のＨ８１０１株（ｒｅｃ−、ｒ−１ｍ−、ｓｔｒ
’　）を主として用いた。プラスミドベクターｐＬＪＣ
１８及びｐＩＪＣｌ　９の宿主としてはエッシエリキア
・コリに１２の０ｍ２１４株（ｒｅＣ＋、ｒ−１ｍ−１
ΔＭ１５、ｓｔｒ’。

Ｆ’）を用いた。本発明において用いた塩基、制限酵素
、Ｔ４ＯＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝
液等は全て市販品を使用した。

本発明で行なった消化、■４ＤＮΔリガーゼを使っての
埋め込みによる平滑末端の作成、連結、カルシュラム処
理による形質転換等の操作はいずれも常法に従っている
ので、詳しい条件は特に記載しない。

遺伝子その他 本発明はストレプトマイシン感受性遺伝子および関連産
物に関するが、これらは制限酵素認識部位によって特定
されたものである。言及されている制限酵素認識部位の
表記およびその内容は当業者にとって周知のものである
。

工程の概要（その−） （１）　組み換えを容易に行なうためのプラスミドベク
ターの作成 本発明者らは、ｐＮｏ１５２３のストレプトマイシン感
受性遺伝子の塩基配列の変更を容易に進めるため、ｐＮ
ｏ１５２３から切り出したストレプトマイシン感受性遺
伝子を、ｐＵｃ９から切り出したアンピシリン耐性遺伝
子とレプリコンをコードラダるＤＮＡｌｉ片に結合させ
て、ｐＨＳＧ６６４なるプラスミドベクターを新たに作
成した。

ｐＨＳ　Ｇ　６６４の作成経路およびその制限酵素地図
は第５図に記載されている。

（２）　合成りＮＡｌｌｌｉ片の立案 ＤＮｏ１５２３のストレプトマイシン感受性遺伝子の！
２基配列を部分的に変更して１１限醇素の認識部位を導
入するためには、コードされるアミノ酸を変えない範囲
で塩基を置き換えて制限酵素の認識部位を作る場合と、
ストレプトマイシン感受性が失われない範囲でコードさ
れるアミノ酸の変更を行なう場合とがある。アミノ酸の
変更はストレプトマイシン感受性の喪失につながるので
、必要最小限にとどめるべきである。また、制限酵素の
認識部位を作るため、塩基を置き換えた結果、同じ制限
酵素の認識部位が複数できることは避ける必要がある。

本発明におけるＮｏｌの認識部位群即ちＡｓｕ■、５ａ
ｃＩ、Ｂａ１Ｉ及びＸｈｏＩ部位、Ｎ０２の認識部位群
即ちＭＩｕＩ、Ｓｎａ■、ＥｃｏＲＩ、ＭｓｔＩ及びＢ
ｓｔＥＩＩ部位、及びＮｏ３の認識部位群即ちＢｃ　Ｉ
　Ｌ　Ｎｏｔ：［及びＢｑｌＩＩ部位は、アミノ酸を変
更することなく塩基のみを変えることによって導入され
る。

Ｎｏ４の認識部位群のうち、Ｋｐｎ　Ｉ、Ｓａｃ■、Ｘ
ｂａＩ、ＰｖｕＩ及び５ｔｕ工部位も、アミノ酸残塁を
変えずに塩基のみを変えて導入されている。Ｎｏ４の２
１部位群のうち、５ａｌＩ及びＣＩ　ａ　Ｉは、ストレ
プトマイシン感受性遺伝子の機能を損うことなくアミノ
酸残基を置換するような塩基配列が導入されている。す
なわら、第１１１番目のりジン残基がアルギニン残基に
、第１１３番目のアラニン残基がアスパラギン酸残基に
置き換えられている。

１）Ｈ５Ｇ６７０に付加的に導入されるＨｉｎｄ■部位
は、アミノ酸の変更すなわら第５２番目のバリン残基の
ロイシン残基への変更を伴う。ｐＨＳＧ６６６に付加的
に導入されるＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位は、アミノ酸の変更
すなわち第９３番目のバリン残基のイソロイシン残基へ
の変更を伴う。

本発明で用いた合成りＮＡｌｌ１片の各１基配列は第３
図にまとめられている。

なお、制限酵素の認識部位を導入する目的以外で−も、
一部、アミノ酸残塁の配列を変えることなしに塩基配列
を変えた場合があるが、これは新たな認識部位を導入す
ることにより、ストレプトマイシン感受性遺伝子の中に
該遺伝子の読み取りを阻害する二次溝’／７１　（５ｅ
ｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）が出きに＜＜−
するためである。

（３）　　ＤＮＡＩｇｉ片の合成と組み換え本発明では
、制限酵素による認識部位群のＤＮＡ配列をＤＮＡ合成
＊＜アメリカ国、アプライド・バイオシステム社製）に
よりホスホアミダイド法により合成し、精製したのち、
ｐＮｏ１５２３由来のストレプトマイシン感受性遺伝子
の一部をその合成りＮＡ断片で置ぎ換えることによって
、新しい制限酵素によるス識部位を導入する。合成され
るＤＮＡ断片の長さは、Ｃ５塩塁以下の長さにとどめる
のが安全である。認識部位群を有する塩基配列が長いと
きは、それを二双上に分けたＤＮＡｌｌｉ片を合成し、
それらを遺伝子工学的手法によって結合させて認識部位
群を有する塩基配列と＜’Ｋ　ＬＪてから、ｐＮｏ１５
２３由来のストレプトマイシン感受性遺伝子と組み換え
ることが望ましい。

本発明において、Ｎｏｌの認識部位群（ＡＳＬＪ■、Ｓ
ａＣ工、３ａｌ工及びＸｈｏＩ）ｋ：相当するＤＮＡ断
片は、二つの合成りＮＡ断片Ａ及びＢを遺伝子工学的手
法によって粘合さゼで作成された。

Ｎｏ２の認識部位群（Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉ、Ｓｎａ■、ＥＣ
０ＲＩ、ＭｓｔＩ、及びＢＳ　ＬＥＩＩ）に相当する断
片は、本発明の実施例では三つの合成りＮＡ断片Ｇ、Ｈ
Ｓ　Ｉを遺伝子工学的手法によって結合させ、更にその
断片Ｈによって導入さ゛れた部分を合成りＮＡ断片Ｊ′
ｒ：ｉｌき換えるという方法で作成している。これは付
加的むｌ−１ｉｎｄ１部位を含む断片Ｈを用いて、付加
的なＨｉｎｄｎ１部位を含むｐＨＳＧ６７０の作成を先
行させたためである。

しかし、通常は三つの合成りＮＡ断片Ｇ、Ｊ及びＩを遺
伝子工学的に結合させて作成される。

Ｎｏ３の認識部位群（ＢｃｌＩ［、ＮｏｔＩ及びＢＱ　
Ｉ　ＩＩ）に相当するＤＮＡＮＡ断片、その仝休が合成
された。

Ｎｏ４の認識部位群（ＫｐｎＩ、５ａｃｌＩ、ＸｂａＩ
、Ｓａ　ｌ　Ｉ、Ｃ１ａＩ、Ｐｖｕ　Ｉ及び３　ｔ　Ｌ
Ｊ　Ｔ　）に相当するＤＮＡ断片は、二つの合成りＮ１
１ｌｒ片Ｃ，Ｄを遺伝子工学的手法によって結合させて
作成された。

合成りＮＡｌｌｌｉ片Ｆは、Ｎｏ４の認識部位群のＫｐ
ｎＩの隣り（上流）に付加的な部位Ｂ　ａｍＨ■を導入
するためものである。

合成りＮＡ断片は、新たに導入される認識部位群に相当
するＤＮＡに加えて、それがｐＮｏ１５２３由来のスト
レプトマイシン感受性ＤＮＡに組み換えるために必要と
される制限酵素の認識部位が、必要に応じて追加されて
いる。合成りＮＡ断片のｐＮｏ１５２３由来のストレプ
トマイシン感受性遺伝子への導入は、置き換えるべきｐ
Ｎｏ１５２３の部位を制限酵素で切り取って、そこへ合
成りＮＡを挿入する通常の方法によって行なう。

成 木発明者は、ｐＮｏ１５２３に合まれるストレフ１〜マ
イシン感受性遺伝子を改変するに当り、合成りＮＡｆｉ
ｉ片どの結合をスムーズに進める目的でｐＮｏ１５２３
のストレプトマイシン感受性遺伝子を持った新しいｐＨ
３Ｇ６６４を作成した。

ｐＨＳＧ６６４は、ｐＮｏ１５２３のストレフ１〜マイ
シン感受性遺伝子、該遺伝子の下流に存在するＢａｍＨ
Ｉ、Ｓａ　Ｉ　Ｉ、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄｌｌ［よりな
るポリリンカ一部分、該遺伝子の上流に存在するＥｃｏ
ＲＩ部位、ｐＬＩｃ９のアンピシリン耐性遺伝子および
ｐＬＩ０９由来のレプリコン、を有している。

ｐ　ｌ−Ｉ　Ｓ　Ｇ　６６４の作成については、第５図
及び参考例に詳述されている。

ｐＨＳＧ６６４は、もとのｐＮｏ１５２３と対比して次
のような利点を有する。

ｉ）　ベクターのサイズが約半分となり、より大きなり
ＮＡ断片を組込むことができる。

ｉｉ）細胞内におけるコピー数が増加しており、より生
母の菌体の培養液からでも容易にプラスミド［）ＮＡ＠
精製できる。

１ｉｉ）　　ストレプトマイシン感受性遺伝子の外側に
存在していたＰｖｕ［，５ｐｈＩおよびＰｓｔＩの認識
部位を削除したことにより、該遭伝子内に存在Ｊるこれ
ら３種の認識部位がクローニング部位として使える。

（２）　制限酵素の認識部位が導入されたＤＮＡ断片の
合成と精製 ｉ）合成で作られるＤＮＡ断片の長さは最大６５塩基に
とどめ、両端に連結に必要とされるり０−ニング部位を
有する断片を合成する。組み換えに使う断片は二本鎖で
あるが、これは−末鎖をそれぞれ合成精製したのち、そ
れらをアニーリングに付すことによって製造される。

ｉｉ）各ＤＮＡ断片の合成はすべて自動的にプログラム
されたＤＮＡ合成機「アプライド・バイオシステム・モ
デル３８０Ａ型」　（米国、アプライド・バイオシステ
ム社製）により合成する。本発明において使用したＤＮ
Ａ合成ｉｒアプライド・バイオシステムス・モデル３８
０Ａ型」については、文献〔アメリカン・バイオテクノ
ロジー・ラボラトリ−（＾ｍｃｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｙ）、第２巻
、第５２−５９頁（１９８４奸）〕に合成反応の詳細、
機械の構造、作動のためのラフ１〜ウエアおよび合成例
が詳述されている。

１ｉｉ）　　各々の合成したＤＮＡ［ｌ］’ｉ片は、Ｄ
ＮＡ合成殿からは各塩基に保護基がついたままのアセト
ニトリル溶液として得られるので、これに′８ｍの淵ア
ンモニアを加え、５５℃において５時間処理することで
脱保護する。ざらに、脱保護したＤＮＡ断片を含む溶液
を濃縮乾固し、これを５０μｍの８０％ホルムアミド溶
液に９５℃で数分間加熱することで溶解させ、１０％ポ
リアクリルアミドゲル（７Ｍ尿素を含む。厚さ３ｍ、高
さ４０ｃｍ。

幅３０ａＲ）を用いた垂直型電気泳動により、０．１Ｍ
トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中にて、目的の長さの
ＤＮＡｆｔＦｉ片を分離精製する。ＤＮＡ断片はＴＬＣ
プレート上にてポリアクリルアミドゲルに紫外光を照射
することにより可視化できるので、カミソリ等で切り出
したゲルから電気的に目的のＤＮＡ断片を流出さＶる。

このＤＮＡ断片を含む流出液は、濃縮の後、ヒフ７デツ
クスＧ−２５（）７ルマシア社）等によるゲルン濾過カ
ラムにＣｖ１製する。

ｉｖ）　　このように精製された一本鎖は、その相補的
関係の他の一本鎖と溶液中で混合し、７０℃で５分間加
熱した後ゆっくりと室温まで冷却することによりアニー
リングして、二本鎖ＤＮＡとする。

このものは、そのまま組み換えに用いられる。

（３）　合成されたＤＮＡ断片の導入 合成されたＤＮＡ断片は、ｐＨＳＧ６６４中のストレプ
トマイシン感受性遺伝子中に存在するＨｐａＩ、ｐｖｕ
　［，５ｐｈＩ、ＰｓｔＩ及びＳｍａ　Ｉの五つの認識
部位、該遺伝子の下流に存在する３ａｍｌ−ＩＩ、Ｓａ
　ｌ　Ｌ　ＸｂａＩ及びＨｔ　ｎｄｌ［よりなるポリリ
ンカ一部位もしくは該遺伝子の上流に存在するＥｃｏＲ
Ｉ部位を使って組み込まれる。ＤＮＡ断片の導入につい
ての詳細は第６〜９図−及び実施例１〜６に記載されて
いる。

実施例１においては、Ｎｏｌの認識部位群がｐＨＳ　Ｇ
　６６４のストレプトマイシン感受性遺伝子中のＨｐａ
Ｉと３　ｐ　ｈ　Ｉ部位の間に導入されている。実施例
２においては、Ｎｏ４の認識部位群がストレプトマイシ
ン感受性遺伝子中のＳｍａ工部位どポリリンカー中のＨ
ｉ　ｎｄｌ［［部位の間に導入されている。実施例３に
おいては、Ｎｏ３の認識部位群がストレプトマイシン感
受性遺伝子中のＰｓｔＩと３　ｍ　ａ　Ｉ部位の間に導
入されている。

実施例６においては、Ｎｏ２の認識部位群がストレプト
マイシン感受性遺伝子中のＳｐｈ　Ｉとｐｓｔ■部位の
間に導入されている。Ｎｏ１、Ｎｏ２、Ｎｏ３及びＮｏ
４の認識部位群以外の追加的な０識部位を導入するとき
は、この追加的な部位は上述したサイトの外に、既に導
入されたＮｏ１、Ｎｏ２、Ｎｏ３及びＮｏ４の認識部位
群の認識部位を使って組み込まれる。

（４）　合成した改良型ストレプトマイシン感受性遺伝
子の塩基配列決定 Ｍｌ　３ｍｐｌ　８ＲＦ　ｌＤＮＡまたはＭ１３ｍｐ１
９ＲＦＩＤＮＡ（ファルマシア社により市販されている
）の１ａｃＰＯＺ’部分に局在するポリリンカ一部分に
合成したストレプトマイシン感受性遺伝子をサブクロー
ニンブザる。得られた組み換えプラスミドは、ＤＮＡ配
列キット（宝酒造■製）により合成ブライマーからクレ
ノー酵素（、Ｋｌｅｎｏｗ　　Ｅｎｚｙｍｅ）を用いて
読み取らせ、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、
オー１−ラジオグラフィーのパターンから塩基配列を決
定する。

（５）　改良型ストレプトマイシン感受性プラスミドベ
クターの生物活性の検定 改良型ストレプトマイシン感受性プラスミドベクターは
、その製造工程中の中間体であるプラスミドベクターも
含めて、ストレプトマイシンに対する耐性あるいは感受
性を次のようにチェックする。２％のアガロース（アメ
リカ国ディフコ（口１ｆｃｏ　）社製）を含むＬＳ培地
（１０％バクトドリブトン（ディフコ社製）、５％イー
ストエキス（ディフコ社’ＩＪ＞　、２．５％塩化ナト
リウム、１％グルコースを含み、ｐＨを１Ｍ水酸化ナト
リウム溶液により７．２〜７．４に合わせた培地〕に、
それぞれａｍｔｃ４度１００μ９／−になるように、ア
ンピシリンとストレプトマイシンくいずれも明治’ＩＩ
菓（Ｉ１％ｌ）を溶かしこみ、プラスチックシシセーレ
上にて固める。また、比較対照のために、アンピシリン
のみを含む１８培地も作成する。これらの固型培地上に
、該プラスミドベクターを持つ形質転換エッシエリキア
・コリを蒔き、−夜３７℃で培養し、それぞれの培地上
で菌の生育の有無を目視により判定する。

以下に参考例及び実施例によって本発明を説明するが、
これらは本発明を限定するものではない。

１−一囲一一１ １煮１　プラスミドベクターｐＨＳＧ６６４の作成（第
５図自照） ｉ）３ｍ’３ｉ伝子の単離とそれに対するポリリンカ一
部位及びＥＣｏＲＩ部位の付加 スウェーデン国ファルマシア社が市販しているプラスミ
ドベクターｐＮｏ１５２３をＳｓｔ［によって消化し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して、５ｓｔｌｒを平滑
末端とした。ついで、これを３ａｍＨＩにより消化して
ｐＮｏｌ　５２３からＳｍ５３Ｉ伝子を切り出した。

一方、プラスミドベクターｐＨＳＧ５９１　（Ｇ。

Ｂｒａｄｙ　ａｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ、２７（１９８４）
２２３−２３２）をＰｓｔＩ及びＢＩＩ［で消化し、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーぜで処理し、ついでＤＮＡリガーゼ
で結合させることにより、ｐｉ−ＩＳＧ５９１のポリリ
ンカ一部位に含まれているＰｓｔＩ及びＢｇｌＩＩのナ
イトを消失させた。このようにして得られたプラミスド
ベクターを３ａｍＨＩ及びＳｍａＩで消化し、先に得ら
れた５ｍ５ｉｌｌ！仏子をコードするＤＮＡと連結して
、ｐ　Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｇ　６　ｅ；　Ｏを得た。ｐＨＳＧ
６６０は本発明の１人とＧ、　Ｂｒａｄｙらによって前
述のＧｅｎｅ。

２７（１９８４）　２２３−２３２に記載されており、
また、ヘキストジせパン（株）総合開発研究所または西
ドイツ国ドイツ癌センター細胞腫瘍研究所（ＤｅｕｔＳ
Ｃｈ−ｅｓ　Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｚｅｎｔｒ
ｕｍ、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　ｆｕｒ　ＺｅｌｕｎｄＴｕＩ
Ｉｌｏｒｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｉｌｅｉｄｅｒｂｃｒｇ）
からだれでも入手することができる。ｐＮｏ１５２３と
は違って、ｐＨＳＧ６６０中では、ストレプトマイシン
感受性遺伝子（ＳｍＳ　）は、両端が（イ）ＥｃｏＲＩ
部位ど（ロ）ＢａｍＨＴ、Ｓａ　Ｉ　Ｉ、ＸｂａＩ及び
ト（ｉ　ｎ　ｄ　ｌ［部位から成るポリリンカ一部位と
にはさ゛まれでいて、以下の組換えがやりやすいように
なっている。

ｐＨ３Ｇ６６０を、ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌｌ［とによ
り分解してＳｍ”Ｗ伝子を含む衛片を切り出した。

アガロールゲル電気泳動法によって分画し、ＤＥ５２カ
ラム（米国ワットマン社）及びエタノール沈殿法等によ
り精製することにより、ＢａｍＨＩ、Ｓａ　Ｉ　Ｉ、Ｘ
ｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩよりなるポリリンカ一部位と
Ｅ　ＣＯ，ＲＩ部位とが付加された、Ｓｍ３遺伝子を単
離した。

ｉｉ）アンピシリン耐性遺伝子（ＡＩ）１１）とｐＵｃ
レブコリンの単離 スウェーデン国ファルマシア社から販売されているｐＵ
　Ｃ９（Ｇｅｎｅ、１９（１９８２）２５９−２６８）
を）ｌ　ａ　ｅ■によって消化し、ついでＨｉ　ｎｄｌ
Ｉ［で消化し、ついでＴ４ＤＮＡポリメラーピで埋め込
み反応を行なって連結して、ｐＨＳＧ１３１１を得た。

この環状プラスミドは１）ｔＪｃ９に含まれている１ａ
ｃＺ’遺伝子のＮ末端領域が取除かれている。

これを一旦エツシエリキア・コリ宿主中で増殖させて、
分１１１１［また。こうして精製された環状ブラスミド
をＡｈａｌＩによって限定消化し、ついでＥＣ０ＲＩで
消化し、Ｔ４ＤＮΔポリメラーゼで処理して生じた端を
平滑末端とし、ついで連結して、環状プラスミドｐｆ−
１８Ｇ３６７を１ｑだ。このプラスミドは、エツシエリ
キア・コリ宿土中で増殖させて、分離精製した。こうし
て得られるプラスミドｐＨＳＧ３６７は、ちとのｐＵＧ
９から１ａｃＺ’遺伝子をコードする領域がＨｉｎｄｕ
［とＥＣ０ＲＩとの間のポリリンカ一部位を残してずべ
て取り除かれ、ｐＵＧ９のアンピシリン耐性遺伝子およ
びｐＵＣレプリコンを残している。

１ｉｉ）　　ＳｍＳ、　Ａｃ）”およびｐｌＪｃのレプ
リコンを含むプラスミドベクターｐＨＳＧ６６４の作成 ｉｉ）の工程で得られた環状プラスミドをＦｃｏＲＩと
ｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩとにより分解し、１）（７）
工程でＥＣ０ＲＩとＨｉ　ｎｄｌｎとによる分解で得ら
れｌζストレブＩ−マイシン感受性遺伝子を含むＤＮＡ
断片と混合し、結合反応により閉環させて、新たなプラ
スミドベクターｐＨＳＧ６６４を得た。

ここまでの諸反応が、正確に進行していることを確かめ
るために、ＤＮＡ配列決定キット（宝酒造（株）製）等
により、得られたプラスミドＤＮＡ分子の塩基配列を決
定するか、あるいは複数の制限酵素での分解によるマツ
ピング（ｍａｐｐｉｎｏ）をＪ３こなった。その結果、
第５図に示した制限酵素による認識部位を持っている目
的としたプラスミドであることを確認した。

実施例１　Ｎ０１の認識部位群の導入（ｐＨＳＧ６６５
の作成。第６図参照） 第３図に示された断片Ａ及びＢを合成した。断片Ａは、
導入するＡｓｕＩＩ及びＳａｃ■のサイトの外に連結の
ためのサイトとして、５ａｌＩ、ＮｃｏＩ、ｌ−１ｐａ
Ｉ及びＰｖｕＩＩのサイトが付加されている。このＨｐ
ａＩ、Ｐｖｕ　Ｉ［はｐＮ。

１２５３のｓｍ”ｉ伝子に含まれているそれらのサイト
に対応しており、クローニングをしやずくするために付
加されたものである。断片Ｂは、導入リベさ・Ｂａ１Ｉ
及σＸｈｏＩ（１）認識部位の外に、連結のためのサイ
トとしてＳａＣ工及び５ｐｈＩ９サイトが付加されてい
る。断片Ａは、ファルマシア社より市販されているｐＵ
Ｇ−１９（ｐＨＳＧ３７８）の３ａｌ工と５ａｃＩの間
にサブクローニングして、ｐ１６０２なるプラスミドベ
クターを得た。このｐ１６０２と、カナマイシン耐性遺
伝子（ＫｍＲ）を有するｐＨＳＧ２８０（由来：カナマ
イシン耐性遺伝子はトランスボゾンＴ、９０３由来〔０
にａ、Ａ、ｅｔ　ａｌ；Ｊ、Ｈｏｔ。

Ｂｉｏｌ、　１４７．２１７−２２６（１９８１））　
Ｔニア’Ｑ、ポリリンカ一部位はファルマシア社より市
販されているｐｕｃ−ｓ由来で、その）（ｉｎｄｌ［［
とＰＳｔ工の間に合成ヌクレオチドにより、さらに新た
にＸｂａＩとＢｑｌＩ［をつ番）加えたもの）を、各々
５ａｌＩで消化し、連結して、ｐ１６０３なるプラスミ
ドベクターを得た。ｐ１６０３を５ａｃＩ及び５ｐｈＩ
でＶＪ１ｇｉシ、その部分に断片Ｂを組み込むと、Ａｓ
ｕｌＩ、５ａｃＩ、［３ａ　ｌ　Ｉ及びＸ　ｈ　ｏ　Ｉ
よりなる認識部位群（Ｎｏｌの認識部位群）と、Ｐｖｕ
　Ｈ、ト１ｐａＩ、ＮＣＯＩ及び５ａｌ工部位を有する
ＤＮＡｌｌ１片を含むｐ１６０４を得た。このｐ１６０
４に含まれる上記ＤＮＡをＨｐａＩ及び５ｐｈＩで切断
し、先に得られたｐＨＳＧ６６４のｌ−１ｆ）ａＩ　〜
Ｓｐｈ工の部分と置き換えて、Ｎｏ１の認識部位群を持
ったストレプトマイシン感受性のプラスミドベクターｐ
ＨＳＧ６６５を得た。

友亙Ｍユ　Ｎｏ４の認識部位群の導入 （ｐｌ　６２６の作成。第７図参照） 第３図に示された断片Ｃ及びＤを合成した。断片Ｃには
、連結のためのサイトとして、Ｂａ１Ｉ［のサイトが付
加されている。断片りに（よ、連結のためのサイトとし
て、＠　ｉ　ｎｄｎ［が付加されている。断片Ｃで、カ
ナマイシン耐性のｐ　ＨＳ　Ｇ２８０のＢＧ　Ｉ　ＩＩ
　〜Ｓａ　ｌ　：［部分ヲ置キカエテ、プラスミドベク
ターｐ１６２２を得た。断片りでクロラムフェニコール
耐性のｐＨＳＧ５９５　（クロラムフェニコール耐性遺
伝子はトランスボゾンＴｎ９山来〔八Ｈｏｎ、Ｎ、に、
、ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ、　２８２．８６４−８Ｇ
Ｏ（１９−／９）　）であり、ポリリンカ一部分および
他のベクタ一部分はファルマシア社より市販されている
ｐｕｃ−１２由来である。）のＳａ１工〜１−１ｉｎｄ
ｌ［［部分を置ぎ換えてプラスミドベクターｐ１６２３
を得た。ついで、ｐ１６２２及びｐ１６２３の両者を５
ａｌＩで開裂し、結合させて、プラスミドベクターｐｌ
　６２４を得た。これをＳｍａＩで開裂し、結合さゼて
、クロラムフェニコール耐性のプラスミドベクター上に
Ｎｏ４の認識部位群が導入されたｐｌ　６２５を得た。

このｐ１６２５に含まれるＮｏ４の１識部位群に対応す
るＤＮＡをＳｍａＩ及びＨｉ　ｎｄｎＩで切断Ｌ、先に
得られたｐＨＳＧ６６５のＳｍａ工〜Ｈｉ　ｎｄｌｌ［
部分と置き換えて、ＮｏｌとＮｏ４の認識部位群を待っ
たストレプトマイシン感受性のプラスミドベクターｒｙ
１６２６を得た。Ｎｏ４の認識部位群に対応するＤＮＡ
をｐＨＳＧ６６４のＳｍａ■〜Ｈｉ　ｎｄｌｌ［部分と
置き換えることによって、Ｎｏ４の認識部位群のみが導
入されたｓ　ｍ　Ｓプラスミドベクターが得られること
は自明である。

実施例３　Ｎ０３の認識部位群の導入 （ｐ１６３０の作成。第８図参照） 第３図に示されたＮｏ３の認識部位群に対応ＪるＤＮＡ
断片Ｅを合成した。断片Ｅは、組み換えのためのサイト
としてＰＳｔｉ及びＳｍａＩのサイトを有する。断片Ｅ
を−Ｈクロラムフエニコール耐性のＤＩ−１８Ｇ５９５
にてサブクローニングして、同一断片を切り出し、先に
得られたｐ１６２６のＰｓｔ−Ｓ−ＳｍａＩ部分と置き
換えて、Ｎ０１、Ｎ０３及びＮｏ４の認識部位群が導入
されているＳｍＳプラスミドベクターｐ１６３０を得た
。

断片Ｅ＠ｐＨ３Ｇ６６４に導入すれば、Ｎｏ３の認；！
部位群のみが導入され１＝プラスミドベクターが得られ
ること及び断片ＥをｐＨ３Ｇ６６５に導入すればＮｏＩ
とＮｏ３の認識部位群が導入されたプラスミドベクター
が得られること、は自明である。

友１五４　　Ｎｏ４の認識ｎ１位群へのＢａｍＩ部位の
導入（１）Ｈ８Ｇ６６６の作成。第８図参照） 第３図に示されたＤＮＡ断片］：を合成した。実施例３
で得られたｐ１６３０の３ｇ　Ｉ　Ｉｆ　〜Ｋｐｎ１部
分をＢｑｌＩ［及びＫｐｎＩで消化して切りとり、そこ
へ合成りＮＡ断片ＦをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合ざヒ゛
ると、Ｎｏｌ及び３の認識部位群と、３　ａ　ｍ　ｌ−
Ｉ　Ｉナイトが追加されたＮｏ４の認識部位群とを右す
るｐｌ−Ｉ　Ｓ　Ｇ　６６６が得られた。

このプラスミドベクター１）Ｈ８Ｇ６６６を組み込んだ
エツシエリキア・コリに１２の８８１０１株は工業技術
院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−８９０２号とし
て寄託きれている。

ｐＨＳＧ６６６は、ストシブ１〜マイシン感受性遺伝子
を有していることが前記工程（５）に示された検定法に
より証明され、また前記工程（４）に示された塩基配列
決定法ににす、計画された改良型ストレプトマイシン感
受性遺伝子の塩基配列を右することが証明された。スト
レプトマイシン感受性遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列
をまとめて第１図に示した。また、ｐＨ３Ｇ６６６の全
てのクローニング部位を第１１図に示した。

′１ＵｕＬ５ＬＨｉ　ｎ　ｄ　ｍが追加されているＮｏ
２の認識部位群の導入（ｐｔ−ＩＳＧ６７０の作成。第
９図参照） 第３図に示されるＤＮＡ断片Ｇ、ト１及びＩを合成した
。ファルマシア社から市販されているＤＵＣ−１８を５
ｐｈＩ及びＥｃｏＲＩでＶ８裂させ、そこへ合成りＮＡ
断片Ｇを組み込んで、ｐ１６１１を得た。

一方、ｐＨＳＧ５９１　（Ｇ、Ｂｒａｄｙ等、Ｇｃｎｅ
２７（１９８４）２２３−２３２）をＥｃｏＲＩとＢａ
ｍ１−ＩＩで開裂させ、そこへ合成りＮＡｆｅｉ片Ｈを
組み込んで、ｐＨＳＧ１６１２を得た。このｐＨ３Ｇ１
６１２をＢＳｔＥＩで開裂させ、合成りＮＡ１ｇｉ片Ｉ
を結合さけた。得られたＤＮＡ鎖は二つのＰｓｔＩ部位
を有するので、両部位の間にある部分を除去してｐｓｔ
Ｉを一つにする目的で、その得られたＤＮＡｖｌをＰｓ
ｔＩで消化し、結合さけて、プラスミドベクターｐ１６
１５を得た。ｐ１６１１及びｐ１６１５の両者をＥｃｏ
ＲＩで開裂さけて結合して、ｐｌ　６１６を得た。ｐｉ
　６１６は、Ｎｏ４の一連の認識部位とその［Ｃ０ＲＩ
とＢｓｔＥＩ［の間にＩ−１ｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位を有す
る。

一方実席例４で得たｐＨＳＧ６６６はＮｏ２の認識部位
群に含まれるＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｌ［［を５ｍ８ｉ伝
子の外側に含んでいるので、外側のＥＣ０ＲＩとｌ−１
ｉｎｄＩｌ［部位は、組み換えに先立って削除すること
が望ましい。このため、ｐＨＳＧ６６６をＥｃｏＲＩで
消化し、１−４Ｄ　ＮＡポリメラーゼで埋め込みをした
後、ＤＮＡリガーゼで連結してＥＣｏＲＩ部位を削除し
７ｅ０ついで、Ｈｉ　ｎｄｌＩ［による消化、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼによる埋め込み及びＤＮＡリガーゼによ
る結合によって）（ｉｎｄｌ１１部位をも削除して、ｐ
１６３４を得た。先に得たｐｌ　６１６を５ｐｈＩ及び
ｐｓｔ４で消化して、置き換えのための断片を切り出す
。ｐｌ　６３４をＳｐｈ工及びｐｓｔＩで消化し、先の
断片を結合させて、Ｎｏ２の認識部位群とそのＥＣ０Ｒ
Ｉど１３ｓｔｌｌの間にト１ｉｎｄＴ［１部位を付加的
に右するｌ）　ｌ−Ｉ　Ｓ　Ｇ　６７０を得た。

この断片は、ｐＨＳＧ６６４、ｏ　ｆ−Ｉ　Ｓ　Ｇ　６
６５、ｐ１６２６及びρ１６３０のｒｓｐｈＩ〜ｐｓｔ
工」部分の置き換えに利用できることは自明である。

ＴＪＡＪＡヱ　Ｎｏ２の認識部位群の導入（ｐＨＳ　Ｇ
６７１の作成、第９図参照） 第３図のＤＮＡＮＡ断片合成した。これは、ｐＨＳＧ６
７０からＨｉｎｄｌ［［部位を削除するためのフラグメ
ントである。ｐ　ＨＳ　Ｇ　６７０をＥＣ０ＲＩとＢｓ
ｔＥＩ［で消化し、そこへ合成りＮＡｉ片Ｊを置きかえ
ることににす、Ｎｏ２の認識部位群を有するｐ１６４３
を得た。ｐ１６４３を５ｐｈＩとＰｓｔＩで消化して、
Ｎｏ２の認識部位群を有する断片を切り出す。

一方、ｐＨＳＧ６６６からは、実施例５で述べた方法に
よって５ｍ８ｉ伝子の外側にあるＥＣ０ＲＩを削除した
ｐ１６４４を得た。

ｐ１６４４を５ｐｈＩ及びＰＳｔＩで消化し、［５ｐｈ
Ｉ〜ＰｓｔＩＪ部位に先に切り出した断ハを連結して、
ｐＨＳＧ６７１を得た。このプラスミドベクターｐｉ−
１８Ｇ６７１を組み込んだエツシエリキア・コリに１２
の８８１０１株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
ＦＥＲＭＰ−８９０３号として寄託されている。

このＮｏ２の認識部位群を有する断片は、ｐＨ５Ｇ６６
４、ｐＨＳＧ６６５、ｐＨＳＧ１６２６及びｐ１６３０
のｒｓｐｈＩ−Ｐｓｔ１１部分の蓚ぎ換えに利用できる
ことは自明である。

１’）Ｈ８Ｇ６７１のス１−レブトマイシン感受性遺伝
子の塩基配列は前記工程４によって決定され、アミノ酸
配列とともに第２図に示されている。

実施例７　改良型ストレプトマイシン感受性プラスミド
ベクターの使用 本発明により作成された改良型ストレプトマイシン感受
性プラスミドベクターのｐＨＳＧ６６６のｐｓｔＩとＢ
ｏｌｌＩの間に、外来性の「ｐｓｔＩ　−ＢｇＩ　ＩＩ
Ｊ　ＤＮＡｌｌｉ片を組み変え、この組み換えプラスミ
ドによりエツシエリキア・コリを形質転換転換させ、ア
ンピシリンとス１−レブトマイシンを各々１１００Ｌｔ
／ｍｉ含むＬＳ選択培地中で生育してきたストレプトマ
イシン耐性株を４×１０４個（形質転換体／μグのプラ
スミドＤＮＡ）得た。これらの耐性株のコロニーから１
４ＭＡを任意に選び、各々からプラスミドＤＮＡを抽出
し、ＰｓｔＩとＢＱ　Ｉ　ＩＩで消化したところ、１４
藺全てにおいてｐＨＳＧ６６６のＰｓｔＩとＢｇＩＩＩ
間に正しく外来性ＤＮＡ断片が組み込まれていることが
証明された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＨ３Ｇ６６６の塩基配列を示ず説明図であ
る。 第２図は、ｐＨＳＧ６７１のｊｎ基配列を示す説明図で
ある。 第３図は、合成フラグメント（合成りＮＡ断片）を一括
して示ｉ＃′説明図である。 第４図は、ｐｌ−１ｓＧ６７１と合成りＮＡ断片との対
応を示寸説明図である。図中においてｒｐｓｌ’及びｒ
ｐＳＬｍはそれぞれ天然型のストレプトマイシン感受ｆ
１３１！伝子及び修飾されたストレプトマイシン感受性
遺伝子を意味する。 第５図は、ｐ　ＨＳ　Ｇ　６６４の作成の７０−チ１？
−トである。 第６図は、ｐＨ３Ｇ６６５の作成のフローチャートであ
る。 第７図は、ｐｌ−１８Ｇ１６２６の作成のフローチャー
トである。 第８図は、ｐ）ｌｓＧｌ　６３０およびｐＨ３Ｇ６６６
の作成のフローチャートである。 第９図は、ｐＨＳＧ６７０およびｐＨＳＧ６７１の作成
のフＯ−チ（７−トである。 第１０図は、ｐＮｏ１５２３およびｐＨ３Ｇ６７１の塩
基の対比を示寸説明図である。 第１１図は、ｐ）−Ｉ　Ｓ　Ｇ　６６６の制限酵素地図
である。 第１２図は、ｐ　ｌ−Ｉ　Ｓ　Ｇ　（３７１の制限酵素
地図である。 第５〜１０図にＪ３いて太く記載されている部分は、合
成りＮＡ断片で置き換えた部分を示している。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 第７図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記から選ばれた１又は２以上の認識部位群を有す
   るストレプトマイシン感受性遺伝子。 ＡｓｕII、Ｓａｃ I 、Ｂａｌ I 及びＸｈｏ I よりな
   る制限酵素認識部位群（以下、Ｎｏ１の認識部位群とい
   う）、 Ｍｌｕ I 、Ｓｎａ I 、ＥｃｏＲ I 、Ｍｓｔ I 及びＢ
   ｓｔＥIIよりなる制限酵素認識部位群（以下、Ｎｏ２の
   認識部位群という）、 Ｂｃｌ I 、Ｎｏｔ I 及びＢｇｌIIよりなる制限酵素認
   識部位群（以下、Ｎｏ３の認識部位群という）および Ｋｐｎ I 、ＳａｃII、Ｘｂａ I 、Ｓａｌ I 、Ｃｌａ
   I 、Ｐｖｕ I 及びＳｔｕ I よりなる制限酵素認識部
   位群（以下、Ｎｏ４の認識部位群という） ２、制限酵素ＢａｍＨ I の認識部位を追加的に有して
   いる、特許請求の範囲第１項記載のストレプトマイシン
   感受性遺伝子。 ３、Ｎｏ１、３及び４の認識部位群と ＢａｍＨ I 部位とを有する、特許請求の範囲第２項記
   載のストレプトマイシン感受性遺伝子。 ４、Ｎｏ１、２、３及び４の全ての認識部位群とＢａｍ
   Ｈ I 部位とを有する、特許請求の範囲第２項記載のス
   トレプトマイシン感受性遺伝子。 ５、下記から選ばれた１又は２以上の認識部位群を有す
   るストレプトマイシン感受性遺伝子を含む、プラスミド
   ベクター。 ＡＳｕII、Ｓａｃ I 、Ｂａｌ I 及びＸｈｏ I よりな
   る制限酵素認識部位群（Ｎｏ１の認識部位群）Ｍｌｕ
   I 、Ｓｎａ I 、ＥｃｏＲ I 、Ｍｓｔ I 及びＢｓｔＥ
   IIよりなる制限酵素認識部位群（Ｎｏ２の認識部位群）
   、 Ｂｃｌ I 、Ｎｏｔ I 及びＢｇｌIIよりなる制限酵素認
   識部位群（Ｎｏ３の認識部位群）およびＸｐｎ I 、Ｓ
   ａｃII、Ｘｂａ I 、Ｓａｌ I 、Ｃｌａ I 、Ｐｖｕ I
   及びＳｔｕ I よりなる制限酵素認識部位群（Ｎｏ４の
   認識部位群） ６、制限酵素ＢａｍＨ I の認識部位を追加的に有する
   ストレプトマイシン感受性遺伝子を含む、特許請求の範
   囲第５項記載のプラスミドベクター。 ７、ｐＨＳＧ６６６と名付けた、特許請求の範囲第６項
   記載のプラスミドベクター。 ８、ｐＨＳＧ６７１と名付けた、特許請求の範囲第７項
   記載のプラスミドベクター。 ９、下記から選ばれた１又は２以上の認識部位群を有す
   るストレプトマイシン感受性遺伝子を含むプラミスドベ
   クター、を含む微生物。 ＡｓｕII、Ｓａｃ I 、Ｂａｌ I 及びＸｈｏ I よりな
   る制限酵素認識部位群（Ｎｏ１の認識部位群）Ｍｌｕ
   I 、Ｓｎａ I 、ＥｃｏＲ I 、Ｍｓｔ I 及びＢｓｔＥ
   IIよりなる制限酵素認識部位群（Ｎｏ２の認識部位群）
   、 Ｂｃｌ I 、Ｎｏｔ I 及びＢｇｌIIよりなる制限酵素認
   識部位群（Ｎｏ３の認識部位群）およびＫｐｎ I 、Ｓ
   ａｃII、Ｘｂａ I 、Ｓａｌ I 、Ｃｌａ I 、Ｐｖｕ I
   及びＳｔｕ I よりなる制限酵素認識部位群（Ｎｏ４の
   認識部位群） １０、ｐＨＳＧ６６６と名付けたプラスミドベクターを
   含む、特許請求の範囲第９項記載の微生物。 １１、ｐＨＳＧ６７１と名付けたプラスミドベクターを
   含む、特許請求の範囲第９項記載の微生物。