JPS62209091A - 抗腫瘍活性多糖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明はマイタケを利用して得る抗腫瘍活性多糖に関
する。

（従来技術） 従来から、キノコに由来する抗腫瘍活性物質は数多く知
られ、マイタケについても多く、例えば特公昭５２−４
４３８６号公報の天然又は合成の栄養液体培地にマイタ
ケを培養して得る培養済培地から制癌物質を抽出する方
法とか特開昭６Ｑ−５８９２５号公報のマイタケ子実体
から抽出する抗腫瘍活性物質等がある。

（発明が解決しようとする問題点） ・上記従来技術において例えば特公昭５２−４４３８６
号公報の方法にあっては、培養済培地を原料とすること
から、抽出物に混入する各種有機・無機成分の分離、精
製に複雑な多数の手間を要する不都合があり、特開昭６
０−５８９２号公報に示すものにあっては原料として子
実体を用いるため原料の十分なる確保において問題なし
としない不都合を有している。

（問題点を解決するための手段） 上記した如く、従来の技術にあっては、目的物の分離、
精製が複雑であるとか、原料供給において問題が残って
いるとかで尚改善の余地を残すものであった。

上記に鑑み、この発明者らは鋭意研究した結果、この発
明者らの一部の者の発明になる特公昭５９−１８９９５
号公報に記載するマイタケ菌糸体を糖質溶液に接触させ
て得る多糖体について更に検討したところ意外にも抗腫
瘍活性のあることを見い出し、この知見に基づき上記で
得た多糖から中性成分を分画したところ、この両分に高
い抗ｊ！ｌ！瘍活性のあることを認め、理化学的分析の
結果、以下に詳記するように、β１→６分技を有するβ
１→３グルカンであることを認めこの発明を完成した。

（イ）元素分析値　Ｃ３８，９〜４０．１％、Ｈ５，８
〜６．０％Ｎ定量限界以下 （＋］）分子量（ゲル濾過法）ｌｘｌＯ５〜ｌＸ１０７
に分布（ハ）融　点　２３０℃で分解 （ニ）比旋光度〔α３Ｄ　＋２９．２±０．５（Ｃ＝０
．１．１１２０）（ホ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ
法）第１図のとおり （へ）　１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ、中
）　第２図のとおり （ト）溶剤に対する溶解性 水、アルカリ、ジメチルスルフオキシド（［）ＭＳＯ）
に易溶、エチルアルコール、メチルアルコール、エーテ
ル、アセトン等の有機溶剤には不溶。

（チ）呈色反応 モーリッシュ反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫
酸反応はいずれも陽性を呈し、ヨード反応、ニンヒドリ
ン反応、ビユレット反応はいずれも陰性を呈す。

（す）塩基性、酸性、中性の別　水溶液は中性を示す （ス）物質の色、形状　　白色、綿状 （作　用） この発明で用いるマイタケ菌糸はシロマイタケ、クロマ
イタケの一般に知られるマイタケを液体又は固体培養基
で培養して得るマイタケ菌糸体であり、これらマイタケ
は天然のマイタケから分離し純粋培養、継代培養によっ
て形質が保持されているもの、或は各種保存機関にある
菌株を同じようにしてその形質を保持させているものい
ずれも用いることができ、例えば保存菌株としてグリフ
ォラ　フロンドッサ（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓ
ａ）　ＩＦＯ４９１１゜ＩＦｏ　７０４０等、天然から
得られたものとして、グリフォラ　フロンドッサ・パル
・トカチアーナ（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓａ　
ｖａｒ　ｔｏｋａｃｈｉａｎａ）（微工研菌寄第４９７
９号）等を挙げることができ、中でもグリフォラ・フロ
ンドッサ・パル・トカチアーナの使用が好ましい。

いま、グリフォラ・フロンドッサ・パル・トカチアーナ
を用いてのこの発明の多糖について説明すると、この菌
株の継代培養物を予め液体或は固体培地により培養して
得た菌糸体を適当な手段により集菌し、必要に応じて水
洗を行った後、好ましくは無菌水に単一に分散懸濁させ
、これをアラビノース、キシロース、フラクトース、グ
ルコース、マンノース、ガラクトース、マルトース、シ
ュクロース、メリビオース、ラクトース、ラフィノース
、イノシトール、マニトール等の低分子糖類、デンプン
、デキストリン、アラビアゴムのような高分子糖類、グ
リコシド類或はこれらの加水分解物、又は精製糖蜜、製
糖工程中の精製粘液等の一種又は二種以上を含む糖質溶
液をクエン酸、乳酸のような有機酸によりｐＨを酸性域
としたものに添加し、攪拌を行いながら２０〜３０℃、
２〜８日間接触反応を行うと、菌糸体が酵素的に糖質に
作用して溶液中に多量の多糖を生成するに至る。

上記反応の終了後、菌糸体と上澄液とに分離し、分離し
た上澄液を濃縮するか或は濃縮することなしに糖不溶性
溶媒例えばメタノール、エタノール等のアルコール、ア
セトンを添加して沈でんを生成せしめる。このとき通常
はエチルアルコールを使用する。このような溶媒による
沈でん生成を必要に応じ複数回行った後、沈でん物を分
離、乾燥すると殆ど白色の綿状物を得る。

、上記で得た白色の綿状物を尿素溶液又は水に溶解し、
ＨＣＯ，−型に再生したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−
２５を用いてクロマト分離し、中性画分を分取し。

これに前記と同様のアルコール等の溶媒を加えて沈でん
を生成せしめると白色綿状の本発明の多糖を得る。この
場合において、尿素溶液に溶解した場合には、溶解性が
よいが、中性画分から尿素を除去するために透析を必要
とする。−力水に溶解した場合には、中性画分の透析を
不要とする利点があるが尿素溶液に比べて若干溶解に時
間を要することになる。従って前記物質の溶解に尿素溶
液を用いるか水を用いるかは事情によって適宜選択。

すればよい。

上記のようにこの発明の多糖は、マイタケ菌糸体を糖質
溶液に接触させて得る物質から、その中性画分を選択的
に取り出すだけで、従来のように前処理に複雑な多くの
精製を不要とし、中性画分の単離、精製に必要に応じて
透析を行う程度で十分に純粋な多糖を得ることができる
。

以上にて得た多糖は、以下に示す理化学的分析結果から
β（１→３）結合するグルコース残基３ケごとにβ（１
→６）結合するグルコース残基１ケの分枝を有するβ−
グルカンであることが知れ、この多糖をＧｒｉｆｏｌａ
ｎ−Ｎと名づける。

このＧｒｉｆｏｌａｎ−Ｎは後述の実施例で説明するよ
うに高い抗腫瘍活性を示す。

理化学的分析 （１）元素分析値等 Ｃ：　３ｇ、９〜４０．１％、Ｈ：　５．８〜６．０％
、Ｎ：定量限界以下、ハロゲン、硫黄は定量されない。

（２）分子量 ０．２モルＮａＯＨ／８モル尿素平衡セファロースＣＬ
−４Ｂ（ファーマシア・ジャパン）カラムによるゲル濾
過クロマトグラフィーにより分子量の分布範囲がｌＸｌ
０’　〜ｌＸ１０’ｔ’ある。

（３）融点 約２３０℃で熱分解する。

（４）比旋光度 ２０℃における水中濃度０．１ｇ／１００ｍＱの［α］
。

が２９．２±０．５を示す。

（５）溶解性 水、アルカリ、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）に
易溶、エチルアルコール、メチルアルコール、エーテル
、アセトン等の有機溶媒には不溶である。

（６）水溶液の塩基性、酸性、中性の別１％水溶液は中
性域（ｐＨ６，３〜６．５）を示す。

（７）構成糖の種類 三弗化酢酸（ＣＦ、Ｃ００Ｈ）による加水分解物を水素
化ホウ素ナトリウム（Ｎａ［３０４）に還元し、これの
アルジトールアセテート誘導体をガスクロマトグラフィ
ー分析した結果、グルコースのみを明確に検出し、フコ
ース、キシロース、マンノース、ガラクトース等の他の
糖は検出しない。

（８）構成糖の結合様式 箱守法によるメチル化分析の結果は、２，３，４゜６−
チトラメチルー〇−０−グリシドール：　２，４．６−
トリメチルー〇−Ｄ−グリシドール：２，４−ジメチル
−〇−Ｄ−グリシドールが１．０：１．７：１．０の比
で３．４．６−トリメチルー〇−Ｄ−グリシドール、２
，６−シメチルー〇−〇−グリシドールが痕跡であるこ
とから、１→３結合Ｄ−グルコース残基３個ごとに１→
６結合Ｄ−グルコースの分枝を有するグルカンを繰り返
し単位とすることが知られる。

（９）スミス分解生成物 完全スミス分解により、生成物としてグルコースとグリ
セリンを検出し、緩和スミス分解物の透析外液からグリ
セリンをそして内液の加水分解液からグルコースのみを
検出したことから、１→３結合とＣ−６に分枝を有する
構造のグルカンであることが知れる。

（１０）赤外線吸収スペクトル ＪＡＳＣＯＩＲＡ−１型分先々度計を用いＫＢｒ法で測
定した結果は第１図のとおりで、波数８９４ｃｍ−１に
βグリコシド結合配向に特徴的な吸収（Ｐ）を認めるこ
とから、β−グリコシド結合構造であることが認められ
る。

（１１）”Ｃ−ＮＭＲスペクトル 重ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ−ｄ、　）に溶解
し、ＪＥＯＬ−ＦＸ２００スペクトルメーターにより６
０℃で測した結果は第２図のとおりで、δ値６７ｐｐｍ
域のβ（ｌ→６）結合に含まれるＣ−６の炭素の帰属を
含むシグナルＳ工と、δ値８Ｓｐｐｍ域のβ（ｌ→３）
結合に含まれるＣ−３の炭素に帰属するシグナルＳ２と
、δ値１１０３ｐｐ域のβ−結合のＣ−１の炭素に帰属
するシグナルが特徴的に認められ、更にシグナルＳ２が
３つのピークを示すことから、β（１→３）結合が３個
あり、β（１→６）が１個あるβ−グルカン構造が知ら
れる。

（１２）呈色反応 モーリッシュ反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫
酸反応はいずれも陽性を呈し、ヨード反応は陰性でα（
１→４）結合グルカンの存在を示さず、ニンヒドリン反
応、ビューレット反応が共に陰性であることから蛋白質
、ペプチドの存在を示さない。

以上述べたようにこの発明の抗腫瘍活性多糖Ｇｒｉｆｏ
ｌａｎ−Ｎは高い抗腫瘍活性を示すことから、薬用とし
て有用で、腹腔内投与、腫瘍的投与、静脈内投与として
利用できるほか、経口投与としての利用も期待しうるも
のであり、各種形の制がん剤用途を有するものである。

以下実施例によってより具体的に説明する。

（実施例） 実施例１ 予め継代培養しているグリフォラ　フロンドッサ　パル
　トカチアーナ（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓａ　
ｖａｒＴｏｋａｃｈｉａｎａ）　（微工研菌寄第４９７
９号）を含む培地面から、５ｍ＋ｓＸ５ｍｍの切片を２
片取り出し、これをマルトエキス４％、おがくずエキス
５％、麩エキス５％、寒天２５％、ｐｉ　ｓ、ｓのオー
トクレーブ処理済の斜面に接種して２５℃、３週間培養
して一次種菌とする。上記−次種菌から５ｍｍＸ５ｍｍ
の切片を３片取り出し、これをせ蔗糖′Ｗｉ２％（糖量
として）。

ポリペプトン０．４％を含み１０％乳酸でＰＨ５，５に
調整したオートクレーブ処理培地５０鵬Ｑに接種して２
５℃で３日間静置培養して二次種菌とする。この二次種
菌の５ｒｔｒＱ宛をプルコース２％、甘蔗糖蜜２％（糖
量として）、ポリペプトン０．６％、大豆油３滴を含み
、１０％乳酸でｐＨ４，５に調整したオートクレーブ処
理済培地１００ｔＲ宛を分注した５００社容量坂ロフラ
スコの２本に夫々接種し、２５℃、２週間で振盪培養し
てこれを三次種菌とする。上記で得た種菌の全量をグル
コース２％、せ蔗糖′ｆ１２％（１１ｉ量として）、ポ
リペプトン０．６％、大豆油０．１％を含み、１０％乳
酸でｐＨ４，５に調整したオートクレーブ処理済培地６
Ｑを収容する１Ｏ１２容量ジャーファーメンタ−に投入
し、通気量０．５ＶＶＭ、温度２５℃、攪拌数２５Ｏｒ
、Ｐ、Ｉｍで６日間培養した。

上記ジャーファーメンタ−培養で得た内容物を遠心分離
（３０ＱＯｒ、ｐ、ｍ、　５分）して集菌し、水洗−遠
心分離を２回行った後、これによって得た菌糸体の全量
をグルコース５％、クエン１ｏ、ｓ％、ｐＨ４，０の糖
質液６Ｑを収容するｌＯＱ容量ジャーファーメンタ−に
投入し、通気量０．５ＶＶＭ、　２８℃、攪拌数２５Ｏ
ｒ、ｐ、ｍで２日間反応させた後内容物を遠心分離して
菌糸体と上澄液に分離し、上澄液にエタノール濃度４０
容量％となるようにエタノールを加えて沈でん物を生成
せしめ、遠心分離後凍結乾燥して。

乾燥物６．５ｇを得た。上記遠心分離によって残留した
反応済の菌糸体により、上記と同じ糖質を用いて第２回
の反応を行い同様に乾燥物５．８ｇを得た。

更に第２回の反応で残留した反応済の菌糸体により上記
と同じ糖質を用いて第３回の反応を行い（但し反応日数
を３日とした）同様に乾燥物５．０ｇを得た。

上記第１回〜第３回で得た乾燥物をよく混合し。

これの１ｇを８モル尿素水溶液におよそ２　ｍｇ／ｍＱ
で溶解し、これをＨＣＯ３″″型に再生したＤＥＡＥ−
セルファデックスＡ−２５２００ｍＲを充填するカラム
を用いて中性画分（尿素溶液溶出素通り区分）を分取し
、セルロースチューブ（白井松器械／製）で７２時間透
析し、内液に１．５倍量のエタノールを加えて沈でんを
生成せしめ、これを凍結乾燥して白色の綿状もしくは微
細繊維様の本発明の抗腫瘍活性多糖Ｇｒｉｆｏｌａｎ−
Ｎ　Ｏ，６ｇを得た。このものは前記した理化学的性質
を示した。

実施例２ 実施例１で得たＧｒｉｆｏｌａｎ−Ｎの抗腫瘍活性（其
の１）ＩＲＣ−系６週令のマウス（雄、体重２７〜３０
ｇ）　１０匹を１群としてサルコーマ１８０腫瘍細胞５
Ｘ１０’ケをそけい部皮下に接種し、これを零日とし、
前記Ｇｒｉｆｏｌａｎ−Ｎを生理食塩水に試験量宛溶解
した試験液を１．３，５．７及び９日目の５回にわたり
、各種経路で投与し、腫瘍細胞の接種後３５日目に解体
し、ＩＩＩＲ瘍増殖の抑止率と完全退縮の程度を調査し
たところ、第１表のとおりでＧｒｉｆｏｌａｒ＋−Ｈの
腫瘍増殖の抑制作用の高いことを認めた。

１）　　＊　　Ｐ＜０．０５．　　　本Ｉ　　Ｐ（０，
０１，重水＊　　ｐ＜ｏ、ｏｏｔ実施例３ 実施例１で得たＧｒｉｆｏｌａｎ−Ｎの抗腫瘍活性（其
の実施例２の要領に準じ、投与口を変えた場合の抑止率
を調査した。　ＩＲＣ−系６週令のマウス（雄、体重２
７〜３０ｇ）を使用し、１０匹を１群としてサルコーマ
１８０腫瘍細胞５Ｘ１０’ケをそけい部皮下に接種し、
これを零日とする。生理食塩水に溶解したＧｒｉｆｏｌ
ａｎ−Ｎの試験量を前記零日の前及び後の所定の日に夫
々腹腔内に投与し、零日の翌日から起算して３５日目に
マウスを解体して腫瘍の状況を調査した。その結果は第
２表に示すとおりで腫瘍接種口以前の投与の場合にも高
い抑止効果を認めた。

このような前投与による抑止効果は、従来知られるマイ
タケ子実体から得た多糖物質（特開昭６０−５８９２５
号公報）と比べてＧｒｉｆｏｌａｎ−Ｎに特徴的なもの
である。この前投与による効果のよって来る理由は未解
明であり、今後の研究に待たれるところである。

第２表 投　与　量　投与スケジュール　　　　腫瘍重量（ｇ）
　　　抑止率μｇ／回×回　　　　（日）　　　　　　
　平均±ＳＤ　　　　（％）１００Ｘ５　　　−９．−
７．−５．−３．−１　　　０．６７±１．６２　　　
８６．２１００Ｘ５　　　　÷１．　＋３．　＋５．　
＋７．　＋１１　　１．１３±３．５７　　　７６．７
１００ｘ５　　　　＋１１．＋１３．＋１５．＋１７．
＋１９　　０．７３＋１．２９　　　８４．９対照　　
＋１．４３．４５．＋７．＋９　　４．８４±３．７８
　　−（効　果） この発明によるときは、多糖の分画、精製がきわめて簡
単で、得られた多糖の抗腫瘍活性が高いものであるから
、腫瘍抑制剤としての利用価値がきわめて高いものであ
り、かつ安価に址産を可能とする。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のＧｒｉｆｏｌａｎ−Ｎの赤外線吸収
スペクトル。 第２図はこの発明のＧｒｉｆｏｌａｎ−Ｎの１３Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の理化学的性質を有する抗腫瘍活性多糖Ｇｒｉｆｏ
   ｌａｎ−Ｎ。 （イ）元素分析値　Ｃ３８．９〜４０．１％、Ｈ５．８
   〜６．０％Ｎ定量限界以下 （ロ）分子量　ゲル濾過法により１×１０＾５〜１×１
   ０＾７に分布 （ハ）融点　２３０℃で熱分解 （ニ）比旋光度〔α〕＿Ｄ　２９．２±０．５（Ｃ＝０
   ．１、Ｈ＿２Ｏ） （ホ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）　第１図に示
   すとおり （ヘ）＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ＿
   ６中）　第２図に示すとおり （ト）溶剤に対する溶解性 水、アルカリ、ジメチルスルフオキシドに易溶、エチル
   アルコール、メチルアルコール、エーテル、アセトン等
   の有機溶剤に不溶 （チ）呈色反応 モーリッシュ反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫
   酸反応はいずれも陽性を呈し、ヨード反応、ニンヒドリ
   ン反応、ビュレット反応はいずれも陰性を呈す。 （リ）塩基性、酸性、中性の別　水溶液は中性を示す （ヌ）物質の色、形状　白色　綿状